Microsoft Word - curs format simplu.doc

1. STRUCTURA MOLECULAR A ACIDULUI DEZOXIROBONUCLEIC (ADN) .................................................................................................................... 31.1.Structura primar a ADN-ului i semnificaia ei genetic ..................................................... 31.1.1.Semnificaia genetic a structurii primare a ADN................................................................... 5

1.2.Structura secundar a ADN-ului i semnificaia ei genetic.................................................. 52. MARKERII MOLECULARI......................................................................... 92.1.Metode de marcare molecular bazate pe restricie enzimatic ......................................... 112.1.1.Marcarea RFLP ...................................................................................................................... 11

2.1.2.Amprentarea genetic bazat pe ADN repetitiv .................................................................... 12

2.2.Metode de marcare molecular bazate pe amplificarea PCR ............................................. 142.2.1.Principiul reaciei PCR ........................................................................................................... 14

2.2.2.Markerii RAPD ...................................................................................................................... 17

2.2.3.Markerii SCAR....................................................................................................................... 19

2.2.4.Markerii SSR (microsatelii) .................................................................................................. 19

2.3.Metode de marcare molecular bazate pe amplificarea PCR i restricie enzimatic ..... 212.3.1.Markerii CAPS ....................................................................................................................... 21

2.3.2.Markerii AFLP ....................................................................................................................... 22

2.4.Aplicaii....................................................................................................................................... 242.4.1.n ameliorare ........................................................................................................................... 24

2.4.2.n genetica populational i taxonomie.................................................................................. 25

3. INGINERIA GENETIC ........................................................................... 333.1.Tehnologia ADN-ului recombinant. ........................................................................................ 333.1.1.Transformarea genetic la procariote..................................................................................... 33

3.2.Secvenierea ADNului. .............................................................................................................. 593.3.Mutageneza dirijat. ................................................................................................................. 623.4.Transformarea genetic la eucariote. ..................................................................................... 673.4.1.Transformarea genetic prin metode indirecte. ..................................................................... 67

3.4.2.Transformarea genetic de tip SID (Site Directed Integration) ............................................ 71

3.4.3.Transformarea genetic prin metode directe. ........................................................................ 72

3.4.4.Instabilitatea exprimrii transgenelor..................................................................................... 7413.5.Realizri privind transformarea genetic a plantelor de cultur........................................ 753.5.1.Ameliorarea rezistenei la virusuri. ........................................................................................ 76

3.5.2.Ameliorarea rezistenei la bacterii i ciuperci........................................................................ 78

3.5.3.Ameliorarea rezistenei la atacul duntorilor. ...................................................................... 80

3.5.4.Ameliorarea rezistenei la erbicidele neselective. ................................................................. 82

3.5.5.Ameliorarea calitii. .............................................................................................................. 83

3.5.6.Producerea de noi compui. ................................................................................................... 84

3.5.7.Ameliorarea rezistenei la stresul abiotic (stresul osmotic, toxicitatea metalelor grele). ..... 86

3.5.8.Manipularea sterilitii mascule. ............................................................................................ 89

3.6.Analiza obiectiv i legislaia referitoare la problematica Organismelor ModificateGenetic (OMG urilor). ........................................................................................................................................... 914. HIBRIDAREA I CIBRIDAREA CELULAR........................................ 1014.1.Hibridarea celular. ................................................................................................................ 1014.1.1.Obinerea protoplastelor. ...................................................................................................... 101

4.1.2.Fuziunea protoplastelor ........................................................................................................ 101

4.1.3.Izolarea celulelor hibride...................................................................................................... 103

4.1.4.Regenerarea plantelor hibride. ............................................................................................. 104

4.1.5.Confirmarea naturii hibride. ................................................................................................. 105

4.1.6.Importana hibridrii celulare............................................................................................... 105

4.2.Cibridarea celular. ................................................................................................................ 1075. HAPLOIDIA PRIN ANDRO I GINOGENEZ ...................................... 1085.1.Haploidia prin androgenez................................................................................................... 1085.2.Haploidia prin ginogenez...................................................................................................... 1085.3.Importana practic a haploidiei. .......................................................................................... 1096. VARIABILITATEA SOMACLONAL .................................................... 1117. BIBLIOGRAFIE ...................................................................................... 11321. Structura molecular a acidului dezoxirobonucleic (ADN)1.1. Structura primar a ADN-ului i semnificaia ei geneticStructura primar a ADN-ului este monocatenar, macromolecular. Macromolecula de ADN este. de fapt, un heteropolimer alctuit din mai multe subuniti elementare numite nucleotide.

Un nucleotid este alctuit dintr-un radical fosforic (P), dezoxiriboz (dR) i o bazazotat (N), formula general a unui nucleotid putnd fi reprezentat astfel: P-dR-N.Dezoxiriboza este o glucid cu cinci atomi de carbon (deci o pentoz), atomi notai de la 1' la 5' (fig. 8.1). Radicalul fosforic este legat printr-o legtur esteric de atomul de carbon5'. Bazele azotate pot fi purinice i pirimidinice. Bazele azotate purinice sunt: adenina (6- aminopurina) i guanina (2-amino, 6-oxipurina) avnd cte un nucleu purinic cu cinci atomi de carbon i patru atomi de azot, atomi notai de la 1 la 9 (fig. 1.2).

Figura 1.1: Dezoxiriboza, monozaharid cu cinci atomi de carbon (pentoz)

Figura 1.2: Bazele azotate puriniceBazele azotate pirimidinice sunt, de regul, timina (2,6-dioxi, 5-metilpirimidina) i citozina (2-oxi, 6-aminopirimidina), avnd cte un nucleu pirimidinic cu patru atomi decarbon i doi de azot, atomi notai de la 1 la 6 (fig. 1.3).3

Figura 1.3: Bazele azotate pirimidiniceRelativ n puine cazuri n lumea vie pot s apar i alte tipuri de baze azotate, cum ar fi de pild 5-hidroximetilcizina sau 6-metiladenina, evideniate la unii fagi.Dezoxiriboza realizeaz legturi l'-9 cu bazele azotate purinice i legturi l'-3 cu bazele azotate pirimidinice. Dezoxiriboza mpreun cu o baz azotat formeaz un nucleotid. Celor patru tipuri de baze azotate le corespund urmtoarele tipuri de nucleotide: dezoxiadenozina; dezoxiguanozina; dezoxitimidina; dezoxicitidina. Aceste nucleotide formeaz patru tipuri de nucleotide n urma legrii radicalului fosforic de atomul de carbon 5' al dezoxiribozei:dezoxiadenozin 5'-monofosfat sau acidul dezoxiadenilic (dAMP);dezoxiguanozin 5'-monofosfat sau acidul dezoxiguanilic (dGMP);dezoxitimidin 5'-monofosfat sau acidul dezoxitimidilic (dTMP);dezoxicitidin 5'-monofosfat sau acidul dezoxicitidilic (dCMP).Dou nucleotide sunt legate de un radicalfosforic prin legturi monofosfodiesterice ntre atomii de carbon 5' i 3' a dezoxiribozei aparinnd celor dounucleotide vecine (Fig. 1.4).Monocatena de ADN este polarizat, n sensul c la unul din capete gruparea OH, aparinndatomului de carbon 5' este esterificat n timp ce la cellalt capt gruparea OH, aparinnd atomului de carbon3' este liber.

Figura 1.4: structura primar a ADN41.1.1. Semnificaia genetic a structurii primare a ADN.Specificitatea moleculei de ADN este determinat de secvena nucleotidelor n cadrul monocatenei, nucleotidele difereniindu-se n raport cu tipul de baz azotat pe care le conin. Numrul deosebit de mare de combinaii care poate s rezulte din combinarea celor patru tipuri de nucleotide (4n, unde reprezint numrul de nucleotide din cadrul unei molecule de ADN ce poate s ajung la cteva mii sau milioane), reprezint suportul material al variabilitii lumii vii, determinnd specificitatea informaional a fiecrei vieuitoare i capacitatea, practic, nelimitat a moleculei de ADN de a stoca informaia genetic.1.2. Structura secundar a ADN-ului i semnificaia ei geneticStructura secundar reprezint starea natural obinuit n care se gsete ADN-ul. Conform modelului descoperit de WATSON i CRICK (1953) pentru care n anul 1962 le-a fost decernat premiul Nobel, structura secundar a ADN-ului este bicatenar, cele dou catene fiind nfurate helicoidal spre dreapta (ADN de dreapta, dextrogir), plectonemical (catenele petrecute una peste alta la fiecare rsucire), formnd un dublu helix cu diametrul de20 (1 = 10-8 cm), pasul sau distana n cadrul unei nfurri complete este de 34.Distana ntre dou nucleotide este de 3,4, deci n interiorul unei nfurri complete a dublului helix se gsesc 10 nucleotide. Spre exterior se afl scheletul glucido-fosforic al moleculei de ADN, iar spre interior se gsesc bazele azotate, legate prin puni de hidrogen, de natur electrostatic.mperecherea bazelor azotate i legarea lor prin puni de hidrogen se face pe principiul complementaritii, n sensul c aceasta se realizeaz strict specific ntre o baz azotat purinic i una pirimidinic. De regul adenina se mperecheaz prin intermediul a dou puni de hidrogen cu timina, iar guanina se mperecheaz prin intermediul a trei puni de hidrogen cu citozina. Aceast specificitate rezult din particularitile sterice a celor dou perechi de baze. Ca urmare a acestui mod de mperechere a bazelor azotate o caten este complementul sau negativul celeilalte catene, fapt deosebit de important pentru asigurarea continuitii genetice n procesul de copiere i transmitere a mesajului genetic (prin mesaj genetic se nelege totalitatea informaiei genetice nmagazinate n ADN sub forma unei secvene particulare de nucleotide). Datorit complementaritii n molecula de ADN coninutul puriniceste totdeauna egal cu coninutul pirimidinic (A + G = T + C).5Raportul (A + T) / (G + C) difer ns de la o specie la alta fiind caracteristic unei anumite specii (CHARGAFF, 1951).Aceast regul de mperechere a bazelor azotate n cadrul moleculei de ADN bicatenare, prezint i unele excepii, n legtur cu posibilitatea trecerii bazelor azotate n formele lor tautomere, prin redistribuirea atomilor de hidrogen n cadrul moleculelor. Astfel, citozina poate trece din forma amin n forma imin (Fig. 1.5). Fenomenul este cunoscut sub denumirea de "tautomeric shift" i are ca i consecin schimbarea proprietilor de mperechere, n sensul c n acest caz citozina se mperecheaz cu timina i nu cu guanina. La fel n cazul unor modificri tautomere adenina se mperecheaz cu guanina nu cu timina. Modificarea proprietilor de mperechere a bazelor n cazul schimbrilor tautomere pot s aib ca efecte secundare apariia unor mutaii.

Figura 1.5: Tautomerizarea citozinei din forma amin n forma iminCele dou catene ale moleculei de ADN sunt antiparalele n sensul c dac ntr-o catena legturile fosfodiesterice sunt pe direcia 5'-3', n cealalt caten legturile sunt pe direcia 3'-5' (fig. 1.6).Pe lng acest tip de ADN de dreapta, n ultimii ani a fost pus n eviden un nou tip de ADN cunoscut ca ADN-z sau ADN de stnga (senestra) la care cele dou catene sunt spiralizate spre stnga, scheletul glucido-fosforic avnd un traiect mai sinuos, n zig-zag (de unde i denumirea de ADN-z). Rolul acestui tip de ADN nu este nc cunoscut.De asemenea, dup cum s-a mai artat exist n stare natural i ADN monocatenar, de pilda in cazul fagilor 0 X 174 i S 13. Acetia i formeaz catena complementar numai dup ptrunderea lor n celula gazd n vederea multiplicrii.Semnificaia genetic a structurii secundare a ADN Structura secundar bicaternar asigur pe de o parte stabilitatea fizic i metabolic a moleculei de ADN. Acest fapt are cu att mai mare importan cu ct molecula de ADN este sintetizat o singur dat pentru ntreaga via a celulei Aceast stabilitate este relativ, n sensul c n anumite condiii naturale, n procesul de replicare i transcriere, sau artificiale (pH alcalin, temperatur ridicat n jur de 70-90C) poate s aib loc denaturarea ADN-ului sau trecerea lui n staremonocatenar. n condiii artificiale, prin rcire lent poate s aib loc renaturarea lui, sau6revenirea la structura bicatenar. Rata de renaturare este o msur cantitativ a complexitii secvenei nucleotidelor n molecula de ADN. Astfel, rata cea mai rapid de renaturare o prezint secvenele nalt repetitive, eventual polinucleotidele sintetice cu o secven monoton de nucleotide. n cazul secvenelor unice rata de renaturare este mai lent. Eficiena ratei de renaturare poate fi apreciat cu ajutorul valorii Cot definite prin formula Co x t, n care Co reprezint timpul de incubaie n condiii standard, dat n secunde. Cu ct eficiena renaturrii este mai mare cu att valoarea Cot este mai mic. De menionat c valorile Cot auspecificitate de specie.

Figura 1.6: Structura secundar a ADN7Prin tehnica denaturrii-renaturrii pot fi realizai hibrizi moleculari ntre specii diferite, putndu-se stabili pe aceast baz legturile lor filogenetice. n acest sens renaturarea este cu att mai eficient sau proporia de renaturare este cu att mai mare cu ct speciile respective sunt mai nrudite Biogenetic. Astfel, proporia de renaturare n cazul hibrizilor moleculari om-maimu este de 75% n timp ce n cazul hibrizilor moleculari om-oarece este numai de 25%.Complementaritatea bazelor, n cadrul structurii secundare, asigur, pe de alt parte, posibilitatea realizrii celor dou funcii importante ale materialului genetic:funcia autocatalitic, n cadrul procesului de biosintez replicativ a ADN- ului, prin care se realizeaz copierea i transmiterea mesajului genetic, deci continuitatea genetic;funcia heterocatalitic, n cadrul procesului de biosintez proteic, prin care se asigur exprimarea mesajului genetic la nivelul fiecrui individ.82. Markerii moleculariAnaliza diversitii genetice i a relaiilor inter- sau intraspecifice, populaionale sau individuale, este o problem central a multora dintre disciplinele biologiei. n ultimii ani, strategii clasice de evaluare a variabilitii genetice, cum ar fi studiile comparative de anatomie, morfologie, embriologie i fiziologie au fost tot mai mult completate de tehnici ale biologiei moleculare. Acestea includ analiza compuilor chimici (de ex. metaboliii secundari) i cel mai important analiza macromoleculelor. Dezvoltarea aa numiilor markeri moleculari, care pun n eviden polimorfismele la nivel de ADN sau proteine, a facilitat cercetrile ntr-o multitudine de discipline cum ar fi taxonomia, filogenia, ecologia, genetica i ameliorarea plantelor (Vila i colab., 1996)Marcherii genetici sunt reprezentai de orice diferen genetic sau fenotipic care este specific individului i se transmite la descendeni, putnd fi urmrit de-a lungul generaiilor. (Staub i colab., 1996)Marcherii genetici sunt de trei tipuri: marcheri morfologici, marcheri proteici i marcheri moleculari (de Vicente i colab., 2004)Marcherii morfologici: cu ajutorul acestor marcheri se poate efectua a evaluare rapid a fenotipului individului, deoarece sunt uor de utilizat i nu necesit echipamente costisitoare. Au fost utilizai n determinarea variabilitii att n cadrul populaiilor ct i ntre acestea; cu toate acestea prezint urmtoarele dezavantajele: se gsesc n numr limitat, necesit evaluarea expertului n cunoaterea speciei la care se utilizeaz i sunt influenai de condiiile de mdiu i de stadiul de dezvoltare al plantei.Marcherii biochimici: se mai numesc i proteici, deoarece se bazeaz pe proprietatea proteinelor de a fi separate n urma electroforezei. Tipuri de marcheri biochimici, sunt proteinele rezultate n urma stocrii seminelor, izoenzimele.Marcherii moleculari: prezint numeroase caracteristici importante, pot fi obinui n numr nelimitat, pot fi obinui din orice esut n orice etap de dezvoltare a plantei, sunt independeni de condiiile de mediu, independeni de expresia fenotipic a genei, nu prezint epistazie i pleiotropie, se transmit mendelian dominant sau codominant i sunt indifereni fa de presiunea de selecie. Spre deosebire de cei morfologici (controleaz caractere morfologice uor de evideniat controlate genetic simplu, monogenic), prezint marele avantajc sunt mult mai numeroi i nu perturb fiziologia organismului.9Izoenzimele sunt enzime ce difer ca structur (secven de aminoacizi), dar catalizeaz aceeai reacie, avnd acelai substrat. Izoenzimele sunt codificate de gene omoloage. (Tanksley i colab., 1983.) Ca marcheri, au fost intens folosii n genetica populaiilor, fiind codominani i prezentnd o reproductibilitate mare. Dezavantajul izoenzimelor ca marcheri const n numrul sczut (sub 90) i faptul c sunt influenate de condiiile de mediu i de stadiul dezvoltrii plantei. (de Vicente i colab., 2004)Marcherii ADN evideniaz polimorfismul la nivelul ADN-ului nuclear i citoplasmatic. Acetia nu sunt influenai de condiiile de mediu, fiind o msur obiectiv a variabilitii, exist n numr nelimitat, acoperind ntregul genom, dar necesit echipamente complexe de analiz.Marcherii ideali ar fi caracterizai de urmtoarele proprieti: polimorfism ridicat, reproductibilitate mare, codominan, distribuie uniform n genom, distinctivitate (s evidenieze diferenele ntre indivizi nrudii), neinfluenai de condiiile de mediu, neutri (alela prezent la locusul marcherului s fie independent fa de presiunea de selecie aplicat individului), necostisitori, uor de utilizat (de Vicente i colab, 2004).Marcherii moleculari pun n eviden diferenele existente ntre secvenele de nucleotidice din ADN-ul extras de la indivizi diferii, diferene care nu sunt neaprat vizibile n fenotip. O singur nucleotid diferit, dintr-o gen sau chiar din ADN-ul repetitiv, poate determina formarea sau dispariia unui marcher molecular (N. Jones i colab., 1997).Marcarea molecular are avantajul de a nu fi limitat de exprimarea fenotipic a caracterelor la nivelul plantei ntregi, fcnd posibil cuantificarea variaiei genetice direct la nivel de ADN. De-a lungul timpului s-au dezvoltat o serie de tehnici de punere n evident a variaiei genetice, aprnd astfel o multitudine de marcheri moleculari (Grant i Shoemaker,2001).Markerii moleculari pot fi clasificai n funcie de tehnicile moleculare implicate precum i n funcie de modul lor de manifestare. Astfel n funcie de tehnicile implicate markerii moleculari pot fi bazai pe :Amplificarea PCR (RAPD, SSR, SCAR, SRAP, TRAP)Restricie enzimatic (RFLP, SSR)Amplificarea PCR i restricie enzimatic (AFLP, CAPS) n funcie de modul de manifestare markerii moleculari pot fi:Dominani (RAPD, AFLP) SRAP, TRAP)10Codominani (SSR, CAPS, RFLP)2.1. Metode de marcare molecular bazate pe restricie enzimatic2.1.1. Marcarea RFLPMarcarea RFLP (Restriction Fragment Length Polimorfism) a fost prima metod utilizat n vederea cartrii variaiilor secvenelor de ADN. Tehnica se bazeaz pe proprietatea endonucleazelor de a recunoate secvene specifice scurte de ADN (4-8 pb) i de a rupe molecula de ADN la nivelul acestor secvene (situsuri de restricie). Datorit faptului c secvenele recunoscute de endonucleaze se repet aleatoriu de mai multe ori de-a lungul genomului, vor rezulta n urma digestiei enzimatice cu o anumit endonucleaz o multitudine de fragmente de lungimi diferite. Orice modificare aprut n interiorul acestor secvene (fie i o singur nucleotid) conduce la imposibilitatea enzimei de a recunoate secvena i de a rupe molecula de ADN. Aceasta nseamn c dac doi indivizi difer n secvena unui astfel de situs de restricie, endonucleaza va tia molecula de ADN a unui individ dar nu i a celuilalt (Grant i colab., 1995).n funcie de lungimea sondei utilizate, respectiv de specificitatea ei, se poate vorbi n cazul markerilor moleculari bazai pe hibridare, de analiza RFLP clasic, care utilizeaz ca sonde secvene cu lungime mai mare fiind astfel specifici unui anumit locus. O alt variant a analizei RFLP este obinerea de amprente genetice, caz n care se folosesc ca sonde secvene scurte care se vor hibridiza cu mai multe fragmente, rezultnd astfel un profil electroforetic cu mai multe benzi dect n cazul analizei RFLP clasice (Vila i colab., 1996)O proprietate foarte util a markerilor RFLP este acea c ei sunt codominani, spre deosebire de markerii fenotipici care sunt n general dominani/recesivi. Aceasta nseamn c prezena uneia dintre alele nu mpiedic detectarea celeilalte alele n cazul n care individul este heterozigot (Grant i colab., 1995; Staub i colab., 1996).Metoda de lucru const n extracia ADN-ului genomal, digerarea lui cu ajutorul unei enzime de restricie i migrarea electroforetic n gel de agaroz. Fragmentele de ADN sunt ulterior transferate prin tehnica Soutern blotting pe o membran de nylon sau nitroceluloz i hibridate cu sonde marcate radioactiv (Olive i colab., 1999;Vila i colab., 1996).Membrana este mai apoi autoradiografiat, rezultnd astfel un film pe care fragmentele de11ADN care s-au hibridizat cu sondele marcate radioactiv, vor aprea sub forma de benzi (Staubi colab., 1996).2.1.2. Amprentarea genetic bazat pe ADN repetitivTehnica clasic de amprentare genetic bazat pe hibridizare scoate n eviden, la organismele eucariote, cteva clase de secvene repetitive, cu un polimorfism ridicat a cror nomenclatur este uneori confuz. Secvenele repetitive sunt o parte integrant a genomului eucariotelor i reprezint uneori pn la 90% din totalul genomului. n funcie de organizarea sa, secvenele repetitive pot fi clasificate n intercalate (risipite de-a lungul genomului) sau n tandem. n cazul secvenelor intercalate, ele se repet de cteva ori n genom. Pe de alt parte, cele repetate n tandem sunt constituite din dou pn la cteva mii de secvene scurte (motive) repetate, aezate cap-coad. Dei acest tip de organizare este ntlnit i n cazul unor gene (de ex. genele care codific histonele sau cele pentru ARNr), cele mai multe secvene repetitive sunt probabil noninformaionale. (Weising i colab., 1995)Fragmentele repetate n tandem pot fi clasificate, n funcie de lungimea lor i numrul de repetiii, astfel:1. ADN-ul satelit a fost descris pentru prima dat acum mai bine de 35 de ani. El a fost denumit dup separabilitatea lui din ADN-ul total prin centrifugarea n gradient de densitate. Acest tip de ADN repetitiv este constituit dintr-un numr foarte mare de repetiii (1000 pn la 100.000 de copii), a unui motiv format din 2 pn la cteva mii de perechi de baze, dar cel mai des din 100-300 pb. Sateliii apar de obicei ntr-un numr redus de loci n genom.2. ADN minisatelit. Termenul a fost introdus n 1985 i descrie o alt familie de secvene repetate n tandem. Aceast clas este constituit din motive mai scurte (de obicei din 10-60 pb), repetate de un numr mai mic de ori. Minisateliii pot forma familii de secvene nrudite i se ntlnesc n mai muli loci.

3. ADN microsatelit sau secvenele simple repetitive (SSR), sau secvene simple n tandem sunt formate din motive scurte (1-10 pb), repetate de un numr mic de ori dar prezente n muli loci (cei mai muli loci i cu cele maiscurte motive).124. Pentru completarea listei de mai sus, a secvenelor repetate n tandem Nakamura i colab. au introdus i termenul de midisatelii pentru a descrie secvenele care combin caliti ale sateliilor (numr foarte mare de repetiii la nu singur locus) i ale minisateliilor (numr variabil de repetiii a unor motive de aproximativ 40 pb)Markerii genetici obinui pe baza acestui tip de amprentare molecular au un comportament codominant, n sensul c prezena uneia dintre alele nu inhib punerea n eviden a unei alte alele (Grant i colab., 1995).Din punct de vedere tehnic, amprentarea genetic pe baza secvenelor repetitive difer de analiza RFLP doar prin lungimea i secvena sondelor utilizate i n ceea ce privete interpretarea rezultatelor. Dac n cazul analizei RFLP vor aprea, n general, pe autoradiografia gelului electroforetic doar una sau dou benzi pentru fiecare individ studiat, n cazul amprentei genetice apare un numr mult mai mare de benzi, corelat cu numrul de loci n care apare secvena repetitiv. Astfel pentru fiecare locus vom avea una sau dou benzi n funcie de starea homozigot sau heterozigot a individului (Fig. 2.1).

Figura 2.1 Amprentarea genetic bazat pe analiza secvenelor repetitive132.2. Metode de marcare molecular bazate pe amplificareaPCRn anul 1985 a fost pus la punct o noua tehnic, care a revoluionat genetica molecular. Aceast tehnic poart numele de Polimerase Chain Reaction PCR (reacia n lan a polimerazei). Tehnica permite amplificarea n vitro a unei secvene dorite de ADN, ntr- un numr foarte mare de copii. Pentru a putea amplifica o secven ADN dorit, sunt necesare dou oligonucleotide monocatenare, complementare capetelor secvenei pe care dorim s o amplificm(primeri).Totodatpentru a realiza o amplificare este necesar o ADN-polimeraz termostabil, nucleotide (sub form de deoxinucleotidtrifosfat DNTP) ct i de un tampon de amplificare potrivit. Reacia are loc pe fondul unui ciclu termic care va permite denaturarea ADN, fixarea primerilor i polimerizarea (extensia) secvenei de ADN cuprinse ntre cei doi primeri (Vila i colab., 1996).Pe baza reaciei PCR s-au dezvoltat o serie de tehnici de obinere a unor amprente genetice i de detectare a polimorfismelor la nivel de ADN. Aceste tehnici utilizeaz primeri specifici (PCR) sau primeri alei aleatoriu (RAPD, DAF, AP-PCR, etc.).2.2.1. Principiul reaciei PCRn reacia PCR tipic se pot distinge trei etape distincte controlate prin temperatura de reacie, repetate ciclic de 25 pn la 50 de ori.Amestecul de reacie cuprinde:Tampon de reacie format n general din TRIS-HCl, KCl, i MCl2;ADN polimeraz termostabil care adaug nucleotide la captul 3 al unui primer ataat la o secven de ADN monocatenar;Patru deoxinucleotide (dNTP: dATP, dCTP, dGTP, dTTP);Doi primeri oligonucleotidici;ADN-ul matri.Principiul reaciei PCR este reprezentat schematic n Fig 2.2. n prima etap ADN-ul matri (genomic) este denaturat prin ridicarea temperaturii la 94 C etapa de denaturare. n cea de a doua etap (de ataare a primerilor) prin scderea temperaturii de reacie la 25 - 65 C, n funcie de lungimea i secvena primerilor, se realizeaz ataarea primerilor la catenele matri. Primerii se vor ataa preferenial la situsurile unde gsesc o secven 14complementar, sau aproape complementar. Vor aprea astfel unele greeli n special la captul 5. Etapa a treia este etapa de elongaie (polimerizare). n aceast etap temperatura este aleas n funcie de temperatura optim de activitate a ADN-polimerazei termostabile. n general aceasta este n jurul valorii de 72 C. De-a lungul acestei etape, la captul 3 al primerului, ADN-polimeraza adaug nucleotide pe baz de complementaritate cu catena matri. Acest ciclu cu trei etape va fi repetat de 24-50 de ori.Specificitatea reaciei este determinat de alegerea primerilor. Primerii sunt secvene oligonucleotidice monocatenare cu secven complementar regiunilor care flancheaz secvena int. Pentru ca amplificarea s aib loc, primerii trebuie s se ataeze n direcii opuse, astfel nct capetele 3 ale lor s fie ndreptate spre secvena int. Pentru o amplificare eficient, distana dintre cei doi primeri nu trebuie s depeasc 4 Kb. n condiii optime de reacie pot fi amplificate, cu eficien mai mic, i fragmente cu dimensiuni de pn la 10 Kb.n funcie de tipul mutaiei i de modul n care au fost concepui primerii n relaie cu mutaia, markerii PCR pot a avea o manifestare dominant sau codominat. Astfel n cazul n care polimorfismul (mutaia) afecteaz unul dintre situsurile de ataare a primerilor, markerii PCR au o manifestare dominant caracterizat prin prezena sau absena produsului de amplificare. Markerii PCR pot fi codominani dac polimorfismul, situat ntre situsurile de ataare a primerilor, este reprezentat de o inserie sau o deleie (mutaii de tip indel), situaiecaracterizat de polimorfisme de lungime a fragmentelor amplificate.15

Fiura 2.2: Principiul reaciei n lan a polimerazei (PCR)162.2.2. Markerii RAPDTehnica RAPD a fost conceput de Williams i colaboratorii (Williams i colab.,1993) i este cea mai simpl i mai utilizat dintre tehnicile de marcare molecular, care au la baz amplificarea PCR cu primeri alei aleatoriu (DAF, AP-PCR) (Vila i colab., 1995).Markerii RAPD (Random Amplified Plymorphic DNA) sunt obinui pe baza tehnicii PCR, utiliznd primeri scuri (de obicei decameri). Primerii se vor hibridiza cu molecula de ADN matri n mai multe locuri n mod aleatoriu. Dac distana dintre doi primeri este suficient de mic i dac sunt orientai corespunztor unul fa de cellalt, fragmentul dintre cei doi primeri va fi amplificat. Produii de amplificare vor fi migrai electroforetic, rezultnd n general un numr de 5 20 de benzi pentru fiecare primer (Grant i colab., 1995) (Fig. 2.3).Primerii utilizai n aceast tehnic sunt de obicei decameri i au un coninut de cel puin 50% n guanin i citozin (GC). Deoarece ntre adenin i timin sunt doar dou puni de hidrogen, primerii cu un coninut de peste 50% n aceste dou nucleotide, nu vor rezista temperaturii la care se face extensia i se vor denatura nainte ca aceasta s nceap (Vila i colab., 1995; Williams i colab., 1993).Datorit faptului c secvena primerilor este fcut arbitrar, nu este necesar cunoaterea prealabil a secvenelor de ADN care vor fi amplificate (Vila i colab., 1995), dar alegerea secvenei primerilor care s evidenieze cel mai bine polimorfismele existente se face prin cercetri empirice (Olive i colab., 1999).Aproape toi markerii RAPD sunt dominani, ei manifestndu-se prin prezena sau absena unei benzi n gelul de electroforez. Este imposibil de spus dac fragmentul amplificat provine de la un locus care este heterozigot sau homozigot pe baza markerilor RAPD. Totui n unele cazuri au fost observai i markeri RAPD codominani. Acetia se pot observa sub forma unor produi de amplificare cu lungimi diferite provenite de la acelai locus (Williams i colab., 1993).n ceea ce privete capacitatea diferenieri ntre dou genotipuri, analiza RAPD s-a dovedit n unele cazuri, mai eficient dect analiza RFLP, dar mai puin eficient dect Rep- PCR (Vila i colab., 1995).Unul dintre neajunsurile markerilor RAPD este reproductibilitatea sczut a acestui tip de analiz. Aceasta se datoreaz faptului c primerii nu sunt specifici unui anumit locus i, astfel, o parte dintre produii de amplificare sunt rezultatul unei atari defectuoase aprimerilor. Analiza este astfel foarte sensibil la o serie de factori cum ar fi: temperatura de17ataare a primerilor, calitatea i concentraiile componentelor tamponului de extracie, ADN- polimeraza utilizat, etc. (Olive i colab., 1999)

Figura 2.3: Principiul metodei RAPD182.2.3. Markerii SCARMarkerii SCAR (Sequence Characterized Amplified Regions regiuni amplificate caracterizate prin secveniere). n anul 1993 Paran i Michelmore, au dezvoltat un nou tip de marker molecular care se obine n urma analizei RAPD, dar este lipsit de unele neajunsuri ale acesteia. Astfel, pornind de la o band identificat prin RAPD, considerat de interes, excizat din gel, clonat i apoi secveniat, se sintetizeaz primeri de 16-24 pb, complementari cu capetele markerilor RAPD clonai. Amplificarea cu primerii astfel obinui va da produi ce formeaz un tipar mai simplu n gel, respectiv un numr mai mic de benzi (de Vicente i colab., 2004).Markerii SCAR au o reproductibilitate mult mai mare dect markerii RAPD, datorit folosirii unor primeri specifici lungi, complementari anumitor loci din genom i datorit condiiilor de specificitate mrit n care are loc amplificarea PCR i care nltur competiia primerilor pentru situsurile de fixare. Un alt avantaj este faptul c i pot pstra caracterul dominant de transmitere n descenden (la fel ca i fragmentul RAPD original), sau pot fi transformai n markeri codominani, prin digestie cu endonucleaze.Identificarea polimorfismului se face prin electroforez n gradient de denaturare (DGGE - denaturing gradient gel electrophoresis), sau prin intermediul tehnicii SSCP (single strand conformational polymorphism) (Rafalski i Tingey, 1993)2.2.4. Markerii SSR (microsatelii)Microsateliii (ADN nalt repetitiv) reprezint secvene scurte (1-10 pb, de obicei 2-3 pb) de nucleotide ce se repet n tandem, gsindu-se n proporie mai mare la nivelul centromerului i telomerelor (ADN non-informaional) (Gupta i colab, 1996). Pentru a putea fi utilizai ca markeri trebuie cunoscut localizarea lor n genom.Majoritatea markerilor microsatelit STR i SSR sunt constituii din repetiii dinucleotidice [(AC)n, (AG)n i (AT)n]. Similar cu repetiiile dinucleotidice (CA)n de la om, repetiiile dinucleotidice (AT)n sunt relativ abundente la plante i prezint un grad ridicat de polimorfism (Morgante i Vogel, 1994). Acest grup de markeri are o expresie codominant.Desi tehnica clasic de analiz a polimorfismelor existente la nivelul locilor SSR era bazat pe digestia enzimatic i hibridare, aceasta prezint unele dezavantaje prin faptul c este o tehnic laborias, care necesit cantiti relativ mari de ADN de bun calitate, i careutilizeaz izotopi radioactivi. Mai mult pentru a putea analiza un anumit locus, acste trebuie19sa fie flancat de situsuri de restricie speciice unei anumite enzime de restricie. Aceste dezavantaje sunt inlturate prin adaptarea lor la tehnica PCR.Polimorfismul apare datorit variaiei n numr a repetiiilor n tandem n urma amplificrii PCR cu primeri complementari secvenelor ce flancheaz ADN-ul microsatelit (secvene conservate n cadrul speciei, uneori i a genului). Produii de amplificare (benzi de200-300 pb, ce difer ntre ele ca mrime prin cel puin 10-20 pb) sunt migrai n gel de agaroz i vizualizai prin colorare cu BrEt.Produii ce difer ntre ei ca mrime prin mai puin de 10 pb n general sunt migrai n gel de poliacrilamid i vizualizai prin colorare cu azotat de argint sau se pot secvenia pentru o analiz foarte clar a rezultatelor.Avantajele markerilor SSR sunt date de: distribuia lor uniform n genom, polimorfism ridicat, posibilitatea separrii mai multor markeri n aceeai coloan a gelului asigurndu-se n acest fel o economie important de munc, timp i costuri reduse, posibilitatea de automatizare a analizelor, interpretarea simpl a rezultatelor, reproductibilitate mare - rezultatele pot fi cu uurin echivalate ntre laboratoare cu condiia ca metoda de separare a fragmentelor ADN prin electroforez s fie aceeai i sunt codominani-ceea ce permite identificarea tuturor alelelor.Principalele impedimente ar fi legate de costul elaborrii primerilor, de necesitatea cunoaterii secvenei de ADN de interes i de faptul c la migrarea n gelpot s apar unele benzi false alturi de fragmentele ateptate, ceea ce poate duce la probleme n aprecierea mrimii alelelor sau confundarea heterozigoilor cu homozigoii dac cele dou benzi sunt suprapuse.

Markerii SSR i gsesc aplicabilitate n genotipizarea indivizilor, evaluarea germoplasmei, a diversitii genetice, cartarea genomului, amprentarea genetic, studii de filogenie i de evoluionism.Identificarea markerilor SSR este o problem mai dificil dect analiza n sine. Izolarea i caracterizarea regiunilor microsatelit, secvenierea acestora i testarea primerilor sunt toate operaiuni care necesit timp i costuri mrite.n programele de cercetare n care se analizeaz numeroi microsatelii, vizualizarea polimorfismelor se poate realiza concomitent n acelai gel de electroforez-MULTIPLE SSR.20Metodele clasice de izolare a marcherilor SSR presupun realizarea unor biblioteci de gene i apoi screeningul acestora pentru evidenierea prezenei microsateliilor. Procentul de clone pozitive astfel obinute este relativ sczut, n jur de 2,3 % (Zane i colab., 2002).Costul elaborrii marcherilor SSR, att prin metodele clasice, ct i prin cele moderne, este relativ ridicat i necesit experien n ceea ce privete realizarea i screeningul bibliotecilor de gene. Pe de alt parte, mai muli autori (Huang i colab., 1998; Cipriani i colab., 1999; Downey i Iezzoni, 2000; Yamamoto i colab., 2001; Wnsch i Hormaza,2002; Mnejja i colab., 2005; Ganopoulos i colab., 2010; Ercisli i colab., 2011, Berindean i colab., 2012) au relevat transferabilitatea marcherilor SSR n cadrul speciilor aparinnd aceluiai gen.2.3. Metode de marcare molecular bazate pe amplificareaPCR i restricie enzimatic2.3.1. Markerii CAPSMarkerii CAPS (cleaved amplified polymorphic sequences), dezvoltai n 1993 de ctre Konieczny i Ausubel n vedera cartrii genetice la Arabidopsis thaliana, au la ora actual o larg rspndire n studiile care vizeaz cartarea genetic la plante, animale i om. Tehnica const n amplificarea unei secvene int n interiorul creia sa existe unul sau mai multe situsuri de restricie, urmat re restricia enzimatic a respectivelor fragmente. Dac o mutaie afecteaz un situs de restricie acesta nu va mai recunoscut de ctre enzim i astfel n gelul electroforetic nu vor aprea dou benzi ci una singur cu o lungime mai mare (Fig 2.4). n cazul n care un individ este heterozigot n gelul electrofortic vor aparea trei benzi. Astfel acest tip de markeri se ncadreaz n categoria markerilor cu manifestare codominant.

Figura 2.4 Principiul metodei CAPS212.3.2. Markerii AFLPAnaliza AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), este o metod de amprentare genomic elaborat de Zabeau i Vos (1993), bazat pe amplificarea selectiv a o parte din fragmentele de ADN, obinute n urma digestiei enzimatice cu endonucleaze (Olive i colab., 1999; Staub i colab., 1996). Se poate spune astfel c aceast analiz este o combinaie a tehnicilor de amprentare genetic RFLP i a celor bazate pe amplificarea PCR.n funcie de numrul de enzime de restricie utilizate i implicit a numrului de primeri, se pot distinge dou variante de analiz AFLP: analiza n care se utilizeaz o singur enzim de restricie i un primer, sau analiza care utilizeaz dou enzime de restricie i doi primeri (Olive i colab., 1999), cel mai des utilizat fiind cea de-a doua variant.Metoda const n extracia ADN-ului genomic total, digestia lui cu ajutorul a dou enzime de restricie, ligarea a doi adaptori oligonucleotidici bicatenari cu capete coezive complementare capetelor rezultate n urma digestiei enzimatice. Fragmentele astfel obinute vor fi amplificate PCR utiliznd primeri complementari adaptorului i situsului de restricie. Pentru a mri specificitatea reaciei i a micora numrul fragmentelor amplificate se poate proceda la o nou amplificare cu primeri la care, pe lng secvenele complementare adaptorului i situsului de restricie, se mai adaug 2-4 nucleotide. Produii de amplificare vor fi migrai electroforetic n gel de poliacrilamid (Olive i colab., 1999) (Fig. 2.5).Polimorfismele sunt date de lungimea fragmentelor amplificate, metoda fiind foarte sensibil. Datorit numrului mare de benzi rezultate, a reproductibilitii bune i a posibilitii scanrii ntregului genom, markerii AFLP se preteaz utilizrii n scopul amprentrii genetice, crerii de hri genetice, estimrii diversitii, analizrii distanei genetice i a caracterizrii coleciilor de germoplasm. Sunt bine adaptai pentru studierea speciilor neexploatate i au fost deja folosii cu succes pentru a discrimina specii diferite, cu diferite niveluri de ploidie (de exemplu: Gossypium i Oryza) (Aggarwal et al, 1999; Abdalla et al, 2001).Dezavantajele markerilor AFLP sunt date de necesitatea tehnologiei computerizate n analizarea rezultatelor, de faptul c sunt dominani, iar din punct de vedere tehnic manopera este laborioas.Markerii AFLP au un caracter dominant, dar, datorit posibilitii de determinare cantitativ n funcie de intensitatea benzilor, se poate face uneori distincie ntre genotipurile22homozigote (benzile mai intense) i cele heterozigote (benzile mai puin intense). Din acest motiv se poate spune ca markerii AFLP se transmit codominant (Staub i colab., 1996).

Figura 2.5: Principiul metodei AFLP232.4. Aplicaii2.4.1. n ameliorareSelecia asistat de markeri (MAS)este un proces prin care un marker molecular este utilizat pentru selecia indirect a unei gene care determin un caracter de interes (de exemplu, productivitate, rezisten la o boala, toleranta la stres biotic sau abiotic). Acest proces este folosit n ameliorarea plantelor i animalelor. Selecia asistat de markeri combin tehnicile de ameliorare clasice cu cele de biologie molecular.Markerii moleculari care sunt strns linkai cu gene importante, n sens agronomic sunt folosii ca instrumente moleculare pentru selecia asistat de marcheri n ameliorarea plantelor. Cu ajutorul marcherilor moleculari se urmrete efectuarea unei selecii indirecte a caracterelor de interes folosind strnsa legatur (linkage-ul) dintre gena sau genele care controleaz caracterul i un marcher molecular.Ulterior stabiliri distanei de nlnuire markerul molecular poate fi utilizat n munca de seleie fr a mai fi necesar urmrirea caracterului cu care acesta este nlnuit, astfel se pot selecta indivizii doar pe baza markerului, ceea ce permite selectarea acestora foarte timpuriu (la plante foarte tinere), reducndu-se astfel timpul necesar seleciei. Un alt avantaj al folosirii markerilor moleculari rezid din independena acestora fa de expresia fenotipic. MAS d rezultate foarte bune i n cazurile n care selecia pe baza fenotipului este foarte dificil.

Pentru a putea fi utilizat in ameliorare un marker molecular trebuie s fie nlnuit cu o gen de interes la o distana ct mai mic (cel mult 5 cM). Astfel primul pas pe care trebuie s l parcurgem n MAS este tocmai stabilirea distanei de nlnuire dintre caracterul de interes i markerul molecular. Aceasta se realizeaz prin efectuarea de hibridri i urmrirea segregrii n descenden.Selecia unui marcher ADN pentru ameliorarea plantelor depinde de anumite obiective: structura populaiei, complexitatea genomului speciei analizate, tipul de marcheri disponibili, timpul necesar pentru analize i costul per marcher. n mod cert, fiecare tip de marcher are avantaje i dezavantaje i de aceea este greu de evaluat potenialul fiecrui tip demarcher nainte de a fi folosit.242.4.2. n genetica populational i taxonomieAnalizarea variabilitii genetice cu ajutorul marcherilor dominani prezint dezavantajul unui nivel sczut al informaiei obinute comparativ cu cea obinut prin utilizarea marcherilor de tip codominant. Acest dezavantaj este ns compensat prin numrul mare de loci analizai att n cazul utilizrii marcherilor AFLP ct i n cazul marcherilor RAPD. Cu toate acestea analiza matematic a rezultatelor este mai dificil i se bazeaz pe o serie de prezumii. n timp ce analiza diversitii cu ajutorul marcherilor codominani se bazeaz n principal pe compararea frecvenelor alelelor i a genotipurilor observate cu cele teoretice, ateptate n cazul respectrii echilibrului Hardy-Weinberg, n cazul marcherilor dominani acest lucru nu poate fi fcut n mod direct.Pentru analiza diversitii genetice cu ajutorul marcherilor dominani se pot utiliza dou metode de analiz. Astfel o prim metod este cea care implic calcularea unor distane genetice ntre taxonii analizai pe baza crora se ntocmesc mai apoi dendrograme (arbori), arbori care pot oferi indicaii asupra modului de grupare a taxonilor n funcie de asemnrile sau diferenele dintre ei.Datele obinute prin marcarea molecular cu marcheri dominani sunt cel mai adesea analizate prin ntocmirea de dendrograme prin metodele UPGMA sau Neighbor Joining. n vederea calculrii distanelor genetice dintre indivizi, necesare ntocmirii dendrogramelor pot fi utilizai diferii coeficieni de distan (D) sau de similaritate (S) cunoscnd relaia: D=1-S. Distanele sunt calculate pentru fiecare pereche de taxoni analizai pe baza prezenei/absenei alelelor dominante (benzilor n gelurile electroforetice). Cel mai des utilizai coeficieni de similaritate sunt coeficientul de similaritate simpl (simple matching) [1] (Sneath, i colab.,1973), coeficientul Jaccard [2] (Jaccard, 1908), i coeficientul Nei Li/Dice [3] (Nei i colab.,1979). Astfel pentru a calcula coeficienii de similaritate ntre indivizii x i y putem uttuliza formulele:S SM

= n11 + n00n

[1]S J =S=

n11n n002n11

[2]

[3]D 2n11 + n10 + n0125unde: n = numrul total de benzi, n11 = Numrul de poziii unde x=1 i y=1, n00 = Numrul de poziii unde x=0 i y=0, n01 = Numrul de poziii unde x=0 i y=1, n10 = Numrul de poziii unde x=1 i y=0.Datorit incertitudinilor privind identitatea alelelor nule cei mai muli autori recomand evitarea utilizrii coeficientului de similaritate simpl [1], care consider identici locii la care ambii indivizi prezint alela nul. Datorit cauzelor multiple care pot concura la lipsa unui fragment amplificat (lipsa situsului F sau R de ataare, inserii sau deleii n interiorul secvenei amplificate), este recomandat evitarea considerrii lor ca un indicator al identitii. Coeficienii Jaccard i Dice [2, 3] nu includ n calculul similaritii benzile absente (alelele nule) i astfel reduc din erorile care pot fi induse din considerarea acestor alele ca fiind identice.2.4.3. Generarea arborilor prin metoda UPGMA.Metoda UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean) este cea mai simpl metod pentru construirea unei dendrograme, dezvoltat iniial pentru construcia fenogramelor, dar care poate fi utilizat i pentru generarea de arbori filogenetici, atunci cnd rata evoluiei este egal pentru toate liniile analizate.Metoda utilizeaz un algoritm secvenial care ncepe cu obinerea unui taxon compozit din perechea de taxoni care au cel mai mare indice de similaritate (cea mai mic distan). Utiliznd n continuare acest taxon compozit se trece mai departe la obinerea unei noi matrice de distante (prin calcularea mediilor aritmetice) n care intr taxonul compozit i restul taxonilor rmai. Pe baza acestei noi matrice de distane se caut urmtorul taxon compozit, i aa mai departe pn n momentul n care rmn doar doi taxoniS presupunem c avem sase taxoni, distanele dintre ei fiind prezentate n tabel.ABCDE

B6

C810

D111311

E1315138

F1315131214

Primul pas este de a grupa taxonii cu cea mai mica distanta (A i B). Nodul dintreramuri va fi marcat la jumtatea distantei dintre A i B (2/2=1)26

Prin gruparea celor doi taxoni se obine un taxon nou, compozit. Se trece mai apoi la calcularea unei noi matrice de distane dup cum urmeaz:dist(A,B),C = (distAC + distBC) / 2 = 4 dist(A,B),D = (distAD + distBD) / 2 = 6 dist(A,B),E = (distAE + distBE) / 2 = 6 dist(A,B),F = (distAF + distBF) / 2 = 8Cu alte cuvinte distana dintre un taxon simplu i unul compozit este egal cu media distanelor dintre taxonul simplu i fiecare dintre taxonii componeni ai celui compozit.ntregul pas se repet pentru matricea nou generatPasul 2(AB)CDE

C9

D1211

E14138

F14131214

Pasul 3(AB)C(DE)

C9

(DE)1312

F141313

27

Pasul 4((AB)C)(DE)

(DE)11

F13,513

Pasul 5(((AB)C)(DE))

F13,25

28Dei metoda conduce spre un arbore nenrdcinat, ea presupune rate egale ale evoluiei, deci rdcina teoretica trebuie s fie echidistant fa de toi taxonii. Astfel putemaplica metoda punctului de mijloc i deci o vom aplica la o distan de:Dezavantajele metodei:

(ABCDE),F / 2 = 4.Metoda este foarte sensibila la ratele de evoluie inegale. Astfel n cazul n care un taxon a avut o rat mai mare a mutaiei (evoluiei) dect ceilali taxoni aceasta va conduce la obinerea unor arbori eronai.Metoda va funciona dor n cazul distantelor ultrametrice (cu respectarea conditiei celor trei puncte)2.4.4. Generarea arborilor prin metoda Neighbor-JoiningNeighbor-joining (Saitou and Nei, 1987) este o metod de grupare care nu cere ca datele sa fie ultrametrice i deci nu presupune c taxonii au o rat egal a evoluiei.n cazul acestei metode se pornete de la un arbore de tip stea, urmrindu-se, spre deosebire de metoda precedenta, distantele dintre noduri i nu cele dintre taxoni sau grupuri de taxoni. Datele brute sunt de asemenea reprezentate de o matrice binar, dup care se calculeaz o a doua matrice modificat, n care distana dintre fiecare doua noduri este ajustat n funcie de distanta medie fa de toate celelalte noduri. Construcia ncepe prin gruparea celor mai apropiate dou noduri i adugarea la arbore a nodului ancestral comun lor. Dup aceasta nodurile terminale sunt nlturate din analiza, astfel nodul ancestral devine nod terminal, ntr-un arbore cu dimensiuni mai mici. Practic n fiecare pas al analizei dou noduri terminale sunt nlocuite cu unul terminal nou. Procesul se ncheie atunci cnd n analiza rmn doar doua noduri separate printr-o singur ramur.Algoritmul permite apariia ramurilor cu valoare negativa. Daca acest fenomen apare atunci lungimea ramurii respective se seteaz la zero, valoarea ei fiind adugat la valoarea ramurii adiacente, astfel c distanta totala dintre cele dou noduri adiacente rmne neschimbat, i topologia general nu este afectat.Avantajele i dezavantajele metodei Neighbor-joiningAvantaje29oEste o metod rapid i deci compatibil cu seturi mari de date i pentru analize de tip bootstrapoPermite construirea de arbori cu lungimi diferite ale braeloroPermite corecii n cazul substituiilor multipleDezavantajeoGenereaz un singur arbore posibiloFoarte dependent de modelul de evoluie utilizat.ExempluS presupunem c avem ase OTU, distanele dintre ele fiind prezentate n tabel.ABCDE

B6

C810

D111311

E1315138

F1315131214

N=6Pasul 1: Se calculeaz distana neta r(i) pentru fiecare OTU fa de toi ceilali OTU, prin nsumarea distanelor lui fa de ceilali:r(A) = 6+8+11+13+13=51r(B) = 59r(C) = 55r(D) = 55r(E) = 63r(F) = 67Pasul 2: Se calculeaz o nou matrice de valori M dup formula:M (ij) = d (ij) [r(i) + r ( j)]N 2Astfel, pentru perechea A-B:M ( AB) = d ( AB) [r( A) + r(B)] = 6 51 + 59 = 21,5N 2430ABCDE

B-21,5

C-18,5-18,5

D-15,5-15,5-16,5

E-15,5-15,5-16,5-21,5

F-16,5-16,5-17,5-18,5-18,5

Pasul 3: Pornind de la un arbore stea (figura 1.6, A), se alege pentru grupare acea pereche de OTU pentru care M(ij) are cea mai mic valoare. n cazul nostru aceasta este perechea A-B perechea A-B se va separa de grup prin formarea unui nou nod (intern) pe care l denumim U1. Calculm lungimile ramurilor de la nodul U1 la A, respectiv B dupformulele:S (iU) = d (ij) + [r (i) r ( j)]2 2( N 2)S ( jU ) = d (ij) S (iU )S ( AU ) = D( AB) + [r ( A) r(B)] = 6 + [51 59] = 21 2 2( N 2)

2 2(6 2)S ( BU1 ) = d ( AB) S ( AU ) = 6 2 = 4Arborele rezultat va fi cel din Figura 1.6, BPasul 4: Se calculeaz distantele fiecrui nod terminal fa de nodul U dup formula:d (kU ) = d (ki) + d (kj) d (ij)2astfel n cazul nostru:

d (CU ) = d (AC ) + d (BC) d ( AB) = 62d (DU ) = d (AD) + d (BD) d ( AB) = 92d (EU ) = d (AE ) + d (BE) d ( AB) = 112d (FU ) = d (AF ) + d (BF ) d ( AB) = 112i se creeaz o nou matrice:UCDE

31C6

D97

E1165

F11898

N= 5Procedura se repet, pentru noua matrice de distane, pn la determinare tuturor nodurilor interne, obinndu-se succesiv arborii din figura 1.6, C, D i E. Trebuie menionat c prin aceast metod se obine un arbore nenrdcinat, care pentru o mai bun claritate poate fi afiat i sub forma unei dendrograme rectangulare.

Figura 2.6: etapele constuciei unui arbore de tip Neighbor-Joining323. Ingineria geneticIngineria genetic reprezint totalitatea metodelor i tehnicilor prin care se acioneazin vitro asupra genelor, cromozomilor sau celulelor cu scopul obinerii unor structuri genetice noi, posibil prestabilite.Prin faptul c se acioneaz in vitro, ingineria genetic aparine biotehnologiilor, n cadrul crora se particularizeaz prin urmtoarele domenii specifice:Tehnologia ADN-ului recombinant;Mutageneza dirijat.Hibridarea i cibridarea celular;Haploidia prin andro- i ginogenez;Variabilitatea somaclonal;3.1. Tehnologia ADN-ului recombinant.Tehnologia ADN-ului recombinant presupune introducerea prin intermediul unui vector (V) a unei gene strine numit pasager (P), provenit de la o specie donor, ntr-o celul gazd (de regul procariot), celul gazd care sufer prin aceasta un proces de transformare genetic n sensul c gena este capabil s se replice i eventual s se exprime n celula gazd. Pasagerul mpreun cu vectorul formeaz ADN-ul recombinant.3.1.1. Transformarea genetic la procariote.Obiectivul transformrii genetice la procariote (bacterii) este clonarea sau multiplicarea genelor, odat cu multiplicarea bacteriilor. Transformarea genetic la procariote nu este un proces integrativ. Genele transferate se multiplic, odat cu vectorul i uneori pot fi capabile s se exprime n celula gazd.Scopul clonrii poate fi foarte divers. Astfel genele multiplicate pot fi utilizate n vederea caracterizrii lor sub aspectul hrilor de restricie sau chiar sub aspectul obinerii secvenelor nucleotidice. Prin exprimarea genelor n celula gazd, n prezena unui promotor de expresie ce aparine, de regul, vectorului, se urmrete recoltarea produsului de expresie a genelor din mediul de cultur. Foarte cunoscut este obinerea pe aceast cale a insulinei umane sau a interferonului. Prin strategia antisens, ce permite blocarea exprimrii unor gene, se poate deduce care este funcia genelor respective. Strategia antisens presupune introducereaunei gene ntr-o poziie invers fa de promotor n raport cu gena endogen pe care dorim s33o blocm, astfel c gena introdus s fie transcris sub forma unui ARN mesager antisens, complementar ARN-ului sens produs de gena endogen. Cele dou molecule de ARN mesager fiind complementare vor forma o structur bicatenar care nu mai poate fi tradus sub forma unei proteine specifice n procesul de translaie. i nu n ultimul rnd, n contextul transformrii genetice la eucariote, o prim etap este reprezentat de izolarea i clonarea genelor ce urmeaz a fi transferate, operaiune realizat, de asemenea, prin tehnologia AND- ului recombinant.Etapele clonrii.Etapele clonrii sunt:a. Izolarea vectorului;b. Obinerea pasagerului;c. Integrarea pasagerului n vector i obinerea ADN-ului recombinant;d. Introducerea ADN-ului recombinant n celula gazd;e. Selecia celulelor gazd ce poart pasagerul integrat n vector;f. Selecia celulelor gazd ce poart un anumit pasager;g. Clonarea propriu zis a genei odat cu multiplicarea celulelor gazd ce poart un anumit pasager sau a genei dorite.a. Izolarea vectorului.n acest context ne vom referi, mai nti, la caracteristicile generale ale vectorilor precum i la exemple de vectori. Vectorii utilizai trebuie s prezinte urmtoarele caracteristici: s fie capabili s se replice n celula gazd; greutatea molecular s nu fie prea mare (de regul n jur de 2-5 kb dar n cazul unor virui poate ajunge pn la 50 kb); s poarte marcheri genetici asociai care s permit identificarea i izolarea celulelor transformate; s poat integra specific pasagerul.Integrarea pasagerului se face la nivelul unui situs de restricie. ntr-un vector pot exista mai multe situsuri de restricie ns un anumit situs trebuie s fie, de regul, unic. Vectorii moderni poart mai multe situsuri de restricie diferite, dispuse n tandem, formaiune numit polilinker sau MCS (Multi Cloning Sites). Vectorul, dup cum s-a mai artat, poate s poarte promotori specifici celulelor gazd pentru ca genele transferate s poat fi exprimate.Ca exemple de vectori putem meniona: plasmidele, fagul , cosmidele, fagul M13 ce aparine vectorilor monocatenari, vectorii YAC (Yeast Artificial Chromosome) .a.Plasmidele ca vector de clonare.34Plasmidele aparin sistemului genetic citoplasmatic al procariotelor (bacteriile i algele albastre), reprezentate, de regul, de molecule de ADN bicatenare, circulare, de dimensiuni reduse (cam 0,2 pn la 4% din lungimea cromozomului bacterian), molecule ce poart gene cu funcii de adaptare. Plasmidele, n starea lor natural sunt supersucite (SC sau supercoils) i rezistente la denaturare. n contextul operaiunilor de izolare se pot rupe la nivelul unei singure catene, devenind circulare (OC sau open circles), sau se pot rupe la nivelul ambelor catene, devenind liniare (L sau linear), sensibile la denaturare. Dup cum se va vedea, aceste caracteristici sunt exploatate n protocolul de izolare a plasmidelor. Pe lng genele ce asigur procesul de conjugare ca form special a funciei reproductive sau genele ce controleaz producerea unor toxine (vibriocin, cloacin, colicin) exist gene care, n condiii obinuite de mediu nu sunt vitale, n schimb, n condiii deosebite de mediu pot asigura supravieuirea indivizilor care le poart. Astfel sunt genele ce determin rezistena la antibiotice, sau capacitatea de a metaboliza un anumit substrat, de regul nociv, cum ar fi capacitatea de a metaboliza, hidrocarburi, compuii aromatici sau chiar acidul salicilic, precum n cazul speciei Pseudomonas putida.Plasmidele se clasific n raport cu capacitatea sau incapacitatea de a realiza conjugarea precum i n raport cu numrul i dimensiunea lor.Dup primul criteriu exist plasmide conjugative i neconjugative. Plasmidele conjugative, cum ar fi plasmidele F (sau factorul de fertilitate) sau chiar plasmidele R (pentru rezistena la antibiotice), poart genele implicate n procesul de conjugare. Conjugarea reprezint un proces sexuat de unire a dou celule bacteriene, una mascul i alta femel, prin intermediul unor puni citoplasmatice, urmat de transferul unidirecional de material genetic, ce poate s aib ca i consecin recombinarea genetic. Ca gene implicate n procesul de conjugare menionm gena tra ce asigur formarea pililor (punile de legtur de natur citoplasmatic dintre celulele ce conjug), gena mob ce codific o endonucleaz ce taie plasmida la punctul de iniiere a transferului sau originea transferului oriT. Conjugarea se face, de regul, ntre indivizii aparinnd unor specii nrudite. Exist situaii n care conjugarea se poate face ntre specii relativ ndeprtate din punct de vedere sistematic. n cazul acestora plasmidele implicate n conjugare poart gene BDH (Broad Host Range) i se numesc plasmide promiscue (promiscuous plasmids).n raport cu numrul i dimensiunea lor exist dou grupe de plasmide, n funcie de mecanismul de control al replicrii (Gartland, 1993) . Replicarea plasmidelor este supuscontrolului unui represor al replicrii cu valoare de prag, represor codificat de o gen35plasmidial. Astfel exist plasmide aflate sub un control relaxat (relaxed plasmids), plasmide la care represia replicrii se realizeaz la o valoare mai ridicat a pragului, i ca atare se gsesc n numr mai mare n celul i sunt de dimensiuni mai mici. Cealalt grup, aflat sub control stringent (stringent plasmids) au o valoare mai redus a pragului la care replicarea este inhibat i deci se gsesc n numr mai mic n celule (1-2) i au dimensiuni mai mari. Din aceeai cauz, legat de valoarea de prag a represorului, ntr-o celul nu pot coexista cele dou grupe de plasmide, plasmidele aflate sub control stringent fiind eliminate. Plasmidele care nu pot coexista n aceiai celul se spune c sunt incompatibile. Din acest punct de vedere exist mai multe grupe de plasmide numite grupe de incompatibilitate (C, P,Q, W) iar plasmidele care aparin unei anumite grupe nu pot coexista n aceiai celul.Ca vectori de clonare plasmidele pot inte-gra pasageri de pn la 15 kb. n continuare vom da cteva exemple de plasmide utilizate ca vectori, de la vectorii ce in mai mult de istoria utilizrii lor ca vectori la vectorii moderni. Acetia se difereniaz n raport cu numrul situsurilor de restricie, marcherii de selecie i posibilitatea izolrii celulelor transformate cu pasageri integrai n vector, posibilitate legat, de regul, de inactivarea unui marcher n cares-a integrat pasagerul sau inactivarea de inserie (tabelul 1).Exemple de plasmide utilizate ca vectori de clonare

Tabelul 1Plasmida Situsuride restricie

Marcheri de selecie

Inactivarea de inserie

ColE1 EcoRI Imunitate la colicin

Mai multen marcheri ApR, TcR

Incapacitatea de a produce colicinTcS, ApR(colonii albe n prezena penicilinei i IK)pUC 18 MCS n lacZ+ ApR lacZ-(colonii albe)pGMT MCS n lacZ+ ApR lacZ-(colonii albe)MCS ntr-ogen letal Gen letal

Supravieuire colonii

Mai multe detalii vom da la paragraful ce se refer la izolarea celulelor gazd ce poartpasagerul integrat n vector, adic ADN-ul recombinant.O categorie de vectori plasmidiali este reprezentat de vectorii navet (Shuttle vectors). Acetia poart marcheri de selecie care permit transformarea unor organisme diferite, att procariote ct i eucariote. Un exemplu este vectorul pDBJ3 care poartmarcherul pyrG+ util pentru selecia trans-formanilor speciei Aspergillus nidulans, n cazul n36care gazda este pyrG- incapabil de a crete pe un mediu lipsit de pirimidin, i marcherul ApR, care permit selecia trans-formanilor E.coli, pe un mediu cu ampicilin, n cazul n care gazda este sensibil la ampicilin.Exist mai multe metode de izolare a plasmidelor. Una dintre metode, utilizat n mod curent (dup Birnboim i Doly, 1979), se bazeaz pe faptul c ADN-ul plasmidelor ntregi (SC) este mai rezistent la denaturare fa de cel cromozomal sau plasmidial rupt prin manipulri (OC sau L). Dup liza bacteriilor n mediu alcalin, ADN-ul cromozomal fragmentat i ADN-ul plasmidial (OC i L) se va denatura n timp ce plasmidele SC vor rmne n starea lor natural. Prin reducerea pH-ului cu acetat de potasiu ADN-ul denaturat se va renatura dezordonat, rezultnd, mpreun cu fragmentele celulare, un conglomerat care va putea fi separat prin centrifugare de plasmidele SC, care rmn n suspensie n supernatant, sau n lizatul celular limpezit. Din suspensie, ADN-ul plasmidial urmeaz a fi precipitat cu alcool i recuperat, n urma centrifugrii.Fagul ca vector de clonare.Fagul este un fag temperat ce paraziteaz bacteria E. coli, motiv pentru care se mai numete bacteriofag. El poate exista att n stare integrat n cromozomul bacteriei, n cadrul ciclului lizogenic, ct i autonom n bacterie, n cadrul ciclului litic, ciclu ce se ncheie cu liza bacteriei i formarea plajelor de liz, cu aspectul unor pete clare pe suprafaa culturii bacteriene. Genomul fagului slbatec care are 48,5 kb, este bicatenar, cu excepia capetelor care sunt monocatenare, complementare, cunoscute ca situsul cos. n cadrul genomului amintim gena A care codific o endonucleaz care taie, n dreptul situsului cos, molecula concatemer de ADN care include, n cadrul procesului de replicare, mai multe genomuri. Urmeaz genele E i D, implicate n formarea capsidei; gena cI ce codific un represor care mpiedec intrarea fagului n ciclul litic. Mai exist o zon central, ntre genele D i cI, neesenial n ciclul de multiplicare a fagului, numit zona stuffer, care poate fi nlocuit cu ADN strin, pasager.Fagul slbatec nu poate fi utilizat ca vector de clonare deoarece n cadrul genomului su exist situsuri de restricie multiple ceea ce ar conduce la fragmentarea lui n mai multe buci. De aceea, ca vectori de clonare, se utilizeaz vectori derivai de la fagul la care situsurile de restricie multiple au fost eliminate . Exist dou tipuri de vectori derivai ianume vectorii de inserie i vectorii de nlocuire.37Vectorii de inserie ( gt 10; Charon 16 A; Charon 3A) pot s integreze pasageri de pn la 7,6 kb deoarece o cantitate mai mare de ADN nu ar mai putea permite ncapsidarea. Vectorului gt 10 are un situs de restricie EcoRI n gena cI care codific represorul. Vectorul Charon 16 A are un situs de restricie EcoRI n gena lacZ care codific -galactozidaza (Old i Primrose,1994). Vectorul Charon 3A poart o mutaie amber care i permite s se replice doar pe bacterii E. coli supresoare a mutaiei amber, bacterii disponibile doar n laborator, fapt ce contribuie la un anumit nivel de protecie biologic.Vectorii de nlocuire (EMBL-3, EMBL-4, EMBL-3Sam) pot integra pasageri de pn la 23 kb, deoarece o parte din genomul virusului, i anume secvena stuffer, poate fi eliminat. n cazul vectorului EMBL-4, aceast secven este flancat, de o parte i de alta de MCS urile cu urmtoarele situsuri de restricie :EcoR I, BamH I i Sal I i deci poate fi eliminat n urma digestiei cu una din enzimele de restricie specifice unui anumit situs. Menionm faptul c secvena stuffer poart genele red i gam responsabile pentru inhibarea creterii fagului pe o bacterie gazd lizogen pentru fagul P2 deci care asigur sensibilitatea la inhibiia determinat de fagul P2 (SPI+ adic Sensitive to P2 inhibition). Fragmentul urmeaz a fi nlocuit cu un pasager obinut prin digestia ADN-ului de la donor cu aceiai enzim de restricie, fagul devenind SPI-, adic rezistent la inhibiia determinat de fagul P2 i deci poate crete pe o bacterie lizogen cu acest fag i, n anumite condiii, pot forma plci de liz (Old i Primrose,1994). Vectorul EMBL-3 Sam poart o mutaie amber, mutaie care i permite s se dezvolte doar pe bacterii supresoare a mutaiei amber, fapt ce asigur, de asemenea, un anumit nivel de protecie biologic.

Pentru izolarea ADN-ului fagic se utilizeaz ca material biologic o cultur bacterian, reprezentat de regul de E. coli, infectat cu fagi. Liza bacteriilor se realizeaz n mod natural, sau, n cazul fagilor lizogeni, liza este idus sub aciunea unui agent inductor cum ar fi radiaia UV. Separarea fagilor de restul celulelor sparte sau chiar ntregi se realizeaz prin centrifugare, fagii rmnnd n suspensie. Din suspensie fagii sunt precipitai cu poli etilen glicol (PEG) i se recupereaz prin centrifugare. Dup resuspendare proteina capsidal este eliminat prin digestie cu prteinaz K sau cu ajutorul fenolului iar ADNul este recuperat princentrifugare, dup precipitate cu alcool sau izopropanol.38Cosmidele ca vectori de clonare.Cosmidele pot fi considerate ca vectori de nlocuire a fagului , fag de la care s-a reinut doar situsul cos. Restul ADN-ului (n jur de 5 kb) este reprezentat de ADN plasmidial, cu marcheri de selecie specifici ADN-ului plasmidial. n consecin cosmidele pot s integreze pasageri de pn la 50 kb. Deoarece lipsesc toate genele fagului, cu excepia situsului cos rezult dou consecine majore. Pe de o parte cosmidele nu vor forma niciodat plaje de liz, selecia transformanilor bazndu-se exclusiv pe marcherii plasmidiali iar pe de alt parte ADN-ul recombinant, adic cosmidele plus pasagerul, nu se poate ncapsida i deci nu poate produce infecia celulelor gazd. Din acest motiv se procedeaz la ncapsidarea in vitro care const n amestecarea ADN-ului recombinant cu dou forme mutante amber ale fagului la care s-a indus lizogenia cu radiaii UV, stare care s le permit intrarea n ciclul litic. O form are o mutaie amber n gena D responsabil de maturarea fagului, i n consecin acumuleaz precursori capsidiali codificai de gena E a mutantului, cealalt are o mutaie amber n gena E, deci nu produce precursori capsidiali dar funcia de maturare a fagului este ndeplinit de gena D normal a mutantului. Menionm faptul c mpachetareain vitro este necesar i n cazul vectorilor de nlocuire.Alte exemple de vectori.Fagul P1 poate integra pasageri de pn la 100 kb.Vectorul PAC (P Artificial Chromosome, vector derivat de la fagul P1, de unde derivnumele) poate integra pasageri de pn la 300 kb.Vectorul BAC (Bacterial Artificial Chromosome, vector derivat de la bacterii de unde deriv numele) poate integra pasageri mai mari de 300 kb.Vectorul de clonare YAC (Yeast Artificial Chromosomes).Vectorul YAC se aseamn cu cromozomii normali ai eucariotelor, avnd un centromer (cen) ce mparte cromozomul n dou brae ce poart marcheri de selecie cum ar fi trp1, ntr-un bra i ura 3 n cellalt bra, precum i originea replicrii (ars1 sau autonomouslyreplicating sequence), iar la capete sunt prezeni telomerii (tel),(fig.3.1). Vectorul YAC are n

Figura 3.1. Prezentarea schematic a unui vector YAC.39jur de 10 kb i este meninut sub form circular, ca orice plasmid. n momentul utilizrii, pentru integrarea pasagerului, este tiat n dou cu o anumit enzim de rstricie. Un astfel de vector poate integra pasageri de pn la 1 MB (1000 kb) n zona MCS.Vectorii monocatenari sunt derivai de la virusurile monocatenare (M13, f1, fd) care sunt virusuri filamentoase care infecteaz bacteriile E. coli cu pili. Vectorii au n jur de 6,5 kb i nu au limite pentru mpachetare, n ceea ce privete dimensiunea pasagerului. Acetia au utilizri speciale pentru secvenierea ADN-ului prin metoda dideoxi sau pentru mutageneza dirijat.

Fagemidele au dou origini ale replicrii, una derivat de la fagul f1, i alta derivat de la plasmida bacterian ColE1, de unde i deriv i numele. Ca exemplu citm vectorul Bluescript II, vector ce poate funciona ca vector de clonare plasmidial sau ca vector monocatenar. Pe lng aceasta polilinkerul sau MCS-ul se gsete n secvena genic lacZ mrginit la cele dou capete de promotorii fagilor T3 i T7 astfel c genele pasager se pot exprima sau nu n funcie de orientarea acestora fa de un anumit promotor.Phasmidele rezult n urma inseriei unei plasmide n fagul la situsul att (lifting) pe baz de crossing over. Un astfel de vector este vectorul ZAP, foarte complex, vector ce poart secvene att de la fagul ct i de la fagii M13, T3 i T7.Pentru alegerea vectorului de clonare se ine cont de anumii factori i anume:Dimensiunea vectorului i pasagerului;Organismul ce urmeaz a fi transformat;Markerii de selecie disponibili;Metoda utilizat pentru selecia celulelor gazd ce poart un anumit pasager;Numrul de transformani dorii i eficiena transformrii;Preferina personal i experiena cercettorului.Fiecare vector are avantajele i dezavantajele n legtur cu factorii menionai.n cazul plasmidelor, ca avantaje menionm faptul c sunt de dimensiuni mici, uor de manipulat i poart un numr mare de marcheri de selecie. Ca dezavantaje se menioneaz dimensiunea relativ redus a pasagerului (pn la 15 kb), eficiena mai redus a transformrii n cazul pasagerilor mai mari i izolarea mai dificil a recombinanilor.n cazul fagilor ca avantaje menionm dimensiunea mai mare a pasagerului (pn la23 kb n cazul vectorilor de nlocuire), eficiena mare a infeciei celulelor utilizate n mod natural ca gazd, ncapsidarea presupune o selecie a dimensiunii pasagerului i izolarea mai40uoar a recombinanilor. Ca dezavantaje menionm transformarea (transfecia) mai dificil a altor organisme dect cele utilizate n mod natural ca gazd i faptul c pasagerii de dimensiuni mari sunt susceptibili la recombinri.n cazul cosmidelor ca avantaje menionm dimensiunea mai mare a pasagerului (pn la 45 kb) i faptul c mpachetarea (ncapsidarea n vitro) presupune o selecie a dimensiunii pasagerului. Ca dezavantaje menionm faptul c pasagerii de dimensiuni mari sunt susceptibili la recombinri i de asemenea este relativ dificil din punct de vedere tehnic s izolezi pasageri de dimensiuni mari.a. Obinerea pasagerului.Pasagerul poate fi obinut pe mai multe ci: prin digestia ADN-ului genomal de la donor cu enzime de restricie; prin reverstranscrierea ARN-ului mesager i obinerea cADN- ului; prin amplificare PCR sau prin sintez artificial.Enzimele de restricie sunt enzime produse de plasmidele bacteriene i sunt capabile de a tia specific ADN-ul, la nivelul unor situsuri de restricie. De exemplu enzima EcoRIpoate tia ADN-ul la nivelul secvenei:felul:

ntre baza azotat G i A. n acest fel vor rezulta capete adezive monocatenare 5`, deEnzima de restricie PstI produs de bacteria Providencia stuarti produce capete monocatenare adezive 3`, deoarece n cadrul situsului de restricie pe care l recunate(CTGCAG) taie monocatena 5`-3` ntre A i G.Enzima de restricie SmaI produs de bacteria Seratia marcescens produce capete bicatenare bonte, deoarece n cadrul situsului de restricie pe care l recunoate (CCCGGG) taie ambele catene ce sunt complementare ntre C i G. La fel se ntmpl i n cazul enzimei de restricie HaeIII produs de bacteria Haemophilus aegyptius care n cadrul situsului de restricie pe care l recunoate (GGCC) taie ambele catene ntre G i C.b. Integrarea pasagerului n vector i obinerea ADN-ului recombinant.Pasagerul este integrat n vector n funcie de modul de obinere a acestuia.41n cazul n care pasagerul este obinut cu enzime de restricie, vectorul trebuie tiat cu aceiai enzim de restricie pentru a forma i acesta capete adezive monocatenare, complementare. Ca urmare pasagerul se integreaz n vector pe baza complementaritii bazelor capetelor adezive a pasagerului i vectorului, dup care urmeaz legarea covalent a pasagerului n cadrul vectorului sub aciunea enzimei ADN ligaza (figura 3.2).

Figura 3.2: Integrarea pasagerului n vector pe baza complementaritii capetelor monocatenare adezive (dup Suzuki i colab., 1986)Dac enzima de restricie a produs capete bicatenare bonte integrarea pasagerului n vector este mult mai puin eficient i se realizeaz n prezena ADN ligazei. Pentru sporirea eficienei integrri se pot crea secundar capete monocatenare adezive complementare la pasager i vector. Acest lucru se pateu face n trei moduri:Adiionarea unor linkeri la capetele bonte cu ajutorul ADN ligazei, linkeri ce reprezin secvene scurte de ADN sintetizate artificial ce poart un anumit situs de restricie. Dup adiionare urmeaz digestia cu enzima de restricie specific n urma creia rezult capete monocatenare adezive complementare la vector i pasager.Adiionarea unor adaptori la capetele bonte cu ajutorul ADN ligazei, adaptori ce reprezint secvene scurte de ADN sintetizate artificial, secvene ce poart capete42monocatenare adezive specifice unei anumite enzime de restricie. Menionm faptul c capetele monocatenare 5` ale adaptorilor trebuie s fie defosforilate pentru a nu exista riscul s se cupleze ntre ei.Adiionarea la capetele 3` a pasagerului i vectorului a unor cozi homopolimere complementare cu ajutorul transferazei terminale din timus de viel (Figura 3.3) .

Fig. 3.3. Adiionarea la capetele 3` a pasagerului i vectorului a unor cozi homopolimere complementare (dup Suzuki i colab.,1986)43Astfel de capete monocatenare se pot obine prin digestie cu enzima Pst I sau prin digestia capetelor 5` graie funciei exonucleazice 5`-3` a ADN polimerazei. n acest caz capetele homopolimere ale pasagerului i vectorului se cupleaz pe baz de complementaritate dar mai rmn goluri care vor fi umplute cu ajutorul ADN polimerazei n prezena celor patru dezoxinucleotid trifosfat prezente n mediu. n final legarea covalent dintre pasager i vector se face n prezena AND ligazei.n cazul n care pasagerul este obinut prin reverstransciere sub form de ADNc(complementar) este posibil clonarea direcional a acestuia (Lessard et.al, dup Clarck1997), ntr-o anumit poziie fa de promotor. Aceast situaie este deosebit de favorabil n contextul strategiei antisens.Se pleac de la ARNul mesager, ARN ce poart la captul 3`, n cazul eucariotelor, cozi poli A (figura 3.4).

Fig.3.4. Integrarea direcional a pasagerului n vector n vederea clonrii direcionale (dup Clark, 1997)44Mai nti se hibridiaz cozile poli A cu un primer poli T, primeri ce poart i o secven ce corespunde unui situs de restricie specific unei enzime de restricie (s spunem R1). Urmeaz sinteza unei monocatene de ADNc, plecnd de la primer, n prezena celor patru dNTPuri (dezoxi nucleotid trifosfat) i a reverstranscriptazei. Odat cu ndeprtarea catenei de ARNm sub aciunea ARNazei H ale loc sinteza celei de a doua catene complementare ADNc, n prezena ADN polimerazei I i a celor patru dNTPuri, dup modelul nick translation. Urmeaz adiionarea de adaptori n prezena ADN ligazei T4, adaptori ce poart capete monocatenare adezive specifice unei alte enzime de restricie (s spunem R2). Dup digestia cu enzima de restricie specific situsului de restricie R1, va rmne pasagerul flancat de capetele monocatenare adezive specifice pentru cele dou enzime de restricie (R1 i R2), fapt ce permite integrarea pasagerului ntr-un vector, ntr-o anumit poziie fa de promotor. Evident c, n acest scop, vectorul trebuie tiat la nivelul MCSului cu enzimele de restricie care s corespund orientrii dorite a pasagerului fa de promotor.Mulimea de pasageri integrai n cte un vector constitue n acest caz o banc de gene ADN genomal. Dac pasagerul a fost obinut prin reverstranscriere va rezulta o banc de gene ADNc. Bncile de gene se mai pot diferenia i dup felul vectorului astfel putem avea bnci de gene plasmidiale, bnci de gene YAC .a.Clonarea pasagerilor obinui prin amplificare PCR prezint cteva caracteristici. n primul rnd este vorba de clonarea unui anumit fragment amplificat i nu se mai poate vorbi de o banc de gene. Aceeai situaie este valabil i n cazul n care pasagerul a fost obinut prin sintez artificial. n al doilea rnd pasagerul poart, de regul, la captul 3` o nucleotid cu Adenin, nucleotid adugat de enzima taq polimeraza fr a exista matri la nivelul secvenei ADN de amplificat , cum s-ar spune din greeal. Alte polimeraze nu au un astfel de efect. Aceast greeal poate fi corectat prin eliminarea nucleotidei (blantare) sau poate fi exploatat prin utilizarea unor vectori T-A, la care,la captul 3` , a fost adugat o nucleotid cu Timin. n acest fel, pe baza complementaritii T-A eficiena integrrii pasagerului n vector este foarte bun. Exist kituri cu astfel de vectori cum ar fi vectorul pGMT. utilizat de Botez i colab., 2002. De menionat c produsul de amplificare trebuie utilizat proaspt, deoarece un produs mai vechi, ngheat i dezgheat de mai multe ori, poate pierde extranucleotida cu Adenin.d.Introducerea AND-ului recombinant n celula gazd se realizeaz difereniat n funcie de felul vectorului i dimensiunea pasagerului. n cazul plasmidelor, ce poart pasageride dimensiuni relativ mici, introducerea se realizeaz printr-un proces cunoscut de45transformare bacterian. n cazul fagilor are loc un proces de infecie. n cazul vectorilor YAC ce poart pasageri de dimensiuni foarte mari se utilizeaz polietilenglicolul (PEG) sau se practic electroporarea. Celula gazd trebuie s fie o form mutant, lipsit de funcia de restricie (restr-), modificare (mod-) i recombinare (rec-) pentru a nu degrada, inactiva prin metilare sau rearanja prin recombinare ADNul utilizat ca pasager.Bncile de gene se conserv, de regul, dup introducerea ADNului recombinant n celula gazd. Dimensiunea bncii de gene ADN genomal, sau numrul de coloni N necesare, n cazul cnd gazda este o bacterie, pentru a avea o anumit probabilitate p ca un pasager de o anumit dimensiune x,exprimat n kb, s se regseasc n banca de gene estedat de relaia:N = ln(1 p)ln(1 x )yn care y este mrimea genomului haploid exprimat tot n kb.relaia:

n cazul bncilor de gene ADN complementar, dimensiunea acestora este dat deN = ln(1 p)ln(1 n)n care n reprezint fracia de ARNul mesager specific, ce vreau s-l clonez, fa detotal ARN mesager.e. Selecia celulelor gazd ce poart pasagerul integrat n vector.Selecia celulelor gazd ce poart pasagerul integrat n vector se realizeaz graie inactivrii de inserie ce presupune inactivarea genei marcher n urma integrrii pasagerului n aceasta. Reamintim faptul c situsul de restricie sau situsurile de restricie multiple (MCSurilke) se gsesc n anumite gene marcher. Prin integrarea pasagerului marcherii se inactiveaz.

n cazul vectorului plasmidial pBR322 dac integrarea pasagerului se face n gena marcher TcR ce asigur rezistena la tetraciclin, celulele transformate, purttoare a pasagerului, vor fi sensibile la tetraciclin. Pentru a putea izola aceste celule se procedeaz n felul urmtor :De la cultura mam, original, se fac dou replici a bncii de gene prin preluarea coloniilor pe o hrtie de filtru i plasarea lor pe mediu de selecie, primul mediu este cu46ampicilin iar al doilea mediu este cu ampicilin i tetraciclin. Pe mediu cu ampicilin vor supravieuii toate coloniile transformate, att cele transformate numai cu vector ct i cele transformat cu vector i pasager. Pe al doilea mediu vor supravieui doar coloniile transformate cu vector. Cele transformate cu vector i pasager vor pieri deoarece gena pentru rezistena la tetraciclin a fost inactivat. Pe aceast baz se revine la cultura mam i se izoleaz coloniile care au pierit pe al doilea mediu de selecie (Figura 3.5).

Figura 3.5. Clonarea n plasmide (dup Qutier i colab., 1988).47La fel se procedeaz i n cazul cosmidelor dac poart acelai marcher (Fig.3.6)

Figura 3.6:Clonarea n cosmide (dup Qutier i colab., 1988)Dac integrarea pasagerului s-a fcut n gena de rezisten la ampicilin, izolarea celulelor gazd transformate cu pasager integrat n vector se realizeaz pe baza unei reacii de culoare. Menionm faptul c gena de rezisten la ampicilin codific o enzim, beta lactamaza, care pe lng faptul c asigur rezistena inactivnd ampicilina, poate transforma penicilina n acid peniciloic care poate fixa iodul. Ca urmare pe un mediu de cultur cu penicilin, amidon i iodur de potasiu, coloniile transformate doar cu vectorul, deci cu genade rezisten la ampicilin activ, vor fi albe , iodul ce ar trebui s produc culoarea albastr48fiind fixat de acidul peniciloic. Coloniile transformate cu pasagerul integrat n vector, deci cu gena de rezisten inactivat, vor fi albastre. Cu acestea se va merge mai departe.n cazul vectorului plasmidial pUC 18 pentru izolarea coloniilor transformate cu pasager integrat n vector se utilizeaz, de asemenea, o reacie de culoare. n acest caz MCSul pentru integrarea pasagerului se gsete n gena lacZ+ responsabil de producerea peptidei, ce reprezin prima parte a unei enzime ( galactozidaza) enzim care produce o reacie de culoare albastru n prezena unui anumit substrat cromogen (Xgal) i a unui agent inductor(IPTG sau Izo Propil Thio Galactozida). Celulele gazd ce urmeaz a fi transformatesunt forme mutante ce sunt capabile s produc a doua parete a enzimei (s spunem peptida). Coloniile transformate doar cu vectorul vor fi albastre, deoarece, n celula gazd, vor exista ambele pri ale enzimei i deci enzima galactozidaza va fi funcional. Coloniile transformate cu pasagerul integrat n vector vor fi albe deoarece prin integrarea pasagerului ngena lacZ+ aceasta a fost inactivat iar prima parte a enzimei lipsete. Deci cu coloniile albese va merge mai departe.n cazul vectorului plasmidial pJET integrarea pasagerului se face ntr-o gen letal ce poate determina moartea celulelor gazd. Datorit inactivrii genei letale doar celulele gazd transformate cu pasagerul integrat n vector vor supravieui, i cu acestea se va merge mai departe. Un astfel de vector a fost utilizat pentru clonarea unor benzi polimorfe RAPD, presupuse a marca gene de rezisten la Phytophthora infestans, agentul patogen ce produce mana la cartof (Balazs i colab., 2010).n cazul vectorului gt10, vector de inserie derivat de la fagul , inseria pasagerului se face n gena cI, responsabil de producerea represorului ce mpiedec intrarea n ciclul litic i deci producerea unor plaje de liz . Prin itegrarea pasagerului n aceast gen nu se mai produce represor iar fagi intr n ciclul litic producnd plaje de le liz, mai ales dac celulele gazd sunt hfl (high frequency lysogeny). Cu acestea se merge mai departe.n cazul vectorului Charon16A, de asemenea vector de inserie derivat de la fagul , integrarea pasagerului se face n gena lacZ responsabil de producerea galactozidazei care, n cazul celulelor gazd E.coli mutante (lac-) i n prezena substratului cromogen Xgal, produce colonii albastre. n cazul integrrii pasagerului gena lacZ este inactivat iar coloniile vor fi albe. Cu acestea se merge mai departe.n cazul vectorului de nlocuire EMBL3 se poate face o selecie pozitiv a celulelor gazd ce poart ADN recombinant prin faptul c doar n urma nlocuirii secvenei stuffer cu49pasagerul, vectorul se transform din fag Spi+, sensibil la inhibiia produs de fagul P2 lizogen cu celulele gazd, fag ce nu poate infecta aceste celule , n fag Spi- insensibil la aceast inhibiie care va putea infecta celulele gazd. Cu acesta se merge mai departe.f. Selecia celulelor gazd ce poart pasagerul dorit se poate realiza, de regul, prin hibridare molecular sau prin metode imunologice. Exist i alte tehnici cum ar fi transposon tagging (Erik i colab., 1994), T-DNA tagging (Schulz i colab., 1994), map based cloning (chromosome walking) mpreun cu testul de complementaritate sau tehnici care se bazeaz pe exprimarea difereniat a genelor la nivelul ARNului mesager cum ar fi differential screening ( Leyser i Chang, 1996). Unele dintre aceste tehnici au fost prezentate n partea de genetic molecular.n cazul hibridrii moleculare s considerm o banc de gene a fagului , obinut cu vectorul gt10 (Fig. 3.7) .Fiecare fag poart, probabil o alt gen i formeaz cte o plaj de liz vizibil ntr-o cultur bacterian sub forma unei pete clare. Aceste plaje urmeaz a fi transferat pe o membran de nitroceluloz. Dup denaturarea ADNului se procedeaz la hibridarea molecular a acestuia cu o sond, eventual radioactiv, ce reprezint o secven ADN, de asemenea monocatenar, complementar genei pe care dorim s o izolm. Prin autoradiografie se depisteaz poziia plajei de liz ce poart gena de interes iar din cultura iniial se izoleaz aceast plaj ce poart fagii ce au integrat gena de interes. n continuare gena izolat, urmeaz a fi multiplicat, deci clonat, odat cu fagii. Se pot utiliza i sonde neradioactive sau reci cum ar fi sistemul cu digoxigenin sau biotin (Karcher,S.J., 1994).Tehnica transposon tagging pentru izolarea i clonarea genelor se bazeaz tot pe hibridarea molecular doar c n acest caz sonda utilizat este reprezentat de un transposon integrat n cadrul genei pe care urmeaz s o clonm.Transpzonii sunt elemente genetice mobile descoperite de ctre Barbara McClintock n1946 la porumb (citat de Roberts, 1996). Transposonii au capacitatea de a-i schimba poziia n cadrul genomului, fenomen numit transpoziie. Transposonii sunt peste tot rspndii n lumea vie, att la procariote ct i la eucariote, att la plante ct i la animale. Mai mult studiai au fost transposonii de la porumb i gura leului (Antirrhinum majus) care determin, prin transpoziie, variegarea culorii boabelor sau a florilor. Exist dou categorii de elemente genetice mobile dup mecanismul lor de transpoziie: elemente genetice mobile care setranspozeaz via ADN, numii n mod curent transposoni, i elemente genetice mobile care se50transpozeaz via ARN intermediar, numii retrotranspozoni. Structural se difereniaz prin faptul c n cazul transpozonilor zona centarl ce codific transpozaza este delimitat de secvene repetitive inversate (IR) n timp ce n cazl retrotransposonilor, zona central ce codific i reverstranscriptaza este delimitat de secvene repetitive directe, neinversate (LTR). Cteva exemple de elemente genetic