STUDIUL UNOR EXTRACTE DE ORIGINE VEGETALĂ CU …

STUDIUL UNOR EXTRACTE DE ORIGINE

VEGETALĂ CU POTENȚIALE EFECTE

NEUROPROTECTOARE

REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT

Coordonator știintific:

Prof. univ. dr. Monica HĂNCIANU

Doctorand:

Farmacist Andrei-Florin PĂDURARU

2021

Actuala Teză de doctorat “Studiul unor extracte de origine

vegetală cu potențiale efecte neuroprotectoare” cuprinde 173 pagini

dintre care 48 dedicate Părții Generale, 103 Părții Personale și 22

Bibliografiei.

Teza cuprinde 121 figuri, 20 tabele, și 290 referințe bibliografice.

În acest Rezumat, figurile, tabelele și referințele bibliografice

selectate păstrează același număr ca cel alocat în textul Tezei de doctorat.

Cuvinte cheie: Ajuga reptans L, Ajuga genevensis L, Leuzea

carthamoides (Willd) Iljin, Leuzea salina, iridoide, ecdisone,

ecdisteroide, acizi polifenolici, flavonoide, antiinflamatoare,

anabolizante, antioxidante, antistres-adaptogene, neuroprotectoare,

anxiolitice, antidepresive, nootrope, demențe, Alzheimer, Parkinson,

demența cu corpi Lewy, demența Huntington.

CUPRINS

MULȚUMIRI v

ABREVIERI viii

A. Partea generală

CAPITOLUL 1: Date actuale privind etiologia și evoluția

unor boli neurodegenerative moderne, cu accent pe boala

Parkinson.

1

1.1 Introducere 1

1.2 Fiziologia neuronului 2

1.3 Neurogeneza la adulți 5

1.4 Apoptoza 7

1.5 Demențele 8

1.5.1 Demențele vasculare 8

1.5.2 Boala Alzheimer 9

1.5.3 Boala Parkinson 10

1.5.3.1 Epidemiologie 10

1.5.3.2 Patofiziologie și etiologie 11

1.5.3.3 Biochimia și farmacologia sindromului Parkinson 13

1.5.3.4 Simptomele bolii 13

1.5.3.5 Importanța stresului oxidativ și a inflamației în boala

Parkinson

15

1.5.3.6 Farmacoterapia simptomatică în boala Parkinson 19

1.6 Măsuri profilactice și terapia adjuvantă în bolile

neurodegenerative

21

CAPITOLUL 2: Date de literatură privind speciile vegetale

luate în studiu

32

2.1 Cunoștințe actuale privind speciile Ajuga reptans și Ajuga

genevensis

32

2.1.1 Încadrare botanică 32

2.1.2 Compoziție chimică 33

2.1.3 Acțiuni farmacologice 36

2.1.4 Biogeneză 36

2.1.5 Rol în organismul vegetal 37

2.1.6 Utilizări și dozaj 37

2.2 Cunoștințe actuale privind genul Leuzea 38

2.2.1 Încadrare botanică 38

2.2.2 Compoziția chimică 39

2.2.3 Rol în organismul vegetal și animal 44

2.2.4 Acţiuni farmacologice 46

2.2.5 Mecanism de acţiune 47

2.2.6 Contraindicaţii şi efecte secundare 48

2.2.7 Utilizari si dozaj 48

B. Parte personală

CAPITOLUL 3: Motivarea alegerii temei; scopul și

obiectivele cercetării

49

3.1 Motivarea alegerii temei 49

3.2 Scopul și obiectivele cercetării 51

CAPITOLUL 4: Material, metode și tehnici de lucru 53

4.1 Prezentarea materialului vegetal supus cercetării 53

4.1.1 Analiza farmacognostică microscopică 53

4.1.2 Analiza histoanatomică 54

4.1.2.1 Protocolul de realizare a preparatelor 54

4.1.2.2 Examinarea la microscopul de baleiaj 54

4.2 Obținerea extractelor incluse în experimentele derulate 55

4.3 Analiza chimică 56

4.3.1 Analiza chimică calitativă prin cromatografie pe strat

subțire (CSS) pentru derivați flavonoidici, polifenolici și

iridoide

56

4.3.2 Analiza chimică cantitativă 57

4.3.2.1 Determinarea spectrofotometrică a polifenolilor

totali a flavonoidelor și a iridoidelor

57

4.3.2.2 Analiza prin cromatografie în fază lichidă de înaltă

performanţă (UHPLC)

61

4.4 Investigarea potențialului biologic ale extractelor de Ajuga

sp. si Leuzea sp. studiate

68

4.4.1 Investigarea in vitro a potențialului antioxidant și

anticolinesterazic

68

4.4.1.1 Inhibarea lipoxigenazei 68

4.4.1.2 Inhibarea colinesterazelor 69

4.4.1.3 Capacitatea de chelatare a ionul feros 69

4.4.2 Evaluarea in vivo a unor efecte farmacologice 70

4.4.2.1 Obținerea modelului experimental de boală

Parkinson indus la șobolani

71

4.4.2.2 Studiul acțiunii antidepresive și anxiolitice a

extractelor de Leuzea: modelul experimental de pești-zebra

(Danio rerio)

77

CAPITOLUL 5: Contribuții la studiul farmacognostic și

biologic a produselor Ajugae herba: Rezultate și Discuții

82

5.1 Analiza fitochimică a produselor Ajugae herba 82

5.1.1 Studiul fitochimic al materialului vegetal recoltat în

anul 2017 din flora spontană

83

5.1.2 Studiul fitochimic a două mostre de Ajuga (reptans și

respectiv genevensis) provenite din cultură

87

5.2 Evaluarea potențialului biologic al extractelor de Ajuga sp. 93

5.2.1. Evaluarea potențialului antioxidant și anticolinesterazic

al extractelor de Ajuga sp.

94

5.2.1.1 Determinarea potențialului de inhibare a

colinesterazelor

94

5.2.1.2 Investigarea acțiunii a extractelor asupra

lipoxigenazei

97

5.2.1.3 Evaluarea capacității de chelatare al ionului feros

5.2.2 Cercetări in vivo privind potențialul anti-Parkinson al

extractelor evaluate

98

99

5.2.2.1 Teste comportamentale 100

5.3 Concluzii 112

CAPITOLUL 6: Contribuții la studiul farmacognostic și

biologic al extractelor obținute din speciile de Leuzea

carthamoides și Leuzea salina: Rezultate și Discuții

113

6.1 Analiza farmacognostică a speciilor Leuzea carthamoides și

Leuzea salina

113

6.1.1 Analiza farmacognostică macroscopică a speciilor

Leuzea carthamoides și Leuzea salina

114

6.1.2 Studiul histoanatomic al speciilor de Leuzea 114

6.1.2.1 Leuzea carthamoides 115

6.1.2.2 Leuzea salina 119

6.1.3 Analiza microscopică a preparatelor superficiale 124

6.2 Contribuții la analiza fitochimică a extractelor de Leuzeae

herba (L. carthamoides și L. salina)

128

6.2.1 Determinarea spectrofotometrică a polifenolilor totali și

a flavonoidelor din extractele celor două specii de Leuzea

129

6.2.2 Identificarea și cuantificarea unor componente bioactive

din extractele de Leuzea, utilizând tehnica UHPLC

130

6.3 Contribuții la evaluarea potențialului biologic al extractelor

de Leuzea sp

134

6.3.1 Evaluarea potențialului antioxidant si anticolinesterazic

al extractelor de Leuzea sp.

134

6.3.1.1 Determinarea potențialului de inhibare a

colinesterazelor

134

6.3.1.2 Investigarea acțiunii de inhibare a lipoxigenazei 136

6.3.1.3 Evaluarea capacității de de chelatare al ionului feros 138

6.3.2. Investigarea potențialului anti-Parkinson al extractelor

de Leuzea prin intermediul testului zebra-fish (Danio rerio)

138

6.3.2.1 Teste comportamentale 139

6.4 Concluzii 144

CAPITOLUL 7: Concluzii generale; Originalitatea tezei;

Perspective de continuare a cercetărilor

146

BIBLIOGRAFIE

152

1

PARTEA PERSONALĂ

Motivarea alegerii temei; scopul și obiectivele cercetării

Plecând de la datele și considerentele prezentate în Capitolul 1

referitor la etiologia și evoluția bolii Parkinson, cele mai importante

substanțe farmacologice active recomandate pacienților sunt levodopa

combinat cu benserazida sau carbidopa al căror rol este de a asigura

creierului o cantitate suficientă de dopamină, neurotransmițător

insuficient sintetizat în această boală.

De asemeni inhibitori de catecol-O-metiltransferaza (COMT)

cum ar fi entacapon sau tolpacon prin blocarea enzimei împiedică

metilarea levodopa la nivelul grupării hidroxil fenolic, cu formarea astfel

a unui metabolit inactiv; prin inhibarea acestei reacții acțiunea levodopa

administrată este accentuată. Entacapon inhibă COMT la nivel periferic

în timp ce Tolcapon o inhibă atât periferic cât și la nivelul SNC. Cu toate

acestea pentru ambele substanțe medicamentoase efectul periferic se află

în prim plan, deoarece COMT este localizat în SNC mai ales în celulele

gliale, neuronii dopaminergi prezentând doar o activitate COMT mică,

până la inexistentă.

Inhibitorii de monoaminoxidază B (MAO-B) reprezintă o altă

posibilitate de a crește concentrația dopaminei la nivelul receptorilor

dopaminergici centrali. Cele două forme izo MAO-A și MAO-B diferă

între ele prin exprimarea lor la nivelul țesuturilor și specificitate de

substrat. MAO-B intermediază degradarea dopaminei precum și

dezaminarea β-feniletilaminei care stimulează eliberarea de dopamină și

inhibă repreluarea neuronală a dopaminei. Inhibarea MAO-B conduce

astfel la o creștere a concentrației intrasinaptice a dopaminei. Prin

blocarea MAO-B se reduce totodată generarea unor specii reactive de

oxigen (RLO). Cei mai importanți inhibitori MAO-B sunt: selegilina,

rasagilina și safinamida.

Agoniștii dopaminergici se folosesc în special la pacienții mai

tineri, efectul lor principal fiind cel de stimulare a receptorilor D2.

2

Agoniștii dopaminergici existenți se subîmpart în derivați ergotinici și

non-ergotinici.

Anticolinergice centrale, sunt antagonisti lipofili terțiari ai

receptorilor muscarinici și reprezintă de fapt cele mai vechi medicamente

antiparkinson cunoscute și încă utilizate. Studiile clinice n-au adus însă

date concludente privind eficiența lor în tratamentul sindromului

Parkinson. Cu toate acestea anticolonergicele sunt clinic utile la pacienții

care prezintă un tremor de repaus foarte intens.

Amantadina, dezvoltată inițial pentru profilaxia gripei s-a dovedit

a fi un inhibitor eficient al receptorilor NMDA (N-metil-D-asprtat) și prin

aceasta inhibă acțiunea glutamatului. În plus, amantadina crește

concentrația extracelulară a dopaminei și inhibă eliberarea acetilcolinei

în SNC. Se utilizează în asociere cu levodopa și antiparkinsoniene

dovedindu-și utilitatea mai ales în crizele akinetice.

Butipin, inhibă receptorii NMDA și este în plus un antagonist al

receptorilor muscarinici: reduce mai ales tremorul, fiind admis în terapia

de combinare la pacienții cu Parkinson fără fluctuații (186).

Desigur că administrarea unor astfel de medicamente de sinteză,

puternic active, vin cu o paletă destul de largă de reacții adverse.

Din grupul medicamentelor utilizate în tratamentul bolii

Parkinson se constată că lipsesc atât antiinflamatoarele, cât și

antioxidantele, cu toate că se știe că atât inflamația cât și supraproducția

de specii reactive de oxigen contribuie la înrăutățirea simptomatologiei

bolii.

Din acest motiv, identificarea speciilor vegetale care să vină cu

principii active cu acțiune: antioxidantă, antiinflamatoare și anabolizantă

este de un real interes.

Produsele vegetale conțin numeroase componente cu acțiune

antioxidantă (47) în special compușii polifenolici (flavonoide și acizi

polifenolici); pentru acțiunea antiinflamatoare așa cum este în cazul bolii

Parkinson ne-am orientat spre identificarea unor plante cu conținut în

iridoide, mai ales din grupul harpagidei, în timp ce pentru acțiunea

anabolizantă ne-am orientat către compuși de tip fitoecdisone.

Astfel am identificat 4 specii vegetale și anume: Ajuga reptans și

Ajuga genevensis,

3

care conform literaturii conțin pe lângă polifenoli antioxidanți și iridoide

din grupul harpagidei, dar și fitoecdisone anabolizante, care apar în

concentrație mai mare la Leuzea carthamoides (Rhaponticum

carthamoides) și Leuzea salina. În ambele specii de Leuzea apar de

asemeni compuși polifenolici, antioxidanți (210).

Deoarece în sindromul Parkinson farmacoterapia utilizează doar

substanțe cu acțiune simptomatică, nu cauzală, cu siguranță că eventuala

identificare a unor noi compuși naturali care sa susțină și să completeze

tratamentul medicamentos alopat deja bine stabilit ar influența

simptomatologia specifică.

Am selectat două specii de Ajuga, comune în țara noastră și a

căror compoziție chimică fusese investigată în cadrul unor studii

prospective efectuate în ultimul deceniu (111, 112, 115). Acestea

puseseră în evidență faptul că în partea aeriană înflorită a celor două

specii, pe lângă derivați polifenolici (în principal flavonoide și acizi

polifenolici) se găsesc iridoide, unele dintre acestea apropiate structural

de 8-O-acetilharpagida. Harpagida reprezintă una dintre componentele

bioactive existente în extractele din tubero-bulbii secundari de

Harpagophyutm procumbens (Burchell de Candolle), plantă care crește

în Africa de Sud. În produsul vegetal Harpagophyti radix se găseste o

întreagă familie de derivați iridoidici printre care harpagozida,

procumbida, 8-p-cumaroilharpagida și 8-O-acetilharpagida (25). Fiind

substanțe amare, iridiodele menționate dezvoltă o serie de acțiuni și

anume: apetisantă, coleretică, de stimulare a secreției gastrice, dar și

antiflogistică și ușor analgetică (151, 274).

Pe piață farmaceutică actuală circulă numeroase medicamente

care conțin extracte preparate din Harpagophyutm procumbens (gheara

diavolului); în afara utilizării pentru calitățile de principii amare acestea

se folosesc și ca antiinflamatoare în tratamentul mai ales al inflamațiilor

cronice (247), în artrita reumatoidă sau în artroză (32).

În ceea ce privește mecanismul de acțiune al extractului din

Harpagophythi radix, acesta se bazează pe inhibarea sintezei de

prostaglandine proinflamatoare (1). Extractele de Harpagophytum

acționează antiinflamator prin inhibarea ciclooxigenazei 2 (COX 2) din

cadrul cascadei acidului arahidonic (1), si în mod selectiv asupra

lipoxigenazei (LOX) (111), împiedicând prin aceasta sinteza de

4

leucotriene (LT). Totodată, interesant este faptul că extractul iridoidic

determină inhibarea interleukinei 2 (IL 2), și suplimentar a activității

colagenazelor ceea ce se traduce prin inhibarea activității enzimelor care

degradează colagenul. Experimental a fost pusă în evidență o inhibare a

metalo-proteinazelor matriciale pe celule articulare, fapt care explică

eficiența dovedită în ceea ce privește tratamentul cu preparate conținând

iridoidele menționate în diferitele forme de artroză (69).

Există în literatura de specialitate o multitudine de lucrări

publicate care se referă la studii clinice dublu-orb precum și un studiu în

care s-a urmărit nivelul eliberării de prostaglandine E (PGE) și

prostaglandine I (PGI) (227) după administrarea unor preparate din

rădăcină de gheara diavolului la pacienți. Pentru principiile active din

extractele de Harpagophytum procumbens s-a dovedit capacitatea

acestora de a traversa bariera hematoencefalică și a dezvolta la nivel

cerebral o acțiune antiinflamatoare, exploatată deocamdată în tratamentul

unor cancere cerebrale; inflamația și durerile asociate acesteia se reduc

semnificativ după aproximativ trei săptămâni de tratament cu minimum

600 mg extract/zi. De altfel în literatura, acțiunea antiinflamatoare a

iridoidelor este frecvent abordată (36, 149, 150, 153, 267, 287), și

totodată se scoate în evidență faptul că unele dintre acestea cum ar fi

genipina și genipozida pot fi folosite datorită efectului antinociceptor

(81), dar și datorită proprietăților neurotrope (125, 166, 167, 280).

Genipozida are chiar calitatea de a atenua moartea neuronală la nivelul

hipocampusului, dacă acesta este supus unei hipoxii și deprivării de

glucoză.

Pe de altă parte, Rhaponticum carthamoides (Willd.) Iljin

(sinonim Leuzea carthamoides DC), este o specie care a constituit

subiectul unei teze de doctorat în anii 80 la disciplina de Farmacognozie

U.M.F. Iași, iar în ultimii ani chimismul (21, 27, 28, 33, 57, 146, 173,

272) și proprietățile biologice ale extractelor au fost investigate mai

indeaproape. Astfel s-a pus în evidență pe lângă altele, acțiunea

adaptogenă (168, 173, 183, 283) a extractelor și efectul de prevenire a

schimbărilor destructive și a descreșterii densității sinapselor în cortexul

cerebral la șobolani cărora li s-a indus și menținut timp de 5 zile o

ischemie cerebrală (168), precum și o îmbunătățire a capacităților de

învățare și memorare (183, 281).

5

De asemeni s-a pus în evidență efectul antioxidant (209) al

extractului total. Toate aceste date din literatură ne-au determinat să

reluăm cercetările și asupra speciei Leuzea carthamoides cultivată, la

acestea adaugându-se existența unei a doua specii de Leuzea, Leuzea

salina. În măsura în care cultivarea L. salina ar putea deveni interesantă

pentru firmele care condiționează produse vegetale, aceasta ar putea fi

cultivată și pe terenuri mlăștinoase.

Pentru toate cele 4 produse vegetale ne-am propus o investigare

chimică corelată cu un studiu al activității biologice (prin studii in vitro

și in vivo) care să confirme eventuale calități anti-Parkinson ale

materialului studiat.

Scopul și obiectivele cercetării

În scopul identificării unei eventuale acțiuni anti-Parkinson, ne-

am propus într-o primă fază aprofundarea studiului chimic cu privire la

prezența iridoidelor, flavonoidelor, acizilor polifenolcarboxilici și

ecdisteroidelor în extractele de Ajuga reptans și Ajuga genevensis, si

ilustrarea variabilității intra și inter specifice, pentru ca apoi să urmărim

in vitro și in vivo efectele biologice.

În partea a doua a tezei ne-am propus investigarea chimică

comparativă a două mostre de Leuzea. Este vorba de Leuzea

carthamoides prelevată din câmpul experimental al C.C.B. Piatra Neamț

si Leuzea salina recoltată din apropiere de Valea Lupului, Iași. Totodată

materialul vegetal a fost supus și unei analize fitochimice care a urmărit

derivații ecdisonici și compușii polifenolici, realizându-se și o

investigare a proprietăților biologice ale extractelor.

Ținând cont de faptul că în cadrul tezei am analizat două specii

de Ajuga și două de Leuzea, obiectivele urmărite au constat în:

recoltarea unor probe de Ajuga sp. în anii 2015, 2016, 2017 și

2018 din flora spontană și din câmpul experimental de plante

medicinale al Centrului de cercetări biologice Stejarul din

Piatra Neamț, la momentul maximei înfloriri (prima

săptămână din mai),

6

recoltarea unor indivizi de Leuzea carthamoides DC de la

C.C.B. Stejarul din Piatra Neamț și respectiv de Leuzea salina

din Valea Lupului, Iași în anii 2017-2018,

studiul histoanatomic al organelor subterane și supraterane ale

speciilor Leuzea carthamoides și Leuzea salina,

uscarea materialului vegetal în condiții similare,

prelucrarea drogurilor pentru obținerea unor extracte

hidroalcoolice,

analizarea chimică (calitativă și cantitativă) pentru stabilirea

componentelor de tip iridoidic, flavonoidic, a polifenolilor

acizi și a polifenolilor totali, a ecdisonelor pentru Ajuga și

respectiv, a polifenolilor și ecdisonelor în cazul speciilor de

Leuzea,

cercetarea in vitro a acțiunii asupra lipoxigenazei,

colinesterazelor și determinarea capacității de chelatarea a

ionului feros,

cercetarea efectului neuroprotector al extractelor de Ajuga sp.

pe șobolani cărora li s-a indus un sindrom Parkinson prin

injectare cu neurotoxina 6-OHDA,

cercetarea influenței extractelor de Leuzea asupra peștilor din

specia Danio rerio, ca măsură a influenței asupra memoriei și

a motivației de căutare/explorare a recompensei.

Presupunând că efectul neuroprotector al extractelor s-ar putea

datora pe de-o parte acțiunii antiinflamatoare și pe de altă parte calităților

antioxidante, dar și prezenței în extracte a ecdisteroidelor în Capitolul

Rezultate și Discutii ale lucrării de față prezentăm rezultatele înregistrate

in vitro a acțiunii asupra unor enzime specifice dar și a capacității de

chelatare a ionului feros, în timp ce in vivo s-a investigat efectul de

imbunătățire a memoriei de scurtă/ lungă durată la șobolani cărora li s-a

provocat un Parkinson experimental (prin injectare cu 6-OHDA), în timp

ce prin testul zebra-fish s-a pus în evidență efectul anxiolitic, antidepresiv

și anti-Parkinson.

Cercetarea noastră a urmărit in vivo și capacitatea celor 4 extracte

de a inhiba acetilcolinesteraza și butirilcolinesteraza, ambele catalizând

hidroliza acetilcolinei sau a altor esteri ai colinei. Unii compuși de origine

vegetală pot bloca mai mult sau mai puțin intens activitatea celor două

7

enzime, ceea ce duce la stimularea în măsură mai mare sau mai mică a

unor procese neuronale, dar și la apariția unor reacții adverse cum ar fi:

grețuri, vărsături, diaree, dispepsie, deprimare respiratorie și apariția unor

erupții cutanate.

Derivații polifenolici, dar și iridoidele din extractele vegetale ar

putea avea o acțiune antioxidantă de foarte bună calitate aceasta fiind

investigată în cadrul cercetărilor actuale prin determinarea in vitro a

capacității de chelatarea a ionului feros.

Cum deja menționasem în Parkinson apare o componentă

inflamatorie de tip cronic, față de care iridoide precum harpagida din

Ajuga ar putea fi eficiente; pentru a pune în evidență acest lucru am apelat

la testul in vitro de inhibare a lipooxigenazei, pentru a constata dacă

această cale de metabolizare a acidului arahidonic către leucotrienele de

tip A4 (pro-inflamatoare, pro-chemotactice, pro-anafilactice) este sau nu

întreruptă. Același test a fost întreprins și pentru extractele de Leuzea.

8

CAPITOLUL 5: Contribuții la studiul farmacognostic și biologic a

produselor Ajugae herba: Rezultate și Discuții

5.1 Analiza fitochimică a produselor Ajugae herba

Având în vedere prezentarea produselor vegetale derivate din

Ajuga reptans și Ajuga genevensis făcută anterior conform datelor din

literatură privind chimismul lor, ne-am propus pentru început

investigarea materialului vegetal existent la noi în țară. Pe lângă aspectul

macroscopic al probelor am urmărit și elementele microscopice care pot

fi evidențiate în partea aeriană înflorită a celor două specii, Ajuga reptans

și Ajuga genevensis, constatând, cum era de așteptat păstrarea

caracteristicilor deja cunoscute din cercetări anterioare (115), motiv

pentru care in teza de față n-am insistat asupra acestora.

Pe de altă parte după cum dovedesc o serie de lucrări efectuate în

ultimii ani, variabilitatea chimică a unei specii este largă și caracteristică

pentru fiecare zonă în parte. Chimismul diferă datorită ofertei de

substanțe nutritive din sol, de clima existentă și modificarile acesteia în

anul recoltării, de nivelul precipitațiilor, intensitatea și durata iluminării

zilnice și bineînțeles in funcție de caracteristicele genetice ale indivizilor.

Pentru a urmări acest aspect în anii 2015- 2019 am prelevat

mostre de Ajuga reptans și respectiv, Ajuga genevensis pe care le-am

uscat și le-am extras cu etanol 70% la reflux, conform descrierii de la

punctul 4.2.

Extractele obținute au fost analizate prin:

A. cromatografie pe strat subțire (analiza chimică calitativă) urmată de

B. determinări spectrofotometrice (probele anilor 2015-2018) pentru

dozarea:

polifenolilor totali- exprimați în g (echivalent) acid galic/ 100g

drog,

flavone- exprimate în g (echivalent) rutozidă/ per 100g drog,

completate cu

dozarea iridoidelor- exprimate în g aucubozidă/ 100g drog si

C. analiza calitativă și cantitativă prin UHPLC pentru polifenoli, acizi

polifenolici, flavonoide, iridoide și ecdisone.

9

Pentru aceste studii comparative materialul vegetal prelucrat a

constat din indivizi de vineriță și suliman prelavați din câmpul

experimental de la C.C.B. Piatra Neamț si respectiv din flora spontană.

Analiza chimică calitativă

Am urmărit evidențierea prin cromatografie pe strat subțire a

derivaților polifenolici, a iridoidelor și a compușilor triterpenici (72) din

cele două specii vegetale, imaginile fiind redate în fig. 5.9A, B, C, D.

Deoarece în momentul cromatografierii nu am avut la dispoziție nici un

etalon din grupul harpagidei, am aplicat ca etalon un extract obținut dintr-

un medicament de proveniență germană Sogoon®, și care conține

harpagozidă.

A. B.

C. D.

Fig. 5.9: CSS pentru acizi polifenolicarboxilici (A,B), flavonoide (C) și iridoide (D) din parțile

aeriene de Ajuga reptans=1 și Ajuga genevensis=2. Etaloane: acid cafeic (Ac.caf), acid

clorogenic (Ac.cl.), acid rozmarinic (Ac.roz.), acid ferulic (Ac.fer.), acid p-cumaric (Ac.p-

cum.), apigenol (A), apigenol-7-O-glucozidă (A7gl), luteolină (L), luteolin-7-O-glucozida

(L7gl), rutozidă (R), aucubozidă (A) și extract din Sogoon (H) (fotografii originale).

10

Analiza chimică cantitativă

S-au urmărit din extractele luate în studiu dozarea

spectrofotometrică a flavonoidelor (exprimate în rutozidă), a

polifenolilor totali (exprimați în acid galic) și a iridoidelor exprimate în

aucubozidă.

În fig. 5.10 redăm rezultatele determinărilor spectrofotometrice

pentru cele două probe de Ajuga recoltate în anul 2018 din câmpul

experimental al C.C.B. Piatra Neamț.

Analiza spectrofotometrică a celor două specii de Ajuga a

evidențiat că extractele sunt bogate în polifenoli, dar mai ales în iridoide;

flavonoidele se regăsesc și ele în aceste probe, dar în cantități mult mai

reduse decât celelalte două clase chimice. Rezultatele obținute dovedesc

că ambele specii conțin același clase de compuși, dar în cantități diferite

deși provin din același mediu de cultură și au fost recoltate la același

moment în fenofaze identice.

Fig. 5.10: Cele mai importante grupe de principii active din probele de Ajuga investigate.

Aceste rezultate sunt în concordanță cu datele din literatura de

specialitate (75, 128, 262, 263, 270) dar nu în totalitate. Cu toate acestea,

trebuie precizat că plantele incluse în studiu provin din cultură controlată,

0 500 1000 1500 2000

Ajuga reptans

Ajuga genevensis

concentrație (mg%)Ajuga reptans Ajuga genevensis

Iridoids 1860 1250

Flavones 141,3 183,6

Total phenols 311,9 375,7

11

în timp ce datele din literatură fac referire în special la produs vegetal

provenit din flora spontană.

Pe de alta parte, pentru a putea confirma variabilitatea specifică

este necesară nu doar o determinare grosieră a totalurilor polifenolice și

iridoidice ci și identificarea și/sau cuantficarea unor principii active

individuale care ar putea fi principalii responsabili de acțiunile biologice

exprimate de extractele hidroalcoolice obținute din cele două specii.

Astfel, prin tehnica de cromatografie de lichide (UHPLC) a fost

confirmată prezența următorilor derivați polifenolici în cele două probe

de Ajuga investigate: acid rozmarinic, acid cafeic, acid p-cumaric,

precum și catehină, apigenol, luteolină și 7-O-glicozida sa.

Astfel de principii active au fost identificate și de către alți autori

în extracte obținute prin diverse metode din speciile de Ajuga (75, 128,

270) (fig. 5.11).

Fig. 5.11: Cromatograma UHPLC a celor două extracte de Ajuga incluse în studiu, unde

AR(albastru) – Ajuga reptans; AG (negru) – Ajuga genevensis. Legendă: 1. acid clorogenic; 2.

acid p-cumaric; 3. catehină; 4. rutozida; 5. lueolin-glucozida; 6. acid rozmarinic; 7. 8-acetil-

harpagozidă; 8. harpagozidă; 9. apigenol.

Valoarea medie a celor trei determinări realizate pentru fiecare

probă este redată comparativ în tabelul VIII. Se observă că spectrul

polifenolilor este același pentru ambele probe, dar cantitativ aceste

componente diferă de la o probă la alta.

12

Tabel nr.VIII: Polifenoli identificați și cuantificați în probele de Ajuga investigate.

Probă

Component (mg/g pv)

acid

cafeic

acid p-

cumaric

acid

ferulic

acid

rosmari

nic

catehină

luteolin-

O-

glucozidă

Luteol

ină Apigenol

Ajuga

reptans

0.85±

0.2

0.646 ±

0.3

2.43±

0.3

19.877±

0.1

1.631±

0.2

9.796 ±

0.1

0.21±

0.2

3.235±

0.1

Ajuga

genevensis

0.33±

0.1

0.333 ±

0.2

4.75±

0.2

17.434±

0.1

2.352 ±

0.1

7.697±

0.4

3.84±

0.3

2.721±

0.2

De asemenea, datele nu permit poziționarea cantitativă a vreuneia

dintre specii, deoarece există compuși în care A. genevensis e mai bogată

(acid ferulic, catehină, luteolină), în timp ce A. reptans este mai bogată

în alții (acid rozmarinic, apigenol).

Conform standardelor utilizate în determinările UHPLC, am

identificat patru iridoide (tabelul nr. IX), dintre care harpagida și

derivatul său acetilat au însumat aproximativ 45% din conținutul total de

iridoide investigate anterior. Pe de altă parte, s-au determinat, de

asemenea, cantități mici de aucubină și catalpol.

Tabel nr. IX: Cuantificarea și identificarea iridoidelor din probele investigate.

Probă

Compus (µg/g pv)

Harpagidă Aucubozidă Catalpol 8-O-acetil-

harpagozidă

Ajuga

reptans 203.899 ± 0.21 17.011± 0.15 11.211± 0.17 610.862 ± 0.11

Ajuga

genevensis 178.61 ± 0.02 8.205± 0.13 10.431± 0.40 420.112 ± 0.22

În ultimii ani s-a pus în evidență prezența unor ecdisterone în

culturile celulare ale unor specii de Ajuga (A. multiflora, A. reptans, A.

iva, A. chamaepitys, A. orientalis). Totodată, speciile de Ajuga au fost

considerate alături de spanac (Spinacia oleracea) noi surse de

fitoecdisteroide, compuși recunoscuți pentru proprietățile lor biologice

complexe, de la antioxidante la hipoglicemiante, hepatoprotectoare,

modulatoare ale creșterii și chiar imunomodulatoare.

De aceea, la analiza cromatografică am urmărit și spectrele unor

ecdisterone precum 20-OH-ecdisterona și α-ecdisterona (conform cu

standardele disponibile în laborator).

13

La integrarea cromatogramelor am reușit identificarea celor două

ecdisterone în ambele probe, la lungimea de undă de λ =245 nm. Un

detaliu al cromatogramei înregistrate la lungimea de undă menționată

prezintă cele mai importante peak-uri de ecdisteroide (fig. 5.12).

Fig.5.12: Detaliu cromatogramă UHPLC Ajuga sp. cu indicarea peak-urilor pentru alte

componente [AR(negru) – Ajuga reptans; AG (albastru) – Ajuga genevensis]. Legendă: 1.

swertiamarina; 2. catalpol; 3. 20-OH-ecdisona; 4. α-ecdisonă; 5. aucubozidă.

Valorile înregistrate pentru cele două ecdisterone, 20-OH-

ecdisona și respectiv α-ecdisona, sunt trecute comparativ în tabelul X.

Tabel nr. X: Cuantificarea ecdisonelor din probele de Ajuga investigate

Probă Compus (mg/g pv)

20-OH-ecdisona α-ecdisona

Ajuga

reptans

0.344 1.625

Ajuga

genevensis

1.367 1.336

În ceea ce privește cromatogramele obținute pentru lungimea de

undă corespunzătoare acizilor polifenolcarboxilici (λ=330 nm), acestea

sunt prezentate în fig. 5.13.

14

Fig. 5.13. Cromatograme pentru extractele de Ajuga sp.investigate la 330 nm, unde AR(negru) –

Ajuga reptans; AG (albastru) – Ajuga genevensis.

După cum se observă din figură, putem aprecia că aspectul și

amplitudinea peak-urilor prezente în cromatograme prezintă atât

asemănări, cât și diferențe, dar cu siguranță concentrațiile fiecărui

compus variză de la o probă la alta. Acest lucru este evidențiat și de date

prezente în literatura de specialitate, când se urmărește extractibilitatea

principiilor active din speciile de Ajuga în funcție de procedeul de

obținere (extracție accelerată cu solvenți, extracție asistată de ultrasunete

și respectiv, metoda de izolare în Soxhlet) utilizat pentru materialul

vegetal amintit.

Autorii au identificat acizi polifenolici (clorogenic, cafeic și

ferulic), dar și glicozide flavonoidice. Totodată, trebuie remarcată

proporția diferită dintre tipurile de acizi polifenoloci, flavonoide și

iridoide din probe, ceea ce ar putea influența semnificativ potențialul

biologic al acestor extracte. Totuși, pentru o corelare doză–acțiune–

structură trebuie urmărite variațiile intensităților de activitate în cadrul

testelor in vitro, utilizate în cadrul acestei teze.

5.2 Evaluarea potențialului biologic al extractelor de Ajuga sp.

5.2.1. Evaluarea potențialului antioxidant și anticolinesterazic al

extractelor de Ajuga sp.

15

În procesele care se desfașoară la nivel cerebral în cazul bolii

Parkinson, am investigat capacitatea de chelatare a fierului având în

vedere faptul că afecțiunea degenerativă este strâns legată și de stresul

oxidativ.

După cum menționam deja în partea introductivă, la baza

simptomelor bolii se află declinul masiv al neuronilor dopaminergici din

ganglionii bazali, un domeniu subcortical al creierului, căruia îi revin

funcții importante în motricitate. Ca urmare apare un dezechilibru al

neurotransmițătorilor, când se instalează: un deficit de dopamină

inhibitoare și un exces relativ de acetilcolină și glutamat excitatoare.

În Parkinson excesul de acetilcolină determină apariția

simptomelor vegetative cunoscute: hipersalivație, transpirații profunde,

hipotensiune ortostatică, constipație, insomnii și tulburări de micțiune.

De aceea am considerat indicată investigarea efectului extractelor noastre

asupra unor enzime din grupul colinesterazelor, acestea fiind implicate în

degradarea acetilcolinei în exces. În lipsa unei astfel de acțiuni, am putea

spera că excesul de acetilcolină prezent în arealele afectate de boală ar

putea fi îndepărtat sub acțiunea enzimei, astfel reducându-se simptomele

vegetative.

Totodată se pare că există un focar inflamator continuu susținut

de metabolizarea la prostanoide proinflamatoare a acidului arahidonic

eliberat din membranele neuronale (sub acțiunea fosfolipazei A2).

Această metabolizare are loc ca urmare a intervenției a două enzime în

cascada acidului arahidonic și anume: ciclooxigenaza (COX) și

lipoxigenaza (LOX).

Având în vedere aspectele enumerate, am investigat în cadrul

studiului nostru efectul pe care cele 2 extracte l-ar putea avea asupra:

lipoxigenazei, colinesterazelor și asupra chelatării ionului feros, ca

parametru de urmărire a capacității antioxidante.

Stresul oxidativ joacă un rol central atât în procesul de

îmbătrânire căt și în patogeneza oricaror afecțiuni degenerative, astfel

încât organismul a dezvoltat mecanisme proprii de protecție pentru

menținerea unei homeostazii redox. Pentru a o ajuta însă, se poate

interveni și cu medicamente antioxidante, polifenolii și iridoidele fiind

cunoscute a avea proprietăți de acest gen, putând interveni prin activarea

16

sistemelor endogene de apărare față de speciile reactive de oxigen, prin

modularea unor procese de semnalizare celulară.

5.2.1.1 Determinarea potențialului de inhibare a colinesterazelor

Acetilcolinesteraza (AChE) catalizează hidroliza acetilcolinei la

colină şi acid acetic. Enzima este fixată pe membrana post-sinaptică de

la nivelul sinapselor colinergice şi al plăcii neuromotorii. Enzima

controlează cantitatea de neuromediator implicată în transmiterea

impulsului nervos către neuronul post sinaptic sau efectorul post-

sinaptic.

Butirilcolinesteraza (BuChE) sau pseudocolinesteraza este o

enzimă cu localizare predominantă în ficat şi plasmă şi care catalizează

hidroliza acetilcolinei sau a altor esteri ai colinei, inclusiv medicamente

cum sunt succinilcolina, mivacurium şi procaina (8). Inhibitorii enzimei

vor creşte disponibilul de neuromediator cu intensificarea procesului de

transmitere sinaptică şi ameliorarea declinului cognitiv la pacienţii cu

boală Alzheimer sau alte afecţiuni neurodegenerative (222). Studii

experimentale evidenţiază legătura dintre acetilcolinesterază şi difuzia

pre-amiloidului la nivel cerebral, structura nucleului plăcilor mature de

amiloid şi modificările vasculare din boala Alzheimer. De asemenea se

consideră că enzima induce fibrilogeneză prin formarea unor complexi

stabili AchE-β-amiloid (216, 127).

Compuşii de origine vegetală pot interacţiona cu grupările

funcţionale din centrul activ al enzimei sau cu alte grupări funcţionale ale

aminoacizilor din structura enzimei. Unii polifenoli inhibă

acetilcolinesteraza prin mecanism necompetitiv, aceştia formează

legături de hidrogen cu grupări ceto şi hidroxil din structura enzimei.

Gradul de inhibiţie este direct proporţional cu numărul grupărilor hidroxil

din structura inhibitorului (162). Creşterea ponderii fragmentelor lipofile

în detrimentul celor hidrofile în structura inhibitorului determină

reducerea acţiunii acestuia asupra AChE. Pentru alcaloizi (cum ar fi

galantamina utilizata ca martor) gradul de inhibiţie enzimatică depinde

de prezenţa unei grupări carbonilice în apropierea atomului de azot (38,

39). Blocarea intensă a enzimei va determina stimularea proceselor

neuronale, dar şi apariţia reacţiilor adverse consecutive suprastimulării

17

colinergice pe teritoriul parasimpatic, cum sunt: greţurile, vărsăturile,

diareea, durerile abdominale, dispepsia, deprimarea respiratorie şi

erupţiile cutanate. Având în vedere aceste reacţii adverse sunt de preferat

compuşii care induc o inhibiţie moderată a enzimei.

La determinarea capacității de inhibare a colinesterazelor, pentru

extractele de Ajuga reptans și Ajuga genevensis am obținut rezultatele

redate în tabelele XI și XII.

Tabel nr. XI: Inhibarea acetilcolinesterazei la tratarea acetilcolinei cu extract de Ajuga reptans

respectiv Ajuga genevensis, comparativ cu galantamina martor.

Probă 20 mg 10 mg 5 mg 2.5 mg 1.25 mg

0.625

mg

0.3125

mg

CE50

(µg/mL

soluție

finală)

Ajuga reptans 66.91±

0.04

45.14±

0.13

32.33±

0.12

27.87±

0.09

17.66±

0.11

14.07±

0.07

10.65±

0.10

583.67±

2.04

Ajuga

genevensis

63.84±

0.14

44.84±

0.12

35.71±

0.13

29.35±

0.18

15.68±

0.17

9.75±

0.08

4.60±

0.08

603.57±

2.76

Galantamină - - 95.39±

0.25

82.76±

0.18

73.23±

0.21

52.27±

0.20

33.24±

0.11

28.70±

0.20

Tabelul nr. XII: Inhibarea butirilcolinesterazei de catre extractele de vineriță și suliman,

comparativ cu galantamina martor.

Probă 20 mg 10 mg 5 mg 2.5 mg 1.25 mg

0.625

mg

0.3125

mg

CE50

(µg/mL

soluție

finală)

Ajuga reptans 75.46±

0.23

45.5±

0.20

29.29±

0.11

22.7±

0.10

17.30±

0.18

14.27±

0.08

8.76±

0.14

554.10±

2.62

Ajuga

genevensis

68.58±

0.28

49.3±

0.17

36.89±

0.31

29.8±

0.11

21.84±

0.25

14.45±

0.08

12.49±

0.11

512.56±

5.09

Galantamină - - 96.34±

0.11

83.0±

0.07

74.14±

0.14

59.73±

0.18

37.08±

0.05

23.20±

0.09

În fig. 5.14 sunt prezentate comparativ rezultatele obținute pentru

capacitatea extractelor de a determina inhibiția acetilcolinesterazei.

Pe lângă acțiunea inhibitoare asupra acetilcolinesterazei, a fost

investigată și influența extractelor asupra butirilcolinesterazei, deoarece

s-au observat că inhibitorii cu acțiune duală asupra celor două enzime

sunt de preferat celor cu acțiune selectivă (doar asupra AchE) (fig. 5.15).

S-a observat că odată cu progresia bolii Alzheimer, activitatea

BuChe este mai intensă comparativ cu cea a AChE. Unii inhibitori ai

18

BuChe au capacitatea de a reduce sau bloca agregarea β-amiloidului (fig.

5.14 și 5.15).

Fig. 5.14: Inhibiţia acetilcolinesterazei – extracte Ajuga genevensis (Ag) şi Ajuga reptans (Ar),

galantamina (G).

Fig. 5.15: Inhibiţia butirilcolinesterazei – extracte Ajuga genevensis (Ag) şi Ajuga reptans (Ar),

galantamina (G).

Compuşii multi-target sunt mai eficienţi în terapia bolii

Alzheimer, comparativ cu cei care îşi manifestă acţiunea printr-un singur

mecanism, Astfel mai eficienţi sunt cei care au atât efect inhibitor asupra

colinesterazelor cât şi efect antioxidant (234).

0

20

40

60

80

100

0,3125 0,625 1,25 2,5 5 10 20

% I

nh

ibiţ

ie

mg/mL

AgArG

0102030405060708090

100

0,3125 0,625 1,25 2,5 5 10 20

% I

nhib

iţie

mg/mL

AgArG

19

Extractele de Ajuga genevensis şi Ajuga reptans au blocat

colinesterazele, dar eficacitatea acestei inhibiţii este mult mai mică

comparativ cu cea indusă de galantamină, diferenţa de eficacitate fiind

extrem de semnificativă statistic (p<0,0001). Ambele extracte au inhibat

mai puternic butirilcolinesteraza comparativ cu acetilcolinesteraza.

5.2.1.2 Investigarea acțiunii extractelor asupra lipoxigenazei

Lipoxigenazele (5-, 12-, 15-lipoxigenaza) (EC 1.13.11.34; EC

1.13.11.31; EC 1.13.11.33) sunt metaloenzime care conţin un singur lanţ

polipeptidic cu două domenii, dintre care domeniul C-terminal este

catalitic. Aceste enzime conţin în centrul catalitic ionul feros sau ionul

feric în funcţie de implicarea în reacţia redox pe care o catalizează.

Domeniul catalitic prezintă o structură de tip „buzunar” care este

hidrofobă şi unde va fi fixat substratul a cărui transformare este catalizată

de enzimă (124).

La nivel cerebral 5-lipoxigenaza este implicată în sinteza

leucotrienelor, a acidului 5-hidroxi-eicosatetraenoic şi a acidului 5-

hidroxi-peroxieicosatetraenoic care induc inflamaţie şi neurodegenerare.

Inhibitorii acestei enzime, dar şi ai 12/15-lipoxigenazei cresc rezistenţa

neuronilor dopaminergici din sistemul nigrostriat, cresc conţinutul în

dopamină al acestor neuroni şi activitatea tirozin hidroxilazei implicată

în sinteza dopaminei (34).

Rezultatele obținute au evidențiat că extractele de Ajuga au

acţiune inhibitorie asupra 15-lipoxigenazei, mult mai redusă comparativ

cu cea indusă de cvercetol, asa cum reiese din tabelul XIII.

Tabel nr. XIII: Rezultatul determinărilor privind inhibarea lipoxigenazei de către extractele

testate (A. reptans și A. genevensis).

Probă 20 mg 10 mg 5 mg 2.5 mg

1.25

mg

0.625

mg

0.3125

mg

CE50

(µg/mL

solutie

finala)

Ajuga

reptans

- - 18.98±

0.27

15.28±

0.32

7.82±

0.21

4.02±

0.08

3.52±

0.18

-

Ajuga

genevensis

- - 22.10±

0.37

11.51±

0.28

9.63±

0.30

6.08±

0.36

3.45±

0.12

-

Cvercetol 100±0 100±0 77.45±

1.12

63.08±

0.86

53.98±

0.46

38.40±

0.36

25.33±

0.42

17.46±

0.32

20

Transpunerea grafică a valorilor înregistrate pentru cele două

extracte de Ajuga este prezentată în fig. 5.16.

Fig. 5.16: Inhibiţia lipoxigenazei – extracte Ajuga genevensis (Ag) şi Ajuga reptans (Ar),

cvercetol (C).

5.2.1.3 Evaluarea capacității de chelatare al ionului feros

Ionii feroşi sunt implicaţi în reacţia Fenton de sinteză a radicalului

hidroxil care este un oxidant neselectiv, unul din cei mai toxici compuşi

sintetizaţi în procesele metabolice celulare şi care va induce stres

oxidativ. Dintre compuşii organici, radicalul hidroxil va ataca mai ales

acizii graşi polinesaturaţi din structura fosfolipidelor membranare, cu

reducerea stabilităţii acesteia.

Compuşii capabili să chelateze ionul feros vor reduce rata de

sinteză a radicalului hidroxil şi vor bloca reacţiile de sinteză a radicalilor

organici la nivel celular (250).

În cadrul cercetărilor noastre, pentru extractele investigate am

obținut valori din care au fost calculate CE50 și care sunt redate în tabelul

XIV. Tabel nr. XIV: Capacitatea de chelatare a ionului feros (martor cvercetol).

Probă CE50 (μg/sol finală)

Ajuga reptans 457,51 ± 1,38

Ajuga genevensis 514,97 ± 2,72

Cvercetol 474,61 ± 4,28

0

20

40

60

80

100

0,3125 0,625 1,25 2,5 5 10 20

% I

nhib

iţie

mg/mL

AgArC

21

Valorile CE50 indică o capacitate de chelatare a ferului apropiată

de a cvercetolului pentru Ajuga reptans și Ajuga genevensis, cel mai activ

extract în ceea ce privește chelatarea fierului s-a dovedit a fi cel de Ajuga

reptans.

În fig. 5.17 sunt redate grafic valorile CE50 privind chelatarea

ferului de extractele de Ajuga sp.

Fig. 5.17: Chelatarea ferului – extracte Ajuga genevensis (Ag) şi Ajuga reptans (Ar), cvercetol

(C).

5.2.2 Cercetări in vivo privind potențialul anti-Parkinson al

extractelor evaluate

Cercetarea acțiunii biologice a celor 2 extracte incluse în studiu

s-a efectuat prin intermediul unui model experimental de inducere a bolii

Parkinson la șobolani.

Pentru o urmărire mai ușoară a acestora vom recapitula modul în

care au fost constituite cele șase loturi experimentale asupra cărora s-a

efectuat testul farmacologic. Fiecare lot a fost constituit din câte 5

animale de experiență, șobolani albi, masculi, rasa Wistar, cu vârsta de 4

luni, având la începutul experimentului o greutate de 320±10g.

Pentru a putea controla experimentul, extractele hidroetanolice

stoc de Ajuga reptans și Ajuga genevensis au fost prelucrate mai întâi

pentru obținerea unor extracte moi. Din extractele moi s-au preparat apoi

0

20

40

60

80

100

0,3125 0,625 1,25 2,5 5 10

% c

hel

atar

e

mg/mL

Ag

Ar

C

22

soluții prin diluare cu ser fiziologic, care au fost analizate chimic,

rezultatele pentru cele doua extracte fiind redate la punctul 5.1.

Loturile experimentale

Repartizarea animalelor incluse în test s-a făcut în 6 loturi, tratate

după cum urmează:

Lotul 1, grupul de control "fals operat" și injectat la 14 zile

intraperitoneal cu ser fiziologic,

Lotul 2, tratat cu neurotoxina 6-hidroxi-dopamina (6-OHDA)

și injectat la 14 zile intraperitoneal cu ser fiziologic (denumit

și grup martor),

Lotul 3, tratat cu 6-OHDA, și injectat la 14 zile cu extract de

Ajuga reptans 25 mg/mL intraperitoneal,


Ajuga reptans 75 mg/mL intraperitoneal,


Ajuga genevensis 25 mg/mL intraperitoneal,


Ajuga genevensis 75 mg/mL, intraperitoneal.

Au fost efectuate următoarele teste comportamentale:

testul labirintului Y- masoară activitatea locomotorie și

alternarea spontană,

testul labirintului cu brațe radiale- evaluează memoria de

lucru precum și memoria de referință; de asemeni au fost

calculate erorile memoriei de lucru și ale memoriei de

referință pe grup și pe zile,

testul labirintului cu brațe deschise- s-au calculat numărul de

intrări și timpul petrecut in brațele labirintului de loturile de

șobolani tratați cu cele două extracte,

testul înotului forțat- masoară timpul de imobilitate respectiv

timpul de înot al loturilor.

5.2.2.1 Teste comportamentale

A. Testul labirintului cu trei brațe

23

Testul Y-maze utilizat în cadrul acestui studiu cuantifică memoria

de scurtă durată (fig. 5.20) și comportamentul de căutare a recompensei

(fig. 5.19), bazându-se pe tendința rozătoarelor de a explora orice mediu

nou în care se află (121).

Nu

mă

ru

l d

e i

ntr

ări

în b

ra

te

Co

ntr

ol

6-O

HD

A

6-O

HD

A+A

. re

pta

ns (

25 m

g/k

g)

6-O

HD

A+A

. re

pta

ns (

75 m

g/k

g)

6-O

HD

A+A

. g

en

even

sis

(25 m

g/k

g)

6-O

HD

A+A

. g

en

even

sis

(75 m

g/k

g)

0

5

1 0

1 5

2 0

2 5

Fig. 5.19: Compararea activității locomotorii (evaluată prin numărul de intrări în brațe) pentru

loturile de șobolani tratate cu extract de Ajuga reptans 25mg/Kg și 75mg/kg și Ajuga genevensis

25mg/kg și 75 mg/kg.

Sp

on

tan

ep

us

alt

ern

ati

on

%

Co

ntr

ol

6-O

HD

A

6-O

HD

A+A

.rep

tan

s (

25 m

g/k

g)

6-O

HD

A+A

.rep

tan

s (

75 m

g/k

g)

6-O

HD

A+A

.gen

even

sis

(25 m

g/k

g)

6-O

HD

A+A

.gen

even

sis

(75 m

g/k

g)

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

Fig. 5.20: Procentul de alternare spontană între loturile tratate cu extract de Ajuga genevensis

25mg/kg și 75mg/kg și cele tratate cu Ajuga reptans 25mg/kg și 75 mg/kg: rezultate

comparative.

Conform datele obținute la testul labirintului cu trei brațe (Y-maze)

toate loturile tratate cu extracte de Ajuga sp. dovedesc o îmbunătățire a

24

memoriei de scurtă durată (MSD). Lotul tratat cu Ajuga reptans în doză

mare (de 75 mg/kg corp) înregistrează cea mai intensă activitate de

îmbunătățire a memoriei MSD comparabilă cu cea a animalelor din lotul de

control sănătoase.

B. Testul labirintului cu brațe radiale

Acest test evaluează memoria spațială a rozatoarelor (121), la

realizarea sa folosindu-se labirintul cu brațe radiale. Șobolanii au fost

testați individual pe parcursul a 7 zile consecutive după ce în prealabil 4

zile s-au acomodat cu labirintul și au învățat brațele în care a fost plasată

momeala.

A fost evaluată memoria de lucru (fig. 5.22 și 5.23), care este o

formă a memoriei de scurtă durată (MSD).

Fig. 5.22: Numărul erorilor memoriei de lucru pentru lotuturile tratate cu Ajuga reptans

25mg/kg și 75mg/kg.

Fig. 5.23: Numărul erorilor memoriei de lucru pentru loturile tratate cu Ajuga genevensis

25mg/kg 75mg/kg.

25

De asemenea au fost evaluate numărul erorilor memoriei de

referință (fig. 5.24 și 5.25), ca formă a memoriei de lungă durată (MLD).

În acest sens au fost contorizate numărul de erori ale memoriei de lucru

(reintrarea într-un braț marcat cu momeală) și numărul de erori ale

memorie de referință (intrarea într-un braț fără momeală).

Fig. 5.24: Numărul erorilor memoriei de referință pentru loturile tratate cu

extracte de Ajuga reptans 25mg/kg și 75mg/kg.

Fig. 5.25: Numărul erorilor memoriei de referință pentru loturile tratate cu

extracte de Ajuga genevensis 25mg/kg și 75mg/kg.

În cadrul studiului statistic efectuat, datele anterior prezentate au

fost defalcate de data aceasta pe loturi experimentale (fig. 5.26) și

respectiv pe zile, urmărid existența diferențelor care apar în ceea ce

privește erorile memoriei de lucru și respectiv, ale memoriei de referință.

26

A. B.

Fig. 5.26: Interpretarea statistică a erorilor memoriei de lucru pentru loturile evaluate: lotul

1=control; lotul 2= martor; lotul 3=tratat cu vineriță 25mg/kg corp, lotul 4= tratat cu vineriță 75

mg/kg corp, lotul 5 =tratat cu suliman 25mg/kg corp, lotul 6= tratat cu suliman 75 mg/kg corp.

Încercând să urmărim variația erorilor medii ale memoriei de

lucru defalcată pe zile, am obținut pentru loturile tratate cu extractele de

Ajuga reptans (loturile 3 și 4) rezultatele înregistrate în fig. 5.27A, iar

pentru loturile 5 și 6, cărora li s-a administrat extract de Ajuga

genevensis, cele redate în fig. 5.27B.

A. B.

Fig. 5.27: Erorile medii ale memoriei de lucru defalcate pe zile pentru grupurile experimentale

tratate cu A=Ajuga reptans (lot 3 si 4) respectiv, B=Ajuga genevensis (lot 5 si lot 6) comparativ

cu martorii (lot 1-control și lot 2-6-OHDA).

Încheind cu aprecierea memoriei de lucru la animalele de

experiență, am trecut la evaluarea erorilor medii în ceea ce privește

memoria de referință. Erorile medii ale memoriei de referință au fost

27

calculate în funcție de doi parametrii și anume: în funcție de lot (fig. 5.28)

și în funcție de zile (fig. 5.29).

A. B.

Fig. 5.28: Interpretarea statistică a erorilor memoriei de referință pentru loturile evaluate: lotul

1=control, fals operat; lotul 2= martor 6-OHDA; lotul 3 si 4 tratate cu vineriță 25 respectiv 75

mg/kg corp (A); loturile 5 si 6 tratate cu suliman 25 respectiv 75 mg/kg corp (B).

Defalcând pe zile rezultatele înregistrate cu privire la memoria

de referință pentru cele patru grupe experimentale, acestea s-au

prezentat după cum reiese din fig. 5.29A pentru vineriță și respectiv B,

pentru Ajuga genevensis.

A. B.

Fig. 5.29: Erorile memoriei de referință pentru cele 6 grupuri experimentale: A - Lot 1, 2

martori, Lot 3 și 4 tratați cu Ajuga reptans 25 și 75 mk/kg corp și B - Lot 5 și 6 tratați cu Ajuga

genevensis 25 și 75 mg/ kg corp (defalcare pe zile).

Conform rezultatelor înregistrate la testul labirintului cu brațe-

radiale (radial arm-maze) toate loturile tratate cu extracte de Ajuga sp. au

28

avut îmbunătățiri în ceea ce privește memoria de lungă durată (MLD) atât

comparativ cu martorii netratați dar și raportat la rezultatele obținute de

control. Lotul tratat cu extract de Ajuga genevensis în doză mică (de 25

mg/kg corp) dovedește cea mai intensă acțiune de îmbunătățire a

memoriei MLD dar și a memoriei de scurtă durată (MSD), intensitatea

efectului menținâdu-se relativ constantă pe parcursul celor 7 zile de

administrare.

C. Testul labirintului cu brațe deschise

Acest test este utilizat pentru a evalua efectele anxiolitice

respectiv anxiogenice provocate de diferiți agenți farmacologici la

rozătoare (23), în cazul nostru acesta fiind constituit din extractele de

Ajuga reptans și Ajuga genevensis, pentru care au fost evaluate numărul

de intrări în brațele deschise care reflectă activitatea locomotorie (fig.

5.31) și respectiv timpul petrecut în brațele dechise care reflectă

proprietățile anxiolitice ale extractelor (fig. 5.32).

A. B.

Co

ntr

ol

6-O

HD

A

6-O

HD

A+

A.

ge

ne

ve

ns

is (

25

mg

/kg

)

6-O

HD

A+

A.

ge

ne

ve

ns

is (

75

mg

/kg

)0 .0

0 .5

1 .0

1 .5

2 .0

Nu

mă

rul

de

in

tră

ri î

n

bra

tele

de

sc

his

e

Fig. 5.31: Numărul de intrări în brațele deschise pentru loturile de șobolani tratate cu extract de

A- Ajuga reptans 25mg/kg și 75mg/kg si B- Ajuga genevensis 25mg/kg și 75mg/kg.

În urma efectuării testului labirintului cu brațe deschise (elevated

plus-maze) rezultatele obținute pun în evidență acțiunea anxiolitică a

extractelor de Ajuga sp., doza mare de Ajuga genevensis (75 mg/kg corp)

29

a înregistrat activitatea anxiolitică cea mai intensă depașind-o pe cea a

lotului de control neintoxicat.

A. B.

Co

ntr

ol

6-O

HD

A

6-O

HD

A+

A. re

pta

ns (

25 m

g/k

g)

6-O

HD

A+

A. re

pta

ns (

75 m

g/k

g)

0

5

1 0

1 5

2 0

2 5

Tim

pu

l p

etr

ec

ut

în

bra

tele

de

sc

his

e

(%)

p < 0 .0 1

p < 0 .0 0 1

Fig. 5.32: Timpul petrecut în brațele deschise pentru grupurile de șobolani tratate cu extract de

A - Ajuga reptans 25mg/kg și 75mg/kg și B - Ajuga genevensis de 25mg/kg și 75mg/kg.

5.2.3.4 Testul înotului forțat

Testul este utilizat pentru evaluarea acțiunii antidepresive (123),

când șobolanii sunt forțați să înoate într-un spațiu limitat, după o perioadă

inițială de luptă, vor deveni imobili, pierzându-și speranța de

supraviețuire, stare care corespunde cu depresia mentală.

Au fost măsurate: timpul de imobilitate (fig. 5.34) care ne indică

faptul că animalul a renunțat la speranța de supraviețuire, dar și timpul

de înot (fig. 5.35) care indică încercarea de adaptare și de a lupta cu

situația dată (componenta motivațională).

Comportamentul de înot respectiv de imobilitate

operaționalizează conceptul de motivație pentru supraviețuire care este

asociată potențialul antidepresiv al extractelor. Rezultatele obținute în

cadrul testului înotului forțat (forced swimming test) dovedesc faptul că

loturile tratate cu extracte de Ajuga sp. (în doză mică și mare) au avut

rezultate semnificativ mai mari (p<0,0001) în ceea ce privește motivația

pentru supraviețuire (operaționalizată prin timpul de înot respectiv timpul

de imobilitate) comparativ cu martorii netratați, depăsind mult și

30

rezultatele obținute de animalele sănătoase. Doza mare de Ajuga

genevensis (75 mg/kg corp) a avut efectul cel mai intens.

A. B.

Tim

pu

l d

e i

mo

bil

ita

te (

s)

Co

ntr

ol

6 -OH

DA

6 -OH

DA

+A

. re p

tan

s (2 5 m

g/k

g)

6 -OH

DA

+A

. re p

tan

s (7 5 m

g/k

g)

0

1 0 0

2 0 0

3 0 0p < 0 ,0 0 0 1

p < 0 ,0 0 0 1

Fig. 5.34: Timpul de imobilitate pentru grupurile tratate cu extract de A - Ajuga reptans

25mg/kg și 75mg/kg și respectiv de B - Ajuga genevensis 25mg/kg și 75mg/kg.

A. B.

Tim

pu

l d

e î

no

t (s

)

Co

ntr

ol

6 -OH

DA

6 -OH

DA

+ A. r

e pta

ns (

2 5 mg

/kg

)

6 -OH

DA

+ A. r

e pta

ns (

7 5 mg

/kg

)0

1 0 0

2 0 0

3 0 0

4 0 0

p < 0 ,0 0 0 1

p < 0 ,0 0 0 1

Tim

pu

l d

e î

no

t (s

)

Co n tr

o l

6 -OH

DA

6 -OH

DA

+ A. g

e n e v e n s is (2

5 mg /k

g )

6 -OH

DA

+ A. g

e n e v e n s is (7

5 mg /k

g )0

1 0 0

2 0 0

3 0 0

4 0 0

p < 0 ,0 0 0 1

p < 0 ,0 0 0 1

Fig. 5.35: Timpul de înot pentru grupurile tratate cu extract de A - Ajuga reptans 25mg/kg și

75mg/kg și B - Ajuga genevensis 25mg/kg și 75mg/kg.

31

CAPITOLUL 6: Contribuții la studiul farmacognostic și biologic al

extractelor obținute din speciile de Leuzea carthamoides și Leuzea

salina: Rezultate și Discuții

6.1 Analiza farmacognostică a speciilor Leuzea carthamoides și

Leuzea salina

Pentru cele două specii de Leuzea, Leuzea carthamoides (Willd)

Iljin și Leuzea salina nemenționată ca atare în literatură, am întreprins o

serie de cercetări care au urmărit evidențierea:

caracterelor morfologice și histoanatomice; în urma acestora

speram să putem lămuri dacă în cazul a ceea ce în cursul tezei

am denumit Leuzea salina este vorba de o chemovarietate

derivată de la Leuzea carthamoides, sau chiar vorbim de o

specie nemenționată în literatură (202);

anumite elemente importante și eventual diferențiale, cum ar

fi celulele epidermice de pe fața inferioară și superioară ale

frunzelor, glandele salinifere, perii tectori, stomatele, au fost

studiate și cu ajutorul microscopului electronic de baleiaj;

componentelor chimice, din cele două mostre de Leuzea,

astfel in extractele realizate au fost investigate în primul rând

componentele de tip ecdisteroidic și polifenolic, înțelegând

prin aceasta flavonoidele totale și polifenolii totali.

În acest context, am efectuat analiza cromatografică pe strat

subțire (care nu ne-a adus foarte multe clarificări), urmată de determinări

cantitative utilizând în acest scop spectrofotometria, pentru a finaliza

apoi cercetarea chimică apelând la tehnica UHPLC.

Studiul chimic calitativ și cantitativ a fost completat cu

investigarea unor efecte biologice ale extractelor, prin teste in vitro și in

vivo, rezultatele fiind prezentate în capitolul VII al tezei.

6.1.2 Studiul histoanatomic al speciilor de Leuzea

Fiind o specie medicinală, Leuzea carthamoides a mai fost

studiată, dar în literatura de specialitate consultată există puține date

privind anatomia și structura acesteia (169), fapt ce a impus realizarea

unui studiu de acest fel pentru materialul vegetal provenit din cultura

32

inițiată la Centrul de Cercetări Biologice Stejarul din Piatra Neamț.

Prelevarea indivizilor s-a făcut în vara anului 2017.

Pentru Leuzea salina probabil că nu există cercetări

histoanatomice deoarece în literatura de specialitate nici nu este

menționată ca atare. Materialul nostru vegetal a provenit din flora

spontană și a fost recoltat în anul 2017 de pe marginea șoselei Iași-

Lețcani (în apropierea localității Valea Lupului).

6.1.2.1 Leuzea carthamoides

Aspectul histoanatomic al tulpinei aeriene:

Aceasta este extrem de scurtă, cu structură primară incipientă, în

care nu s-au diferențiat țesuturile conducătoare, fiind înconjurată de mai

multe frunze de mărime și vărstă diferită, realizând câteva cercuri

concentrice (fig. 6.4A). Frunzele de pe cele 3-4 cercuri concetrice au

marginile apropiate realizând forma revolută.

La toate grosimea limbului descrește spre margini, nervura

mediană fiind vizibil proeminentă la fața externă, iar fasciculele

conducătoare, de mărime diferită sunt dispuse în profunzimea

mezofilului parenchimatic (fig. 6.4). A. B.

Secțiunea prin frunză:

Fig. 6.4: Secțiune transversală prin tulpina de Leuzea carthamoides: A. imagine generală, B.

detaliu (fotografii originale).

Frunza matură prezintă un pețiol (fig. 6.5) de formă semicirculară

în secțiune transversală, având un șanț adaxial larg și superficial,

delimitat de 2 creste latero-adaxiale în al căror parenchim omogen se

33

observă câte un fascicul conducător foarte mic, localizat în dreptul unui

cordon subțire de colenchim hipodermic.

Epiderma prezintă celule izodiametrice cu peretele extern ușor

mai îngroșat decât ceilalți și slab cutinizat. Din loc în loc se observă

stomate. Parenchimul fundamental are celule a căror mărime descrește

spre interiorul organului. Stratul hipodermic este ușor colenchimatizat,

iar în cele 2 creste latero-adaxiale celulele de colenchim au pereții vizibil

îngroșați.

Partea centrală a pețiolului este ocupată de o cavitate aeriferă

largă, cu intrânduri vizibile în parenchimul interfascicular. Fasciculele

conducătoare, în număr de aproximativ 10, de mărime diferită și dispuse

pe un arc, sunt formate din liber (tuburi ciuruite și celule anexe) și lemn

(vase și parenchim lignificat), fig. 6.5. A. B.

Fig. 6.5: Secțiune transversală prin pețiolul de Leuzea carthamoides: A. imagine generală, B.

detaliu (fotografii originale).

La microscopul electronic de baleiaj, pețiolul de Leuzea

carthamoides apare ca în fig. 6.6.

Fig. 6.6: Pețiolul de Leuzea carthamoides văzut la microscopul electronic (fotografii originale).

34

Limbul frunzei mature (fig. 6.7) are nervura mediană vizibil

proeminentă la fața inferioară și o creastă slab proeminentă la fața

superioară. Epiderma prezintă celule izodiametrice mai mici la fața

inferioară a limbului, cu pereții subțiri, iar din loc în loc se observă peri

tectori lungi, pluricelulari, cu vârful obtuz sau ascuțit. În aceeași

epidermă pot fi observate și formațiuni secretoare de săruri.

Mezofilul este gros, diferențiat în țesut palisadic la fața superioară

și țesut lacunos la fața inferioară, deci limbul are o structură bifacială-

heterofacială (dorsi-ventrală).

Țesutul palisadic este bi- sau tristratificat, cu celule relativ scurte

și largi, ocupând aproximativ 40% din grosimea mezofilului (fig.6.7).

A. B

Fig. 6.7: Secțiune transversală prin limbul foliar de Leuzea carthamoides: A. nervură principală,

B. mezofil (fotografii originale).

Țesutul lacunos, mai gros decât cel palisadic are celule mari

separate de lacune aerifere. În mijlocul nervurii mediane este o cavitate

aeriferă largă, de formă neregulată, adesea în contact cu fasciculele

conducătoare. Acestea, în număr de 3 formează un arc și au o structură

primară, cu liberul spre fața inferioară (format din tuburi ciuruite și celule

anexe) și lemn spre fața superioară (format din vase și parenchim ușor

lignificat). Această cavitate este înconjurată de parenchim omogen lipsit

de cloroplaste.

Între nervurile laterale de ordinul I se află mai multe fascicule

conducătoare, dar mai mici decât cele din nervura mediană, toate cu

structură primară (fig. 6.7).

35

La microscopul electronic de baleiaj epiderma prezintă celule cu

contur neregulat și de mărime uniformă, cu peretele ondulat și stomate,

prezente la nivelul ambelor epiderme, și peri tectori (fig. 6.8, fig. 6.9).

A. B.

Fig. 6.8: Epidermă foliară superioară la Leuzea carthamoides văzută de față: A. imagine de

ansamblu, B. stomată (fotografii originale).

A. B.

Fig. 6.9: Epidermă foliară inferioară la Leuzea carthamoides văzută de față: A. imagine de

ansamblu, B. păr tector (fotografii originale).

6.1.2.2 Leuzea salina

Studiul histoanatomic al tulpinii:

Conturul secțiunii transversale este circular costat, în coaste fiind

vizibile cordoane hipodermice de colenchim. Epiderma prezintă celule

izodiametrice în dreptul coastelor și ușor alungite tangențial în dreptul

valeculelor. Scoarța este foarte subțire, cu cavități aerifere din loc în loc.

36

Cilindrul central este gros și cuprinde: un inel de fascicule

conducătoare libero-lemnoase, de tip colateral; un parenchim

fundamental lignificat în poziție interfasciculară și celulozic în

vecinătatea cavității aerifere centrale.

Fasciculele conducătoare, în număr mare și de mărime diferită,

prezintă câte un cordon gros perifloemic de elemente sclerenchimatice la

exterior, o zonă subțire subadiacentă de liber și o alta internă, mai groasă,

de lemn. Elementele sclerenchimatice perifloemice au pereții puternic

îngroșați și intens lignificați, mărimea și gradul lor de lignificare

descrescând de la periferie spre liber. Liberul prezintă tuburi ciuruite și

celule anexe, care adesea se dezorganizează rezultând cavități aerifere de

mărimi diferite. Lemnul prezintă vase cu dispoziție neregulată și de

diametru diferit, separate de parenchim celulozic în curs de

dezorganizare spre interior și celule de parenchim lignificat spre exterior.

La fața internă a fasciculelor conducătoare se află o calotă de țesut

mecanic, formată din celule cu pereții mai subțiri decât cele din cordonul

gros perifloemic. Parenchimul interfascicular are celule cu pereții subțiri,

dar ușor lignificați. Cavitatea aeriferă centrală foarte mare este

înconjurată de parenchim celulozic (fig. 6.14).

A. B.

Fig. 6.14: Secțiune transversală prin tulpina de Leuzea salina: A. imagine de ansamblu, B.

fascicul conducător (fotografii originale).

La microscopul electronic de baleiaj se observă, printre celulele

epidermice de mărime diferită, formațiuni salifere cu structură de tip

special (fig. 6.15), care nu existau la Leuzea carthamoides, provenite

din câmpul de cultură de la Piatra Neamț (202).

37

A. B.

Fig. 6.15: Tulpina de Leuzea salina văzută la microscopul electronic de baleiaj: A. imagine de

ansamblu; B. formațiuni salifere (fotografii originale).

Sectiunea prin limbul foliar:

În secțiune transversală prin limb, nervura mediană este groasă și

proeminenta la fața inferioară. În grosimea nervurii mediene predomină

parenchimul lipsit de cloroplaste în care există mai multe (10-12)

fascicule conducătoare, de mărime diferită, dispuse pe un arc, toate cu

structură primară.

Epiderma prezintă celule ușor alungite tangențial cu peretele

extern ușor mai îngroșat decât ceilalți și slab cutinizat. Din loc în loc se

observă peri tectori pluricelulari, relativ scurți, și glande salifere,

inexistente la Leuzea carthamoides. Mezofilul este aproape în totalitate

de tip palisadic, cu celule relativ scurte și largi, așadar limbul are o

structură bifacială izofacială (ecvifacială) (fig. 6.16 A. B.

Fig. 6.16: Secțiune transversală prin limbul foliar de Leuzea salina: A. nervură mediană, B.

mezofil (fotografii originale).

38

Indiferent de mărime toate fascicule conducătoare au liberul

format din tuburi ciuruite și celule anexe și lemnul format din vase

separate de celule parenchimatice cu pereții groși și intens lignificați spre

liber. La fasciculele mari se observă câte un cordon perifloemic de

elemente colenchimatizate și câteva celule mecanice cu pereții moderat

îngroșați și lignificați. La microscopul electronic de baleiaj celulele

epidermice de pe față inferioară și superioară a limbului foliar, apar cu

contur neregulat, cu pereții laterali neregulat ondulați, iar printre ele se

observă stomate, care au formă eliptică, iar pereții ce delimitează ostiola

sunt foarte groși (fig. 6.17 și 6.18). A. B.

Fig. 6.17: Epiderma inferioară a limbului foliar de Leuzea salina vazută la microscopul

electronic de baleiaj: A. imagine de ansamblu, B. stomată (fotografii originale).

A. B.

Fig. 6.18: Epiderma superioară a limbului foliar de Leuzea salina vazută la microscopul

electronic de baleiaj: A. imagine de ansamblu, B. stomată (fotografii originale).

39

Analizând secțiunile transversale practicate prin rădăcina,

rizomul, tulpină și limbul foliar a celor două specii de Leuzea incluse în

studiu am constatat o serie de asemănări care sunt normale pentru plante

aparținând aceluiași gen dar și o serie de diferențe atât la nivelul

rizomului cât și al rădăcinii, a tulpinii aeriene, și a limbului foliar;

asemănările morfologice dintre cele două materiale de Leuzea investigate

sunt normale pentru specii aparținând aceluiași gen.

Singura diferență majoră constă în existența unor formarțiuni

salifere, evidențiate la microscopul electronic de baleiaj, doar în cazul

indivizilor de Leuzea salina; în literatura de specialitate consultată nu am

găsit date cu privire la existența unor astfel de formațiuni, nici măcar

pentru specia Leuzea carthamoides. Asta nu înseamnă însă că vorbim cu

adevarat de două specii diferite, Leuzea carthamoides și Leuzea salina,

ci poate fi vorba de o varietate chimică a primei specii, care însă s-a

dezvoltat pe un teren inițial mlăștinos, transformat în cursul verii în

sărătură.

6.2 Contribuții la analiza fitochimică a extractelor de Leuzeae herba

(L. carthamoides și L. salina)

Materialul vegetal analizat din punct de vedere fitochimic în

lucrarea de față a fost prelevat în anul 2018 și 2019; plantele de Leuzea

carthamoides au provenit din câmpul experimental de la C.C.B. Piatra

Neamț (fiind deci exemplare de cultură, la noi în țară specia negăsindu-

se în flora spontană) în timp ce plantele de Leuzea salina au fost recoltate

din flora spontană de pe un câmp mlăștinos și sărăturos din apropiere de

Iași.

Partea aeriană înflorită a celor două specii de Leuzea a fost uscată,

extrasă conform indicațiilor de la punctul 4.2, extractele rezultate fiind

analizate prin:

cromatografie pe strat subțire, pentru flavone și polifenoli,

determinări spectrofotometrice pentru polifenoli totali și

flavone,

40

UHPLC, când s-a urmărit natura polifenolilor și

ecdisteroidelor, care totodată au fost cuantificate.

6.2.1 Determinarea spectrofotometrică a polifenolilor totali și a

flavonoidelor din extractele celor două specii de Leuzea

Rezultatele determinării cantitative a polifenolilor totali și a

flavonoidelor din extractele obținute din rădăcinile de Leuzea

carthamoides și Leuzea salina (recolta anului 2018) pot fi exprimate

grafic ca în fig. 6.25.

Fig. 6.25: Cele mai importante grupe de principii active determinate in probele de Leuzea

investigate.

Se observă încă de la început că există diferențe cantitative

importante între cele două specii în ceea ce privește conținutul în

polifenoli totali și respectiv flavonoide.

Precizăm că din punct de vedere cantitativ, extractul de L.

carthamoides este mult mai bogat în fracțiunile urmărite (flavonoide și

polifenoli), diferențele fiind de două sau chiar trei ori mai mari la specia

recunoscută botanic, comparativ cu L. salina.

Valorile obținute în cursul studiului nostru pentru mostra de

Leuzea carthamoides analizată sunt asemănătoare cu cele din literatura

0 50 100 150 200 250 300 350 400

Leuzea salina

Leuzea carthamoides

concentrație (g %)Leuzea salina Leuzea carthamoides

Flavonoide 47,33 178,94

Polifenoli totali 119,23 349,44

41

de specialitate, dar datele pentru Leuzea salina nu pot fi verificate din

lipsa studiilor pe această temă (74, 146, 188, 233, 238, 239).

Cu toate că literatura de specialitate nu menționează specia

Leuzea salina, cercetările din lucrarea de față pun problema existenței

acestei specii spontane în țara noastră. Deși este încă prematur să

afirmăm că datele analizei chimice indică existența unei variabilități între

cele două specii (deci variabilitate interspecifică), la o primă vedere se

poate specula acest aspect, deoarece între cele două probe există o

variabilitate chimică marcată.

Pentru confirmarea și validarea acestor considerații se impune o

analiză chimica pe un număr de cel puțin 6 ani, și care să aprofundeze

calitativ și cantitativ spectrul de principii bioactive existente în probele

de Leuzea incluse în studiu. Aceasta ar presupune totodată aducerea în

cultură la C.C.B. Piatra Neamț a unor exemplare de Leuzea salina, care

ar avea la dispoziție aceleași condiții de sol și mediu înconjurător ca

Leuzea carthamoides, fără a mai exista intervenția solului sărăturos și

mlăștinos.

6.2.2 Identificarea și cuantificarea unor componente bioactive din

extractele de Leuzea, utilizând tehnica UHPLC

Apelând la analiza cromatografică ultrarapidă de lichide în fază

inversă și verificând raportul dintre diferitele componente identificate în

probe, ne-am putut da seama că din punct de vedere majoritar speciile

conțin: acid clorogenic, luteolină și kemferol, acid ferulic, elagic, β-

sitosterol, alături de o serie de componente minore.

Prin tehnica de cromatografie lichidă a fost confirmată prezența

următorilor derivați polifenolici în cele două probe: acid clorogenic, acid

galic, acid ferulic, precum și derivați glucozidați ai cvercetolului,

kemferolului și luteolinei.

Astfel de principii active au fost identificate și de către alți autori

în extracte obținute din L. carthamoides.

În fig. 6.26 sunt redate cromatogramele UHPLC obținute la

analiza extractelor hidroalcoolice de Leuzea la λ=245 nm, pentru

ecdisteroizi și iridoide.

42

Fig. 6.26: Cromatogramele UHPLC pentru extractele de Leuzea la λ=245 nm

L. carthamoides (albastru); L. salina (negru).

Deoarece proba de L. carthamoides s-a dovedit a fi mult mai

bogată în principii active decât L. salina, cromatogramele din figură au

fost redate la amplitudinea maximă a peak-urilor (fig. 6.27).

Fig. 6.27: Detaliu al cromatogramelor UHPLC (λ=245 nm), unde: L. carthamoides (albastru), L.

salina (negru); Etaloane: 1. 20-OH-ecdisonă; 2. izomeri ai hidroxiedcisonei; 3. α-ecdisona; 4.

rutozida.

Calculând conținutul în ecdisteroizi evidențiați în extractele de L.

carthamoides și L. salina studiate prin UHPLC, am obținut valorile

redate în tabelul XV.

43

Tabel nr. XV: Ecdisone identificate în extractele din radacini de Leuzea sp.

Compus (mg /g pv) Extract

L. salina L. carthamoides

20-OH-ecdisona 3.0654 4.3506

α-ecdisona 1.6358 5.2942

alte ecdisteroide 1.7813 3.6546

Deoarece acești compuși nu sunt stabili și tautomerizează ușor

chiar și în condiții de lucru blânde (cantități și concentrații mici de acizi,

în acest caz acid fosforic la eluare), sunt greu de izolat din materialul

vegetal. De cele mai multe ori, prezența compușilor acestora a fost

evidențiată mai ales în absența completă a mediului acid.

Totuși, evidențierea spectrelor și a standardelor ne-a permis

identificare și cuantificarea cu precizie a 20-OH-ecdisonei și a α-

ecdisonei. Am regăsit însă între componentele identificate și spectre care

se înscriu în domeniul ecdisteroidelor, pe care le-am cuantificat ca un

total ecdisonic.

Analizând prin HPLC extractele la lungimea de undă λ= 280 și

275 nm, probele fiind prelucrate identic (același solvent, timp de

extracție, aceeași concentrație de 4mg/mL și cantitate identică injectată –

5 μl de către autosampler) am obținut curbele cromatografice redate în

fig. 6.28 și 6.29.

Fig. 6.28: Cromatogramele UHPLC pentru cele două extracte de Luzea înregistrate la

λ=280 nm; L. carthamoides (albastru), L. salina (negru).

44

Fig. 6.29: Identificarea peak-urilor pentru flavonoidele din extractele de Leuzea la

λ= 275 nm; Legendă: L. carthamoides (albastru), L. salina (negru); Etaloane: 1. epicatehină; 2.

acid clorogenic; 3. acid elagic; 4. rutozida; 5. lueolin-glucozida; 6. acid ferulic; 7. kemferol-

glucozida; 8. luteolina; 9. sitosterol; 10. kemferol.

Pentru a putea urmări cu mai mare acuratețe prezența acizilor

polifenolcarboxilici în extractele analizate, au fost înregistrate

cromatogramele UHPLC la lungimea de undă λ=330 nm; imaginile sunt

redate în fig. 6.30.

Fig. 6.30: Cromatograme UHPLC inregistrate la 330 nm pentru cele două probe de Leuzea

incluse în studiu. Legendă: L. carthamoides (albastru), L. salina (negru), Etaloane: 1.

epicatehină; 2. acid clorogenic; 3. acid elagic; 4. rutozida; 5. lueolin-glucozida; 6. acid ferulic;

7. kemferol-glucozida; 8. luteolina; 9. sitosterol; 10. kemferol.

45

Rezultatele înregistrate în cursul acestor determinări sunt

prezentate în tabelul XVI care redă natura și cantitatea polifenolilor

existenți în materialul vegetal.

Tabel nr. XVI: Polifenoli identificați și cuantificați în probele de Leuzea investigate.

Nr. Compus (mg /g pv) Extract

L. salina L. carthamoides

1. epicatehină 0.8665 3.3547

2. acid clorogenic 3.1477 52.3850

3. acid elagic 0.8430 4.2942

4. rutozidă 0.9639 0.6479

5. lueolin-glucozida 0.5062 3.3896

6. acid ferulic 4.0845 4.5096

7. kemferol-glucozidă 0.6402 2.6048

8. luteolină 1.2171 9.3322

9. sitosterol 0.6487 5.2996

10. kemferol 3,8061 9.1120

Din aceste date se remarcă prezența în cantități ridicate a acizilor

polifenolici față de fracțiunea flavonoidică, tendință care se păstrează la

ambele specii. Mai mult, se evidențiază că odată cu aceste clase de

compuși s-au mai extras și taninuri, precum și mici cantități de sitosterol.

Conform rezultatelor se poate concluziona că specia Leuzea

carthamoides este mai valoroasă din punct de vedere compozițional decât

Leuzea salina, atât în ceea ce privește conținutul în polifenoli cât și în

ecdisone.

Studiile de specialitate publicate menționează existența acelorași

compuși, dar o cuantificare amănunțită a acestora nu a fost realizată până

în prezent. Totodată, sursele bibliografice actuale nu conțin nici o referire

la specia sau chemovarietatea Leuzea salina.

6.3 Contribuții la evaluarea potențialului biologic al extractelor de

Leuzea sp.

Investigarea acțiunii biologice s-a realizat cu ajutorul:

testelor biochimice, când a fost urmarită influența extractelor

asupra unor componente implicate în procesul degenerativ al

neuronilor din boala Parkinson, și

46

unui test farmacologic, în care reactivul animal a fost

reprezentat de pești din specia Danio rerio.

6.3.1 Evaluarea potențialului antioxidant si anticolinesterazic al

extractelor de Leuzea sp.

6.3.1.1 Determinarea potențialului de inhibare a colinesterazelor

Pentru extractele de Leuzea probe de concentrații diferite au fost

evaluate privind inhibarea acțiunii colinesterazelor, rezultatele obținute

sunt redate în tabelele XVII și XVIII.

Tabel nr. XVII: Inhibarea acetilcolinesterazei la tratarea acetilcolinei cu extract de Leuzea

carthamoides și Leuzea salina, comparativ cu galantamina martor.


1.25

mg

0.625

mg

0.3125

mg

CE50

(µg/mL

solutie

finala)

Leuzea

carthamoides

90.60±

0.16

75.39±

0.23

64.45±

0.17

34.72±

0.14

22.68±

0.07

13.77±

0.11

11.73±

0.08

178.41±

0.64

Leuzea

salina

96.42±

0.14

76.88±

0.09

54.78±

0.15

36.56±

0.12

22.89±

0.03

13.71±

0.17

7.68±

0.06

208.43±

1.12

Galantamina - - 95.39±

0.25

82.76±

0.18

73.23±

0.21

52.27±

0.20

33.24±

0.11

28.70±

0.20

Tabelul XVIII: Inhibarea butirilcolinesterazei de catre extractele Leuzeae herba, comparativ cu

galantamina martor.


1.25

mg

0.625

mg

0.3125

mg

CE50

(µg/mL

solutie

finala)

Leuzea

carthamoides

92.45±

0.47

86.77±

0.04

62.14±

0.08

35.23±

0.21

21.15±

0.07

10.21±

0.04

2.43±

0.06

182.86±

0.65

Leuzea

salina

97.58±

0.32

89.62±

0.11

62.75±

0.25

39.40±

0.14

32.37±

0.34

18.74±

0.26

11.93±

0.09

171.23±

0.96

Galantamina - - 96.34±

0.11

83.08±

0.07

74.14±

0.14

59.73±

0.18

37.08±

0.05

23.20±

0.09

Extractele de Leuzea salina au efecte inhibitorii mai intense

asupra BuChE comparativ cu AChE, valoarea CE50 fiind de 171,23 ±

0,96 µg/mL şi respectiv 208,43 ± 1,12 µg/mL.

47

Pentru extractul de Leuzea carhtamoides efectul inhibitor este

mai intens faţă de AChE (CE50 178,40 ± 0,64 µg/mL) comparativ cu

BuChE (CE50 182,86 ± 0,65 µg/mL).

Reprezentarea grafică a intensității de acțiune a extractelor asupra

AChE și BuChE este redată în fig. 6.31 și 6.32.

Fig. 6.31: Inhibiţia acetilcolinesterazei – de către extractele Leuzea salina (Ls) şi Leuzea

carthamoides (Lc), martor: galantamina (G).

Fig. 6.32: Inhibiţia butirilcolinesterazei – de către extractele de Leuzea salina (Ls) şi Leuzea

carthamoides (Lc), martor: galantamina (G).

Blocarea colinestrazelor sub acţiunea celor 2 extracte vegetale

este de intensitate mai mică comparativ cu cea indusă de galantamină,

0

20

40

60

80

100

0.3125 0.625 1.25 2.5 5 10 20

% I

nhib

iţie

mg/mL

LsLcG

0102030405060708090

100

0,3125 0,625 1,25 2,5 5 10 20

% I

nh

ibiţ

ie

mg/mL

Ls

Lc

G

48

ceea ce prezintă un avantaj la pacienţii cu boală Parkinson şi declin

cognitiv datorită deficitului de acetilcolină la nivelul sinapselor cerebrale.

O acţiune inhibitorie enzimatică intensă va permite un control mai

bun al declinului cognitiv, dar în acelaşi timp va reduce din acţiunea

terapeutică a medicamentelor utilizate în terapia bolii Parkinson.

Acţiunea inhibitorie mai redusă a celor 2 extracte, comparativ cu

a galantaminei subliniază avantajul pe care utilizarea acestora în cazul

bolii Parkinson însoţită de declin cognitiv l-ar putea avea în sensul

reducerii de efecte adverse.

6.3.1.2 Investigarea acțiunii de inhibare a lipoxigenazei

În procesul de degenerare neurologică caracteristică bolii

Parkinson sunt implicate activ lipoxigenazele prin generarea unor

citokine de tip leucotriene dar și a unor acizi cum ar fi acidul 5-hidroxi-

eicosatetraenoic și acidul 5-hidroxi-peroxieicosatetraenoic care

determină inflamație și neurodegenerare.

După cum a rezultat din studiul nostru, extractele de Leuzea au

acţiune inhibitorie asupra 15-lipoxigenazei, însă mai redusă decât cea a

cvercetolui, așa cum reiese din tabelul XIX.

Tabel nr. XIX: Rezultatul determinărilor privind inhibarea lipoxigenazei de către extractele

testate (martor cvercetol).


1.25

mg

0.625

mg

0.3125

mg

CE50

(µg/mL

solutie

finala)

Leuzea

carthamoides

- - 49.47±

0.59

25.47±

0.90

12.55±

1.03

8.92±

0.42

7.57±

0.40

-

Leuzea

salina

- 27.49±

1.19

18.30±

0.19

12.48±

0.46

9.98±

0.18

8.30±

0.30

4.79±

0.19

-

Cvercetol 100±0 100±0 77.45±

1.12

63.08±

0.86

53.98±

0.46

38.40±

0.36

25.33±

0.42

17.46±

0.32

Capacitatea de inhibiţie enzimatică a celor 2 extracte analizate

este redusă; pentru nici unul dintre acestea nu s-a obţinut o inhibiţie mai

mare de 50%, motiv pentru care nu s-a calculat valoarea CE50 (fig. 6.33).

49

Dacă ne referim la eventualul mecanism de acțiune, am putea

presupune că substanțele active prezente în extractele de Leuzea ar putea

bloca enzima prin mai multe căi.

Reprezentarea grafică a intensității de acțiune a extractelor asupra

lipoxigenazei este redată în fig. 6.33.

Fig. 6.33: Inhibiţia lipoxigenazei – de către extractele Leuzea salina (Ls) şi Leuzea

carthamoides (Lc), martor: cvercetol (C).

6.3.1.3 Evaluarea capacității de de chelatare al ionului feros

Urmărind să evidențiem și pentru extractele de Leuzea

capacitatea de chelatare al ionului feros am obținut valori din care au fost

calculate CE50, care sunt redate în tabelul XX.

Tabel nr. XX: Capacitatea de chelatare a ionului feros (martor cvercetol).

Probă CE50 (μg/sol finală)

Leuzea salina 497,10 ± 1,20

Leuzea cartamoides 1068,49 ± 0,73

Cvercetol 474,61 ± 4,28

Valorile CE50 indică o capacitate de chelatare a ferului apropiată

de cea a cvercetolului pentru extractul de Leuzea salina, în timp ce pentru

Leuzea carthamoides valoarea CE50 este de două ori mai mare decât cea

a cvercetolului (fig. 6.34).

Rezultatele au dovedit puterea de chelatare al ionului feros de

către componentele din extracte care este apropiată de cea a cvercetolului

0

20

40

60

80

100

0.3125 0.625 1.25 2.5 5 10 20

% I

nhib

iţie

mg/mL

Ls

Lc

C

50

martor (sau mai mare) lucru important, deoarece în arealele cerebrale

afectate în boala Parkinson se acumulează Fe2+ care generează o

supraproducție de radicali hidroxil, dăunatori (fig. 6.34).

Fig. 6.34: Chelatarea ferului – de către extractele Leuzea salina (Ls) şi Leuzea carthamoides

(Lc), martor: cvercetol (C).

6.3.2. Investigarea potențialului anti-Parkinson al extractelor de

Leuzea prin intermediul testului zebra-fish (Danio rerio)

Extractele de Leuzea carthamoides și L. salina au fost investigate

în ceea ce privește acțiunea biologică in vivo cu ajutorul testelor zebrafish

(Danio rerio), pentru care modul de lucru a fost prezentat în cadrul

punctului 4.5.2.2.

Repartizarea animalelor pe loturi a fost realizată conform

protocolului următor:

Lotul 1 (de control propriu-zis): pești sănătoși, care nu au fost

intoxicați cu neurotoxină 6-OHDA,

Lotul 2 (martor): animale intoxicate cu 6-OHDA și netratate cu

extracte vegetale,

Lotul 3 (experimental): animale intoxicate cu 6-OHDA și carora

li s-a administrat în ziua 1,3,6,9 și 12 extract de Leuzea

carthamoides în doză de 0,5 mg/L apă,

0

20

40

60

80

100

0,3125 0,625 1,25 2,5 5 10

% c

hel

atar

e

mg/mL

Ls

Lc

C

51

Lotul 4 (experimental): animale tratate cu 6-OHDA și carora li s-

a administrat în ziua 1,3,6,9 și 12 extract de Leuzea carthamoides

în doză de 1mg/L apă,


a administrat în ziua 1,3,6,9 și 12 extract de Leuzea salina în doză

de 0,5 mg/L apă,


a administrat în ziua 1,3,6,9 și 12 extract de Leuzea salina în doză

de 1mg/L apă.

Au fost efectuate următoarele teste comportamentale:

testul labirintului cu trei brațe (Y maze) care apreciază activitatea

locomotorie și memoria spațială ca și componentă a memoriei de

scurtă durată (121) și

testul bazinului nou (novel tank diving test), care evaluează starea

de anxietate și comportamentul de explorare al peștilor.

6.3.2.1 Teste comportamentale

A. Testul labirintului cu trei brațe (Y-maze)

Testul Y-maze evaluează activitatea locomotorie și memoria

spațială ca și componentă a memoriei de scurtă durată (121).

Activitatea locomotorie se apreciază ținând cont de numărul de

intrări al animalelor de experiență (Danio rerio) în cele trei brațe ale

dispozitivului (fig. 6.36).

În cazul evaluării memoriei de scurtă durată (importantă mai mult

în Alzheimer decât în Parkinson) se înregistrează alternarea spontană,

adică secvențele de intrare în cele trei brațe.

Dacă secvențele sunt consecutive A-B-C acest lucru înseamnă o

bună funcționare a memoriei. Dacă animalul de experiență revine

repetat într-unul din brațe practuitând faptul că a mai explorat brațul

respectiv acest lucru înseamnă o degradare a memoriei de scurtă durată

(fig. 6.37).

52

Fig. 6.36: Activitatea locomotorie evaluată prin numărul de intrări în brațe pentru loturile de

pesti tratați cu Leuzea carthamoides 0,5mg/L (A) și 1mg/L respectiv cu Leuzea salina (B)

0,5mg/L și 1mg/L.

Fig. 6.37: Procentul de alternare spontană pentru loturile tratate cu extracte de Leuzea

carthamoides în doze de 0,5mg/L și 1mg/L (A) respectiv pentru loturile tratate cu Leuzea salina

în doze de 0,5mg/L și 1mg/L (B).

Recunoșterea brațului nou și timpul petrecut pentru explorarea

acestuia implică o bună funcționare a memoriei de scurtă durată. Așa cum

am menționat inițial, fiecare braț are aplicată pe partea exterioară o folie

cu figurine specifice: triunghiuri-brațul A, pătrate-brațul B și cercuri-

brațul C, astfel încât peștii să poată face deosebirea și să poata învăța

traseul prin toate brațele.

Dacă se ia în calcul timpul petrecut în brațul nou, abia deschis

pentru explorare, se consideră că memoria de scurtă durată crește o dată

cu creșterea timpului petrecut în noul brat (fig. 6.38).

53

Fig. 6.38: Timpul petrecut în brațul nou pentru loturile tratate cu extracte de LC în doze de 0,5

mg/L și 1 mg/L, respectiv LS în doze de 0,5mg/L și 1mg/L apa.

Potrivit datelor obținute le testele comportamentale efectuate, la

testul labirintului Y (Y-maze) toate loturile tratate cu extracte de Leuzea

sp. au prezentat activitate locomotorie mai bună față de martori, depășind

la doze mari de L. cathamoides (1mg/L) și respectiv doze mici de L.

salina, valorile înregistrate de loturile de control sănătoase. Doza mică

de Leuzea salina (de 0,5mg/L) a stimulat cel mai mult activitatea

locomotorie a animalelor prin labirint.

Recunoașterea și timpul petrecut în brațul deschis pun în evidență

tendința animalelor de explorarea a noului și de căutare a recompensei

care implică căile dopaminergice cerebrale. Conform datelor obținute

toate loturile tratate cu extracte de Leuzea sp. s-au mișcat semnificativ

mai mult în brațul deschis, fiind mai motivate în căutarea recompensei

comparativ cu animalele cu Parkinson indus și netratate. Lotul tratat cu

doză mare de L. salina (1mg/L) a înregistrat rezultate asemănătoare

lotului de control sănătos.

Motivația este o componentă psihologică cheie care lipsește

pacienților diagnosticați cu depresii severe. Având în vedere aceste

aspecte și datele obținute din experimentele efectuate investigarea în

viitor prin examene specifice a potențialul antidepresiv al extractelor din

Leuzea sp este o direcție de cercetare promițătoare.

În ceea ce privește memoria de scurtă durată (MSD)

(operaționalizată prin procentul de alternare spontană și timpul petrecut

în brațul deschis) loturile tratate cu extracte de Leuzea sp. au avut

îmbunătățiri semnificative a MSD față de lotul martor, depășind și

54

loturile de control sănătoase. Valorile cele mai mari au fost înregistrate

pentru lotul tratat cu L. carthamoides în doză mică de 0,5mg/L (în ceea

ce privește alternarea spontană) și respectiv lotul tratat cu L salina în doză

mare de 1mg/L (în ceea ce privește timpul petrecut în brațul deschis).

B. Testul bazinului nou (novel tank diving test)

Testul bazinului nou evaluează starea de anxietate și

comportamentul de explorare operaționalizate prin: timpul petrecut în

zona superioară a bazinului, distanța totală parcursă de pești în bazin și

numărul de intrări în zona superioară a bazinului.

Peștii fiind anxioși au tendința de a înota în zona inferioară a

bazinului, abia când devin mai relaxați încep să exploreze și

compartimentul superior, în căutarea hranei (fig. 6.40).

Fig. 6.40: Timpul petrecut în zona superioară a bazinului pentru loturile de pești tratați cu

extracte de Leuzea carthamoides (A) și Leuzea salina (B).

Comportamentul de explorare și căutare a recompensei se

urmărește prin înregistrarea numărului de intrări a peștilor în zona

superioară a bazinului (fig. 6.41).

Acest comportament se mai numește si motivație de explorare sau

motivație de căutare a recompensei și implicată calea nigrostriată a

dopaminei care este afectată in cazul pacienților cu boală Parkinson

55

Fig. 6.41: Numărul de intrări în zona superioară a bazinului pentru loturile de pești tratați cu

extract de Leuzea carthamoides (A) și Leuzea salina (B) în doze de 0,5mg/L și 1mg/L apă.

Starea de anxietate a animalelor poate fi apreciată și în funcție de

distanța totală parcursă de indivizi în bazin. Dacă animalele parcurg

distanțe mai mari în zona inferioară a bazinului înseamnă că nivelul

acestora de anxietate este mare, în timp ce parcurgerea unei distanțe mai

mari în zona superioară a bazinului indică prezența comportamentului de

explorare, concomitent unui grad de anxietate redus. Rezultatele obținute

în cadrul acestui experiment sunt redate în fig. 6.42.

Fig. 6.42: Distanța totală parcursă în bazin pentru loturile de pești tratați cu Leuzea

carthamoides (A) 0,5mg/l și 1mg/l respectiv cu Leuzea salina (B) 0,5mg/L și 1mg/L apă.

Datele obținute la testul bazinului nou (novel tank diving test)

arată că loturile cu Parkinson indus și tratate cu extracte de Leuzea sp.

prezintă o activitate anxiolitică semnificativă în comparație cu martorii

netratați. Cele mai bune rezultate au fost obținute de lotul tratat cu

Leuzea carthamoides în doză mare (1mg/L).

56

CAPITOLUL 7: Concluzii generale; Originalitatea tezei;

Perspective de continuare a cercetărilor

În cadrul cercetărilor noastre au fost studiate din punct de vedere

farmacognostic, fitochimic și al activității biologice părțile aeriene a două

specii de Ajuga: Ajuga reptans L. și Ajuga genevensis L. și rădăcinile

provenite de la două specii de Leuzea: Leuzea carthamoides (Willd.)

[sinonim Rhaponticum carthamoides (Willd. Iljin)] și Lauzea salina.

Concluziile studiului întreprins asupra extractelor de Ajuga

reptans și Ajuga genevensis

Studiile efectuate au condus la o serie de rezultate care au generat

următoarele concluzii. În cadrul cercetărilor noastre au fost analizate din

punct de vedere fitochimic și al calităților biologice părțile aeriene a două

specii de Ajuga: A. reptans și A. genevensis; rezultatele înregistrate ne

permit să tragem o serie de concluzii:

studiul chimic calitativ și cantitativ a demonstrat prezența în

extractele celor două specii de Ajuga a unor grupe de principii

active și anume: acizi polifenolcarboxilici, flavonoide, iridoide și

ecdisteroide;

analiza cromatografică în start subțire a permis evidențierea în

extracte a unor spoturi masive atribuite de noi 8-O-

acetilharpagidei și harpagidei, a luteolin-7-O-glucozidei, precum

și a unor acizi polifenolici;

între cele două specii există, așa după cum ne așteptam o

variabilitate interspecifică, și, de asemeni o variabilitate

intraspecifică, pentru indivizii aceleiași specii recoltate din locații

diferite; variabilitatea interspecifică se datorează moștenirii

genetice, în timp ce variabilitatea intraspecifică depinde de

condițiile de mediu (compoziția solului, temperatura, precipitații,

solarizare) în care s-a dezvoltat planta;

prin spectrofotometrie am realizat o determinare cantitativă, care

apoi a fost completată prin analiza UHPLC. Am constatat că

părțile aeriene de Ajuga reptans conțin o cantitate mai mare de

derivați polifenolici (de unde rezultă acțiunea antioxidantă), în

57

timp ce la Ajuga genevensis, predomină iridoidele, responsabile

de efectul antiedematos, antiinflamator;

analiza UHPLC a cuantificat diferitele componente, identificând

printre altele: acizii cafeic, p-cumaric, rozmarinic, catehina,

luteolin-7-O-glucozida, luteolina, apigenolul, harpagida,

aucubozida, catalpolul și 8-O-acetil-harpagozida;

din punct de vedere biochimic am urmărit influența extractelor

asupra activității unor enzime, cum ar fi: acetilcolineteraza,

butirilcolinesteraza și lipoxigenaza dar și capacitatea de chelatare

a fierului, toate implicate activ în procesul de degenerare

neuronală din Parkinson. S-a constatat că ambele extracte inhibă

atât acetilcolinesteraza cât și butirilcolinesteraza (aceasta din

urmă mai intens), precum și lipoxigenaza, efectul de inhibiție

fiind cu atât mai mare cu cât doza de pricipii active crește. Ca

intensitate, inhibarea de către extracte a enzimelor cercetate a fost

mult mai mică decât cea indusă de etaloanele galantamină și

respectiv cvercetol;

în Parkinson la nivelul ganglionilor bazali și a substanței negre,

nivelul de radicali hidroxil este foarte ridicat, ca de altfel și

acumularea de ion feros. De aceea se caută compuși capabili să

chelateze ionul feros pentru a reduce nivelul de producție al

radicalului hidroxil, prin aceasta blocându-se reacțiile de sinteză

a unor radicali organici la nivel celular. Atât pentru extractul din

Ajuga reptans cât și pentru cel din Ajuga genevensis s-au obținut

valori CE50 care indică o capacitate de chelatare a ferului

apropiată de cea a cvercetolului, etalon;

cercetările farmacologice efectuate au demonstrat că extractele

acționează avantajos, dar pentru fiecare din specii intensitatea de

acțiune pe o anumită componentă la nivel cerebral este

caracteristică;

investigând memoria de scurtă durată a animalelor cu Parkinson

experimental, am putut constata că ambele extracte determină o

mai bună funcționare a acesteia efectul cel mai puternic fiind

înregistrat pentru Ajuga reptans la doza de 75 mg/kg corp. Este

drept că activitatea locomotorie a fost se pare mai puțin

58

influențată, procentul de îmbunătățire a alternării spontane fiind

semnificativ crescut;

urmărind să evaluăm memoria spațială, memoria de lucru (ca

formă a memoriei de scurtă durată) și memoria de referință (ca

formă a memoriei de lungă durată) a rozatoarelor am utilizat

testul labirintului cu brațe radiale. Rezultatele sugerează că

procesul degenerativ indus prin injectare cu 6-OHDA a fost

parțial contracarat prin tratamentul aplicat; interesant este faptul

că la Ajuga reptans răspunsul a fost mai intens la doza de 75

mg/kg corp, cum era de asteptat, în timp ce pentru suliman

eficiența mai mare o are doza redusă de 25 mg/kg corp;

efectele anxiolitice au fost investigate cu ajutorul testului

labirintului cu brațe deschise, când s-a constatat că ambele

extracte administrate în doză mare conduc la o scădere

semnificativă a nivelului de anxietate; de această dată Ajuga

genevensis având o eficiență anxiolitică mai mare decât cea a

extractului de vineriță;

în cadrul testului înotului forțat a fost urmarită acțiunea

antidepresivă pe care o dezvoltă cele două extracte. Datele

înregistrate în cadrul acestui test demonstrează eficiența

terapeutică, antidepresivă, care crește în relație directă cu doza

aplicată;

după efectuarea tuturor testelor farmacologice cu extractele de

Ajuga reptans și Ajuga genevensis, este evident că acțiunea

antidepresivă este puternic influențată de tratamentul cu extract

de suliman, care are capacitatea de contracarare a alterărilor

neurologice de acest tip, produse animalelor de experiență prin

inducerea Parkinsonului cu 6-OHDA.

În ceea ce privește activitatea biologică, putem presupune că

fiecare dintre cele două extracte acționează ca un fitocomplex în sine;

având în vedere determinările noastre chimice, biochimice și

farmacologice presupunem că acțiunea neuroprotectoare și evident

neuroregeneratoare este conferită de componentele prezente, dintre care:

59

flavonoidele și polifenolii vin cu o importantă acțiune

antioxidantă, prezenta, dar investigată deja la noi în țară (26, 115,

262, 263),

iridoidele cu activitate antiinflamatoare și antiedematoasa și

ecdisonele, și ele antiinflamatoare, dar totodată puternic

antistres - adaptogene, anxiolitice și antidepresive.

Având în vedere faptul că derivații chimici din grupele mai sus

menționate acționează la administrări repetate, dispersate pe o perioadă

mai lungă de timp, aspectele de acțiune farmacologică a trebui investigate

eventual pe o perioadă de 14-21 zile, deoarece abia în administrare

cronică se poate vedea cu adevărat eficiența tratamentului.

În orice caz, prin compoziția complexă și nivelele diferite la care

acționează diversele grupe de principii active, putem considera că

extractele de Ajuga reptans și Ajuga genevensis se înscriu în categoria

preparatelor cu acțiune multi-target.

Cercetări privind speciile Leuzea carthamoides și Leuzea salina

În cadrul tezei de doctorat am prezentat rezultatele obținute

pentru analiza farmacognostică, constând din studiul macroscopic,

microscopic (preparate superficiale) și morfologic (202), cea fitochimică

și biologică, ceea ce ne-a permis să tragem următoarele concluzii:

analizând secțiunile transversale practicate prin rădăcina,

rizomul, tulpina și limbul foliar a celor două specii de Leuzea

incluse în studiu am constatat o serie de asemănări care sunt

normale pentru plante aparținând aceluiași gen dar și o serie de

diferențe atât la nivelul rizomului cât și al rădăcinii, a tulpinii

aeriene, și a limbului foliar; asemănările morfologice dintre cele

două materiale de Leuzea investigate sunt normale pentru specii

aparținând aceluiași gen;

singura diferență majoră constă în existența unor formarțiuni

salifere, evidențiate la microscopul electronic de baleiaj, doar în

cazul indivizilor de Leuzea salina; în literatura de specialitate

consultată nu am găsit date cu privire la existența unor astfel de

formațiuni, nici măcar pentru specia Leuzea carthamoides;

60

asta nu înseamnă însă că vorbim cu adevarat de două specii

diferite, Leuzea carthamoides și Leuzea salina, ci poate fi vorba

de o varietate chimică a primei specii, care însă s-a dezvoltat pe

un teren inițial mlăștinos, transformat în cursul verii în sărătură;

elemente de acest tip cum ar fi glandele salifere sunt pe larg

discutate în literatură științifică mai veche (107, 257) ca fiind

caracteristice plantelor halofite. Oricum în momentul de față nu

există informații recente privind prezența acestor formațiuni și

rolul lor la plantele de Leuzea.

rezultatele studiului chimic și biologic ar putea aduce lămuriri în

această problemă, dar totodată este posobil să fie necesare studii

mai aprofundate ca durată și spectru de compuși chimici, pentru

clarificarea acestui aspect;

de asemeni este necesară stabilirea cu exactitate dacă în acest caz

este vorba într-adevăr de glande prin care se elimină clorura de

sodiu din plantă, sau ele conțin alte componente minerale;

studiul fitochimic a urmărit determinarea cantitativă (prin

spectrofotometrie și UHPLC) a compușilor flavonoidici, a

acizilor polifenolcarboxilici și a derivaților ecdisonici din

extractele de rădăcini de Leuzea. S-a dovedit că atât polifenolii

cât și ecdisteroidele sunt cantitativ mai bine reprezentate la specia

Leuzea carthamoides;

componentele identificate prin UHPLC în extractul de Leuzea

carthamoides au fost: epicatehina, acid clorogenic, acid elagic,

rutozida, luteolin-7-O-glucozida, acid ferulic, o kemferol-

glucozida, luteolina, sitosterolul și kemferolul;

pentru Leuzea salina, epicatehina, acidul elagic, rutozida,

luteolin-7-O-glucozida, kemferol-glucozida și sitosterolul se află

în cantități de sub 1 mg/g pulbere vegetală, conținutul fiind mult

redus față de specia medicinală;

testele biochimice au dovedit pentru cele două extracte de Leuzea

capacitatea de blocare a colinesterazelor mai redusă decât cea

provocată cu galantamină; acest lucru însemnând pentru

extractele vegetale că o dată cu o inhibiție mai redusă a enzimei

se reduc efectele adverse (numeroase și grave) ale inhibitorilor de

colinesteraza;

61

capacitatea de inhibitie a lipoxigenazei comparativ cu cea a

cvercetolului este mai redusă, dar totuși notabilă. Și în acest caz

extractul de Leuzea carthamoides este mai eficient;

valorile CE50 obținute indică pentru Leuzea salina o capacitate

de chelatare a ferului apropiată de cea a cvercetolului, în timp ce

pentru Leuzea carthamoides este de două ori mai mare decât cea

a martorului cvercetol (CE50 = 474,61 ± 4,28 g/sol finală);

în testul labirintului cu trei brațe am constatat că activitatea

locomotorie s-a îmbunătățit foarte mult în prezența extractului de

Leuzea salina 0,5 mg/L;

memoria de scurtă durată (puternic afectată mai ales în

Alzheimer) s-a îmbunătățit sub tratament, cel mai eficient

dovedindu-se a fi extractul de Leuzea carthamoides 0,5mg/L;

comportamentul de explorare (afectat în Parkinson) s-a dovedit a

fi influențat pozitiv de ambele extracte, efectul cel mai evident

apărând pentru Leuzea salina 1mg/L;

actiunea anxiolitică dezvoltată de ambele extracte este și ea

remarcabilă, având în vedere că la administrare este activat

comportamentul de explorare care angajează câile dopaminergice

(alterate în Parkinson), efectul cel mai intens dezvoltându-se la 1

mg/l apă Leuzea carthamoides, totodată numărul de intrări în

zona superioară a bazinului și distanța parcursă la acest nivel fiind

semnificativ mai mare pentru loturile intoxicate și tratate

comparativ cu peștii control respectiv, intoxicati cu neurotoxină.

Reiese din cercetările efectuate că cele 4 specii studiate conțin

principii active importante și în cantități suficient de mari pentru ca la o

administrare adecvată să se obțină răspunsuri farmacologice nete, dintre

care se remarcă: acțiunea antioxidantă, antiinflamatoare și

antiedematoasă, nootropă și neuroregeneratoare, îmbunătățirea activității

locomotorii și a comportamentului de explorare, îmbunătățirea memoria

de scurtă și lungă durată, acțiunea anxiolitică și antidepresivă.

62

Originalitatea tezei

Studiile realizate pe parcursul acestei lucrări asupra speciilor

Ajuga reptans și Ajuga genevensis au adus o serie de aspecte originale:

prezența unor cantități importante de iridoide antiinflamatoare în

special în Ajuga genevensis în timp ce plantele de Ajuga reptans

conțin mai mulți polifenoli, antioxidanți;

capacitatea celor două extracte de a inhiba moderat acetil- și

butirilcolinesteraza, ceea ce reprezintă o calitate, dacă acestea ar

urma să fie folosite ca adjuvanți în tratamentul bolii Parkinson

sau Alzheimer;

acțiunea de inhibare a lipoxigenazei implicată în procesele

inflamatorii;

capacitatea de chelatare a fierului, implicat activ în procesul de

degenerare neuronală din Parkinson și Alzheimer;

s-a demonstrat influența benefică pe care extractele o au asupra

memoriei spațiale și a memoriei de lucru (ca formă a memoriei

de scurtă durată) și memoria de referință (ca formă a memoriei de

lungă durată) la animalele cărora li s-a provocat un Parkinson

experimental.

În cazul cercetărilor speciilor Leuzea carthamoides și Leuzea

salina originalitatea rezultatelor constă în:

efectuarea unui studiu morfologic comparativ a diferitelor organe

ale celor două specii;

identificarea, pentru prima oară, a unor glande salifere în ceea ce

studiul nostru n-a putut atribui speciei Leuzea salina respectiv,

sau unei chemovarietăți de de sărătură a speciei Leuzea

cathamoides;

analiza fitochimică a materialului vegetal provenit din țara

noastră, cu identificarea în extracte a epicatehinei, acidului

clorogenic, acidului elagic, a rutozidei, a luteolin-7-O-glucozidei,

a kemferol-glucozidei, a sitosterolului precum și a 2 componente

ecdisteroidice (20-OH-ecdisona, α-ecdisona);

63

pentru prima dată s-a investigat cu ajutorul unor teste biochimice

capacitatea de blocare a colinesterazelor, a lipoxigenazei precum

și cea de chelatare a ionului feros;

pentru prima dată a fost investigată, prin testul pe pești din specia

Danio rerio capacitatea de contracarare a efectelor de deriorare

neurologică indusă reactivului biologic la tratarea cu neurotoxina

6-OHDA; s-au urmărit influența asupra memoriei de scurtă, a

comportamentul de explorare, acțiunea anxiolitică, și acțiunea

antidepresivă, care s-au dovedit a fi remarcabile.

Perspective de continuarea a cercetărilor

Ar fi interesantă și chiar importantă continuarea studiilor

morfologice asupra speciilor Leuzea carthamoides și Leuzea

salina timp de 5 – 6 ani, cu material de cultură provenind, pe de-

o parte dintr-o cultură controlată (eventual Gradina Botanică), și

respectiv de pe terenul sărăturos de lângă Valea Lupului, Iași.

De asemeni merită investigată problematica existenței speciei

Leuzea salina ca specie de sine stătătoare, sau ca și varietate

chimică a speciei L. carthamoides; Ar trebui investigată natura

chimică a excreției salifere, precum și dacă este vorba de o glandă

care elimină sărurile în vacuolă sau glande care elimină sărurile

în afara celulelor (67).

În ceea ce privește rezultatele obținute la testele in vivo efectuate

cu extractele de Leuzea sp. studiile viitoare ar putea analiza prin

examene specifice efectul antidepresiv si de ameliorare a

tulburărilor de memorie al extractelor menționate.

Investigarea mai de aproape a potențialului antimicrobian și

antiviral al extractelor de Leuzea carthamoides și Leuzea salina.

În baza rezultatelor înregistrate la testele comportamentale cu

extractele de Ajuga sp. studiile viitoare ar putea investiga prin

examene specifice potențialul extractelor menționate în terapia și

profilaxia tulburărilor mnezice (demențe, inclusiv demența

vasculară, Alzheimer, demența cu corpi Lewi) dar mai ales în

ceea ce privește terapia tulburărilor depresive (depresia majoră și

episoadele depresive din cadrul tulburările afective bipolare).

64

Administrarea extractelor să se efectueze pe perioade mai lungi

(atât în cazul speciile de Leuzea cât și de Ajuga sp.) urmărindu-se

intensitatea efectului terapeutic în timp, dacă acesta se menține

relativ constant sau dacă apar fluctuații de intensitate.

65

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

1. Abdelouahab N, Heard C. Effect of the major glycosides of

Harpagophytum procumbens (Devil’s Claw) on epidermal

cyclooxygenase-2 (COX-2) in vitro. J Nat Prod 2008; 71(5): 746-749.

8. Andersson M L, Møller A M, Wildgaard K. Butyrylcholinesterase

deficiency and its clinical importance in anaesthesia: a systematic review.

Anaesthesia 2019; 74(4): 518-528.

21. Biskup E, Szynklarz B, Golebiowski M, Borsuk K, Stepnowski P,

Lojkowska E. Composition and biological activity of Rhaponticum

carthamoides extracts obtained from plants collected in Poland and

Russia. J Med Res 2013; 7(11): 687-95.

23. Blainski A, Piccolo V K, Mello J C, de Oliveira R M. Dual effects of

crude extracts obtained from Petiveria alliacea L. (Phytolaccaceae) on

experimental anxiety in mice. J Ethnopharmacol 2010; 128(2): 541–4.

25. Boje K, Lechtenberg M, Nahrstedt A. New and known iridoid- and

phenylethanoid glycosides from Harpagophytum procumbens and their

in vitro inhibition of human leucocyte elastase. Planta Med 2003; 69(9):

820:5.

26. Bokov D O, Sidorova Yu S, Mazo V K, Bessonov V V. Prospects for

the use of spinach (Spinacia oleracea L.) containing phytoecdysteroids

and polyphenols. Pharmacognosy Journal 2020; 12(2):246-250.

27. Borovikova E B, Boltaev U A. Lesterone a new phytoecdysteroids

from the seeds of Leuzea carthamoides. Chem Nat Comp 1999; 35(2):

182-183.

28. Borovikova E B, Shangaraeva G S, Boltaev U A. Rhapisterone D-20

acetat from the seeds of Leuzea carthamoides. Chem Nat Compd 1999;

35(2): 184-186.

66

32. Brien S, Lewith G T, Mc Gregor G. Devil’s claw (Harpagophytum

procumbens) as a treatment for osteoarthrits: A review of efficacy and

safety. J Altern and Complement Med 2006; 12(10): 981-93.

33. Budesínský M, Vokác M, Harmatha J, Cvacka J. Additional minor

ecdysteroid components of Leuzea carthamoides. Steroids 2008; 73(5):

502-514.

34. Bui T T, Nguyen T H. Natural product for the treatment of

Alzheimer’s disease. J Basic Clin Physiol Pharmacol 2017; 28(5): 413-

423.

36. Carillo-Ocampo D, Bazaldúa-Gómez S, Bonilla Barbosa J R, Aburto-

Amar R, Rodríguez-López V. Anti-inflammatory activity of iridoids and

verbascoside isolated from Castilleja tenuiflora. Molecules 2013; 18(10):

12109-12118.

38. Cespedes C L, Balbontin C, Avila J G, Dominguez M, Alarcon J, Paz

C, Burgos V, Ortiz L, Peñaloza-Castro I, Seigler D S, Kubo I. Inhibition

on cholinesterase and tyrosinase by alkaloids and phenolics from

Aristotelia chilensis leaves. Food and Chemical Toxicol 2017; 109( pt 2):

984-995.

39. Cespedes C L, Munoz E, Salazar J R, Yamaguchi L, Werner E,

Alarcon J, Kubo I. Inhibition of cholinesterase activity by extracts,

fractions and compounds from Calceolaria alcana and C.integrifolia

(Calceolariaceae: Scrophulariaceae). Food and Chemical Toxicol 2013;

62:919-926.

47. Ciocârlan V. Flora ilustrată a României Ed a-II-a, Ed. Ceres București

2000.

57. Dinan L, Hormann R E. Ecdysteroid agonists and antagonists.

Elsevier BV 2005; 198-213.

67. Fahn A. Secretory tissues in plants. Academic Press Oxford 1988.

67

69. Ferger B E I. Morbus Parkinson. Deutsch Apoth Z 2000; 140: 566-

671.

72. Garg A, Sharma R, Dey P, Kundu A, Kim H S, Bhakta T, Kumar A.

Analysis of triterpenes and triterpenoids. In Recent Advances in: Natural

Products Analysis. Elsevier 2020; 393-426.

74. Geszprych A, Weglarz Z. Composition of essential oil from

underground and aboveground organs of Rhaponticum carthamoides

(Willd.) Iljin. Herba Pol 2002; 48:188-92.

75. Ghiță G, Cioancă O, Gille E, Necula R, Zamfirache M, Stănescu U.

Contributions to the phytochemical study of some samples of Ajuga

reptans L. and Ajuga genevensis L. Bull. Univ. Transilvania Braşov Ser.

VI: Med. Sci 2011; 4(53):7-14.

81. Gong N, Fan H, Ma A N, Xiao Q, Wang Y X. Geniposide and its

iridoid analogs exhibit antinociception by acting at the spinal GLP-1

receptors. Neuropharmacology 2014; 84:31-45.

107. Helder R J. The loss of substances by cells and tisues (salt glands)

In: Ruhland W (Ed) Handbuch der Pflanzenphysiologie, Vol. 2 Springer,

Berlin-Göttingen-Heidelberg 1956; 466-488.

111. Hemcinschi A, Gille E, Necula R, Dănilă D, Trifan A, Stănescu U.

Chemical variability of some natural population of Ajuga sp from the

North-Eastern part of Romania. Planta Med 75(Suppl 1) 2009; 931.

112. Hemcinschi A, Gales R, Stănescu U, Toma C. Comparative histo-

anatomy and chemical composition of two Ajuga species from the

romanian flora. Analele științifice ale Universității Al. I. Cuza, Iași, S. a

II-a Bilologie Vegetală 2009; 55(2):3346.

115. Hemcinschi Lungu A. Contrubuții la studiul unor specii indigene de

Galium și Ajuga, Teză de doctorat, Universitatea de Medicină și

Farmacie Gr. T. Popa Iași 2011.

68

121. Hrițcu L. Fiziologie animală experimentală. Ed. Universităţii Al. I.

Cuza Iaşi 2012.

123. Hrițcu L, Ioniță R, Motei D E, Babii C, Ștefan M, Mihășan M.

Nicotine versus 6-hydroxy-L-nicotine against chlorisondamine induced

memory impairment and oxidative stress in the rat hippocampus.

Biomedicine & Pharmacotherapy 2017; 86:102-108.

124. Hu C, Ma S. Recent development of lipoxygenase inhibitors as anti-

inflammatory agents. Medchemcomm 2017; 9(2):212-225.

125. Huang B, Chen P, Huang L, Li S, Zhu R, Sheng T, Yu W, Chen Z,

Wang T. Geniposide attenuates post-ischemic neurovascular demage via

Glu N2A/AKT/ERK- dependent mechanism. Cell Physiol Biochem

2017; 43:705-716.

127. Inestrosa N, Dinamarca M C, Alvarez A. Amyloid-cholinesterase

interactions. Implications for Alzheimer's disease. FEBS J 2008;

275(4):625-632.

128. Inomata, Yusuke & Terahara, Norihiko & Kitajima, Junichi &

Kokubugata, Goro & Iwashina, Tsukasa. Flavones and anthocyanins

from the leaves and flowers of Japanese Ajuga species (Lamiaceae).

Biochemical Systematics and Ecology 2013; 51:123–129.

146. Kokoska L, Janovska D. Chemistry and pharmacology of

Rhaponticum carthamoides: a review. Phytochemistry 2009; 70(7):842-

55.

149. Koo H J, Lim K H, Jung H J, Park E N. Anti-inflammatory

evaluation of gardenia-extract, geniposide and genipin. J

Ethnopharmacol 2006; 103(3):496-500.

150. Koo H J, Song Y S, Kim H J, Lee Y H, Hong S M, Kim S J, Kim B

C, Jin C, Lim C J, Park E H. Anti-inflammatory effects on genipin, an

active principle of gardenia. Eur J Pharmacol 2004; 495(2-3):201-8.

69

151. Kraft K. Antientzündliche Mechanismen von Arzneipflanzen.

Phytotherapie Austria 2017; 11(6):4.

153. Küpeli E, Harput U S, Varel M, Yesilada E, Saracoglu I. Bioassay-

guided isolation of iridoid glucosides with antinociceptive and anti-

inflammatory activities from Veronica anagallis-aquatica L. J

Ethnopharmacol. 2005; 102(2):170-6.

162. Lee J, Jun M. Dual BACE1 and cholinesterase inhibitory effects of

phlorotannins from Ecklonia cava - An in vitro and in silico study. Mar

Drugs 2019; 17:91.

166. Liu J H, Yin F, Guo L X, Deng X H, Hu Y H. Neuroprotection of

geniposide against hydrogen peroxide induced PC12 cells injury:

involvement of P13 kinase signal pathway. Acta Phamacologica Sinica

2009; 30:159-165;

167. Liu J, Zheng X, Yin F, Hu Y, Guo L, Deng X, Chen G, Jiajia J,

Zhang H. Neurotrophic property of geniposide for inducing the neuronal

differentiation of PC 12 cells. Int J Dev Neurosci. 2006; 24(7):419-24.

168. Logvinov S V, Pugachenko N V, Potapov A V, Krasnov E A,

Plutnikov M B, Maslov M Yu, Aliev O I, Tyukavkina N A. Ischemia-

induced changes in synaptoarchitectonis of brain cortex and their

correction with ascovertin and Leuzea extract. Bull Exp Biol Med 2001;

132:1017-20.

169. Lotocka B, Geszprych A. Anatomy of the vegetative organs and

secretory structures of Rhaponticus carthamoides (Asteraceae). Bot J

Linnean Sok 2004; 144(2):207-233.

173. Mamedov N, Mamadalieva N. Medicinal plants from countries of

former USSR used for treatment of depression. In: Grosso C. (ed), Herbal

medicine in depression, Springer Publ. Elvetia 2016; 183-258.

70

183. Mosharrof A H. Effects of extract from Rhaponticum carthamoides

(Willd) Iljin (Leuzea) on learning and memory in rats. Acta Physiol

Pharmacol Bulg 1987; 13(3):37-42.

186. Mutschler E, Geisslinger G, Menzel S, Ruth P, Schmidtko A.

Pharmakologie kompakt WVG Stuttgart 2016.

188. Namuna A. Bioecological Characteristics and Natural Resources of

Rhaponticum integrifolium in Uzbekistan. American Journal of Plant

Sciences 2019; 10(05):850-865.

202. Păduraru A F, Cioancă O, Gille E, Iancu C, Burlec F, Enache L,

Toma C, Hăncianu M. Morphologic profile of two Leuzea species

harvested from wild flora of Eastern Romania. Med. Surg. J. Rev. Med.

Chir. Soc. Med. Nat. Iași 2019; Vol. 123, No. 1 :187-194.

209. Pospelova M L, Barnaul O F. The anti hypoxant and antioxidant

effects of medicinal plants as the basis for their use in destructive diseases

of the brain. Human Psychol 2000; 26(1):86-91.

210. Prior R L, Wu X, Schaich K. Standardized methods for the

determination of antioxidant capacity and phenolics in foods and dietary

supplements. J Agric Food. Chem 2005; 53:4290-4302.

216. Rees T, Hammond P, Soreq H, Younkin S, Brimijoin S.

Acetylcholinesterase promotes beta-amyloid plaques in cerebral cortex.

Neurobiol Aging 2003; 24:777-787.

222. Russo P, Kisialiou A, Lamonaca P, Moroni R, Prinzi G, Fini M.

New drugs from marine organisms in Alzheimer’s disease. Mar Drugs

2016; 14:5.

227. Schilcher H, Kammerer S, Wegener T. Leitfaden Phytotherapie. ed.

a lV-a, Urban & Fischer, München 2010;

71

233. Sharaf M, Skiba A, Werglarz Z, El- Ansari M A. Two flavonoid 5-

O-glycosides from the roots of Leuzea carthamoides. Fitoterapia 2001;

72:940-942.

234. Sharma P, Srivastava P, Seth A, Tripathi P N, Banerjee A G,

Shrivastava S K. Comprehensive review of mechanisms of pathogenesis

involved in Alzheimer’s disease and potential therapeutic strategies.

Progr Neurobiol 2019; 174:53-89.

238. Skiba A, Werglarz Z. Phenolic acides of Rhaponticum

carthamoides. Acta Hortic 2003; 597:119-124.

239. Skiba A, Werglarz Z. Accumulation of the biomass and some

polyphenolic compounds in Rhaponticum carthamoides (Willd.)

Iljin. Annals of Warsaw Agricultural University SGGW, Horticulture

(Landscape Architecture) 2000; 20:19-25.

247. Stănescu U, Hăncianu M, Cioancă O, Aprotosoaie A, Miron A.

Plante medicinale de la A la Z, ed. a II-a. Polirom Iași 2014; 306-308.

250. Stoyanovsky D A, Tyurina Y Y, Shrivastava I, Bahar I, Tyurin V A,

Protchenko O, Jadhav S, Bolevich S B, Kozlov A V, Vladimirov Y A,

Shvedova A A, Philpott C C, Bayir H, Kagan V E. Iron catalysis of lipid

peroxidation in ferroptosis: Regulated enzymatic or random free radical

reaction? Free Radic Biol Med. 2019; 133:153-161.

257. Thomson W W. The structures and functions of salt glands. In:

Polyakoff-Mayber A, Gale J (eds) Plants in Saline Environemets.

Ecological studies (Analysis and Synthesis), Vol. 15, Springer, Berlin-

Heidelberg 1975.

262. Toiu A, Vlase L, Arsene A L, Vodnar D C, Oniga I. LC/UV/MS

profile of polyphenols, antioxidant and antimicrobial effects of Ajuga

genevensis L. Extracts. Farmacia 2016; 64:53–57.

https://www.cabdirect.org/cabdirect/search/?q=do%3a%22Annals+of+Warsaw+Agricultural+University+SGGW%2c+Horticulture+(Landscape+Architecture)%22

https://www.cabdirect.org/cabdirect/search/?q=do%3a%22Annals+of+Warsaw+Agricultural+University+SGGW%2c+Horticulture+(Landscape+Architecture)%22

72

263. Toiu A, Vlase L, Gheldiu A M, Vodnar D, Oniga I. Evaluation of

the antioxidant and antibacterial potential of bioactive compounds from

Ajuga reptans extracts. Farmacia 2017; 65:351–355.

267. Tundis R, Loizzo M R, Menichini F, Statti G A, Menichini F.

Biological and pharmacological activities of iridoids: recent

developments. Mini Rev Med Chem. 2008; 8(4):399-420.

270. Venditti A, Frezza C, Riccardelli M, Foddai S, Nicoletti M, Serafini

M, Bianco A. Unusual molecular pattern in Ajugoideae subfamily: the

case of Ajuga genevensis L. from Dolomites. Natural Product Research

2016; 30(9):1098-1102.

272. Vereskovskii V V, Kintya P K, Shapiro D K, Chekalinskaya I I.

Triterpene glycosides of Rhaponticum carthamoides cultivated in

Belorussia. Chem. Nat. Compd. 1978; 13:484- 485.

274. Vlachojannis J, Roufogalis B D, Chrubasik S. Systematic review on

the safety of Harpagophytum preparations for osteoarthritic and low back

pain. Phytother Res 2008; 22(2):149-52.

280. Wang S W, Lai C Y, Wang C J. Inhibitory effect of geniposide on

aflatoxin B1-induced DNA repair synthesis in primary cultured rat

hepatocytes. Cancer Lett. 1992; 65(2):133-7.

281. Willborn C D, Taylor L W, Campbell B I, Kerksick C, Rasmussen

C J, Greenwood M, Kreider R B. Effects of methoxyisoflavone,

ecdysterone and sulfo-polysaccharide supplementation on tranning

adaptation in resistance-trained males. J Int Soc Sports Nutritio 2006;

3(2):19-27.

287. Zuo T, Zhu M, Xu W, Wang Z, Song H. Iridoids with genipin stem

nucleus inhibit lipopolysaccharide-induced inflammation and oxidative

stress by blocking the NF-kB pathway in polycystic ovary syndrome.

Cell Physiol Biochem 2017; 43:1855-1865.

STUDIUL UNOR EXTRACTE DE ORIGINE VEGETALĂ CU …

Documents

Transcript of STUDIUL UNOR EXTRACTE DE ORIGINE VEGETALĂ CU …