Studio delle malattie genetiche Ad eredità mendelianaTalassemia, falcemia, fibrosi cistica Fenotipi...
81
Malattie genetiche Ad eredità mendeliana Talassemia, falcemia, fibrosi cistica Fenotipi complessi Neoplasie, malattie degenerative Studio delle malattie genetiche
Transcript of Studio delle malattie genetiche Ad eredità mendelianaTalassemia, falcemia, fibrosi cistica Fenotipi...
Malattie genetiche
Ad eredità mendelianaTalassemia, falcemia, fibrosi cistica
Fenotipi complessiNeoplasie, malattie degenerative
Studio delle malattie genetiche
Complex Traits
Complex Traits
Complex Traits
5
Il cancro è una malattia genetica.
Differentemente da altre malattie genetiche, a trasmissione
mendeliana oppure ad eziologia multifattoriale,
esso è principalmente causato da mutazioni de novo che avvengono
nel genoma di cellule somatiche.
Mutazioni somatiche e germinali
7
Affinché si sviluppi un tumore non è sufficiente la mutazione di un
singolo gene, bensì è necessario che si accumulino all’interno della
stesso genoma differenti mutazioni, il cui numero esatto varia in
dipendenza dello specifico tipo di neoplasia
8
9Figure 20-11 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
10Figure 20-14 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
11
Il controllo della proliferazione, del differenziamento
cellulare e dell’apoptosi sono caratteristiche
fenotipiche estremamente complesse, multigeniche e
ridondanti
12
13
14
15Figure 20-20b Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
16Figure 20-22 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
17Figure 20-2 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
18Table 20-1 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
19
Tumor cells differ from their normal counterparts in many respects:
growth control, morphology, cell-to-cell interactions, membrane properties, cytoskeletal
structure, protein secretion, and gene expression.
20
Quali sono i geni le cui mutazioni possono
contribuire all’insorgenza del
fenotipo neoplastico ?
21
Fattori di crescita
Recettori per i fattori di crescita
Proteine coinvolte trasduzione del segnale
Fattori di trascrizione
Proteine pro- apoptoticheoppure anti-apoptotiche
Proteine che controllano ilciclo cellulare
Proteine coinvolte nellariparazione del DNA
22Figure 20-37 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
23
Geni coinvolti nell’insorgenza e nella progressione della neoplasia
Protooncogeni
Oncosoppressori
Geni codificanti proteine coinvolte nella riparazione del DNA
24
Another class of genes that are commonly mutated in cancer
cells are not directly involved in controlling the cell cycle.
Instead, they have a general role as 'caretakers', ensuring the
integrity of the genome.
Loss of function mutations in these genes lead to a general
genetic instability that has long been recognized as a feature of
cancer cells.
Geni Mutatori
25
What are the genes responsible for tumorigenic cell growth?
Normal
Cancer
Proto-oncogenesCell growth and proliferation
Tumor suppressor genes
+
-
Mutated or “activated”oncogenes Malignant transformation
Loss or mutation ofTumor suppressor genes
++
26
27
28
Le mutazioni dei protooncogèni (che diventano oncogèni) alterano la
struttura e le funzioni del gene, e della proteina codificata,
in modo tale da determinare un cambiamento del fenotipo anche in
condizione di eterozigosi (gain of function mutations):
si comportano, quindi, in maniera dominante.
29
D’altra parte, le mutazioni dei geni oncosoppressori (cioè, geni che
modulano negativamente la proliferazione cellulare),
causano perdita della funzione del gene e della proteina codificata,
si comportano in modo recessivo (loss of function mutations).
30
In alcuni tipi di tumori, gli individui affetti ereditano dai genitori
alcune delle mutazioni,
che possono contribuire all’insorgenza di un determinato fenotipo
neoplastico.
La Predisposizione familiareMutazioni germinali a carico di oncosoppresori
31
32
Sporadic and familial (Mendelian) forms of cancerKnudson’s two-hit hypothesis
Sporadic Normal tumorsuppressorgene
Single tumors,unilateral,later-onset
Somaticmutationin one allele
Somaticmutationin other allele
• two mutations (two hits) are required for loss of tumor suppressor function
33
Sporadic and familial (Mendelian) forms of cancerKnudson’s two-hit hypothesis
FamilialTumor suppressor genecontaining a germlinemutation in one allele -heterozygous for themutation
Multiple tumors,bilateral,early-onset
Somaticmutationin other allele
• two mutations (two hits) are required for loss of tumor suppressor function• the first “hit” is inherited and the second “hit” is somatic
34
Mutazioni geniche in grado di trasformare un protooncogenein oncogene
35
Oncogenes in human tumors
Mechanisms of activation of proto-oncogenes
• point mutations
• chromosomal rearrangements or translocations
• gene amplifications
36
1. Point mutations in a proto-oncogene that result in a constitutively acting protein product
2. Localized reduplication (gene amplification) of a DNA segment that includes a proto-oncogene, leading to overexpression of the encoded protein
3. Chromosomal translocation that brings a growth-regulatory gene under the control of a different promoter and that causes inappropriate expression of the gene
37
An oncogene formed by the first mechanism encodes an oncoprotein that differs slightly from the normal protein encoded by the
corresponding proto-oncogene.
In contrast, the latter two mechanisms, usually, generate oncogenes whose protein products are identical with the normal proteins;
their oncogenic effect is due to their being expressed at higher-than-normal levels or in cells where they normally are not expressed.
38
39
42
Il passaggio attraverso il punto di restrizione G0 richiede l’attività del fattore E2F, il quale promuove la trascrizione di geni codificanti
le proteine necessarie per la duplicazione del DNA cellulare. Questo fattore è attivato da Cdk2, Ciclina E e Ciclina A. L’attività di E2F è inibita dal legame con la proteina Rb
ipofosforilata, presente durante la fase M. Le Cdk 4/6, la Ciclina D, e successivamente la Cdk2 e la ciclina E, fosforilano Rb provocando
il rilascio e la conseguente attivazione di E2F
44Figure 20-40 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
46
I danni subiti dal DNA nucleare sono identificati da un sistema di controllo, attivo durante G1 e G2, che si basa sulla attivazione dip53, un fattore di trascrizione che stimola l’espressione di p21CIP.
Questo cyclin-kinase inhibitor (CKI) si lega ai complessi Cdk-Ciclina e li inibisce, causando l’arresto del ciclo in G1 oppure in G2 finchè
il danno non sia stato riparato
47
48
Functions of selected proto-oncogenes
Proto-oncogene Biochemical property
1. Secreted growth factorsc-sis Platelet derived growth factor
2. Growth factor receptorsc-erbB Epidermal growth factor receptor
3. Signal transduction proteinsc-abl Protein kinasec-src Protein kinaseH-ras Small G-proteinK-ras Small G-protein
4. Nuclear proteinsc-myc Transcription factorc-fos Transcription factor
49
Le mutazioni a carico delle proteine Ras costituiscono un tipico esempio: infatti, una mutazione puntiforme nel gene, che codifica per questa proteina, riduce la sua attività GTPasica rendendola
costitutivamente attiva.
Guadagno di funzione
50
Ras family proteins
• the c-ras family contains three genes: H-ras, K-ras, and N-ras
• the Ras proteins encoded by these genes are small G-proteins
• the proteins transmit growth signals from cell surface receptors
• the Ras proteins are activated by binding GTP
• the proteins are inactivated by GTP to GDP hydrolysis
• mutations in the c-ras genes inactivate the Ras GTPase
• mutated Ras proteins are constitutively active
• constitutively active Ras proteins result in uncontrolled cell growth
51
amino acid positionRas gene 12 59 61 Tumor
c-ras (H, K, N) Gly Ala Gln normal cells
H-ras Gly Ala Leu lung carcinomaVal Ala Gln bladder carcinoma
K-ras Cys Ala Gln lung carcinomaArg Ala Gln lung carcinomaVal Ala Gln colon carcinoma
N-ras Gly Ala Lys neuroblastomaGly Ala Arg lung carcinoma
Murine sarcoma virus
H-ras Arg Thr Gln Harvey strainK-ras Ser Thr Gln Kirsten strain
Amino acid substitutions in Ras family proteins
52
Le ricerche sono state condotte sul cetuximab, un anticorpo monoclonale utilizzato
per il trattamento del cancro del colon-retto metastatico ed è stato individuato un
gene (KRAS) che predice l'efficacia di questa molecola sul paziente.
I risultati mostrano che il cetuximab funziona meglio nei pazienti che non
presentano mutazioni in questo marcatore.
Questa scoperta è un altro decisivo passo avanti verso la messa a punto di terapie
sempre più mirate e su misura per il paziente.
53
54
Una mutazione puntiforme nel gene, che codifica per la proteina Ras, riduce la sua attività GTPasica rendendola
costitutivamente attiva.
55
Cetuximab è un anticorpo
monoclonale che blocca il
recettore dell’EGF.
La proteina Ras si trova a valle
di EGFR, quindi anche bloccando
il recettore non si ottiene la
risposta desiderata (blocco della
proliferazione cellulare)
WhenWhen EGFREGFR isis blocked,blocked, KRASKRAS doesdoes notnot transducetransduce proliferationproliferation signalssignals andandduplicationduplication ofof tumourtumour cellscells isis affectedaffected.. However,However, KRASKRAS mutations,mutations, casuallycasuallyoccurringoccurring inin CRCCRC patients,patients, maymay leadlead toto aa KRASKRAS permanentlypermanently turnedturned onon togethertogether withwithitsits downstreamdownstream signallingsignalling:: thisthis maymay causecause tumourtumour cellscells toto proliferateproliferate withoutwithout controlcontrol
57
Ricerca delle mutazioni del gene K-Ras
nella biopsia del paziente
58
Metodologia
Preparazione del DNA dalla biopsia
Amplificazione (PCR) della regione genomicadi interesse
•Sequenziamento dei frammenti ottenuti
•Saggi di discriminazione allelica medianteReal-Time PCR
Sequenziamento dei frammenti ottenuti
Discriminazione allelica
61
Chromosomal rearrangements or translocations
Neoplasm Translocation Proto-oncogene
Burkitt lymphoma t(8;14) 80% of cases c-myc1
t(8;22) 15% of casest(2;8) 5% of cases
Chronic myelogenous t(9;22) 90-95% of cases bcr-abl2leukemia
Acute lymphocytic t(9;22) 10-15% of cases bcr-abl2leukemia
1c-myc is translocated to the IgG locus, which results in its activated expression2bcr-abl fusion protein is produced, which results in a constitutively active abl kinase
62
La proteina, codificata da c-myc attiva la trascrizione di geni che controllano la progressione del ciclo cellulare
dalla fase G1 alla fase S.
Normalmente, sia l’ mRNA trascritto dal protooncogene, che la proteina sono molto instabili.
Le cellule il cui genoma contiene le mutazioni sono costitutivamente indotte a proliferare.
63
sono tipiche le traslocazioni che interessano il cromosoma 8, dove è
localizzato il gene c-myc, ed uno dei tre cromosomi in cui sono
localizzati i geni che codificano per le catene pesanti e leggere delle
immunoglobuline.
La traslocazione più frequente è la [t (8:14)], che si riscontra nel
90% dei BL:
la traslocazione, spostando cMyc in prossimità dell’enhancer del
gene che codifica per una delle catene delle immunoglobuline, causa
la sua continua espressione e di conseguenza le cellule sono
costitutivamente stimolate a proliferare.
64
c-myc is translocated to the IgG locus,which results in its activated expression
bcr-abl fusion protein is produced,which results in a constitutively active abl kinase
bcr-abl
bcr
abl
c-myc IgGIgG enhancerc-myc is activated bythe IgG enhancer in
lymphocytes
65
A chromosome translocation that forms Bcr-Abl in a hematopoietic stem cell forms the diagnostic “Philadelphia” chromosome and results in the initial chronic phase of human chronic myelogenous leukemia (CML), characterized by an expansion in the number of well-differentiated granulocytes, a type of white blood cell. A second mutation in one such cell (e.g., in p53) leads to acute leukemia.
66
67
The chromosomal translocation results in fusion of a portion of the bcr gene (whose function is unknown but whose N-terminal segment
forms a coiled-coil domain that links several bcr polypeptides together) with part of the c-abl gene, which encodes a protein-
tyrosine kinase whose normal substrates are not known.
The chimeric polypeptides expressed from the resulting Bcr-Abl oncogene form a tetramer that exhibits constitutive Abl kinase
activity. Although Abl is normally localized to the nucleus, addition of the Bcr segment causes the Bcr-Abl oncoprotein to be localized to the
cytosol.
Bcr-Abl binds to many intracellular signal-transduction proteins and then phosporylates them, proteins that Abl would not normally
activate.As a consequence, these signaling proteins become activated in the
absence of growth factors.
68
69
microRNAs CAN FUNCTION AS TS AND OG
73
79
80Figure 20-16 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
81
