Phùng Thị Ngọc Quyền-k22 sinh học

Sử dụng enzyme transferase trong chuẩn đoán bệnh học

I. Giới thiệu chung về enzyme

1. Enzyme là gì?

Là các đại phân tử có bản chất là protein,có khả năng xúc tác cho 1 hoặc nhiều phản ứng sinh hoá với

mức độ đặc hiệu khác nhau.

So với các chất xúc tác vô cơ,enzyme có nhiều đặc tính ưu việt như: sử dụng trong điều kiên thường với

tốc độ phản ứng nhanh, cơ chất và sản phẩm có tính đặc hiệu. vì vậy, chúng ngày càng được ứng dụng

rộng rãi trong đời sống và kỹ thuật . Mỗi enzym có 1 hoặc vài trung tâm hoạt động để xúc tác cho phản

ứng của cơ chất

Cơ chế tác dụng của enzym  

        Cơ chế tác dụng của enzym  là làm giảm năng lượng hoạt hóa của phản ứng  để các cơ chất dễ dàng

đạt được mức năng lượng trạng thái chuyển tiếp, từ đó phản ứng  có thể xảy ra . Enzym  làm giảm năng

lượng hoạt hóa của phản ứng  bằng cách kết hợp với cơ chất tạo phức E-S: E + S ↔ ES E + P

(E là enzym , S là cơ chất, P là sản phẩm của phản ứng).

2. Phân loại

Dựa vào đặc tính của enzyme hội hóa sinh quốc tế(IUB) đã thống nhất phân loại enzyme thành 6 lớp:

Oxidoreductase: xúc tác phản ứng oxi hóa khử

Transferase: xúc tác phản ứng chuyển gốc hay chuyển nhóm từ chất này sang chất khác

Hydrolase: xác tác phản ứng thủy phân các hợp chất hữu cơ

Lyase: xúc tác phản ứng phân cắt không cần nước, hoặc loại nước, thêm nước vào nối đôi

Isomerase: chuyển vị đồng phân hoặc nội phân

Ligase( synthetase): tổng hợp các hợp chất hữu cơ cao năng.

.    Enzym  vận chuyển nhóm (transferase )

Là enzyme xúc tác phản ứng  vận chuyển 1 nhóm hóa học( ko phải H) giữa 2 cơ chất AX + B A + BX.

Gồm 8 lớp phụ rất khác nhau tùy theo bản chất của nhóm được chuyển vị như monocarbon, alkyl,

glucosyl, các nhóm phosphate, lưu huỳnh…

Phùng Thị Ngọc Quyền-k22 sinh học

       Các aminotransferase : chuyển nhóm –NH2 tử acid amin vào acid cetonic . VD: aspartat

transaminase , alanin transferase …

       Transcetolase và transaldolase : chuyển đơn vị 2C và 3C vào cơ chất . VD: transscetolase ,

transaldolase ….

       Các acyl-, metyl- , glucosyl –transferase , phosphorylase : chuyển các nhóm tương ứng vào cơ chất .

VD: acyl CoA – cholesterol acyl transferase (ACAT) , glycogen phosphorylase …

      Các kinase : chuyển gốc –PO3 từ ATP vào cơ chất .VD: hexokinase

       Các thiolase : chuyển nhóm CoA –SH vào cơ chất .VD: acyl –CoA acetyltransferase( thiolase )..

       Các polymerase : chuyển các nucleotid từ các nucleotide triphosphat (NTP) vào phân tử ADN hoặc

ARN .VD: các ADN polymerase , các ARN polymerase

II. Quy trình tinh sạch enzyme

Để tách và tinh chế enzyme thường có một loạt phương pháp hóa lý khác nhau. Có thể chia thành 5 nhóm

phương pháp sau:

Phương pháp biến tính chọn lọc

Phương pháp kết tủa phâm đoạn

Phương pháp hấp thụ chọn lọc

Phương pháp sắc kí

Phương pháp tách hệ 2 pha nước

Để xây dựng phương pháp tách và làm sạch 1 enzyme cần biết lựa chọn và phối hợp 1 cách có hiệu quả

nhất các biện pháp tách và làm sạch khác nhau. Cụ thể:

1. γ_Glutamyltranspeptidase ( GGT) ( EC.2.3.2.2) được tinh chế từ các phần periplasmic của

Escherichia coli K-12. GGT thuộc nhóm transferase được tìm thấy trong nhiều sinh vật khác nhau

từ vi khuẩn đến nhiều động vật có vú, GGT xúc tác quá trình chuyển hóa các chất bài tiết trong

nước tiểu và mật, phân cắt glutathione ngoại sinh và nito trong E.coli, nấm men và động vật có

vú. GGT cũng được chuyển sang bacillus subtilic bằng AND tái tổ hợp để sản xuất.

Nuôi E.coli( hoặc B,subtilis) trong môi trường dinh dưỡng lỏng ( đường)+ apicilin+ SeMet→ thêm

isopropyl-1-Thio-β- D -galactopyranoside → lắc ủ 12 giờ→. tách rửa GGT từ một cột

PBE94→ thêm ammonium sulfate tới 80% độ bão hòa. Tủa này được hòa tan trong

Phùng Thị Ngọc Quyền-k22 sinh học

một lượng nhỏ 20 mM Tris · HCl (pH 8).  Đoạn có chứa GGT được kết tủa bằng cách

thêm ammonium sulfate tới 80% độ bão hòa và bảo quản ở 4 ° C cho đến khi sử

dụng.  

Kết tủa ammonium sulfate của SeMet GGT được hòa tan trong 50 mM Hepes đệm

tại pH 7,0.  SeMet GGT đã được khử muối bằng cách lặp đi lặp lại và pha loãng với

hệ đệm bằng cách sử dụng bộ lọc đến khi còn 6 mg / ml tinh. .Tinh thể GGT được

sản xuất ở 4 ° C.  Tinh thể đã được ngâm trong dung dịch bảo vệ lạnh và đèn flash

làm mát bằng một dòng khí nitơ ở 100 K, nơi mà các giải pháp bảo vệ lạnh đã được

chuẩn bị bởi các thêm PEG 4000 và glycerol với các hồ. Hầu hết các tinh thể và các

chất nền đã được chuẩn bị theo phương pháp ngâm, chứa các chất bảo vệ lạnh.

γ-Glutamyltranspeptidase của Escherichia coli K-12 bao gồm một tiểu đơn vị lớn và một

tiểu đơn vị nhỏ, có thể được ngăn cách với nhau bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao, tiểu

đơn vị lớn và nhỏ tách ra được tái tạo trong ống nghiệm  →sự tổng hợp γ-

glutamyltranspeptidase trong tiền thân polypeptide sau đó xử lý 1 lần duy nhất có hiệu

quả hơn để xây dựng các cấu trúc nguyên vẹn của γ-glutamyltranspeptidase

2. GOT: (glutamat oxaloacetat transaminase) có trong gan, cơ… và có trong nốt sần họ đậu, được

tinh chế bằng phương pháp sắc kí troa đổi ion

III. Ứng dụng của tranferase trong chuẩn đoán bệnh học

1. ứng dụng trong chuẩn đoán bệnh về gan

Gan là một tạng lớn nhất trong cơ thể. Trong gan có một hệ thống enzym rất hoàn chỉnh   để thực hiện

hoạt động tổng hợp và chuyển hóa các chất protid, gluxit, lipid. Người ta gọi chung những enzym này là

men gan. Các enzyme đó là  SGOT(AST), SGPT(ALT), GGT , LDH.

Trong gan, các enzym này có mặt trong tế bào gan. Mỗi ngày, cơ thể luôn luôn có những tế bào già chết

đi và tế bào mới sinh ra,  Khi những tế bào gan chết đi thì enzym trong tế bào đó sẽ được giải phóng vào

máu. Như vậy, trong máu luôn tồn tại một lượng men gan  nhất định.

Khi một hoặc nhiều hơn một trong số các enzym này có giá trị cao hơn giá trị bình thường sẽ dẫ tới men

gan cao. Có nghĩa là lượng enzyme được giải phóng vào máu nhiều hơn bình thường phản ánh tình trạng

các tế bào gan đang bị hủy hoại. Chỉ số men gan càng cao hơn bình thường đánh giá tình trạng tổn thương

nhu mô gan càng nhiều.

Phùng Thị Ngọc Quyền-k22 sinh học

Bốn enzym chủ đạo để đánh giá tình trạng tổn thương của các tế bào gan đó là  SGOT, SGPT, GGT và

LDH.

GGT - Gamma Glutamyl Transferase ( gamma GT) (EC2.3.2.2) : Là một enzyme của màng tế bào, tham

gia vào quá trình trao đổi các axit amin qua màng tế bào, thực hiện chức năng chuyển nhóm γ-glutamyl.

Nó được tìm thấy ở nhiều mô trong đó nhiều nhất là ở gan và có dấu hiệu chuẩn đoán bệnh trong y học.

GGT chuyển nhóm glutamyl cho một loạt các phân tử chất nhận kể cả nước đặc biệt là L-axitamin để cân

bằng nội môi đồng thời GGT cũng có tác dụng chống oxi hóatrong tế bào vì nó liên quan đến sự trao đổi

chất gluthatione dẫn tới sự hình thành cystein.

(5-L-glutamyl)-peptide + một axit amin↔ peptide +5-L-glutamyl- axit amin

GGT có chu kì bán rã khoảng 10 ngày tùy tình trạng sức khỏe.

Về cấu trúc: GGT gồm 2 chuỗi polypeptide, một lớn một bé, có trungtaam hoạt động nằm trong tiểu đơn

vị bé

GGT chủ yếu được sử dung để chuẩn đoán bệnh tăng huyết áp. GGT có thể đựợc cọi là enzym đầu tiên

chịu tác động một khi xảy ra các bệnh lý  gan và đường mật. Bình thường, men gan này tồn tại trong máu

với giá trị bình thường là:

Nam : 5-38 U/L

Nữ : 5-29 U/L

Trẻ nhỏ: 3 -30 U/L

Trẻ sơ sinh : Lớn gấp 5 lần giá trị được thấy ở trẻ nhỏ.

Khi cơ thể bạn đang mắc một số bệnh như: Viêm gan , xơ gan do rượu, viêm gan nhiễm trùng, viêm gan

mãn tính, áp xe gan, kén sán lá gan, tăng lipid máu, xơ gan do mật tiên phát, viêm đường mật xơ hóa, sỏi

mật, ung thư biểu mô đường mật…thì men gan này tăng lên cao hơn bình thường

Ở người nghiện rượu, GGT thường gia tăng đơn độc ( không kèm theo tăng SGOT SGPT, LDH). Lượng

enzym này trong máu tương ứng với lượng rượu hấp thụ. Theo dõi lượng enzym trong các lần xét nghiệm

máu định kỳ, thường xuyên giúp bác sĩ đánh giá thói quen dùng rượu của người bệnh. Từ đây cho phép

phát hiện các bệnh nhân nghiện rượu theo dõi bênh nhân nghiện rượu, giúp chẩn đoán sớm các vấn đề gan

mật ở bênh nhân nhất là xơ gan do rượu và u gan.

Phùng Thị Ngọc Quyền-k22 sinh học

SGOT ( glutamat oxaloacetat transaminase ) hay ASAT ( aspartat transaminase) và SGPT

( glutamat pyruvat transaminase ) hay ALAT ( alanin transaminase )

Chúng là các enzym có trong tế bào gan có vai trò cơ bản xúc tác cho những phản ứng sau:

Aspartat + α_cetoglutarat GOT Oxaloacetat + Glutamat

Alanin  +  α_cetoglutarat GPT Pyruvat + Glutamat

Các men gan này có  một lượng nhất định trong máu:

Khi có tình trạng tổn thương tế bào gan như viêm gan, u gan, xơ gan thì,  các men này tăng lên trong máu.

Xét nghiệm kiểm tra lượng men gan (SGOT. SGPT,LDH, GGT)  trong máu cho phép xác định một  bệnh

lý gan và theo dõi tiến triển của bệnh. Tỉ lệ SGOT/SGPT >1 , kết hợp với tăng GGT và Globulin máu

kèm giảm nồng độ antithrombin III (một yếu tố đông máu) sẽ dự đoán được tình trạng xơ gan.

.Men gan cao chỉ là một căn cứ tin tưởng hơn cho việc chẩn đoán bệnh chắc chắn, kết hợp với các triệu

chứng của người bệnh. Tuy nhiên SGOT, SGPT, GGT,LDH  không chỉ tồn tại duy nhất ở tế bào gan, mà

nó còn có mặt ở trong tế bào của nhiều cơ quan bộ phận  khác như tim, thận,tụy , cơ khớp, hồng cầu, bạch

cầu .

LDH - Lactac DeHydrogenase : Là một enzyme trong tế bào xúc tác phản ứng chuyển hóa năng lượng .

LDH có mặt nhiều ở  trong tế bào gan và  được giải phóng ra huyết tương khi có tình trạng hủy hoại tế

bào gan.

Có khoảng 110 -210 U/L lượng LDH tồn tại trong máu

LDH chủ yếu tăng cao trong các tổn thương tế bào gan:Viêm gan nhiễm khuẩn, nhiễm độc., viêm gan do

rượu, di căn gan, viêm gan do thuốc (rifampicin, salycylat, INH)

2. Xác định nồng độ cơ chất

Phương pháp động học xác định triglyceride

Phương pháp này chỉ xác định nồng độ cơ chất dưới giá trị Km

Xác định glucose

Phùng Thị Ngọc Quyền-k22 sinh học

D – glucose + ATP D-glucose-6-phosphate + ADP

D-glucose -6-phosphate +NADP+ D-glucono-denta-lactose-6-phosphate + NADPH+

Ở phản ứng đầu, glucose được phosphoryl hóa bởi hexokinase ,sau đó glucose-6-phosphate bị hydrogen

hóa bởi tác động của glucose-6-phosphate dehydrogenase .Sự tạo thành NADPH sẽ được xác định bằng

máy quang phổ.

Trilyceride + 3 H2O glycerol +3 acid béo

Glycerol + ATP glycerol -3-phosphate + ADP

ADP + phosphoenolpyruvate ATP + pyruvate

Pyruvate + NADH + H+ L-lactate + NAD+

Chất béo được thủy phân bằng lipase(EC.3.1.1.3) carboxylesterase (EC.3.1.1.1) tạo ra glycerol và sẽ được

phosphoryl hóa bởi glycerol kinase(EC.2.7.1.30), ADP tạo thành sẽ tiếp tục được phosphoryl hóa đến

ATP với phosphoenolpyruvate và pyruvate kinase(EC.2.7.1.40), cuối cùng pyruvate được hydrogen hóa

bởi L–lactate dehydrogenase (EC.1.1.1.27) và NADH giảm dần.

Xác định hoạt tính của creatine kinase

Creatine phosphate + ADP createne + ATP

ATP tạo thành trong phản ứng này nhờ xúc tác của enzyme creatin kinase.

Creatine kinase (CK), còn được gọi là creatine phosphokinase (CPK) hoặc phospho-creatine kinase, hoặc

được xem như là creatine kinase là một loại enzyme thuộc nhóm transferase ( EC 2.7.3.2 ) trong nhóm N-

phosphoryl của Adenosindiphosphat (ADP) xuất hiện ở các mô khác nhau và các loại tế bào. CK xúc tác

chuyển đổi của creatine và biến đổi adenosine triphosphate (ATP) để tạo ra phosphocreatine (PCR) +

adenosine diphosphate (ADP) và ngược lại . Phản ứng lưu trữ năng lượng trong cơ bắp và mô não

INCLUDEPICTURE

"http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/c/c0/Creatine_kinase_rxn.png/500px-

Creatine_kinase_rxn.png" \* MERGEFORMATINET INCLUDEPICTURE

"http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/c/c0/Creatine_kinase_rxn.png/500px-

Phùng Thị Ngọc Quyền-k22 sinh học

Creatine_kinase_rxn.png" \* MERGEFORMATINET

CK có nhiều trong các mô và các tế bào sử dụng nhiều ATP, đặc biệt là cơ xương, não , các tế bào tiếp

nhận ánh sáng của võng mạc , các tế bào lông trong tai trong , tinh trùng và cơ trơn , PCR phục vụ như

một hồ chứa năng lượng nhanh chóng và tái sinh của ATP tại chỗ, cũng như vận chuyển năng lượng trong

tế bào [3] Như vậy creatine kinase là một enzyme vô cùng quan trọng.

Có 4 loại enzyme khác nhau: CK-MM, CK-BB và CK-MB

CK-1: BB isoenzyme, tìm thấy chủ yếu trong não.

CK-2: MB isoenzyme, nồng độ cao nhất trong cơ tim, ít hơn trong cơ xương.

CK-3: MM isoenzyme, được tìm thấy trong cơ xương, ít hơn trong cơ tim.

CK-Mt: tìm thấy trong màng ty thể, chiếm 15% lượng CK của tim.

CK có chu kì bán rã rất ngắn. Hoạt động mạnh lúc 6-12 giờ và trở lại bình thường trong vòng 24-48 giờ.

Khi chấn thương cơ bắp sẽ duy trì nồng độ CK cao. Hoạt động CK là ổn định cho 7 ngày tại 4 C và 1

tháng ở -25 C

INCLUDEPICTURE "https://ahdc.vet.cornell.edu/clinpath/modules/chem/images/ckastkin.gif" \*

MERGEFORMATINET INCLUDEPICTURE

Phùng Thị Ngọc Quyền-k22 sinh học

"https://ahdc.vet.cornell.edu/clinpath/modules/chem/images/ckastkin.gif" \* MERGEFORMATINET

Hình 1: chức năng cơ xương (bởi Cardinet Guitar Hero III trong "Clinical Biochemistry of Domestic

Animals", 5th edition, Kaneko et al, eds, pg 426, 1997; Copyright Elsevier.)

Xét nghiệm lâm sàng, creatine kinase trong xét nghiệm máu là một dấu hiệu nhận biết của nhồi

máu cơ tim

Khi bệnh nhân đau ngực hoặc nếu nghi ngờ. suy thận cấp sẽ được kiểm tra lượng CK. Thông

thường tổng số lượng CK là 24-170 IU / l ở phụ nữ, 24-195 IU / l ở nam giới, nếu CK tăng cao là

dấu hiệu của tổn thương cơ bắp . Có thể là dấu hiệu của chấn thương , tiêu cơ vân , nhồi máu cơ

tim , viêm cơ và viêm cơ tim . Với bệnh nhân suy giáp, CK tang tương ứng với giảm huyết thanh

T3. Vì vậy, việc ước lượng huyết thanh CK được xem là có giá trị trong việc kiểm tra cho bệnh

nhân suy giápGiảm CK có thể là một dấu hiệu của bệnh gan do rượu và viêm khớp dạng thấp .

Tài liệu tham khảo1. Đặng Thị Thu, Công nghệ enzyme

2. Phạm Thị Chân Châu, enzyme và ứng dụng trong công nghệ sinh học tập 3

3. Wallimann T, Hemmer W (1994). "Creatine kinase in non-muscle tissues and cells".

Molecular and Cellular Biochemistry . 133–134: 193–220.

Phùng Thị Ngọc Quyền-k22 sinh học

4. Hekimsoy, Zeliha; Oktem, Iris Kavalali (2005). "Serum creatine kinase levels in

overt and subclinical hypothyroidism". Endocrine Research 31

5. Tietz Textbook of Clinical Chemistry. Edited by CA Burtis, ER Ashwood. WB Saunders Company, Philadelphia, 1994

6. Journal of Bacteriology, Dec, 1986, p1325-1331 0021-9193/86/121325-07502.000 γ_glutamyltranspeptidase from E.coli K12: Purification and Propecties

7. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16618936