Sublethal Stress in Escherichia Coli a Function of Salinityt

8/10/2019 Sublethal Stress in Escherichia Coli a Function of Salinityt

1/6


2/6

1 1 4 8

ANDERSON, RHODES,

N KATOR

w e r e

h a r v e s t e d

b y

c e n t r i f u g a t i o n

( 1 , 0 0 0

x

g )

a t

r o o m

t e m p e r a t u r e

f o r 1 0

m i n

a n d

w a s h e d

t h r e e t i m e s

i n

p h o s p h a t e - b u f f e r e d

w a t e r

( p H

7 . 2 ) .

C e l l s

w e r e

r e s u s -

p e n d e d t o a n

o p t i c a l d e n s i t y

a t

5 4 0

nm

( O D s 0 )

o f

0 . 2

t o

0 . 3 i n s e a w a t e r

( p H

7 . 4 t o

7 . 6 )

o f s e l e c t e d

s a l i n i t i e s .

S e a w a t e r

e x p e r i m e n t s .

A

1 0 - f o l d d i l u t i o n

o f

t h e

f i n a l

w a s h e d c e l l

s u s p e n s i o n

was

made i n 9 0

m l

o f

s e a w a t e r

p r e v i o u s l y

e q u i l i b r a t e d

t o t h e

t e s t

t e m p e r a -

t u r e

i n

1 2 5 - m l

s t e r i l e

s c r e w - c a p p e d

f l a s k s .

S e a w a t e r

a t

s e l e c t e d

s a l i n i t i e s w a s

p r e p a r e d

b y

d i l u t i n g

a g e d ,

f i l -

t e r e d o c e a n w a t e r

( 3 5 o )

w i t h r e v e r s e

o s m o s i s - g l a s s -

d i s t i l l e d

w a t e r

a n d

s t e r i l i z e d

b y

a u t o c l a v i n g .

S e a w a t e r

f r o m

t h e m i d- At l a n t i c c o n t i n e n t a l

s h e l f

was t h e

s o l e

s o u r c e

f o r a l l

p r o c e d u r e s .

S a m p l e s

w e r e

r e m o v e d

a f t e r

v a r i o u s t i m e i n t e r v a l s f o r e n u m e r a t i o n

b y s p r e a d

p l a t -

i n g

o n

T S A , d e t e r m i n a t i o n

o f

E D T ,

a n d

i n d u c t i o n o f

, B - g a l a c t o s i d a s e .

M e d i a u s e d f o r b o t h EDT

a n d

, B - g a -

l a c t o s i d a s e

s t u d i e s i n c l u d e d

E C ,

medium

A - 1

( 1 ) ,

a n d

T r y p t i c a s e s o y

b r o t h

( T S B ) . F o r e n z y m e

s t u d i e s ,

T SB

w a s

m o d i f i e d

t o c o n t a i n l a c t o s e i n s t e a d o f

g l u c o s e .

A l l

t e s t s

w e r e r u n a t

4 4 . 5 C . C o l o n y

c o u n t s w e r e

m a d e

a f t e r c a .

2 4

h

o f

i n c u b a t i o n

a t

3 5 C .

T o t a l

e x p o s u r e

t i m e

t o s e a w a t e r

b e f o r e z e r o

t i m e

s a m p l i n g

r a n g e d

f r o m

2

t o 5

m i n , w h e r e a s

e x p o s u r e

t i m e t o m e d i a a t

4 4 . 5 C

b e f o r e d i l u t i o n

f o r

p l a t e

c o u n t s w a s

l e s s t h a n

3 0 s .

D e t e r m i n a t i o n

o f EDT.

I n s t r u m e n t a t i o n f o r

d e -

t e r m i n i n g EDT

c o n s i s t e d

o f

a

t e s t t u b e

( 2 5

b y 1 0 0

mm)

c o n t a i n i n g

t w o

p l a t i n u m e l e c t r o d e s

a n d

1 8

m l

o f

m e d i u m t o

w h i c h

2

m l

o f

E .

c o l i - s e e d e d s e a w a t e r w a s

a d d e d .

T u b e s

w e r e f i t t e d

w i t h

a

n o .

4 r u b b e r

s t o p p e r

c o n t a i n i n g

e l e c t r o d e s o f

g r a d e

A

p l a t i n u m

a l l o y w i r e ,

2 4

g a u g e ( 0 . 5 0 8

mm)

( E n g e l h a r d

I n d u s t r y ,

C a r t e r e t ,

N . J . ) . E l e c t r o d e s

w e r e i n s e r t e d

i n t o

s l i t s

made i n

t h e

s t o p p e r , a n d

t h e s t o p p e r

w a s b o u n d w i t h

w i r e

o r

e p o x y

o r b o t h

t o p r e v e n t

e l e c t r o d e

s l i p p a g e .

E l e c t r o d e s

w e r e

d e s i g n e d

s u c h

t h a t t h e

r a t i o o f t h e i r

l e n g t h s b e l o w t h e

s u r f a c e o f t h e

medium

w a s

c a . 1 : 4 .

S t e r i l i z a t i o n

w a s b y

f l a m i n g

o v e r a n

a l c o h o l

l a m p .

T h e

l o n g e r

e l e c t r o d e

w a s c o n n e c t e d

t o t h e

n e g a t i v e

t e r m i n a l

a n d t h e

s h o r t e r

o n e

w a s

c o n n e c t e d

t o t h e

p o s i t i v e

t e r m i n a l

o f

a s t r i p

c h a r t

r e c o r d e r

( m o d e l

1 9 4 ,

H o n e y w e l l I n d u s t r i a l

D i -

v i s i o n ,

F o r t

W a s h i n g t o n ,

P a . ;

m o d e l

S R - 2 0 4 ,

H e a t h

C o . ,

B e n t o n

H a r b o r , M i c h . ; o r m o d e l

3 2 0 , S a n b o r n

C o . ,

W a l t h a m ,

M a s s . ) . EDT

w a s

m e a s u r e d a s t h e

t i m e

e l a p s e d

b e t w e e n

c h a l l e n g e

a n d t h e

maximum

c h a n g e

i n

p o t e n t i a l .

, 8 - G a l a c t o s i d a s e a s s a y .

C e l l s

e x p o s e d

t o

s e a w a t e r

f o r

v a r i o u s

t i m e

i n t e r v a l s

w e r e d i l u t e d

1 0 - f o l d i n t o

E C ,

medium

A - 1 , a n d

T S B , e a c h

c o n t a i n i n g

0 . 5

l a c t o s e .

A f t e r 1 5 0

m i n

o f i n d u c t i o n ,

t w o 1 0 - m l

p o r t i o n s

w e r e

f i l t e r e d

t h r o u g h

25-mm

N u c l e p o r e f i l t e r s

( 0 . 4 , u m )

w i t h

1 0 - m l

h y p o d e r m i c s y r i n g e s

e q u i p p e d

w i t h

S w i n n y

a d a p t e r s . O n e

p o r t i o n

w a s

w a s h e d o n c e w i t h p h o s -

p h a t e - b u f f e r e d

w a t e r

c o n t a i n i n g

m a g n e s i u m

s u l f a t e

( 0 . 1 3

g / l i t e r )

a n d

a s s a y e d

b y t h e

o - n i t r o p h e n y l - , 8 - D -

g a l a c t o p y r a n o s i d e

(ONPG) m e t h o d ( 1 5 ) .

The

s a m p l e

w a s

r e s u s p e n d e d i n

1

m l

o f a

t r i s ( h y d r o x y -

m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e

( T r i s ) - m a g n e s i u m

s u l f a t e

b u f f e r

( T r i s , 0 . 0 1 M ;

MgSO4 7 H 2 0 ,

0 . 0 1

M ;

N a C l , 0 . 0 5

M ; a d j u s t e d

t o

pH 7 . 4 ) .

A f t e r a d d i t i o n

o f 1

d r o p o f

t o l u e n e ,

t h e

s a m p l e

w a s

b l e n d e d i n a

v o r t e x

m i x e r a n d

i n c u b a t e d

a t

3 5 C

f o r

3 0

m i n . A

0 . 2 - m l

a m o u n t o f

ONPG

( 0 . 1 3

M

i n

T r i s - m a g n e s i u m b u f f e r ,

pH

7 . 4 ) w a s

a d d e d ,

a n d t h e

s a m p l e

w a s i n c u b a t e d

a t 2 8 C

u n t i l

a

y e l l o w

c o l o r

d e v e l o p e d .

The

r e a c t i o n w a s

s t o p p e d

b y

a d d i t i o n

o f 0 . 5 m l

o f 1 M

N a 2 C O 3 .

O D w a s

m e a s u r e d

a t

b o t h 5 5 0

a n d 4 2 0 n m w i t h

a B a u s c h

a n d Lomb

S p e c t r o n i c

7 0 . O n e

u n i t o f

e n z y m e

w a s d e f i n e d

a s t h e

amount

o f

e n z y m e

t h a t

r e l e a s e d

1

n m o l

o f

o - n i t r o p h e -

n o l

p e r

m i n

a t

2 8 C , pH

7 . 4 .

E n z y m e

u n i t s

w e r e

c a l c u l a t e d

f r o m

t h e

e q u a t i o n e n z y m e

u n i t s =

[ O D 4 2 0

-

( 1 . 6 5

O D 5 5 o ) ] / [ ( t i m e

o f

i n c u b a t i o n ,

m i n u t e s )

( 0 . 0 0 7 5 ) ] .

The

s e c o n d

1 0 - m l

p o r t i o n

w a s

a s s a y e d f o r

p r o t e i n

b y

t h e

m e t h o d o f

L o w r y e t a l .

( 1 1 ) .

The

s a m p l e w a s

w a s h e d

t w i c e w i t h

p h o s p h a t e - m a g n e s i u m

s u l f a t e

b u f f e r a n d

r e s u s p e n d e d

i n

1

m l

o f

1

N NaOH

b e f o r e

a s s a y .

A

s t a n d a r d c u r v e

f o r

p r o t e i n

w a s

d e v e l o p e d

w i t h s e r u m

a l b u m i n

( 1

m g / m l

i n

w a t e r ) .

D i l u t i o n s

o f

s e r u m

a l b u m i n w e r e

made i n

0 . 1

N

NaOH.

E n z y m e

s p e c i f i c

a c t i v i t y

w a s

d e f i n e d a s

e n z y m e

u n i t s

p e r

m i -

c r o g r a m

o f

p r o t e i n .

S t a n d a r d

c u r v e s

and

d a t a

a n a l y s i s .

The r e l a -

t i o n s h i p o f E DT t o

i n o c u l u m

d e n s i t y

f o r

u n s t a r v e d

c e l l s w a s d e t e r m i n e d

w i t h

E C ,

A - 1 ,

a n d

T SB

m e d i a .

T e n f o l d d i l u t i o n s

o f a n E .

c o l i

s u s p e n s i o n ,

p r e p a r e d a s

d e s c r i b e d

f o r s e a w a t e r

e x p e r i m e n t s ,

w e r e made

i n

2 5 o

s e a w a t e r

a t

2 0 C .

E x p o s u r e

t o s e a w a t e r n e v e r

e x -

c e e d e d

5

m i n .

A f t e r

s a m p l e s f o r i n i t i a l v i a b l e

c o u n t s

w e r e

r e m o v e d , d i l u t i o n s w e r e i n o c u l a t e d

i n t o

e a c h

t e s t

medium a n d

i n c u b a t e d

a t

4 4 . 5 C f o r

d e t e r m i n a t i o n

o f

EDT. A

minimum o f 1 8 E DT

m e a s u r e m e n t s

w e r e

p e r f o r m e d t o

c o n s t r u c t a s t a n d a r d c u r v e

f o r e a c h

t e s t

m e d i u m .

D a t a w e r e

a n a l y z e d b y

a l i n e a r

l e a s t - s q u a r e s

r e g r e s s i o n

t e c h n i q u e w i t h

a

9 5

c o n f i d e n c e

i n t e r v a l

( 1 6 ) .

S t a n d a r d

c u r v e

d a t a w e r e

u s e d a s f o l l o w s .

D u r i n g

e x p o s u r e

o f c e l l s

t o

s e a w a t e r

( s t a r v a t i o n ) ,

s a m p l e s

w e r e

r e m o v e d a t t i m e d

i n t e r v a l s

f o r

d e t e r m i n a t i o n

o f

v i a b l e

c o u n t s

( T S A ) a n d E DT i n

t e s t m e d i a .

V i a b l e

c o u n t s

w e r e u s e d t o d e r i v e a

p r e d i c t e d

EDT

f r o m t h e

a p p r o p r i a t e s t a n d a r d

c u r v e . D i f f e r e n c e s

o b t a i n e d

b y

s u b t r a c t i o n o f

t h e

p r e d i c t e d

f r o m

t h e o b s e r v e d

v a l u e s

w e r e p l o t t e d

f o r

e a c h

t e s t medium a s

a f u n c t i o n

o f

e x p o s u r e

t i m e i n

s e a w a t e r .

R E SUL T S

E f f e c t

on

v i a b i l i t y .

S u r v i v a l

s t u d i e s

o f

E .

c o l i i n

s e a w a t e r o f

s e l e c t e d

s a l i n i t i e s ( T a b l e

1 )

i n d i c a t e d

t h a t

d e c r e a s i n g s a l i n i t y w a s

a c c o m p a -

n i e d

b y

i n c r e a s i n g s u r v i v a l . A t

s a l i n i t i e s o f

1 5

a n d

3 0 o ,

maximum

l o s s i n

v i a b i l i t y

o c c u r r e d

d u r i n g t h e

f i r s t 2

d a y s

o f

e x p o s u r e ,

w h e r e a s a t

1 0 o

t h e d e a t h

r a t e

was

a p p r e c i a b l y s l o w e r .

E f f e c t

on EDT.

S t a n d a r d

c u r v e

d a t a

( T a b l e

2 )

w e r e

u s e d

t o

e v a l u a t e t h e

r e s p o n s e s o f

s t a r v e d

c e l l

p o p u l a t i o n s

u p o n

t r a n s f e r t o

m e d i a a t

4 4 . 5 C .

S t r e s s ,

d e f i n e d a s

o b s e r v e d

m i n u s p r e -

d i c t e d

EDT, w a s

a

f u n c t i o n o f

b o t h

s a l i n i t y a n d

t e s t

medium

( F i g .

1 ) .

G e n e r a l l y ,

maximum

s t r e s s

d e v e l o p e d e a r l y

d u r i n g

t h e

s t a r v a t i o n p e r i o d a n d

s u b s e q u e n t l y d e c r e a s e d o r

r e m a i n e d

c o n s t a n t

a f t e r e x t e n d e d

e x p o s u r e . Maximum

d e l a y i n d e -

t e c t i o n

t i m e

o c c u r r e d

i n

EC

medium a f t e r

e x -

p o s u r e

t o

3 0 o

s e a w a t e r .

Medium A - 1 w a s

s u -

A P P L . E N VI R ON . M I C R O B I O L .


3/6

DETECTION OF SUBLETHAL S T R E S S IN E .

COLI

1 1 4 9

p e r i o r

t o EC

i n

e n u m e r a t i n g s t r e s s e d

E .

c o l i a n d

w a s a s

e f f e c t i v e

a s T S B . D i f f e r e n c e s i n

e n u m e r -

a t i o n

e f f i c i e n c y

f o r t h e t h r e e

m e d i a

w e r e

m o s t

o b v i o u s

e a r l y

i n t h e s t a r v a t i o n

p e r i o d

a n d

d i -

m i n i s h e d

w i t h e x t e n d e d s t a r v a t i o n .

E f f e c t

on

g r o w t h r a t e . G r o w t h

r a t e s

o f E .

c o l i

i n d i f f e r e n t t e s t

m e d i a

w e r e m e a s u r e d w i t h

i n o c u l a

b e f o r e

a n d

a f t e r

s t a r v a t i o n

f o r v a r i o u s

t i m e i n t e r v a l s

i n 1 0

a n d

3 0 o

s e a w a t e r .

A s n o t e d

a b o v e , s o m e l o s s o f

v i a b i l i t y

o c c u r r e d d u r i n g

e x p o s u r e

t o

s e a w a t e r

( T a b l e

1 ) . A f t e r i n o c u l a -

t i o n i n t o

t e s t m e d i a , t h e r e w a s a n i m m e d i a t e

d i e - o f f

r e l a t e d t o d u r a t i o n o f

e x p o s u r e t o

s e a -

w a t e r , s a l i n i t y , a n d t e s t medium ( T a b l e

3 ) . D i e -

o f f

w a s

m o s t

p r o n o u n c e d w h e n c e l l s e x p o s e d t o

3 0 o s e a wa t e r w e r e

i n o c u l a t e d

i n t o

EC m e d i u m .

I n o c u l u m

r e d u c t i o n

w a s l e s s

e x t e n s i v e

i n m e -

d i u m

A - 1

a n d

n e g l i g i b l e

i n

T S B .

D i e - o f f

w a s

e v i d e n t a f t e r

o n l y 3 0

s o f

e x p o s u r e t o t h e

t e s t

m e d i u m . C e l l d e n s i t i e s

a t z e r o

t i m e

s h o w n

i n

F i g . 2

r e f l e c t e d b o t h

l o s s o f

v i a b i l i t y i n s e a w a t e r

a n d i m m e d i a t e d i e - o f f

u p o n

e x p o s u r e

t o

t h e

t e s t

m e d i u m a t 4 4 . 5 C . T h e r e a f t e r , n o o b v i o u s d i f -

f e r e n c e s i n

l a g

t i m e s o r

g r o w t h

r a t e s f o r

a n y

o f

t h e

i n o c u l a

w e r e

o b s e r v e d .

E f f e c t on

P - g a l a c t o s i d a s e

a c t i v i t y

a f t e r

TABLE 1 .

P e r c e n t

s u r v i v a l o f

E .

c o l i

i n

s e a w a t e r

a d j u s t e d

t o

s e l e c t e d

s a l i n i t i e s

S a l i n i t y

E x p o s u r e

S u r v i v a l '

M O

( d a y s )

1 0

2

1 0 0 . 6

5

8 7 . 6

8

5 3 . 5

1 5

2

2 7 . 9

5 1 1 . 7

8 7 . 1

2 5

2

8 . 6

5

5 . 1

8

4 . 3

3 0

2 1 . 7

5

0 . 7

8

2 . 0

a

B a s e d o n

z e r o

t i m e d e n s i t i e s

o f

E .

c o l i

i n s e a w a t e r

( c a .

1 0 7 c e l l s

n e r

m l ) .

E a c h

d a t a

p o i n t

r e p r e s e n t s

t h e

mean o f t w o

e x p e r i m e n t s .

i n d u c t i o n

i n T S B - l a c t o s e ,

medium

A - 1 ,

and

E C .

, B - G a l a c t o s i d a s e

s p e c i f i c a c t i v i t y

d e c l i n e d

w i t h i n c r e a s i n g s t a r v a t i o n

t i m e

a n d s a l i n i t y

( F i g .

3 ) .

I n

c e l l s e x p o s e d

t o 2 o

s e a w a t e r , enzyme

a c t i v i t y d e c r e a s e d s l i g h t l y i n

t h o s e c e l ls i n d u c e d

i n

T S B - l a c t o s e

a n d

not

i n

cells i n d u c e d

i n

EC or

medium A - 1 . Enzyme a c t i v i t i e s

d e c l i n e d

approx-

i m a t e l y 5 0 t o 80 a f t e r 7

d a y s i n

1 0 o seawater

r e g a r d l e s s

o f

i n d u c t i o n

m e d i u m . C e l l s s t a r v e d i n

3 0 o s e a w a t e r e v i d e n c e d

a

p r e c i p i t o u s d e c l i n e i n

s p e c i f i c a c t i v i t y i n a l l t h r e e

m e d i a .

DISCUSSION

C o n s i d e r a b l e

c o n t r o v e r s y r e m a i n s

c o n c e r n i n g

causes

f o r t h e

d i e - o f f o f

E . c o l i i n a q u a t i c e n v i -

r o n m e n t s . D i e - o f f

h a s

most

o f t e n

b e e n m e a s u r e d

b y

v i a b l e c o u n t

t e c h n i q u e s

e m p l o y i n g s t a n d a r d

E . c o l i

A

1 O 0 .

1 5 o

25 o

30 .

2

X

0

1 0

0

1 0

0

1 0

0

1 0

E . c o l i

B

10 o

3 0 0

E

JE

1

10

2 3

0 1 0

20

3 0

DAYS

I N

SEAWATER

F I G .

1 . I n c i d e n c e

o f

s t r e s s i n E .

c o l i

d u r i n g expo-

sure t o s e a w a t e r

as

measured

b y

t h e

e l e c t r o c h e m i c a l

d e t e c t i o n

m e t h o d . S t r e s s

was

d e f i n e d

as t h e

d i f f e r e n c e

b e t w e e n

o b s e r v e d

EDT i n t e s t

media

an d

p r e d i c t e d

EDT b a s e d on

s t a n d a r d

curves.

T he

p r e d i c t e d

EDT

was d e r i v e d

f r o m

a

l i n e a r

r e g r e s s i o n

l i n e based

on

t h e v i a b l e

c o u n t

i n t h e s e a w a t e r

s a m p l e .

TABLE

2 .

S u m m a r y o f

s t a n d a r d c u r v e d a t a

i n v a r i o u s

m e d i a a t

4 4 . 5 0 C

N o .

o f

sam-

D e t e c t i o n

t i m e

C o r r e l a t i o n

c o e f - 9 5

C o n f i -

T e s t

o r g a n i s m

T e s t m e d i u m

p l e s

S l o p e

i n t e r c e p t

f i c i e n t d e n c e

l i m i t s

( b )

E .

c o l i

A EC

2 0 - 1 . 2 3

1 0 . 9 4

- 0 . 9 9

0 . 5 0

T SB

2 2

- 1 . 0 4

9 . 8 5 - 0 . 9 7 + 0 . 5 6

E .

c o l i

B

EC

1 8

- 1 . 0 5 1 0 . 2 6 - 1 . 0 0

0 . 1 1

A - 1

1 8 - 0 . 8 0

8 . 1 1 - 1 . 0 0

0 . 1 3

T SB

1 8

- 0 . 9 2

8 . 9 9 - 1 . 0 0

0 . 2 2

V O L .

3 8 ,

1 9 7 9


4/6

1 1 5 0

ANDERSON,

R H O D E S ,

AND

KATOR

TABLE

3 .

D i e - o f f

o f

E .

c o l i B

i n

t e s t m e d i a

a t

4 4 . 5 C

a f t e r e x p o s u r e

t o

s e a w a t e r

S a l i n i t

E x p o s u r e

D i e - o f f ' i n :

( o ) ( d a y s )

EC

A - i

T SB

1 0

0

0 . 0 9 . 1

0 . 0

2

2 1 . 4 2 8 . 6

1 4 . 3

5

0 . 0

0 . 0 0 . 0

7

0 . 0

0 . 0 0 . 0

9

5 . 6

1 1 . 1

0 . 0

1 4 1 3 . 3 1 3 . 3

0 . 0

2 4

7 . 7 7 . 7

0 . 0

3 0 0

6 2 . 3 2 9 . 2

0 . 0

2

9 8 . 8 9 0 . 7

1 1 . 1

5 9 8 . 1

5 6 . 6

1 1 . 3

7

9 8 . 9

6 1 . 7 5 . 6

9 9 5 . 9

3 9 . 4

1 2 . 7

1 4

6 6 . 9

0 . 0 0 . 0

2 4

7 7 . 1

3 5 . 3

2 3 . 5

T h e

o c c u r r e n c e

o f

d i e - o f f

i n a

g i v e n

t e s t

medium

w a s d e t e c t e d

b y

c o m p a r i s o n

o f

v i a b l e

c o u n t s

( o n

T S A )

o f

E . c o l i

t a k e n f r o m

s e a w a t e r f o r

i m m e d i a t e

e n u m e r -

a t i o n a n d t h o s e e n u m e r a t e d a f t e r

a

3 0 - s

p a s s a g e

t h r o u g h

a

g i v e n

t e s t m e d i u m a t

4 4 . 5 C .

P e r c e n t

d i e -

o f f

=

[ 1

-

( v i a b l e

c o u n t f r o m

t e s t

m e d i u m / v i a b l e

c o u n t f r o m

s e a w a t e r ) ]

x

1 0 0 .

m e d i a .

R e c e n t l y ,

i t h a s

b e e n

n o t e d

t h a t

t h e

e n u m e r a t i o n

p r o c e s s

i t s e l f

may

b e

r e s p o n s i b l e

f o r

t h i s

a p p a r e n t

d i e - o f f

i n

n a t u r a l w a t e r s .

O l s o n

( 1 3 )

n o t e d

t h a t m o r e t h a n

h a l f o f

t h e w a t e r

s a m p l e s

f r o m

C a l i f o r n i a b e a c h e s

p r o d u c e d

f a l s e

n e g a t i v e s

i n

t h e s t a n d a r d

f e c a l

c o l i f o r m

m o s t

p r o b a b l e n u m b e r

t e s t ,

i . e . ,

g r o w t h

b u t

n o g a s i n

t h e

p r e s u m p t i v e p o r t i o n

o f

t h e t e s t

f o l l o w e d

b y

g r o w t h

a n d

g a s

p r o d u c t i o n

i n

b o t h

t h e

c o n f i r m e d

a n d

e l e v a t e d

t e m p e r a t u r e

p o r t i o n s o f

t h e t e s t .

T h e s e

r e s u l t s

s u g g e s t e d

t h a t

a

p r o p o r t i o n

o f t h e

f e c a l

c o l i f o r m s

i s o l a t e d

may

h a v e b e e n

s u b l e -

t h a l l y

d a m a g e d a n d ,

t h e r e f o r e , w o u l d b e

u n d e -

t e c t e d

b y

u s u a l


p r o c e d u r e s .

B i s s o n n e t t e

e t a l .

( 2 )

s u g g e s t e d t h a t

c o l i f o r m s

i n t r o d u c e d

i n t o

a n

a q u a t i c

e n v i r o n m e n t e x h i b i t

t h e

f o l l o w i n g

r e s p o n s e s :

d e a t h ,

s u r v i v a l

w i t h


p o s s i b l e

b y

s t a n d a r d

p r o c e d u r e s ,

a n d

s u b l e t h a l s t r e s s

f o l l o w e d

b y

d e a t h

i n

s t a n -

d a r d

e n u m e r a t i o n m e d i a .

S t r e s s e d c e l l s

w e r e

i d e n t i f i e d

b y

t h e i r

a b i l i t y

t o

g r o w o n a

n o n s e l e c -

t i v e , b u t

n o t

o n a s e l e c t i v e

m e d i u m .

S i m i l a r l y ,

K l e i n

a n d

Wu

( 1 0 ) d e t e c t e d

t h e p r e s e n c e

o f

s u b l e t h a l

s t r e s s

i n

b a c t e r i a

s t a r v e d

i n f r e s h w a t e r

b y

s u b j e c t i n g

t h e c e l l s

t o

a

t r a n s i e n t

w a r m i n g

s t r e s s

b e f o r e

p l a t i n g o n n u t r i e n t

a g a r .

W i t h

t h e

r e c o g n i t i o n

o f

s u b l e t h a l

s t r e s s , e f -

f o r t s

h a v e

b e e n

d i r e c t e d

t o w a r d

d e v e l o p m e n t

o f


p r o c e d u r e s

w h i c h r e t a i n

s e l e c t i v i t y

f o r

f e c a l

c o l i f o r m s

b u t

a l l o w r e c o v e r y o f

s t r e s s e d

c e l l s .

S t u a r t

e t a l . ( 1 8 )

d e v e l o p e d

a b i l a y e r

p l a t e

c o n t a i n i n g b o t h a s e l e c t i v e

a n d

a

n o n s e l e c t i v e

medium f o r

r e c o v e r y

o f

f e c a l

c o l i f o r m s s t r e s s e d

b y

t h e

a q u a t i c e n v i r o n m e n t .

S p e c k

e t a l .

( 1 7 )

d e v e l o p e d

a

s i m i l a r

b i l a y e r

p l a t i n g p r o c e d u r e f o r

e n u m e r a t i n g

i n j u r e d

c o l i f o r m s i n f r o z e n

f o o d s .

Many

w o r k e r s

h a v e

a t t e m p t e d

i n c o n c l u s i v e l y

t o e v a l u a t e

t h e

i n f l u e n c e

o f

s a l i n i t y o n E . c o l i

d i e - o f f

i n

m a r i n e

e n v i r o n m e n t s

( 5 , 7 , 1 4 ,

1 9 ) .

R a t h e r t h a n

e m p l o y i n g

a n a l l - o r - n o n e

r e s p o n s e

t o

d e t e r m i n e

t h e

e f f e c t o f s a l i n i t y , we

c h o s e

i n s t e a d

t o

m e a s u r e g r a d e d

r e s p o n s e s ,

i . e . ,

d e v e l -

o p m e n t

o f a n i n c r e a s e

i n p o t e n t i a l ,

e n z y m e

s p e -

c i f i c

a c t i v i t y ,

a n d

g r o w t h

r a t e

i n s e l e c t i v e

a n d

n o n s e l e c t i v e m e d i a .

I t

h a s

b e e n

o u r

e x p e r i e n c e

t h a t

s o u r c e ,

s t o r a g e

c o n d i t i o n s , a n d

c u l t u r a l

h i s -

t o r y

o f t h e

o r g a n i s m s

g r e a t l y

i n f l u e n c e d

t h e i r

r e s p o n s e t o

e x p e r i m e n t a l

s a l i n i t y r e g i m e s ( u n -

p u b l i s h e d

d a t a ) .

S u b l e t h a l

s t r e s s

w a s

m o s t

a p -

p a r e n t i n

f r e s h l y i s o l a t e d E . c o l i a s

o p p o s e d t o

i s o l a t e s s t o r e d

f o r

l o n g p e r i o d s

o f

t i m e e i t h e r

o n

s l a n t s

a t S o C

o r

i n

4 0

g l y c e r o l a t

- 5 C .

E .

c o l i

p r e g r o w n i n

a

r i c h

medium

( T S B ) a n d

t h e n

e x p o s e d

t o s e a w a t e r e x h i b i t e d a

f a s t e r ,

m o r e

e x t e n s i v e

d i e - o f f

when t e s t e d

i n

a

s e l e c t i v e

m e -

d i u m

( E C ) t h a n

d i d c e l l s

p r e g r o w n i n

a

m i n i m a l

m e d i u m .

G r a d e d r e s p o n s e s w e r e

m e a s u r e d

w i t h

t w o

s t a n d a r d s e l e c t i v e

m e d i a ,

EC

a n d

medium

A - 1

a t

4 4 . 5 0 C ,

t o m a x i m i z e

t h e

e x p r e s s i o n o f

s t r e s s .

T SB s e r v e d a s a

n o n s e l e c t i v e t e s t

medium

t o

m i n i m i z e

t h e

e x p r e s s i o n

o f

s t r e s s .

R e s u l t s

w i t h t h e EDT

t e c h n i q u e

c o n f i r m

t h e

o b s e r v a t i o n o f

W i l k i n s a n d

B o y k i n

( 2 3 ) t h a t

l 0 .

8

7

' I

- 0

5

1

O

8

-

w 7-

z

o ,

6-

0

- J

5 -

4 -

3-

0

A - - ~

0

2

A

, . . .

s D :

e

0

3 0 .

0

x

t o 1 y

HOURS

I N C U B A T I O N AT

4 4 . 5 - C

F I G .

2 .

G r o w t h

o f E . c o l i

B i n

t e s t

m e d i a

a t

4 4 . 5 0

C

b e f o r e

and

a f t e r

s t a r v a t i o n i n 1 0 an d

3 0 o

s e a w a t e r .

S y m b o l s : 0 ,

O

d a y ;

0 ,

2 d a y s ;

x ,

5

d a y s ;

A , 7 d a y s o f

s t a r v a t i o n .

A P P L .

E N V I R O N .

M I C R O B I O L .

i1


5/6

DETECTION OF

SUBLETHAL S TR ESS IN

E . COLI

1 1 5 1

1 0 0 -

8 0 -

6 0 -

4 0 -

L I J

a l .

U

c L )

c n )

20 ]

1 0 0 -

80-

60-

40-

20-

1 0 0 -

80-

60-

4 0 -

20-

0 O

0

2 4

DAYS

I N

SEAWAT

F I G .

3 . E f f e c t o f

s t a r v a t i o n a t s e l e c t e d

s

enzyme

s p e c i f i c a c t i v i t y e x p r e s s e d as pet

zero

t i m e

a c t i v i t y .

Enzyme

was

i n d u c e d

m e d i a a t

4 4 . 5 C .

S y m b o l s :

0 ,

E C ;

0,

T SB

c o l i f o r m s f r o m e s t u a r i n e w a t e r s e x h i b

d e t e c t i o n

t i m e s

r e l a t i v e

t o

t h o s e

f r o m r

t e r . C e l l s s t r e s s e d

b y

i n

v i t r o

e x p o s u w

s a l i n i t y

d i s p l a y e d

EDT

responses

l a t e r

d i c t e d

f r o m s t a n d a r d curves. Of

t h e t w 4

m e d i a ,

s t r e s s

was

c o n s i d e r a b l y

more

p r

i n

E C t h a n

i n

medium

A - 1 .

Based on

we

s u g g e s t

t h a t t h e

EDT

t e c h n i q u e

s u i t a b l e

f o r

c o l i f o r m


as

b y

W i l k i n s a n d

B o y k i n ( 2 3 )

p r o v i d e (

s t a n d a r d

c urves are

d e v e l o p e d

f o r t h e

c o n d i t i o n s i n

t h e e n v i r o n m e n t

b e i n g

n

( i i )

f e c a l c o l i f o r m s

i s o l a t e d from

n a t u

ar e u s e d i n

e s t a b l i s h i n g

t h e s e

s t a n d a

2

( i i i ) medium

A -1 o r

a

s i m i l a r

b e n i g n y e t s e l e c t i v e

medium i s u t i l i z e d f o r

d e t e r m i n a t i o n o f

EDT.

The

l i k e l i h o o d

o f u n d e r e s t i m a t i n g c o l i f o r m

d e n -

s i t i e s w o u l d

i n c r e a s e

i f

s a m p l e s

w e r e

t a k e n

f r o m

h i g h - s t r e s s a r e a s ,

f o r e x a m p l e ,

d o w n s t r e a m o f

a

s e w a g e

t r e a t m e n t

p l a n t o r

i n d u s t r i a l

o u t f a l l .

A

p o s s i b l e m o d i f i c a t i o n o f

t h e

EDT

t e c h n i q u e t o

i m p r o v e d e t e c t i o n o f

s t r e s s e d c o l i f o r m s , f o r e x -

a m p l e ,

w o u l d

u t i l i z e

p r e i n c u b a t i o n a t

a

t e m p e r -

a t u r e

l o w e r

t h a n

4 4 . 5 C

o r i n a medium

c o n d u -

c i v e

t o

r e p a i r

o f d a m a g e d

c e l l s

b e f o r e e x p o s u r e

t o

s e l e c t i v e c o n d i t i o n s .

A d d i t i o n a l

w o r k i s n e c e s s a r y t o

c o m p a r e t h e

1 0 / o

e f f i c i e n c y o f

t h e E T t e c h n i q u e

t o s t a n d a r d

m o s t

p r o b a b l e

n u m b e r

o r

f i l t r a t i o n

t e s t s

f o r

e n u -

m e r a t i o n o f

s t r e s s e d f e c a l

c o l i f o r m s .

The

a p p l i -

c a t i o n o f t h e

EDT

t e c h n i q u e s t o

e n u m e r a t i o n o f

o t h e r

o r g a n i s m s

o f p u b l i c

h e a l t h

c o n c e r n ,

e . g . ,

p s e u d o m o n a d s , v i b r i o s , f e c a l

s t r e p t o c o c c i ,

a n d

>,

s t a p h y l o c o c c i

s h o u l d

a l s o

b e

i n v e s t i g a t e d .

W a r r e n e t

a l .

( 2 0 ) ,

a p p l y i n g t h e f 8 - g a l a c t o s i d -

a s e a s s a y t e c h n i q u e

t o

t h e r a p i d

e n u m e r a t i o n o f

f e c a l

c o l i f o r m s i n

n a t u r a l w a t e r s , n o t e d u n e x -

p e c t e d

r e s u l t s

w h e n

s a m p l e s w e r e

t a k e n f r o m a

h i g h - s t r e s s a r e a , i . e . ,

d o w n s t r e a m

o f

a

s e w a g e

30

o

t r e a t m e n t p l a n t . O u r e x p e r i m e n t

t o

q u a n t i f y t h e

e x t e n t o f

s u b l e t h a l

s t r e s s i n f e c a l

c o l i f o r m s e x -

p o s e d

t o s e a w a t e r

m e a s u r e d , B - g a l a c t o s i d a s e

s p e -

c i f i c a c t i v i t y . I n

c o n t r a s t ,

W a r r e n e t a l . ( 2 0 )

d e t e r m i n e d

t h e

t i m e

n e c e s s a r y

t o

r e a c h

h a l f -

maximum

a b s o r b a n c e i n

ONP G

m e d i u m . The

s h a r p

d e c r e a s e i n

s p e c i f i c

a c t i v i t y

o b s e r v e d

i n

a l l

t e s t

m e d i a a f t e r

e x p o s u r e t o s e a w a t e r

may b e

a c c o u n t e d

f o r

b y

d i e - o f f

o f

t h e c o l i f o r m s i n

t h e

t e s t m e d i a ,

c a t a b o l i t e

r e p r e s s i o n ,

r e d u c t i o n

i n

l a c t o s e

p e r m e a s e

a c t i v i t y , r e p r e s s i o n

o f t h e l a c -

8

t o s e

o p e r o n ,

o r

a

c o m b i n a t i o n

o f

t h e a b o v e .

O u r

' E R

d a t a

s u g g e s t e d

t h a t

d i e - o f f

a l o n e

d i d

n o t

a c c o u n t

f o r t h e d e c r e a s e s i n

e n z y m e s p e c i f i c

a c t i v i t i e s

a l i n i t i e s

o n s i n c e t h e r e w a s m i n i m a l

d i e - o f f i n T S B ,

y e t

t h e

r c e n t a g e

o f

e n z y m e

a c t i v i t y

f e l l

o f f a s

s h a r p l y

a s

i n

EC

o r

i n

v a r i o u s

medium A - 1 .

S i m i l a r l y ,

c a t a b o l i t e

r e p r e s s i o n

;

x ,

A - 1 .

w o u l d b e e x p e c t e d

t o

r e d u c e e n z y m e

s p e c i f i c

a c t i v i t y

i n r i c h

m e d i a w h e r e t h e

g r o w t h

r a t e

o r

i t d e l a y e d m e t a b o l i c

a c t i v i t y

h a s b e e n

d e p r e s s e d ; y e t

t h e r e

i

f r e s h w a -

w e r e

n o

c l e a r

d i f f e r e n c e s i n

l a g

t i m e s o r

g r o w t h

r e t o

h i g h r a t e s o f c e l l s

e x p o s e d

t o

s e a w a t e r

f o r

v a r y i n g

r

t h a n

p r e -

p e r i o d s o f t i m e ( F i g .

2 ) .

No

a t t e m p t

was

made

o

s e l e c t i v e t o

m e a s u r e

a

d e c r e a s e i n l a c t o s e

p e r m e a s e

o r

i n

r o n o u n c e d

t r a n s c r i p t i o n a l

a c t i v i t y .

o u r

d a t a ,

By u s i n g

e i t h e r t h e

EDT

o r

/ ? - g a l a c t o s i d a s e

w o u l d

b e

a s s a y t e c h n i q u e ,

i t i s

c l e a r

t h a t

s u b l e t h a l

s t r e s s

s u g g e s t e d

c a n

d e v e l o p

a s

a

r e s u l t

o f

i n

v i t r o

e x p o s u r e

t o

d

t h a t :

( i )

a u t o c l a v e d

s e a w a t e r

o f

s e l e c t e d

s a l i n i t i e s .

T h e s e

p a r t i c u l a r

t e c h n i q u e s may

a l l o w

f o r

i d e n t i f i c a t i o n

o f

o t h e r

n o n i t o r e d ;

p o t e n t i a l

s t r e s s f a c t o r s

s u c h

a s

t e m p e r a t u r e ,

n u -

r a l

w a t e r s t r i e n t

c o n c e n t r a t i o n ,

a n d

a c t i v e

h a l o g e n

i n

t h e

r d

c u r v e s ; a q u a t i c

e n v i r o n m e n t .

S u c h

i n f o r m a t i o n

may

b e

V O L .

3 8 ,

1 9 7 9

d W I )

. 1


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Sublethal Stress in Escherichia Coli a Function of Salinityt

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