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Studien zur Biosynthese des fungalen

Sekundärmetaboliten Ampullosporin

und Untersuchung der

Kultivierungsbedingungen des

Produzenten

Sepedonium ampullosporum

Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades

doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.)

vorgelegt dem Rat der Biologisch-Pharmazeutischen Fakultät

der Friedrich-Schiller-Universität Jena,

am 04.11.2002

von Dipl.-Ing. (FH) für Biotechnologie Kathrin Reiber

geboren am 24.02.1974

Gutachter

1. Fr. Prof. Erika Kothe (Friedrich-Schiller-Universität Jena)

2. Hr. Prof. Wolfgang Knorre (Hans-Knöll-Institut Jena)

3. Hr. PD Dr. Hans von Döhren (Technische Universität Berlin)

Tag der Doktorprüfung: 19.02.2003

Tag der öffentlichen Verteidigung: 13.03.2003

Im Gedenken an meine Schwiegermutter Christel Reiber

Zusammenfassung:

In der vorliegenden Arbeit wurden Erkenntnisse zur Biosynthese der 1996 isolierten,

neuroleptisch wirksamen Substanz mit der Bezeichnung Ampullosporin (Ritzau et al.,

1997) gewonnen. Außerdem gelang es, basierend auf der Untersuchung des Einflusses

verschiedener physiologischer Parameter auf Kulturen des Produzenten Sepedonium

ampullosporum, ein standardisiertes Submerskultivierungsregime im Schüttelkolben-

maßstab zu etablieren. Eine erhöhte Ampullosporin-Produktion von bis zu 33 mg/l bei

verkürzten Fermentationszeiten wurde dabei realisiert.

Als effektivste Methode zur kostengünstigen Bereitstellung großer Mengen des

Sekundärmetaboliten Ampullosporin stellte sich die Feststoff-Fermentation heraus. Hier

wurden Ausbeuten von etwa 0,27–0,4 g Reinsubstanz pro kg Substrat erzielt.

Monospezifische Antikörper gegen Ampullosporin wurden hergestellt, die eine Detektion

der Zielsubstanz in der produzierenden Zelle ermöglichten. Durch ultramikrotomisches

Schneiden des gesamten Pellets konnte auf eine Verteilung des Ampullosporins im

produziernden Mycelpellet geschlossen werden. Die Methoden der

Immunelektronenmikroskopie dienten zur Visualisierung der Ampullosporin-

Ampullosporinantikörper-Komplexe.

Aufgrund der nichtproteinogenen Aminosäure, der α-Aminoisobuttersäure, im

Ampullosporin-Molekül, wurde ein nichtribosomaler Peptidsynthetase-Komplex (NRPS)

als biosynthetisches System angenommen. Aus ampullosporinproduzierenden Zellen

konnten zwei stark miteinander assoziierte, hochmolekulare Proteine mit der Bezeichnung

HMWP1 und HMWP2 ankonzentriert und partiell aufgereinigt werden. Ihre Größe von

etwa 1,5 MDa und 350 kDa entspricht einem 15 modularem NRPS-System. Außerdem

korreliert ihr Auftreten mit dem Prozess der Ampullosporinbildung. Beide Proteine

reagierten mit hochspezifischen NRPS-Antikörpern, sodass vermutet wird, dass HMWP1

und HMWP2 in das biosynthetische System zur Expression von Ampullosporin involviert

sind.

Nach proteolytischer Spaltung des 1,5 MDa–Proteins (HMWP1) gelang die

Ansequenzierung eines internen Fragments. Degenerierte, von hochkonservierten

Aminosäure-Sequenzmotiven der Adenylierungsdomäne von NRPS abgeleitete

Oligonukleotid-Primer wurden für ein Screening nach NRPS-codierenden Genen auf dem

S. ampullosporum-Genom eingesetzt. Mit Hilfe des Genomic-Walking konnte ein NRPS-

Genfragment mit einer Gesamtgröße von etwa 2 kb amplifiziert werden. Dieses zeigt

größte Ähnlichkeit zu den beiden glutaminaktivierenden Modulen der einzig publizierten

Peptaibol-Synthetase-codierenden Sequenz tex1 aus Trichoderma virens .

Gliederung

1 Abkürzungsverzeichnis 1

2 Aufgabenstellung 3

3 Einleitung 4

3.1 Ampullosporin, ein Vertreter der Peptaibole mit antibiotischer

und neuroleptischer Wirkung

4

3.2 Sepedonium ampullosporum 7

3.3 Die nichtribosomale Peptidbiosynthese 9

Die Adenylierungs(A)-Domäne 12

Die Thiolierungs(T)-Domäne bzw. das Peptidylcarrier-Protein

(PCP)

13

Die Kondensations(C)-Domäne 14

Die Thioesterase(TE)-Domäne 14

Modifizierende Domänen 14

3.4 Peptid-Polyketid-Hybride 15

4 Materialien 19

4.1 Chemikalien und Materialien 19

4.2 Geräte 21

4.3 Mikroorganismen 23

4.4 Plasmide 23

4.5 Primer 24

4.6 Medien 25

4.7 Lösungen und Puffer 27

5 Methoden 31

5.1 Mikrobiologische Arbeiten 31

5.1.1 Stammhaltung und Anzucht von Sepedonium ampullosporum 31

5.1.2 Kultivierung von Sepedonium ampullosporum 32

5.1.2.1 Emerskultivierung 32

5.1.2.2 Submerskultivierung im Schüttelkolben 32

5.1.2.3 Submerskultivierung im Rührbioreaktor 32

5.1.2.4 Emerskultivierung im Festbettreaktor 33

5.2 Enzympräparation aus Sepedonium ampullosporum 33

5.2.1 Zellernte 33

5.2.2 Zellaufschluss 33

5.2.3 Ammoniumsulfatfällung 34

5.2.4 Enzymaufreinigung mittels säulenchromatografischer

Methoden

34

5.2.4.1 Gelfiltration mit Superdex 200 HiLoad 34

5.2.4.2 Anionenaustauschchromatographie an High PerformanceTM

Q-Sepharose Fast Flow 5/5 und Mono QTM HR 5/5

35

5.2.4.3 Hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC) an

phenylsub-stituierter Sepharose HR 5/5

35

5.3 Enzymaktivitätstests zum Nachweis von

Peptidsynthetasen

36

5.3.1 Nachweis der Aminoacyladenylatbildung über den ATP/PPi –

Austausch

36

5.3.2 Thioesterbildung 37

5.4 Proteolytischer Verdau und N-terminale

Ansequenzierung interner Fragmente

37

In-Gel-Verdau 38

Ansequenzierung interner Protein-Fragmente 38

5.5 SDS Polyacrylamid – Gelelektrophorese (SDS-PAGE) 39

5.6 Präparation genomischer DNA aus


39

5.7 Primer-Design 40

5.8 Polymerase Chain Reaction (PCR) 40

Gradienten-PCR 41

Touch-Down-PCR 42

Nested PCR 42

5.9 DNA–Trennung im Agarosegel 42

5.10 Isolierung von DNA aus dem Agarose-Gel 43

5.11 Klonierung von DNA-Fragmenten 43

5.11.1 Insertion von DNA-Fragmenten in ein Plasmid-Vektor 43

5.11.2 Herstellung von elektrokompetenten E.-coli-Zellen 44

5.11.3 Elektroporation von E.-coli-Zellen 44

5.11.4 Präparation von E.-coli-Klonen 44

5.12 DNA-Sequenzierung und Sequenzvergleiche 45

5.13 Immunologische Methoden 45

5.13.1 Herstellung von Antikörpern gegen Ampullosporin 45

5.13.2 Aufreinigung der Ampullosporin-Antikörper 46

5.13.3 Herstellung von Antikörpern gegen das HMWP1- und

HMWP2-Protein

48

5.13.4 Tests zur Bestimmung der Immunaktivität 48

5.13.4.1 Dot-Blot-Immunoassay 48

5.13.4.2 Western– Blot- Analyse 50

5.13.5 Immunelektronenmikroskopie 50

5.14 Allgemeine Methoden 52

5.14.1 Bestimmung der Trockenbiomasse 52

5.14.2 Glucose–Bestimmung 52

5.14.3 Maltose-Bestimmung 53

5.14.4 Stickstoff–Analyse 53

5.14.5 Phosphat–Analyse 53

5.14.6 Aminosäure–Analyse in Kulturlösungen 54

5.14.7 Ampullosporin–Bestimmung 55

5.14.8 Proteinbestimmung nach BRADFORD 55

5.14.9 Down-Stream-Processing zur Aufreinigung und Isolierung von

Ampullosporin

56

6 Ergebnisse 57

6.1 Optimierung der Fermentationsbedingungen von


57

6.1.1 Einfluss der Kohlenstoffquelle auf Zellwachstum und

Produktbildung

58

6.1.2 Einfluss der Stickstoffquelle auf die Produktbildung 59

6.1.3 Einfluss von Scherkraft auf die Ampullosporinbildung 62

6.1.4 Scale-up-Experimente 63

6.2 Biosynthese von Ampullosporin 66

6.2.1 Gewinnung der potentiellen Ampullosporinsynthetase(n)

(HMWP)

66

6.2.2 Reinigung der Zielproteine 69

6.2.2.1 Gelfiltration mit Superdex 200 HiLoad 16/60 69

6.2.2.2 Aufreinigungsversuche mittels Anionenaustausch-

chromatographie an High PerformanceTM Q-Sepharose und

Mono QTM HR 5/5 sowie Hydrophober Interaktions-

chromatografie an phenylsubstituierter Sepharose

71

6.2.3 Biochemische Untersuchung von HMWP1 und HMWP2 72

6.2.3.1 Untersuchung auf NRPS-Aktivität 72

6.2.3.2 WESTERN–Blot-Analyse mit spezifischen NRPS-Antikörpern 74

6.2.3.3 Proteolyseverhalten 75

6.2.4 Screening nach NRPS codierenden Genen 79

6.2.4.1 Primerdesign 79

6.2.4.2 PCR mit degenerierten Oligonukleotiden 81

6.2.4.3 Sequenzierung der NRPS-DNA-Fragmente und

Sequenzvergleiche

83

6.2.4.4 PCR mit degenerierten Ketoacylsynthase-Primern zur

Detektion von PKS-codierenden Genen

85

6.3 Auswertung immunologischer Experimente 86

6.3.1 Herstellung monospezifischer Antikörper gegen

Ampullosporin

86

6.3.2 Immunelektronenmikroskopie zur Lokalisation von

Ampullosporin

88

6.3.3 Antikörper gegen die putativen

ampullosporinbiosynthetischen Proteine HMWP1 und

HMWP2

90

7 Diskussion 91

7.1 Auswertung von Kultivierungsexperimenten 91

Kohlenstoff(C)-Repression 92

Einfluß der Stickstoffversorgung 92

Einfluß von Scherkraft und Scale up 94

7.2 Lokalisation von Ampullosporin mittels monospezifischer

Antikörper

96

7.3 Auswertung erster Untersuchungsergebnisse der

Biosynthese von Ampullosporin

97

7.3.1 HMWP1 und HMWP2 als potentielle Ampullosporin-

Synthetasen

98

7.3.2 Auswertung der Aktivitätstests 102

7.3.3 Proteolyseverhalten der potentiellen Ampullosporin-

Synthetasen HMWP1 und HMWP2

103

7.3.4 Screening nach NRPS-codierenden Genen 104

8 Ausblick 106

9 Literatur 108

Abkürzungsverzeichnis

1

1 Abkürzungsverzeichnis

Ω Ohm, elektr. Widerstand HIC Hydrophobe

Interaktionschromatografie

µCi Curie, Radioaktivität IgG Immunglobuline G

µF Farad, elektr. Kapazität KR Ketoreduktase

ACP Acyl-Carrier-Protein KS Ketoacyl-Synthase

ACV δ-(L-Aminoadipyl)-L-

Cysteinyl-D-Valin

kV Kilovolt, elektr. Spannung

A-Domäne Adenylierungsdomäne mesh Größenangabe für

kolloidales Gold

AK Antikörper min (’) Minuten

AMP Adenosinmonophosphat MW Molekulargewicht

AS Aminosäure MT Methyltransferase

AT Acyltransferase NRPS Nichtribosomale

Peptidsynthetase

ATP Adenosintriphosphat OD600 Optische Dichte bei 600

nm

BSA Rinderserumalbumin OX Oxidationsdomäne

C-Domäne Kondensationsdomäne PAA Polyacrylamid

CoA Coenzym A PAGE Polyacrylamid-

Gelelektrophorese

Cy Zyklisierungsdomäne PCP Peptidylcarrier-Protein

Cy A Cyclosporin A PCR Polymerase Chain

Reaction (Polymerase-

Kettenreaktion)

Da Dalton, Molekulargewicht PFA Paraformaldehyd

kDa; MDa Kilo-, Mega-Dalton PKS Polyketidsynthase

DC Dünnschichtchromatografie PPi Pyrophosphat

DH Dehydrogenase/Dehydratase PVDF hydrophobe, mikroporöse

Polyvinyliden-Membran

DNA Desoxyribonukleinsäure rpm Umdrehungen pro Minute

dNTP Desoxynukleotid SDS Sodium dodecyl sulfate

DTE;

DTT

1,4-Dithioerythritol;

Dithiothreitol

s (’’) Sekunden

EDTA Ethylendiamintetraacetic acid Std. (h) Stunden

ER Enolreduktase TCA Trichloressigsäure

Abkürzungsverzeichnis

2

EtBr Ethidiumbromid T-Domäne Thiolierungsdomäne

EtOH

MeOH

Ethanol

Methanol

TE Thioesterase

FPLC Fast Protein Liquid

Chromatography

Tm Melting Point

(Schmelztemperatur)

FS(S)

GA

Fettsäure(synthase)

Glutardialdehyd

Tris Tris(hydroxymethyl)amino

methan

HMWP1 Hochmolekulares Protein 1

(1,5 MDa)

U Units, Enzymaktivität

HMWP2 Hochmolekulares Protein 2

(350 kDa)

UDS Ultradünnschnitte

Aminosäure-Code Universeller degenerierter DNA-Code

Alanin Ala A M (A/C)

Arginin Arg R R (A/G)

Asparagin Asn N W (A/T)

Asparaginsäure Asp D S (G/C)

Cystein Cys C Y (C/T)

Glutamin Gln Q K (G/T)

Glutaminsäure Glu E V (A/G/C)

Glycin Gly G H (A/C/T)

Histidin His H D (A/G/T)

Isoleucin Ile I B (C/G/T)

Leucin Leu L N (A/G/C/T)

Lysin Lys K

Methionin Met M

Phenylalanin Phe F

Prolin Pro P

Serin Ser S

Threonin Thr T

Tryptophan Trp W

Tyrosin Tyr Y

Valin Val V

α-Aminoiso-buttersäure

Aib U

Isovalin Iva J

Aufgabenstellung

3

2 Aufgabenstellung

Gegenstand dieser Arbeit war der fungale Sekundärmetabolit und das zur Klasse der

Peptaibole zählende Peptidantibiotikum Ampullosporin (Ritzau et al., 1997). Basierend auf

dem Interesse an Peptaibol-Biosynthesen und dem Bedarf an größeren Substanzmen-

gen, die eine intensive Beforschung des potentiellen, pharmakologisch relevanten Wirk-

stoffs ermöglichen, wurde das Ziel dieser Arbeit bestimmt.

Durch physiologische und biosynthetische Untersuchungen der Ampullosporin-

Biosynthese sollte zur Aufklärung des Ampullosporin-Bildungsprozesses beigetragen

werden. Außerdem wurde die Etablierung eines ertragreichen Kultivierungsregimes ange-

strebt.

Wie viele fungalen Sekundärmetabolite konnte auch Ampullosporin anfänglich nur in Spu-

ren aus Emerskulturen des Produzenten Sepedonium ampullosporum gewonnen werden.

Für die Untersuchung von Struktur-Wirkungsbeziehungen werden jedoch mehrere Gramm

an Reinsubstanz benötigt. Die chemische Synthese solcher Verbindungen ist zunächst

sehr schwierig realisierbar und mit einem hohen Kostenaufwand verbunden (chemische

Synthese von Ampullosporin an der Festphase erst seit 2001, Nguyen et al., 2002). Des

weiteren werden gewöhnlich nur geringe Mengen synthetisiert.

Eine optimierte biotechnologische Herstellung des interessanten Wirkstoffes könnte hin-

gegen beide Vorteile gewähren: eine kostengünstige Bereitstellung größerer Substanz-

mengen.

Aufgrund der produktbezogenen schwierigen Kultivierung des Pilzes, könnte bei Kenntnis

der Enzymeigenschaften bis hin zum Biosynthese-Gencluster die Enzym- bzw. Produk-

texpression gezielt stimuliert werden. Eine andere Variante besteht in einer möglichen

heterologen Expression des Ampullosporins in einem leichter kultivierbaren Produktion-

sorganismus. Die dafür notwendigen Grundkenntnisse sollten mit dieser Arbeit erweitert

werden.

Bis kurz vor Ende der Dissertation gab es kaum Angaben zur Peptaibolbiosynthese.

1976-78 wurden Untersuchungen zur Alamethicin-Biosynthese veröffentlicht (Rindfleisch

& Kleinkauf, 1976; Mohr & Kleinkauf, 1978). Bis auf die dort vorgestellten Enzym-

Aktivitätsstudien, konnten bis März 2002 (Wiest et al., 2002) auf keine Peptibolsyntheta-

se-spezifischen Daten (auch genetische Analysendaten) zurückgegriffen werden. Alle

Erkenntnisse, die im Zusammenhang mit der Ampullosporin-Biosynthese gewonnen wer-

den, liefern somit auch notwendige Grundlagen zur Aufklärung anderer Peptaibol-

Bildungsprozesse.

Einleitung

4

3 Einleitung

3.1 Ampullosporin, ein Vertreter der Peptaibole mit antibiotischer und

neuroleptischer Wirkung

1996 wurde in der Arbeitsgruppe U. Gräfe des Hans-Knöll-Instituts für Naturstoff-

Forschung eine neue, psychogen wirksame Substanz, als Sekundärmetabolit des myce-

lialen Pilzes Sepedonium ampullosporum entdeckt (Ritzau et al., 1997).

Es handelt sich dabei um ein aus 15 Aminosäuren bestehendes Peptid (MW: 1621 Da),

mit der Bezeichnung Ampullosporin, welches die typischen Charakteristika eines Peptai-

bols aufweist.

Peptaibole sind kurzkettige (bis zu 20 Aminosäuren), lineare Peptide mit einem stets

acetylierten N-Terminus und zum Alkohol reduzierten C-Terminus (Nagaraj et al., 1981).

Als weiteres, strukturelles Merkmal beinhalten Peptaibole eine hohe Anzahl an α,α-

dialkylierten Aminosäuren, wie α-Aminoisobuttersäure (Aib) und/oder Isovalin (Iva).

Alle der über 200 bisher entdeckten Peptaibole sind fungale Sekundärmetabolite (Chugh

& Wallace, 2001). Dabei treten die Trichodermen als häufigste Produzenten-Gattung auf

(Sansom et al., 1991). Die Ampullosporine gehen jedoch wie die Chrysospermine (Dorn-

berger et al., 1995), Microspermine (Stadler et al., 2001) und das Peptaibolin (Hülsmann

et al., 1998) aus Sepedonium- bzw. Apiocrea-Stämmen hervor.

Die Hauptkomponente, das Ampullosporin A, weist gleich 7 mal die α-

Aminoisobuttersäure im Molekül auf und beinhaltet weiterhin L-Leucin, L-Glutamin, L-

Alanin und L-Tryptophan. In Abb. 1 ist seine Strukturformel dargestellt.

Abb. 1: Strukturformel des Ampullosporins (Ritzau et al., 1997)

Einleitung

5

Aufgrund des hohen Anteils an α-Aminoisobuttersäure, einer die Helixbildung fördernde

Aminosäure, zeigen Peptaibole eine große Tendenz, amphipatische Helixstrukturen aus-

zubilden (Venkatachalapathi & Balaram, 1979, Mathew & Balaram, 1983). Diese Eigen-

schaft ermöglicht die Zusammenlagerung der Helices zu Poren in lipophiler Umgebung

(Boheim, 1974, Duclohier, et al., 1998) (Abb. 2). In der zellulären Lipiddoppelschicht bil-

den Peptaibole senkrecht zur Membran ausgerichtete Transmembrankanalstrukturen aus

(Brachais et al., 1995). Diese werden durch innere H-Brücken zwischen hydrophilen Car-

boxygruppen und Amid-Wasserstoffen sowie durch Lipidinteraktionen mit den nach außen

weisenden aliphatischen Resten der Aminosäuren stabilisiert. Die im Innenraum angeord-

neten polaren Gruppen fungieren als Hydrathülle des Kations (z.B. K+, Na+), welches

sich somit passiv von einem zum anderen Ende der Membran bewegen kann.

Die Assoziation der Monomere zu transmembranen Multimeren ermöglicht auf diese Wei-

se eine spannungsabhängige Öffnung des Kanals (Cascio et al., 1988, Sansom, 1991).

Dadurch ist ein kurzer Flux von Ionen aus und in die Targetzelle hinein möglich, was im

Bilayer-Experiment an künstlichen Membranen nachweisbar ist (Grigoriev et al., 1995).

(a) (b)

Abb. 2: Die helikale Struktur des Chrysospermin C – Monomers (Anders et al., 2000) (a) und die spezi-

fische, membranporenbildende Zusammenlagerung von 6 – 12 helikalen Monomeren in der

Zellmembran am Beispiel des Antimoebin-Oktamers (Snook et al., 1998) (b)

Die bei allen Peptaibolen vorkommende antimikrobielle Aktivität gegenüber gram-

positiven Bakterien (Brückner et al., 1979) und fungalen Organismen (Hajji et al., 1987)

wird vorwiegend dem membrankanalbildenden Effekt zugeschrieben. Dieser bewirkt eine

Störung des osmotischen Drucks, was letztlich den Zelltod hervorruft. So wird auch Am-

pullosporin als Peptidantibiotikum eingestuft (Ritzau et al., 1997).

Im weiteren Wirkungsspektrum dieser Substanz fällt ein morphogener Effekt auf andere

Organismen auf.

Einleitung

6

Anhand des Testorganismus Phoma destructiva, dessen Differenzierung mit einer starken

Melaninbildung und der damit verbundenen Schwarzfärbung korreliert, ist die differenzie-

rungsfördernde Wirkung von Substanzen erkennbar (Dornberger et al., 1995). Im Agar-

Lochplatten-Diffusionstest (Phoma-Test) kommt es im Infiltrationsbereich von Ampullos-

porinen zu einem frühzeitigen Einsetzen der schwarzen Pigmentierung des Pilzes (Abb.

3). Ob dieser Effekt unmittelbar auf die Transmembrankanalbildung von Peptaibolen zu-

rückzuführen ist, ist noch unklar. Die 1999 isolierten Bergofungine (Berg et al., 1999) als

typische Peptaibole verursachten beispielsweise keine schnellere Zytodifferenzierung,

obwohl auch bei ihnen Membrankanalbildung nachgewiesen wurde.

Abb. 3: a) Phoma-Test mit Ampullosporin A im Vergleich zur Testsubstanz Cyclosporin A

Die sog. Phoma-Wirkung steht offenbar in Beziehung zu einer dritten Eigenschaft des

Ampullosporins, seiner hypothermen Wirkung auf Mäuse und seinem neuroleptischen

Effekt auf Ratten (Ritzau et al., 1997, Schlegel et al., 2000, Härtl et al., 1999).

Nach intraperitonealer Applikation von Ampullosporin in Mäusen wurde eine dosisabhän-

gige Absenkung der Körpertemperatur verbunden mit einer Abnahme der spontanen Be-

wegungsaktivität beobachtet. Dies sind typische Charakteristika eines neuroleptischen

Effekts, der durch weitere pharmakologische Untersuchungen (wie MOTITEST,

CATALEPSY-Effekt, ROTA-ROD-Test) an Ratten im Institut für Pharmakologie und Toxi-

kologie der Otto-von-Guerike-Universität in Magdeburg bestätigt wurde (Härtl et al., 1999).

Der schnelle und streng dosisabhängige Eintritt der Wirkungsstärken weist auf eine um-

fassende Resorption und Verteilung von Ampullosporin sowie eine hohe Penetration in

das Zentralnervensystem (ZNS) hin.

Klassische Neuroleptika, wie Chlorpromazin oder Haloperidol zeigen gegenüber dem

Testpilz Phoma destructiva eine ähnliche morphogene Wirkung wie Ampullosporin A.

Daraufhin wurde der Phoma-Test als Vorauswahl- bzw. Vorscreening-Test zur Detektion

Cyclosporin A

Ampullosporin A

Einleitung

7

potentieller, psychogen wirksamer Metabolite etabliert (Schlegel et al., 2000, Nguyen et

al. 2002).

Über die Ursachen der Ampullosporin-Wirkung auf die Pilzmorphogenese und die Neuro-

aktivität liegen noch keine gesicherten Ergebnisse in der Literatur vor.

Eine Hypothese der Arbeitsgruppe Gräfe sieht Ampullosporin A als peptidsubstituiertes

Tryptophan. Die Applikation des Wirkstoffs könnte im Pilz eine Inhibierung der Trypto-

phan-Synthetase bewirken, wodurch mehr Tyrosin für die frühzeitigere Melanin-

Biosynthese zur Verfügung steht. Im Säuger wäre eine Wirkung als Neurotransmitterana-

logon denkbar. Aufgrund der strukturellen Ähnlichkeit des Peptidyltryptophans mit dem

Neurotransmitter Serotonin, könnte Ampullosporin A serotonerge Rezeptoren beeinflus-

sen.

Diese Annahmen bestätigten sich jedoch nicht, da andere Peptaibole, wie beispielsweise

die Trichofumine, auch ohne Tryptophan in der Peptidkette eine ähnliche neuroleptische

Wirkung zeigten (Berg et al., in preparation).

3.2 Sepedonium ampullosporum

Als Produzent der neuroleptisch wirksamen Substanz Ampullosporin wurde der filamentö-

se, auch als Goldschimmel bezeichnete Pilz Sepedonium ampullosporum identifiziert

(HKI-0053, Ritzau et al., 1997). Der auf den Fruchtkörpern der Boletales (Röhrlingsver-

wandte) vorkommende Saprophyt oder auch Mycoparasit (Ammer et al., 1997) wird als

anamorphe Form der Apiocrea chrysosperma beschrieben.

Sepedonium ampullosporum zählt zur Familie der mitosporischen Hypocreaceae, die der

Ordnung der Hypocreales angehört. Diese gliedern sich in die Klasse der Sodariomycetes

ein, welche den Pezizomycotina und der Abteilung der Ascomycota untergeordnet sind

(Carmichael et al., 1980; von Arx, 1981).

S. ampullosporum bildet zwei Arten von Sporen aus (Abb. 4–7). Die Phialosporen werden

während der Wachstumsphase in großer Menge ausgeschüttet, was ein weitflächiges

Auskeimen und Anwachsen des Pilzes gewährleistet. Sie besitzen eine zylindrische bis

ampullenartige Form und sind kleiner als die Alleuriosporen (Abb. 5). Diese wiederum

treten kugelförmig mit einem Durchmesser bis zu 30 µm auf. Im unreifen Zustand er-

scheinen sie hyalin, glatt und weiß. Als reife, ausdifferenzierte Sporen zeigen sie sich gelb

bis intensiv orange gefärbt und sind mit 1–3 µm großen Warzen bedeckt (Damon, 1952,

Gray & Morgan-Jones, 1980). Dies verleiht dem Pilz sein charakteristisches Aussehen.

Einleitung

8

Abb. 4: auskeimende Phialokonidien Abb. 5: Phialosporen und reife Alleuriokonidien

Abb. 6: unreife Alleuriokonidien Abb. 7: ausgereifte Alleuriokonidien

Einleitung

9

3.3 Die nichtribosomale Peptidbiosynthese

Neben Ampullosporin A wurden im Produktspektrum von S. ampullosporum wie bei fast

allen Peptaibolen, eine Reihe von Strukturanaloga detektiert (Kronen et al., 2001; Abb. 8).

Diese als Minorkomponenten auftretenden Ampullosporine, weisen eine einfache bis

mehrmalige Substitution von Aib gegen Alanin auf. Bei Annahme einer nichtribosomalen

Peptidbiosynthese an großen multifunktionellen Enzymmatritzen besteht durchaus die

Möglichkeit, dass bei Aib-Mangel, das strukturell sehr ähnliche Alanin in die Peptidkette

inkorporiert wird. Die Erkennungsregionen nichtribosomaler Peptidsynthetasen können

nämlich im Gegensatz zu denen der Aminoacyl-tRNA-Synthetasen in der ribosomalen

Peptidsynthese wesentlich unspezifischer sein (Katz, 1967).

Jedoch allein die Existenz der nichtproteinogenen α-Aminoisobuttersäure im Ampullospo-

rinmolekül weist bereits auf eine nichtribosomale Peptidbiosynthese hin. Da dieses Motiv

sehr häufig, d. h. 7 mal in der Hauptkomponente Ampullosporin A auftritt, kann eine post-

translationale Modifikation, z. B. in Form einer Alanin-Methylierung ausgeschlossen wer-

den.

Ampullosporin_A Ac-Trp-Ala-Aib-Aib-Leu-Aib-Gln-Aib-Aib-Aib-Gln-Leu-Aib-Gln-Leu-OH

Ampullosporin_B Ac-Trp-Ala-Aib-Aib-Leu-Aib-Gln-Ala-Aib-Aib-Gln-Leu-Aib-Gln-Leu-OH

Ampullosporin_C Ac-Trp-Ala-Aib-Aib-Leu-Aib-Gln-Aib-Ala-Aib-Gln-Leu-Aib-Gln-Leu-OH

Ampullosporin_D Ac-Trp-Ala-Aib-Aib-Leu-Aib-Gln-Aib-Aib-Ala-Gln-Leu-Aib-Gln-Leu-OH

Ampullosporin_E1 Ac-Trp-Ala-Aib-Aib-Leu-Aib-Gln-Ala-Aib-Aib-Gln-Leu-Ala-Gln-Leu-OH

Ampullosporin_E2 Ac-Trp-Ala-Aib-Aib-Leu-Aib-Gln-Aib-Ala-Ala-Gln-Leu-Aib-Gln-Leu-OH

Ampullosporin_E3 Ac-Trp-Ala-Aib-Aib-Leu-Aib-Gln-Aib-Aib-Ala-Gln-Leu-Ala-Gln-Leu-OH

Ampullosporin_E4 Ac-Trp-Ala-Aib-Aib-Leu-Aib-Gln-Ala-Ala-Aib-Gln-Leu-Aib-Gln-Leu-OH

Abb. 8: Ampullosporin A und Analoga (Kronen et al., 2001)

Die nichtribosomale Peptidbiosynthese erfolgt analog zur Polyketidsynthese an Typ I-

Polyketidsynthasen (PKS), an großen, modular aufgebauten Enzymkomplexen, sog.

nichtribosomalen Peptidsynthetasen (NRPS) nach dem Prinzip des Thiotemplate-

Mechanismus (Lipmann, 1973).

PKS- und NRPS-Systeme unterscheiden sich in erster Linie in der Wahl ihrer Monomere.

Während Polyketidsynthasen aktivierte Fettsäuren (acyl-CoenzymA–Thioester) selektie-

ren, benötigen die Synthetasen ATP, um ihre Substrataminosäuren als AMP-Ester in situ

zu aktivieren (Keating & Walsh, 1999).

Einleitung

10

Jedes Modul der NRPS und PKS stellt eine separate, katalytische Einheit dar, die eine

Substraterkennung, -Bindung und Verknüpfung des an jedem Modul gekoppelten Mono-

mers gewährt (Kleinkauf & von Döhren 1987, 1990, Zuber, 1991, Mootz & Marahiel,

1997).

Die Enzyme werden auch als „assembly line (Fließband-)- Enzyme“ bezeichnet. Nach

Selektion der produktformenden Monomere aus dem zellulären Pool und ihrer kovalenten

Kopplung an spezifische Enzymregionen, erfolgt schrittweise und linear eine Verknüpfung

entlang der Enzymkette (Keating & Walsh, 1999).

Das fertige Peptid bzw. Polyketid wird beispielsweise durch Hydrolyse oder Zyklisierung

(Konz et al., 1997) von der NRPS bzw. PKS abgespalten. Diese Reaktion, die Terminati-

on, wird durch eine am C-Terminus endständige Thioesterase katalysiert (Cane, 1997,

Cane et al., 1998). Tex 1 jedoch, ein erst kürzlich publiziertes Gen aus Trichoderma vi-

rens zur Expression einer Peptaibolsynthetase, kodiert für eine C-terminale Reduktase

(Wiest et al., 2002). Substituierte TE-Domänen sind auch aus der Rifamycin- (Yu et al.,

1999) und Saframycin-Biosynthese (Pospiech et al., 1996) bekannt.

Die einzelnen katalytischen Funktionen innerhalb der Module von NRPS sind in Domänen

organisiert.

Die Substraterkennung und Bindung der Aminosäure als Aminoacyladenylat wird von der

Adenylierungs(A)-Domäne realisiert.

Im Anschluss erfolgt eine Übertragung auf die Thiolierungs(T)-Domäne (auch Pepti-

dylcarrier-Protein), an welcher die Substrataminosäure kovalent in Form einer Thioester-

bindung gekoppelt wird.

Die dritte, die Kondensations(C)-Domäne katalysiert die Kondensation als Verknüp-

fungsreaktion mit der am nächsten Modul aktivierten Substrataminosäure und gewährlei-

stet somit den Prozess der Elongation (Abb. 9), (Cane, 1997, Konz & Marahiel, 1999, von

Döhren et al., 1999).

Einleitung

11

Abb. 9: Schema über den Aufbau einer NRPS: vom Modul über Domänen zum NRPS-Produkt (nach

einer Darstellung von Schwarzer & Marahiel, 2001)

Für eine Aktivierung der nichtribosomalen Peptidsynthetase ist zunächst die Überführung

eines jeden Peptidylcarrier-Proteins (PCP) aus seiner inaktiven Apo- in die aktive Holo-

Form notwendig. Dieses sog. Priming wird durch eine hochspezifische CoA: 4’-

Phosphopantethein-Protein-Transferase (PPTase) katalysiert. Dabei wird, wie in Abb. 10

dargestellt, eine von CoA abgeleitete Phosphopantetheingruppe auf einen spezifischen, in

jeder T-Domäne vorhandenen Serin-Seitenkettenarm übertragen (Walsh et al., 1997,

Lambalot et al., 1996). Erst jetzt ist eine Thiolierung und somit feste Bindung der Sub-

strataminosäuren an das Enzym möglich.

Abb. 10: Prozess des Priming, Übertragung der Phosphopantetheingruppe auf die Peptidylcarrier-

Protein-Domäne (aus Keating & Walsh, 1999)

Starter-Einheit

Modul 1 Modul 2 Modul 3

A T A TC A TC

SH SH SH

N

R1

O

ONH

R2HN

R3

O

TE

O-

Module

Domänen

Produkt

Einleitung

12

Die Adenylierungs(A)-Domäne

Die A-Domäne ist verantwortlich für die Substratspezifität eines Moduls. Sie diktiert wel-

che Aminosäure in das Peptidprodukt eingebaut wird und legt somit seine Primärstruktur

fest.

Unter ATP-Verbrauch erfolgt nach der Substraterkennung eine Bindung der Aminosäure

an das Enzym als Aminoacyladenylat. Demnach gehören die A-Domänen wie die Insek-

tenluciferase und die Acyl-CoA-Synthetasen zur Superfamilie der Adenylat-formenden

Enzyme (Toh, 1990, Turgay et al., 1992). Diese zeigen bei Vergleich der genetischen

Daten lokal ausgeprägte Sequenzhomologien, d.h. hochkonservierte Core-Sequenzen

(Adefarati et al., 1991, Pfeifer et al., 1995, Stachelhaus & Marahiel, 1995). Die A-

Domänen verschiedener NRPS-Enzyme weisen sogar Übereinstimmungen von 30–

70 % auf (Schwarzer & Marahiel, 2001).

Die aus etwa 500-600 Aminosäuren aufgebaute A-Domäne besteht aus zwei interagie-

renden Subdomänen (Dieckmann et al., 1997, Conti et al., 1996).

Bei der Untersuchung der Kristallstruktur der phenylalaninaktivierenden A-Domäne der

GramicidinS-Synthetase 1 (GrsA) (Conti et al., 1997) konnte eine bemerkenswerte Analo-

gie zum dreidimensionalen Modell der Feuerfliegen-Luciferase (Conti et al., 1996) festge-

stellt werden. Beide ließen klar die Subdomänstruktur erkennen.

Während der Substrat-Bindung und Adenylat-Bildung findet eine Konformationsänderung

in Folge einer Rotationsbewegung der Subdomänen statt. Dies schließt die Kluft zwischen

den Subdomänen und stabilisiert das Aminoacyladenylat-Intermediat (Conti et al., 1997).

Die Strukturhomologien innerhalb der Familie der adenylatformenden Enzyme schließt

nicht die Aminoacyl-tRNA-Synthetasen als weitere Aminosäure-adenylierenden Enzyme

mit ein (Keller & Schauwecker, 2001).

Zwar katalysieren in der ribosomalen Peptidsynthese auch die t-RNA-Synthetasen eine

substratabhängige ATP-Hydrolyse, jedoch sind die Aktivierungsmechanismen der ribo-

somalen und nichtribosomalen Peptidsynthese nicht miteinander verwandt. Die Ami-

noacyl-tRNA-Synthetasen nehmen bei Fehlaktivierung eine hydrolytische Korrektur vor

und übertragen die Aminosäure auf eine spezifische tRNA. Des weiteren gibt es im Ge-

gensatz zu den nichtribosomalen Peptidsynthetasen keine Thiolfunktion (siehe Thiolie-

rungs-Domäne der NRPS).

Die Röntgenstrukturanalyse der phenylalaninaktivierenden Adenylierungsdomäne der

GramicidinS-Synthetase 1 führte auch zur Identifizierung verschiedener „Schlüssel“-

Aminosäuren, die die Ausprägung einer substratspezifisch-geformten Tasche gewähren.

Aminosäuren in festgelegten Positionen der A-Domäne ermöglichen auf diese Weise eine

Substraterkennung (Stachelhaus et al., 1999, Conti et al., 1997).

Einleitung

13

Aufgrund der starken Ähnlichkeit der A-Domänen wurde angenommen, allein durch die

Sequenzanalyse auch in anderen, noch nicht untersuchten NRPS, die Substratspezifität

vorausbestimmen zu können.

Die Toleranz gegenüber den Substrataminosäuren, die in einigen Modulen stärker (Katz,

1967), in anderen kaum ausgeprägt ist, lässt jedoch bereits erahnen, dass es keinen ein-

heitlichen AS-Code für die Erkennung und Aktivierung der einzelnen Aminosäuren geben

wird (von Döhren et al., 1997).

In Modulen mit mangelnder Substratspezifität der A-Domänen übernehmen die Thiolie-

rungsdomänen eine Art Korrektur-Lesefunktion (von Döhren et al., 1999).

Die Thiolierungs(T)-Domäne bzw. das Peptidylcarrier-Protein (PCP)

Das PCP erfüllt eine Spezifizierungs- und Bindungsfunktion, d.h. nur Substrataminosäu-

ren oder strukturell sehr ähnliche Aminosäuren werden akzeptiert und in Form eines

Thioesters kovalent an die Phosphopantetheinylgruppe der Thiolierungsdomäne gebun-

den. Als „schwingender Arm“ erreicht die gekoppelte AS auf diese Weise jedes relevante

katalytische Zentrum (für die folgende Kondensation oder Modifikation, Schwarzer & Ma-

rahiel, 2001)

Die T-Domäne besteht aus 80 bis 100 AS und ist den funktionell analogen, in Polyke-

tidsynthasen vorkommenden Acyl-Carrier-Proteinen (ACP) auch genetisch sehr ähnlich

(Stein & Vater, 1996, Dieckmann et al., 1995). Die allgemeine Faltung deckt sich mit der

Topologie des ACP’s der Fettsäuresynthase in E. coli (Holak et al., 1988) und der Ac-

tinorhodin-Polyketidsynthase aus Streptomyces coelicolor (Crump et al., 1997).

Zwar gibt es Unterschiede bezüglich der Oberflächenpolarität, der Länge und dem relati-

ven Alignment der Helices (das PCP besteht aus einem 4-Helix-Bündel). Das hochkon-

servierte Serin, die Co-Faktor-Bindungsregion („binding site“), ist jedoch im PCP wie im

ACP übereinstimmend lokalisiert (Weber et al., 2000). Wie bereits erwähnt erfolgt an die-

sem Serin-Seitenkettenarm durch die Übertragung der funktionellen 4’-

Phosphopantethein-Gruppe mittels spezifischer Phosphopantethein-Transferasen (PPTa-

sen) eine posttranslationale Modifikation (Prozess des Primings).

Die NRPS-spezifischen PPTasen, welche sich sequenziell von denen der PKS- und FAS-

Systeme unterscheiden, sind oftmals im Peptid-Biosynthese-Gencluster co-lokalisiert

(Lambalot et al., 1996). Aus diesem Grunde gibt es Bestrebungen, mit Primern für diese

4’-PPTasen, nach NRPS-Gen-Clustern zu screenen (Sanches et al., 2001).

Einleitung

14

Die Kondensations(C)-Domäne

Als dritte essentielle Domäne wird die Kondensations(C)-Domäne vorgestellt. Sie kataly-

siert die Verknüpfungsreaktion, d.h. den Eleongationsprozess zur Peptidbildung. Dabei

wird die an der T-Domäne gekoppelte AS auf das am nächsten Modul aktivierte Substrat

übertragen.

Die aus etwa 450 AS bestehende C-Domäne initiiert die Spaltung des Carboxythioesters

von der ersten T-Domäne und die Kondensation mit dem aminoterminalen Ende der

zweiten Substrataminosäure. Die Peptidkette verlängert sich somit vom N- zum C-

Terminus.

Alle bekannten C-Domänen beinhalten konservierte Core-Motive, wobei das Aminosäure-

Motiv: HHXXXDGXS eine essentielle Rolle in der Kondensationsfunktion einnimmt (de

Crecy-Lagard et al., 1995).

Die Thioesterase(TE)-Domäne

Das letzte Modul von NRPS-Systemen beinhaltet häufig eine carboxy-terminale Domäne

von etwa 350 Aminosäuren, die Sequenzhomologien zu FSS und PKS-Thioesterasen

aufweist (Smith et al., 1990, MacCabe et al., 1991).

Thioesterasen gehören wie die Proteinasen, Lipasen und Acetylcholinesterasen zur Su-

perfamilie der Serin-abhängigen Hydrolasen. Sie katalysieren die hydrolytische Spaltung

von Amiden, Estern oder Thioestern, was die am letzten PCP als Thioester gekoppelte

Peptidkette freisetzt.

Die Palette der Peptid-Produkte ist jedoch sehr vielfältig. Zyklische (Cyclopeptide, Pepti-

dolactone) oder C-terminal reduzierte Produkte werden, wie bereits beschrieben, häufig

ohne oder durch Thioesterase-substituierte Domänen (z.B. Reduktase- oder Zyklisie-

rungs-Domänen) freigesetzt.

Modifizierende Domänen

Neben den A-, T-, C- und Termination-katalysierenden Domänen, die für jedes NRPS-

System essentiell sind, können zusätzliche Domänen in Modulen integriert sein. Diese

katalysieren eine posttranslationale Modifikation der am entsprechendem Modul aktivier-

ten und gekoppelten Aminosäure noch vor dem Elongationsprozess (Billich & Zocher,

1990, Zocher et al., 1982).

Reduktion, Epimerisierung, Glucosilierung oder Methylierung entsprechen dabei typischen

Modifikationsreaktionen.

Einleitung

15

Die verschiedenen Domänen können jedoch unterschiedlich lokalisiert sein. Haese et al.

fanden 1993 in der Enniathin-Synthetase zwischen der A- und T-Domäne des D-2-

Hydroxyisovalerat-inkorporierenden Moduls eine etwa 450 AS große Sequenz mit hoher

Ähnlichkeit zu N-Methyltransferasen.

Die Epimerisierungsdomänen von etwa 400 AS Länge werden hingegen downstream,

hinter dem Peptidyl-Carrier-Protein lokalisiert (Stachelhaus & Marahiel, 1995, de Crecy-

Lagard et al., 1995).

3.4 Peptid-Polyketid-Hybride

Bei „reinen“ nichtribosomalen Peptidsynthetasen sind alle inkorporierten Monomere Ami-

nosäuren. Als typische Vertreter gelten z. B. δ-(L-Aminoadipyl)-L-Cysteinyl-D-Valin (ACV;

van Liempt et al., 1989), Gramicidin (Kleinkauf & Gevers, 1969), Enniatin (Zocher et al.,

1982) oder Tyrocidin (Mootz & Marahiel, 1997).

Viele mikrobielle Metabolite weisen jedoch neben Aminosäuren auch Ketoacyl-Einheiten

auf (Abb. 11, 12). Diese werden von Polyketidsynthase(PKS)-Modulen, welche analog

den NRPS-Modulen funktionieren (Keating & Walsh, 1999, Staunton & Weissman, 2001),

eingebaut (siehe 3.3).

Abb. 11: Beispiele für Peptid-Polyketid-Hybride, welche (A) durch funktionell nicht-hybridisierte NRPS-

PKS-Proteine synthetisiert werden (nach einer Darstellung von Liangcheng Du et al., 2001); (1)

Cyclosporin A, (3) Surfactin, (4) Coronatin, (5) Mycosubtilin, (6) Mycrocystin

Einleitung

16

Abb. 12: Beispiele für Peptid-Polyketid-Hybride, welche (B) durch NRPS-PKS-Hybridsysteme syntheti-

siert werden (nach einer Darstellung von Liangcheng Du et al., 2001);

(2) Rapamycin, (7) Bleomycin, (8) Epothilon, (9) Myxothiazol, (10) Pristinamycin IIB, (11) TA,

(12) Yersiniabactin, (13) Nostopeptolid

Die Polyketid-Monomere liefern CoA-Substrate, wie z. B. Acetyl-, Propionyl- oder Malonyl-

CoA, sodass eine Aktivierung bzw. „Loading“ der PKS-Substrate ohne zusätzliches ATP

erfolgen kann. Eine Acetyltransferase sorgt analog der Adenylierungsdomäne bei NRPS

für die nötige Substratspezifität.

Peptid-Polyketid-Hybride, wie Cyclosporin A (Billich & Zocher, 1987), Surfactin (Galli et

al., 1994) oder Microcystin (Dittmann et al., 1997, Nishizawa et al., 2000) entstehen

durch die Verknüpfung der an separaten NRPS- und PKS-Enzymen synthetisierten Pep-

tid- und Polyketid-Einheiten.

Cyclosporin A beinhaltet die ungewöhnliche AS (4R)-4-[(E)-2-butenyl]-4-methyl-1-

Threonin, die aus einer Polyketideinheit, dem (3R)-hydroxy-(4R)-methyl-(6E)-octenyl-CoA

hervorgeht. Dieser Prozess wird durch eine Polyketid-Sythase katalysiert. Im Anschluss

wird der entstandene Threoninkomplex durch die Cyclosporin-Synthetase in das NRPS-

Produkt inkorporiert (Weber et al., 1994).

Einleitung

17

Bei der Analyse von Lipopeptiden, wie Surfactin, wurde in Starter-Position vor dem er-

sten NRPS-Modul, eine C-Domäne identifiziert, welche für die Verknüpfung der Fettsäure

mit dem Peptidgerüst verantwortlich gemacht wird (Du et al., 2001).

Weitere Varianten des Zusammenspiels von NRPS- und PKS-Einheiten zur Synthese

entsprechender Hybride werden in der Arbeit von Liangcheng Du et al. (2001) beschrie-

ben.

Yersiniabactin (Gehring et al., 1998, Pelludat et al., 1998), Epothilon (Julien et al. 2000,

O’Connor et al. 2002) oder Bleomycin (Du & Shen, 1999) sind hingegen Produkte von

Hybrid-NRPS-PKS-Systemen.

In Abb. 13 und 14 sind modellartige Ausschnitte aus NRPS-PKS- bzw. PKS-NRPS-

Hybridenzymen dargestellt. Aufgrund der modularen Funktionalität von NRPS und PKS

können Ketoacylreste auf Aminosäuren im Elongationsprozess übertragen werden und

umgekehrt. Sind alle PKS- und NRPS-Domänen auf einem Protein lokalisiert, wie z. B. bei

dem PKS-NRPS-Antibiotikum TA von Myxococcus xanthus (Paitan et al., 1999), so han-

delt es sich um Typ-I–Hybride.

Abb. 13: Modell der Domänenorganisation bei einer Typ I – NRPS-PKS-Synthetase zur Synthese von TA

(nach Du et al., 2001)

Einleitung

18

Kommen die interagierenden PKS- und NRPS-Module auf separaten Proteinen vor, wie

bei Bleomycin, Epothilon oder den Nostopeptoliden (Hoffmann et al., 1999), so spricht

man von PKS-NRPS-Hybriden vom Typ II. Häufig sind jedoch Kombinationen beider Ty-

pen anzutreffen, wie bei Yersiniabactin oder Myxothiazol (Silakowski et al., 1999).

Abb. 14: Domänen- und modulare Organisation von bekannten NRPS-PKS-Systemen des Typ II (A)

Bleomycin, (B) Epothilon bzw. TypI – Typ II - Kombinationen (C) Myxothiazol, (G) Yersiniabactin

(nach Du et al., 2001)

Materialien

19

4 Materialien

4.1 Chemikalien und Materialien

AA (Acrylamid) BIORAD (München, Deutschland)

ACN (Acetonitril) MERCK EUROLAB GmbH (Darmstadt,

Deutschland)

Acrylharze:

LR-White; Unicryl BRITISH BIOCELL INTERNATIONAL

Agarose ROTH (Karlsruhe, Deutschland)/

BIORAD

Aminosäuren:

Aib, Trp, Ala, Leu, Gln, Arg, Asn

SIGMA (Deisenhofen, Deutschland);

MERCK

Ampicillin Natriumsalz SIGMA

Anti-Kaninchen-IgG-Konjugat

(Peroxidase; Phosphatase)

AMERSHAM PHARMACIA BIOTECH

(Uppsala, Schweden)

ATP (Adenosin-5-Triphosphat) SIGMA (München, Deutschland)

APS (Ammoniumpersulfat) BIORAD; SERVA (Heidelberg,

Deutschland)

Bis (Bisacrylamid) BIORAD

BrCN (Bromcyan) FLUKA (Neu-Ulm, Deutschland)

Bromphenolblau SERVA

BSA (Rinderserumalbumin) MERCK

Casein-Pepton DIFCO (Detroit, USA)

Coomassie Blau G, R 250 SERVA

DAB (3,3‘ – Diaminobenzidine) SIGMA

DMF (N,N-Dimethylformamid) FLUKA

DTE (1,4-Dithioerytritol) ACROS (Schwerte, Deutschland)

EDTA (Ethylendiamintetraacetic acid) ACROS

Enzyme:

Trypsin; Chymotrypsin; Endoproteinase Glu-C;

Endoproteinase Arg-C; Thermolysin; Papain

SIGMA, MERCK, ACROS

Fast DNA Kit (No.1-800-424-6101) BIO 101 Inc.

Filter:

Sterilfilter (0,2 µm), PTFE-Sterilfilter

Whatman Cellulose DE 52

SATORIUS (Göttingen, Deutschland)

WHATMAN (Maidstone, USA)

Materialien

20

Glutardialdehyd FLUKA

Glycerin MERCK

Glycin MERCK

Hefeextrakt OXOID (Wesel, Deutschland)

HMW (Hochmolekulargewichtsmarker)

(Kit: 16 – 220 kDa)

SIGMA

Immobilon-P Transfer Membran MILLIPORE (Bedford, USA)

KCL (Kaliumchlorid) ACROS

2-Mercaptoethanol MERCK

MgSO4 (Magnesiumsulfat) ACROS

Mono Q HR 5/5 PHARMACIA

NaCL (Natriumchlorid) FLUKA

Natronkalk Soda Lime (Deutschland)

Nitrocellulose Transfer Membran Schleicher & Schüll (Dassel,

Deutschland)

p-Nitrophenol-Phosphat-Tabletten SIGMA

PEG 1500 (Polyethylenglycol) MERCK

Phenylsepharose CL – 4B (5/5) PHARMACIA

PMSF (Phenylmethylsulfonylflurid) ACROS

QIAquick Gel Extraction Kit (250) QUIAGEN,

QIAprep Spin Miniprep Kit (250) QUIAGEN

QIAquick PCR Purification Kit (50) QUIAGEN

Q-Sepharose (5/5) PHARMACIA

Radiochemikalien:

[γ - 32P] – ATP

L – [U-14C] – Aib (Aminoisobuttersäure)

L – [U-14C] – Glutamin

L – [U-14C] – Leucin

L – [U-14C] – Phenylalanin

ICN Biomedicals (Eschwege,

Deutschland)

SDS (Natrium-Dodecylsulfat) SERVA

TCA (Trichloressigsäure) ICN Biomedicals

TEMED (N;N;N’;N’-Tetramethylethylenamine) BIORAD

TFA (Triflouressigsäure) MERCK

Tris (hydroxymethyl)-aminoethan MERCK

Triton X –100 MERCK

Tween 20 SIGMA

Materialien

21

4.2 Geräte

Blot – Transfer – Einheit:

Mini TRANS BLOT

BLOT-Einheit

BIORAD

HOEFER SCIENTIFIC INSTRUMENTS

(San Francisco, USA)

Elektrophorese-Einheiten:

Proteingele: BIORAD Mini PROTEAN NTM

Isoelektrische Focussierung: MULTIPHOR II

Agarose-DNA-Gelkammer

BIORAD

PHARMACIA

PHARMACIA

FPLC – Chromatographie – Einheit PHARMACIA

Glucose-Analysengerät:

YSI 2700 SELECT YSI Incorporated (Ohio, USA)

HPLC – Einheit, bestehend aus:

Autosampler: SIL – 10 ADvp

2 Pumpen: LC – 10 ATvp

Degasser: DGU – 14 A

Säulenofen: CTO – 10 ACvp

Detector: SPD M 10 Avp

System-Controller: SCL – 10 Avp

Software: CLASS VP 5.03

SHIMADZU (Kyoto, Japan)

Hochdruck-Homogenisator GAULIN APV Homogenisier GmbH

(Deutschland)

Stab-Homogenisierer:

ULTRA – TURRAX T25

POLYTRON PT 1200 CL

Janke&Kunkel IKA Labortechnik

(Staufen, Deutschland)

KINEMATICA AG (Littau, Schweiz)

Kühlzentrifugen J2 – 21 mit den Rotoren:

JA 10, JA 14 und JA 20

AVANTITM J20 XP, J25

BECKMAN Instruments GmbH

(München, Deutschland)

Lyophillisationseinheit:

CHRIST LOC-1M ALPHA 1-4 CHRIST (Stuttgart, Deutschland)

Massenspektrometrie – Einheit:

CID-MS/MS QUATTRO

FISION BIOTECH VG (Altrincham,

England)

Materialien

22

Phosphat-Analysengerät:

Spektralphotometer MERCK SQ 118

MERCK

Rotationsverdampfer BÜCHI (Konstanz, Deutschland)

Schütteleinheit

Spektralphotometer UV–120–02 SHIMADZU

Stickstoff-Analysengeräte:

Destillationseinheit B – 339

SPECTROQUANT NOVA 60

BÜCHI

MERCK

Submersbioreaktoren:

5 l: BIOSTAT MD/M5

10 l: BIOSTAT ED/ES10

B. BRAUN BIOTECH International

GmbH (Melsungen, Deutschland)

PCR - Gerät:

T-Gradient Thermocycler BIOMETRA (Göttingen, Deutschland)

Szintillationszähler Mark III LEARTE NUCLEAR CHICAGO

(Chicago, USA)

Tischzentrifugen mit den Rotoren:

F0685; F2402H;F1010

BECKMAN Instruments GmbH

Elektroporator:

Gene-PulserTM-Gerät BIORAD

Fräsmaschine für Ultramikrotomie:

Ultratrim REICHERT LEIKA (Deutschland)

Anfertigen von UDS:

Reichert Ultra Cut S REICHERT LEIKA

Transmissionselektronenmikroskop

CEM 902 A ZEISS (Jena, Deutschland)

Materialien

23

4.3 Mikroorganismen

Sepedonium ampullosporum DSM 10602

(Ampullosporin-produzierender Stamm)

daraus eigene Selektanten: A85/453-1/K. gelb

A85/453-1/K. weiß

Sepedonium ampullosporum i1009

(Peptaibolin-produzierender Stamm)

E.coli JM 1009

(Klonierungsorganismus)

4.4 Plasmide

pGEMR – T Vektor Dieser Vektor mit einer Größe von 3000 bp besitzt eine

Bindungsregion für den pUC/M13–Vorwärtsprimer sowie eine

für den pUC/M13–Rückwärtsprimer. Des weiteren trägt das

Plasmid eine beta-Lactamase kodierende Region, die den

entsprechenden Transformanden eine Ampicillin-Resistenz

verleiht [http://www.promega.com/vectors/ pgemt.txt].

Materialien

24

4.5 Primer

Primer AS-Sequenz-Motiv Redundanz

NRPS_LowF

Tm = 62,4°C

KAGA(G)G(A) 4

NRPS_HighF

Tm = 69,6°C

KAGA(G)G(A) 4

MTF2

Tm = 65,5°C

KAGA(G)G(A) 512

NRPS_LowR

Tm = 49,1°C

RIELGEIE 8

NRPS_HighR

Tm = 56,4°C

RIELGEIE 8

MTR2

Tm = 51,2°C

RIELGEIE 192

Fung170F_neu

Tm = 60°C

Y(F)TSGT(S)TG 1536

Fung170R_neu

Tm = 60°C

YTSGTTG 1536

Fung320F_neu

Tm = 50,1°C

YGPTE 24

Fung320R_neu

Tm = 50,1°C

YGPTE 24

Fung430F_neu

Tm = 51,2°C

YK(R)T(S)GDL(R) 3072

Fung430R_neu

Tm = 51,2°C

YK(R)T(S)GDL(R) 3072

Mio1F

Tm = 52,8°C

PSPLPN 512

Mio1R

Tm = 52,8°C

PSPLPN 512

Mio1F_neu

Tm = °C

PSPLPN 256

Mio1R_neu

Tm = °C

PSPLPN 256

Mio2F

Tm = 46,7°C

VFLVTT 256

Mio2R

Tm = 45,5°C

VFLVTT 256

Materialien

25

Tib1

Tm = 36,9°C

YGPTE 3072

Tib2

Tm = 37,4°C

YK(R)T(S)GDL(R) 256

SepAfor

Tm = 57,5

spezifische Sepedonium-NRPS-Sequenz: GRRDTQV

0

Cdom1R

Tm = 64,8

HHXXXDGXS 192

DKF

Tm = 67°C

128

DKR

Tm = 65°C

64

Bei allen aufgeführten Oligonukleotid-Primern handelt es sich um NRPS-spezifische

Motive, außer bei DKF und DKR. Diese sind aus Ketoacylsynthase-Motiven der

Microcystin-Synthetase abgeleitet worden (Moffitt & Neilan, 2001; Felsenstein, 1985).

Cdom1R wurde von T. Schwecke, AG von Döhren, TU Berlin zur Verfügung gestellt.

4.6 Medien

VK–0* (Vorkultur-Flüssigmedium) HK–0* (Hauptkultur–Flüssigmedium)

Glucose: 8 g/l Maltose: 5 g/lMaltose: 3 g/l Casein – Pepton: 2 g/lCasein – Pepton: 4 g/l KH2PO4: 2 g/lKH2PO4: 2 g/l MgSO4 * 7 H2O: 0,5 g/lMgSO4 * 7 H2O: 0,5 g/l ZnSO4 * 7 H2O: 0,008 g/l

ZnSO4 * 7 H2O: 0,008 g/l

pH 5,8 ... 6,2 pH 5,8 ... 6,2

HK–0*/1 (Hauptkultur–Flüssigmedium)

HK–0*-Medium mit 5 ml AS-Cocktail 2a an

Stelle des Casein-Peptons; pH 5,8 ... 6,2


HK–0*-Medium mit 5 ml AS-Cocktail 2b an



HK–0*-Medium mit 0,002-1 g/l α-Aib an



HK–0*-Medium mit 3 g/l Soytone an Stelle

des Casein-Peptons; pH 5,8 ... 6,2

HK–0*/4a (Hauptkultur–Flüssigmedium)

wie HK-0*/4 mit 1 g/l α-Aib


HK–0*-Medium mit 3,5 g/l (NH4)2SO4 anStelle des Casein–Peptons; pH 5,8 ... 6,2

Materialien

26




HK–0*-Medium mit 3,5 g/l NaNO3 an Stelle

des Casein–Peptons; pH 5,8 ... 6,2




HK–0*-Medium mit 3 g/l Hefeextrakt an



wie HK–0*/7 mit 1 g/l α-Aib

2 TY Medium

NaCl 10 g/lTrypton 10 g/lHefeextrakt 5 g/l(Agar 1,5-2 %)

pH 7,2

Wb 6 – 1/14, Var.13 (Flüssigmedium) Synthetisches Pilz–Flüssigmedium

Glucose: 10 g/l Glucose: 10 g/l(NH4)2SO4: 3,5 g/l Hefeextrakt: 0,5 g/lKH2PO4: 2 g/l L – Asparagin: 2,5 g/lMgSO4 * 7 H2O: 0,5 g/l DL – Phenylalanin: 0,15 g/lZnSO4 * 7 H2O: 0,008 g/l KH2PO4: 0,5 g/l

MgSO4 * 7 H2O: 0,5 g/l

SPZ – Stammlösung: 10 ml/l

pH 5,0 ... 5,3 pH 6,5

GNB Zeolith–Agar(Flüssigmedium zur Kontaminationskontrolle)

Pepton: 10 g/l Glucose: 10 g/lGlucose: 5 g/l Glycerin: 30 g/lNaCl: 5 g/l Casein – Pepton: 5 g/l

NaCl: 2 g/lAgar: 1,5 ... 2 g/l

pH 7,0 pH 7,3

Aminosäure–Agar HMG–Medium

Glucose: 10 g/l Glucose: 30 g/lL-Glutamin: 1 g/l Glycerin: 10 g/lL-Alanin: 0,1 g/l Sojamehl: 50 g/lα-Aminoiso-buttersäure:

0,1 g/l Casein – Pepton: 8 g/l

L-Tryptophan 0,1 g/l NaNO3: 1 g/lL-Leucin 0,32 g/l Zn(NO3): 0,5 g/lNaCl: 2 g/lAgar: 1,5 ... 2 g/l

pH 6,5 pH 7,3

Materialien

27

Malzextrakt – Medium Malz – Agar

Glucose: 10 g/l Malzextrakt: 4 g/lMalzextrakt: 20 g/l Hefeextrakt: 0,4 g/lHefeextrakt: 2 g/l Agar: 1,5 g/l(NH4)2HPO4: 3,5 g/l

pH 6,0 pH 6,0

Alle Medien wurden, wenn nicht anders angegeben, 35 min bei 121 °C im Autoklav

sterilisiert. Hitzeempfindliche Substanzen, wie Aminosäuren oder Antibiotika (z.B.

Ampicillin), wurden sterilfiltriert und bei Bedarf nach Abkühlen des Mediums auf

mindestens 60 °C zugesetzt.

4.7 Lösungen und Puffer

AS – Cocktail 2a:

Aminosäure (AS): Konzentration der AS

in der Feed – Lösung:

Endkonzentration der

AS im Medium:

L-Glutamin: 20 g/l 1 g/lL-Alanin: 2 g/l 0,1 g/lα-Aminoisobuttersäure: 2 g/l 0,1 g/lL-Tryptophan 2 g/l 0,1 g/lL-Leucin 6,4 g/l 0,32 g/l

AS – Cocktail 2b:

Aminosäure: Konzentration der AS



AS im Medium:

L-Glutamin: 26 g/l 1,3 g/lL-Alanin: 5 g/l 0,25 g/lα-Aminoisobuttersäure: 2 g/l 0,1 g/lL-Asparagin 10 g/l 0,5 g/l

α-Aib - Lösung:

Aminosäure: Konzentration der AS



AS im Medium:

α-Aminoisobuttersäure: 0,04 ... 20 g/l 0,002 ... 1 g/l

Aminosäureanalytik:

Derivatisierungspuffer: pH 8,7 Natriumbicarbonat 50 mM

Dabsylchlorid – Lösung: Dabsylchlorid 1,29 mg/ml

ACN

Verdünnungspuffer: pH 7,0 Phosphatpuffer 50 mM

Mix im Verhältnis 1 : 1 96 % EtOH

Materialien

28

Laufmittel A: pH 6,5 Natriumacetat 30 mM

DMF 4 %

Elutionsmittel B: Acetonitril, HPLC – rein

Ampullosporin – Analytik:

Laufmittel: A. bidest mit 0,1 % TFA

Elutionsmittel: Acetonitril, HPLC – rein

Enzympräparation:

Waschpuffer: pH 7,5 Tris 50 mM

KCl 100 mM

Aufschlusspuffer: pH 7,5 Tris 100 mM

NaCl 50 mM

DTE 30 mM

EDTA 20 mM

PMSF etwa 100 µl / l (gesätt. Lsg.)

Glycerin 30 %

Puffer A: pH 7,5 Tris 50 mM

NaCl 200 mM

EDTA 1 mM

DTE 3 mM

Glycerin 10 %

Puffer B: pH 7,5 Tris 50 mM

EDTA 1 mM

DTE 3 mM

Puffer C pH 7,5 Tris 50 mM

EDTA 1 mM

DTE 3 mM

NaCl 500 mM

Puffer D pH 7,5 Tris 50 mM

EDTA 1 mM

DTE 3 mM

(NH4)2SO4 1000 mM

SDS-PAGE (nach Laemmli):

Elektrophoresepuffer: pH 8,8 Tris 25 mM

Glycin 192 mM

Materialien

29

SDS 0,1 %

SDS – Probenpuffer: SDS 1 g

Glycerol 2 ml

Bromphenolblau (0,1 %) 2 ml

pH 6,8 Tris, 1 M 1,25 ml

2-Mercaptoethanol 2 ml

Pipettierschema:

Trenngel (8 ml) 10 % 5 % 3 %

AA/Bis

(30 %/0,8 %)

2,6 ml 1,34 ml 0,8 ml

Tris – HCl

1 M, pH 8,8

3,0 ml 3,0 ml 3,0 ml

H2O 1,9 ml 3,24 ml 3,77 ml

TEMED 8 µl 8 µl 8 µl

SDS, 10 % 80 µl 80 µl 80 µl

APS (1 %) 334 µl 334 µl 334 µl

Sammelgel (4 ml) 5 % 3 %

AA/Bis

(30 %/0,8 %)

0,67 ml 0,404 ml

Tris – HCl

0,5 M, pH 6,8

1,0 ml 1,0 ml

H2O 2,05 ml 2,32 ml

TEMED 5,71 µl 5,71 µl

SDS, 10 % 40 µl 40 µl

APS (1 %) 228 µl 228 µl

* Für alle SDS-Gelelektrophoresen wurden 3 %ige Sammelgele verwendet.

Coomassie – Färbelösung: Coomassie 0,3 g

Blau G, R 250

MeOH 225 ml

Eisessig 50 ml

H2O 225 ml

Entfärbelösung: Eisessig 20 ml

MeOH/EtOH, tech. 250 ml

H2O 875 ml

Transferpuffer: pH 8,3 Glycin 192 mM

Materialien

30

Tris 25 mM

MeOH/EtOH, tech. 10 %

PBS (10 x) pH 7,2 KH2PO4 2 g

Na2HPO4 * 12 H2O 29 g

NaCl 80 g

KCl 2 g

H2O ad 1000 ml

Blotpuffer 1 PBS

Tween/Triton X 100 0,05 %

Blotpuffer 2 PBS

Tween/Triton X 100 0,05 %

Magermilch 2,0 %

Peroxidase-Nachweis-Reagenz DAB 10 g

NaCl (0,9 %) 18 ml

pH 5 ... 7,6 Tris, 0,5 M 2 ml

H2O2 10 µl

TAE Puffer pH 7,8 Tris 400 mM

(Tris Acetat Puffer) mit Eisessig Natriumacetat 200 mM

eingestellt EDTA 10 mM

6 x DNA Gel Loading Puffer Bromphenolblau 0,25 %

Glycerol 30 %

Bradford Reagenz Coomassie Blau 60 -100 mg

(Coomassie Blau + EtOH EtOH, abs. 50 ml

5 h rühren Phosphorsäure 100 ml;

anschließend auffüllen, H2O ad 1000 ml

filtrieren und Triton-Zugabe;

1 Tag stehen lassen; Triton X – 100 (0,1 %) 0,2 ml

Extinktionskontrolle E (0,5 cm, 465 nm) gegen A. dest = 0,52

und ev. Korrektur)

Puffer zur Ampullosporin-Antikörper-Aufreinigung:

Puffer C pH 8,0 NaHCO3 100 mM

NaCl 500 mM

Lösung E pH 3,5 Essigsäure 100 mM

NaCl 500 mM

Reynolds-Reagenz: pH 11,5 ... 12 Bleicitrat in A. dest 2 %

Scintillationscocktail

Methoden

31

5 Methoden

5.1 Mikrobiologische Arbeiten

5.1.1 Stammhaltung und Anzucht von Sepedonium ampullosporum

Bis zu 3 Wochen altes, gut sporuliertes Mycel diente zum Anlegen von Arbeitskonserven

in Form von bei 4°C gelagerten Schrägagarkulturen und Masterkonserven.

Von den Arbeitskonserven ausgehend, erfolgte die Bereitstellung frischen Impfmaterials.

Hierzu wurden Agarstückchen der Schrägagarkultur auf Zeolith-Agarplatten überimpft.

Nach 7 bis max. 14 Tagen bei 24°C waren die Agarplatten ausreichend mit neuem, durch

junge ausdifferenzierte Alleuriosporen gelb erscheinendem Mycel besiedelt. Etwa 1/8 der

Agarplatte wurde in etwa 4 ml sterile Kochsalzlösung übertragen und mittels eines

Homogenisierstabes zerkleinert. Diese Suspension stellte das Inoculum für 100 ml

Vorkultur (VK-0-Medium) dar, wobei 500 ml Erlenmeyerkolben ohne Schikanen als

Kultivierungsgefäße verwendet wurden. Das Verhältnis von Kolbengröße zur Menge des

Mediums pro Kolben betrug stets 5:1.

Nach einer Inkubation von 48 Stunden bei 24°C und einer Schüttelfrequenz von 90 rpm

erfolgte eine 5 bis 10 %ige Überimpfung in die 2. Vorkultur (gleiches Medium).

Zum Beimpfen der Hauptkultur wurden 5 bis 7 % der 24 bis max. 48 Stunden alten

zweiten Vorkultur verwendet. Entscheidend war die Menge und der Entwicklungsstatus

der Vorkultur. Das pelletierte Pilzmycel durfte noch nicht gelblich verfärbt sein, d. h. keine,

bereits ausdifferenzierten Alleuriosporen sollten vorhanden sein. Eine stark gewachsene,

jedoch nicht zähflüssige Suspension erschien als Hauptkultur-Inokulum am besten

geeignet.

Parallel zu jedem Kultivierungsschritt wurden Sterilkontrollen in Form von Schüttelkulturen

mit Glucosenährbouillon und 5 % Probeninokulum angelegt.

Als Masterkonserven dienten agarstückbespickte, dünne Plastikröhrchen in sterilen Tubes

sowie Agarstücksuspensionen, hergestellt nach dem Prinzip der Inokulumsbereitstellung

für die erste Vorkultur. Diese wurden zusätzlich mit 20 % Glycerin versetzt und bei –80°C

gelagert. Analog existiert eine Stammkonservierung bei etwa –196°C im Flüssigstickstoff.

Methoden

32

5.1.2 Kultivierung von Sepedonium ampullosporum

5.1.2.1 Emerskultivierung

Eine Oberflächenkultivierung wurde in verschiedenen Kultivierungsgefäßen, wie

Erlenmeyerkolben, Steilbrust- oder Rouxflaschen (Flachbettschalen) vorgenommen.

Dabei kamen eine Reihe von komplexen Flüssigmedien, vorwiegend Zeolith-, Malz- oder

HMG-Medium zum Einsatz, die teilweise mit Agar oder Rotigelzusätzen zähflüssige

Suspensionen darstellten. Wie unter 5.1.1 beschriebenen, erfolgte die Beimpfung mit

einer Sporensuspension, einem Agarstück bzw. einer Agarstücksuspension. Als Inokulum

diente auch frisch ausgekeimtes Mycel, das aus der zweiten Vorkultur (vergleiche 5.1.1)

übertragen wurde. Die Kultivierung erfolgte bei 24°C über einen Zeitraum von ca. 1 bis 3

Wochen in Form von Standkulturen.

5.1.2.2 Submerskultivierung im Schüttelkolben

Wie unter 5.1.1 beschrieben wurde der Pilz über 2 Vorstufen kultiviert und anschließend

in das Hauptkulturmedium übertragen. Die standardisierte Kultivierung im Schüttelkolben

erfolgte im 100-ml–Maßstab unter Verwendung von 500 ml Erlenmeyerkolben ohne

Schikanen bei 24°C und einer Schütteldrehzahl von 90 rpm. In dem während der Arbeit

etablierten Standard-Verfahren diente das HK-O*-Medium als Hauptkulturmedium.

Zur Optimierung des Fermentationsprozesses wurde der Einfluss von Substrat- und

verschiedenen weiteren physiologischen Parametern auf das Wachstum und die

Ampullosporinbildung untersucht. In Folge dessen ergaben sich unterschiedliche

Kultivierungsregime, die im Ergebnisteil näher erläutert werden.

5.1.2.3 Submerskultivierung im Rührbioreaktor

Ausgehend von der 2. Vorkultur, die in einem speziellen Impfkolben mit Impfstutzen

kultiviert wurde, dienten Rührreaktoren in einer Größe von 4-30 l–Kultivierungsvolumen

zur Untersuchung des Wachstums- und Produktbildungsverhaltens im

Laborfermentationsmaßstab.

Methoden

33

5.1.2.4 Emerskultivierung im Festbettreaktor

In Kooperation mit der Firma PROPHYTA GmbH wurde Sepedonium ampullosporum auf

festem Substrat in Form von teilweise aufgeschlossenem Getreide-Mix kultiviert. Das

genaue Kultivierungsverfahren kann hier aufgrund eines bestehenden

Geheimhaltungsabkommens nicht offengelegt werden, basiert jedoch auf folgendem

Prinzip. In dünnen Schichten aufgeschüttetes, befeuchtetes und keimarmes Substrat wird

gleichmäßig mit einer Sporensuspension des Pilzes beimpft. Es erfolgt während des

gesamten Kultivierungszeitraumes keine Bewegung oder Durchmischung des Substrats.

Nach 2 bis 3 Wochen ist der Getreide-Mix fast vollständig vom Pilzmycel durchwachsen

und aufgrund starker Sporulierung gelb bis leuchtend orange gefärbt (6.1.5, Abb. 23).

Für die Ampullosporingewinnung wird das gesamte, bewachsene Substrat extrahiert und

dem unter Punkt 5.14.9 beschriebenen Down-Stream-Processing unterzogen.

5.2 Enzympräparation aus Sepedonium ampullosporum

5.2.1 Zellernte

Für die Enzymseparation wurde das Mycel aus Schüttelkulturen verwendet. Durch

Zentrifugation (BECKMANN-Kühlzentrifuge; JA Rotor; 30 min; 5000 rpm) geerntete Zellen

wurden einmal in einem ½ Volumen Waschpuffer resuspendiert und von Bestandteilen

der Nährlösung befreit. Erfolgte die Aufarbeitung nicht innerhalb der nächsten 24 h,

wurden die Zellen bei –20°C über Nacht tiefgefroren und anschließend lyophilisiert. Das

getrocknete Pilzmycel wurde luftdicht in Plastikfolie eingeschweißt und bei –20°C

gelagert. Die Proteinextraktion und Aufreinigung der Zielproteine erfolgte in Anlehnung an

die von Jensen et al. (1988) beschriebene Methode.

5.2.2 Zellaufschluss

Aus ca. 5 l Schüttelkultur, die im Standard-Verfahren hergestellt wurden, ließen sich ca.

20 bis höchstens 30 g lyophilisierte Zellen gewinnen. Diese wurden in etwa 500 ml

Aufschlusspuffer suspendiert und im Hochdruckhomogenisator (GAULIN) unter starker

Kühlung bei 700–900 bar 5–10 min lang aufgeschlossen. In der mikroskopischen

Betrachtung lagen nach dieser Prozedur homogen verteilte Zellbruchstücke und kaum

noch ganze Zellen vor. Bei Anwendung des French-Press-Verfahrens waren mindestens

zwei bis drei Durchläufe mit einem Druck von etwa 10.000 Psi für einen befriedigenden

Zellaufschluss nötig.

Methoden

34

Die Zelltrümmer wurden in einer Kühlzentrifuge (BECKMANN; JA 10/20) mit mindestens

13.000 rpm abzentrifugiert.

5.2.3 Ammoniumsulfatfällung

Der nach Abtrennung der Zelltrümmer vorliegende Rohextrakt wird mit Puffer B auf einen

Glycerinanteil von etwa 20 % verdünnt. Somit können die Proteine effektiver nach der

Ammoniumsulfatfällung abgetrennt werden. Mit gesättigter Ammoniumsulfatlösung oder

(zur Volumenbegrenzung) festem Ammoniumsulfat wurde ein Anteil von 60 % im

Rohextrakt realisiert. Die Fällung erfolgte unter stetigem Rühren über Nacht bei 4°C. Das

ausgefällte Protein wurde anschließend in einer Kühlzentrifuge (BECKMANN; JA-20-

Rotor; 15.000 rpm) abzentrifugiert.

Das Proteinpellet sollte möglichst vollständig, jedoch in einem geringen Volumen Puffer A

resuspendiert werden. Nach erneuter Zentrifugation und Filtration durch einen

Spritzenvorsatzfilter mit max. 0,45 µm Porenweite, konnte die Proteinlösung dem

nächsten Schritt der Aufreinigung, einer Gelfiltration, unterzogen werden.

Um das immer noch sehr große Volumen des Proteinrohextraktes zu verringern, wurde

dieser über Nacht gegen A. dest bei 4°C dialysiert bis ein Leitwert < 50 mS erreicht war.

Anschließend wurde der dialysierte Proteinextrakt bei –20°C tiefgefroren und lyophilisiert.

Das Lyophilisat löste sich im allgemeinen fast vollständig in einem Bruchteil des

vorherigen Volumens an Puffer A (5-10 ml statt 50-80 ml) und konnte nach Filtration der

Gelfiltrationschromatographie unterzogen werden. Ohne Lyophilisierung des

Proteinrohextraktes waren viele Zyklen in der Gelfiltrationschromatographie erforderlich.

5.2.4 Enzymaufreinigung mittels säulenchromatografischer Methoden

5.2.4.1 Gelfiltration mit Superdex 200 HiLoad

Das Prinzip der Gelfiltration beruht auf der Trennung eines Proteingemischs nach der

Proteingröße. Als Separationsmaterial wurde das Agarose-Dextran vernetzte Superdex

200 eingesetzt, wobei Säulen verschiedener Abmessungen verwendet wurden. Es

standen Säulenbettvolumen von 120 ml (HiLoad 16/60) und 320 ml zur Verfügung, die mit

Probenvolumina von nicht größer 1 ml bzw. 10 ml beladen wurden. Das Säulenmaterial

Superdex 200 hat ein Ausschlussvolumen von 1,3 MDa und einen linearen Trennbereich

von 10 000–600 000 Da. Die Proben wurden mit einer Flussgeschwindigkeit von 1 ml/min

auf die Trennsäule aufgetragen und in Fraktionen `a 4 ml eluiert. Die Trennung erfolgte im

isokratischen Verfahren in der FPLC–Einheit Pharmacia unter Verwendung von Puffer A

Methoden

35

als Laufmittel. Nach jedem Gelfiltrationszyklus wurde die Säule mit einem Volumen Puffer

A gespült und somit neu equilibriert.

5.2.4.2 Anionenaustauschchromatographie an High PerformanceTM Q-

Sepharose Fast Flow 5/5 und Mono QTM HR 5/5

Zur weiteren Aufreinigung der Zielproteine wurden entsprechende Fraktionen aus der

Gelfiltration vereinigt und über eine Anionenaustauschsäule gegeben.

Die Anionenaustauschchromatographie beruht auf dem Prinzip der Trennung der Proteine

nach ihren unterschiedlichen negativen Ladungen. Dazu ist es wichtig, möglichst geringe

Salzkonzentrationen beim Probenauftrag zu realisieren. Für eine effektive Trennung

sollten die Proben, die Säulen und das Laufmittel (Puffer B) einheitlich auf ein gleiches

pH- und Salzniveau eingestellt sein. Demzufolge wurden die Proben der Gelfiltration

mehrere Stunden gegen Puffer B dialysiert und die Säulen mit dem dreifachen

Säulenvolumen an Puffer B equilibriert. Nach Probenauftrag sorgte ein Salzgradient von

0–500 mM NaCl für eine Elution aller zurückgehaltenen Proteine.

Die hier eingesetzte Q-Sepharose wird mit einer Bindungskapazität von 25 mg Protein pro

ml Säulenmaterial beschrieben. Mit einer Flussrate von 3-1 ml/min wurde die Probe im

isokratischen Verfahren bei 4°C auf die Säule appliziert. Einen stärkeren

Anionenaustauscher stellt das Mono Q–Säulenmaterial dar (Beladungskapazität: 25

mg/ml Säulenmaterial). Der Auftrag der Proteinproben erfolgte mit einer Flussrate von 0,2

ml/min.

5.2.4.3 Hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC) an phenylsub-

stituierter Sepharose HR 5/5

Bei der hydrophober Interaktionschromatographie adsorbieren die Proteine aufgrund ihrer

unpolaren Oberflächenregionen in Gegenwart hoher Salzkonzentrationen an der

stationären Phase und werden mit Verringerung der Salzkonzentration sukzessive eluiert.

Das birgt den Vorteil, dass Proben der Gelfiltration nicht dialysiert werden müssen. Mit

Ammoniumsulfat wurde ein Salzgehalt von 1 M eingestellt. Nach Equilibrierung der Säule

mit dreifachem Volumen Puffer D, erfolgte ein isokratischer Probenauftrag mit einer

Flussrate von 0,2 ml/min. Anschließend wurde ein Gradient von 1–0 M (NH4)2SO4 in

Puffer B über 20 Säulenvolumen realisiert. Eine Steigerung der Elutionskapazität bewirkte

die Zugabe von 40 % Ethylenglykol in Puffer B.

Methoden

36

5.3 Enzymaktivitätstests zum Nachweis von Peptidsynthetasen

5.3.1 Nachweis der Aminoacyladenylatbildung über den ATP/PPi -

Austausch

Bei einer nichtribosomalen Peptidbiosynthese können einzelne Teilreaktionen des

Thiotemplate-Mechanismus nachgewiesen werden. Dazu gehören die Aktivierung und

anschließende Thioesterbindung der Substrataminosäuren an die multifunktionelle

Enzymmatritze.

Im ersten Schritt, der Aktivierung oder Adenylierung, werden spezifisch die

Substrataminosäuren als Aminoacyladenylate unter ATP-Verbrauch (ATP ↔ AMP + PPi)

von der entsprechenden substrataktivierenden Domäne gebunden. Normalerweise erfolgt

darauf eine Übertragung der Aminosäure auf die Thiolierungsdomäne unter Abspaltung

des AMP's und Bindung der Substrataminosäure als Thioester. Höhere ATP-Einsätze

stimulieren jedoch den Zerfall und die erneute Bildung von Adenylaten oder

Diadenosintetraphosphat, ohne die Bedingung der anschließenden Thiolierung der

Substrataminosäure in jedem Fall zu erfüllen (Sillero et al., 1991, Ortiz et al., 1993,

Guranowski et al., 1994).

Auf diesem Prinzip beruht die sog. ATP-PPi-Austauschreaktion. Diese von Calendar &

Berg (1966) entwickelte Methode besteht im radioaktiven Nachweis der

Aminoacyladenylatbildung. Dabei wird radioaktives [32PPi] eingesetzt, welches in der

Rückreaktion von AMP zu ATP die Bildung von radioaktiven [32P]-ATP verursacht. Dieses

bindet im Gegensatz zu [32PPi] an Aktivkohle, die aus dem Reaktionsansatz über einen

Glasfaserfilter abtrennbar ist.

Ein Testansatz enthielt 20 µl Enzymlösung und 50 µl Reaktionsmix, der zur Optimierung

bzw. in unserem Falle zum Gelingen der Reaktion variabel gestaltet wurde. ATP ging in

den Reaktionsansatz mit einer Konzentration von 0,15 bis 2 mM, die jeweilige

Substrataminosäure mit 1 bis 2 mM, MgAc mit 30 mM, DTT mit 1 bis 2 mM, EDTA mit

0,14 bis 1 mM, NaPPi (0,1 µCi) mit 0,5 bis 1 mM ein. Die Testansätze wurden 20 bis 60

min bei 28°C inkubiert und durch Zugabe von 0,5 ml eines Perchlorsäure-Aktivkohle-

Gemisches (Norit A-Lösung) bei 0°C abgestoppt. Es erfolgte eine Absaugung der Ansätze

über Glasfaserfilter. Nach zweimaligem Waschen mit A. dest, wurden die Filter bei 60 °C

für 20 min getrocknet, anschließend mit 5 ml Scintillationscocktail versetzt und im

Scintillationszähler vermessen. Zur Kontrolle wurden Testansätze ohne Aminosäure

mitgeführt und die gemessene Radioaktivität als Blindwert abgezogen.

Methoden

37

5.3.2 Thioesterbildung

Die 2. Teilreaktion im Thiotemplate-Mechanismus der nichtribosomalen

Peptidbiosynthese, die Thioesterbildung, kann durch einen Filterbindungstest und nach

einer Methode von Keller (1987) nachgewiesen werden.

Im ersteren Falle beinhaltete ein Reaktionsansatz 200 µl Enzymlösung, wobei es sich um

gelfiltrationsgereinigte Protein- oder Rohextrakte handelte. Der außerdem zugesetzte

Reaktionsmix wurde basierend auf den Erfahrungen früherer Arbeiten (Schwecke, 1993,

Pfeifer et al., 1995) gestaltet.

In 35 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5–8 mM ATP, 25–40 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0,1 mM EDTA

sowie 0,25 µCi [14C]-markiertes Aib/ Gln/ Ala wurde die Enzymlösung in einem

Totalvolumen von 300 µl 30–60 min bei RT inkubiert. Die Zugabe von 300 µl 10 %iger

eiskalter TCA diente der Beendigung der Reaktion. Das nach 10 minütiger Inkubation

ausgefallene Protein wurde abzentrifugiert, dreimal mit TCA und einmal mit absolutem

Ethanol gewaschen und getrocknet. Es erfolgte eine Solubilisierung des getrockneten

Proteinpellets in 100 µl Ameisensäure mit anschließender Aufteilung in 2 Fraktionen `a

50 µl.

Für den Filterbindungstest genügte ein Absaugen der Lösung über einen Glasfaserfilter,

Porenweite 0,45 µm, bzw. Nitrocellulosefilter. Bei erfolgter Thiolierung liegt

filtergebundene Radioaktivität vor und wird wie unter 5.3.1 beschrieben bestimmt.

Keller beschrieb 1987 eine Methode zum spezifischen Nachweis von Thioesterbindungen.

Dabei wird einer in Ameisensäure gelösten Proteinfraktionen 20 µl Wasser, der anderen

20 µl Wasserstoffperoxid zugesetzt. H2O2 wandelt Ameisensäure in Perameisensäure um,

die spezifisch Thioester, jedoch keine Sauerstoffester, spaltet. Nach 1 h Inkubation bei RT

wurden die Proben unter Vakuum getrocknet, in 50 µl EtOH aufgenommen und auf

Kieselgel 60 DC-Platten aufgetragen. Es erfolgte eine Dünnschichtchromatografie im

n-Butanol : Essigsäure : Wasser-Gemisch von 4:1:1. Die Auswertung und Bestimmung

der Radioaktivität wurde auf einem Dünnschichtplattenscanner (Berthold) vorgenommen.

Lag im Ausgangszustand eine Thioesterbindung vor, so wird die Wasserstoffperoxid-

behandelte Fraktion einen radioaktiven Spot in Höhe der freien Aminosäure aufweisen.

5.4 Proteolytischer Verdau und N-terminale Ansequenzierung interner

Fragmente

Für die proteolytische Spaltung der Zielproteine HMWP1 und HMWP2, die zunächst als

limitierte Proteolyse nach den Erkenntnissen Aparicios (1994) realisiert werden sollte,

wurden verschiedene proteolytische Enzyme und Bedingungen getestet. So fanden

Methoden

38

sowohl Trypsin, Chymotrypsin, Papain, Elastase, Thermolysin, Endoproteinase Glu-C und

Arg-C wie auch Bromcyan, welches spezifisch an Methioninresten schneidet, ihren

Einsatz. Unterschiedliche Konzentrationen, d. h. Enzym-Proteinverhältnisse, die die

empfohlenen Standardeinstellungen weit übertrafen (vgl. Tabelle 1, 6.2.2.6), sowie

variable Inkubationszeiten wurden verwendet. Des weiteren erfolgte durch 5 bis 10

minütiges Kochen mit 1-20 mM DTT und 1 % SDS eine intensive Vorbehandlung des

Proteins.

In-Gel-Verdau

Eine stark aufkonzentrierte Proteinlösung wurde in einer 5 %-SDS-PAGE

elektrophoretisch aufgetrennt. Die Zielproteine HMWP1 und HMWP2 wurden, ohne vorher

angefärbt zu werden, ausgeschnitten und in separate Reaktionsgefäße überführt. Es

folgte eine Lyophilisierung der Gelstückchen, um ein Aufsaugen der Enzymlösung im

anschließenden Proteolyse-Prozess zu gewährleisten.

HMWP2 wurde mit 150 µg Chymotrypsin in einem Enzym-Proteinverhältnis von etwa 1:1

bei einem pH von 7,5 für 1 bis 2 h bei 37°C inkubiert. Die Spaltung von HMWP1 erfolgte

hingegen mit 5 µg Endoproteinase Glu-C bei einem Enzym-Proteinverhältnis von etwa 1:4

über 5–12 h und einer Temperatur von 37°C. Die Reaktion wurde durch ein bis zu 20-

minütiges Erhitzen auf 95°C unter Zugabe des Laemmli-Probenpuffers abgestoppt.

Die Gelstückchen wurden auf ein neues, mindestens 10 %-SDS-PAA-Gel aufgetragen

und die darin enthaltenden Proteine unter reduzierenden Bedingungen (Zugabe von

2–10 mM DTT oder DTE zum SDS-Laufpuffer) neu getrennt.

Ansequenzierung interner Protein-Fragmente

Im Anschluß an die Elektrophorese erfolgte durch Elektroblotting (etwa 3 h oder über

Nacht) ein Transfer der Proteine auf eine PVDF-Membran. Die auch hier angewandten

Blot-Bedingungen stimmen mit den unter Punkt 5.13.4.2 beschriebenen Western-Blot-

Maßgaben überein. Nach dem Blotten wurde die PVDF-Membran mit verdünnter

Coomassie-Lösung (etwa 10 % in Methanol) ca. 10’ gefärbt und anschließend mit

Methanol wieder entfärbt. Die Fragmentbanden wurden sehr genau ausgeschnitten und

der N-terminalen Sequenzierung zugeführt.

Methoden

39

5.5 SDS Polyacrylamid – Gelelektrophorese (SDS-PAGE)

Jeder Schritt der Protein-Aufreinigung und –Konzentrierung sowie die Ergebnisse der

Proteolyse-Experimente wurden mit Hilfe der SDS Polyacrylamid-Gelelektophorese nach

der Methode von Laemmli (1970) verfolgt.

Zur Darstellung des HMWP1 und HMWP2 wurden die Proteinextrakte auf 5 %-ige

Trenngele aufgetragen und bei einer Spannung von 120–160 V und Stromstärken von

20–60 mA getrennt. Eine halbe bis eine Stunde nach Auslaufen der Laemmli-Bande

erfolgte die Beendigung der Elektrophorese. Zuvor wurden die Proben je nach

Proteingehalt meist 8–10 %ig TCA-gefällt und in einem möglichst geringen Volumen (ca.

20 µl) 0,5–1 M Tris (pH 9–11) wieder gelöst. Nach Zugabe des gleichen Volumens

doppelt konzentrierten Laemmli-Probenpuffers erfolgte ein ca. 5-minütiges Erhitzen der

Probe auf 95°C.

Neben den Proben wurde stets ein Molekulargewichtsstandard mitgeführt. Dabei handelte

es sich um einen Hochmolekulargewichtsmarker (HMW) der Firma SIGMA bzw.

AMERSHAM PHARMACIA. Die Abschätzung der Größe der hochmolekularen

Zielproteine konnte jedoch nur mit vergleichbar großen Proteinen erfolgen. Dazu dienten

Peptidsynthetasen, wie die Enniatin-Synthetase (350 kDa) und Cyclosporinsynthetase

(1,7 MDa).

Im Anschluss an die Proteintrennung erfolgte ein Anfärben der Proteinbanden mit

Coomassie-R 250. Eine sensitivere Methode stellt die Silbernitratfärbung nach Oakley

(1980) dar, die nur bei sehr geringen Proteinkonzentrationen Anwendung fand.

Zur weiteren Verwendung konnten die Proteine vor Anfärbung aus dem Gel auf eine

Transfermembran geblottet werden. Die Art des eingesetzten Membranmaterials richtete

sich nach dem Zweck der Anwendung (PVDF-Membranen für Aminosäure-

Sequenzierungen, Nitrocellulose-Membranen für immunologische Zwecke).

5.6 Präparation genomischer DNA aus Sepedonium ampullosporum

Die Sepedonium-DNA wurde mit einem Präparationskit der Firma QBIOgene (Fast DNA

Kit Bio101) extrahiert. Der Quotient des bei 260/280 nm gemessenen DNA-Extraktes

betrug 1,75 und bezeugt damit einen sehr hohen Reinheitsgrad der gewonnenen DNA

(2,0–1,8 bei 70-95 % Reinheit, Sambrock et al., 1989). Die Konzentration wurde auf 4

ng/µl eingestellt.

Methoden

40

5.7 Primer-Design

Alle verwendeten Primer sind unter Punkt 4.5 aufgeführt. Zum größten Teil wurden diese

von hochkonservierten Aminosäure-Sequenzmotiven auf der Adenylierungsdomäne von

nichtribosomalen Peptidsynthetasen abgeleitet.

Ein multiples Alignment von fungalen A-Domänen, durchgeführt mit dem Programm

CLUSTAL W (Wagemann, 2002), diente bei der Kreation von Fung170, Fung320 und

Fung 430 als Matritze. Zur Verringerung der Redundanz, wurde der Codon Usage von

Trichoderma harzianum (http://www.kazusa.org.jp) herangezogen. Dies ist eine durchaus

zulässige Variante, da eine relativ nahe Verwandtschaft zu S. ampullosporum besteht.

Des weiteren kamen publizierte Oligonukleotidsequenzen, wie MTF2 und MTR2

(Christiansen et al., 2001), von der Universität in Sheffield erfolgreich eingesetzte Primer

(Tib1 und Tib2), sowie im Rahmen einer weiteren Studienarbeit hergestellte Primer-

Sequenzen (Xu, 2001) zum Einsatz. Die mittels In-Gel-Verdau erhaltenen internen

Aminosäuresequenzen wurden in den genetischen Code übersetzt und als Mio1 und Mio2

(jeweils als Vorwärts- und Rückwärts-Primer) im NRPS-Screening verwendet.

5.8 Polymerase Chain Reaction (PCR)

Die von Karry B. Mullis (1983) entdeckte Polymerasekettenreaktion ist eine Methode zur

Amplifizierung von Nucleinsäuren. Kurze Oligonukleotidsequenzen (Primer mit freien 3'-

OH-Enden) können an komplementären Motiven auf einer in Einzelsträngen vorliegenden,

genomischen DNA binden (Annealing). Der Einsatz von Vorwärts- und Rückwärtsprimern

sorgt bei erfolgreicher Hybridisierung in Gegenwart aller notwendigen

Reaktionskomponenten für die Amplifizierung des eingeschlossenen DNA-Abschnitts um

einen Faktor von 106-108.

Die Polymerasekettenreaktion teilt sich in 3 Abschnitte auf, die sich in jedem Zyklus

wiederholen. Im ersten Schritt erfolgt bei 94-95°C die Denaturierung, d. h. Auftrennung

der genomischen DNA in Einzelstränge. Nach Abkühlen auf etwa 60-50°C, je nach

Schmelztemperatur der eingesetzten Primer, werden diese an einer komplementären

DNA-Sequenz hybridisieren (Annealing) und verhindern so das Reannealing der

ursprünglichen DNA-Einzelstränge. Im dritten Schritt der Polymerisation (Extension) findet

bei 72°C durch die Katalyse einer hitzestabilen DNA-Polymerase (z.B. Taq-Polymerase

aus Thermus aquaticus) unter Verwendung von zugesetzten 4’-Desoxynukleotid-5’-

triphosphaten (dNTP’s) die Synthese eines zum Einzelstrang komplementären DNA-

Stranges statt. Dabei wird der DNA-Abschnitt zwischen den hybridisierten Primern

ergänzt. Diese Reaktionsfolge wird etwa 30-mal wiederholt. Danach ist der

Methoden

41

Reaktionsansatz weitestgehend erschöpft und das entsprechende DNA-Fragment

aufgrund der exponentiellen Vervielfältigung in ausreichender Menge amplifiziert.

Die optimalen Reaktionsbedingungen wurden experimentell und unter Nutzung

spezifischer Erfahrungen zur Amplifizierung von NRPS-DNA-Fragmenten (Rybicki, 2001;

Turgay, 1994) durch die Variation aller einflussnehmenden Parameter, wie:

§ Denaturierungs-, Annealing-, Extensiontemperatur und –zeit

§ Anzahl der Reaktionszyklen

§ Qualität und Konzentration der Einsatzstoffe

bestimmt.

Ein Reaktionsansatz (50 µl) enthielt:

§ 4–15 ng hochreine genomische Sepedonium-DNA als Template (5.6)

§ 200 µM dNTP’s (Ultrapure dNTP-Set, Pharmacia)

§ 2–8 µM je Oligonukleotid-Primer

§ PCR-Fertigpuffer (QIAGEN) zur Einstellung bewährter Salz- und pH-Konditionen

§ 1,5–2,5 mM Mg2+-Ionen (25 mM MgCl2-Lösung von QIAgen)

§ 0,5 U (0,2 µl pro Ansatz) Taq-Polymerase (QIAgen)

unter optimierten PCR-Bedingungen:

§ 2 µM (je 1 µl einer 200 µM Lösung) je Oligonukleotid-Primer

§ 8 ng der Template-DNA pro PCR-Ansatz von 50 µl

§ 200 µM der dNTP's

§ PCR-Fertigpuffer (QIAGEN)

§ 1 mM MgCl2 (Gesamt-Mg 2+-Konzentration im PCR-Ansatz: 1,5 mM)

§ 0,5 U (0,2 µl pro Ansatz) Taq-Polymerase (QIAgen)

Die Denaturierungsbedingungen waren mit 94–95°C (30–45 s) relativ konstant. Die

Annealingtemperatur wurde in Abhängigkeit von der Primer-Schmelztemperatur (Tm, bis

minimal 5°C darunter) gestaltet. Die Hybridisierungszeit variierte zwischen 30 s und 2 min.

Je nach der Größe des erwarteten DNA-Fragments wurde die Extensionzeit bei einer

konstanten Temperatur von 72°C eingestellt. Sie belief sich auf 45 s-2 min.

Verschiedene PCR-Techniken kamen zum Einsatz:

Gradienten-PCR

Zur Bestimmung der optimalen Hybridisierungstemperatur von Primern diente der Einsatz

dieser Methode, wobei ein Gradient von 40-60°C Annealingtemperatur für das Primer-

Paar Fung170F und Fung430R im Thermocycler eingestellt wurde.

Methoden

42

Touch-Down-PCR

Zur Steigerung der Spezifität der PCR Reaktion wird die Hybridisierungstemperatur von

10–15°C über der Primer-Schmelztemperatur sukzessive in 2°C-Schritten bis zum

optimalen Temperaturniveau (kurz unterhalb des Schmelzpunktes) abgesenkt. Diese

Methode wurde bei einer großen Anzahl von Primer-Kombinationen angewandt.

Unter optimierten Bedingungen setzte sie sich aus 31 Zyklen zusammen. Dem ersten

Zyklus, dem Vorlauf, folgte nach einer 4 minütigen Denaturierung bei 95°C in jedem

weiteren Zyklus eine Auftrennung der Doppelstrang-DNA bei 94°C in 30 s. Die Primer-

Hybridisierung fand im ersten Zyklus bei 55°C innerhalb von 30 s statt. In 6 weiteren

Zyklen erfolgte eine sukzessive Absenkung der Annealing-Temperatur (AT) um jeweils

2°C von 60 auf 50°C bei einer in allen Zyklen konstanten Annealingzeit von 30 s.

Durchweg gleiche Bedingungen galten für die Denaturierungs- und Extensiontemperatur

und -zeit (D: 94°C/ 30 s; E: 72°C/ 45 s). Der 7. Zyklus bei AT = 50°C wurde 15 mal

wiederholt.

Nested PCR

Das bzw. die Fragmente einer ersten PCR dienen statt der ursprünglichen gesamten

genomischen DNA als Template in einem folgenden PCR-Ansatz. Dabei wird eine

Primerkombination gewählt, die weiter innen liegende Targets und damit auf den

Fragmenten bestehende Zielorte anstrebt. Auch diese Methode dient wiederum der

Spezifizierung.

5.9 DNA–Trennung im Agarosegel

Die erste Kontrolle, ob eine PCR-Reaktion erfolgreich war, lieferte die Größenbestimmung

der amplifizierten DNA-Fragmente. Dazu wurden Proben bzw. das gesamte Volumen der

PCR-Ansätze auf 1-2 %ige Agarose-Gele aufgetragen. Die elektrophoretische Trennung

nach dem Molekulargewicht erfolgte bei einer Spannung von 90 Volt.

Als Laufmittel diente TAE-Puffer, der auch zum Lösen der Agarose verwendet wurde.

Dabei war auf eine vollständige Homogenität der Gellösung durch intensives Aufkochen,

zu achten. Vor der Applizierung der DNA-Proben auf das Gel, erfolgte die Zugabe von

DNA-Gel-Loading-Puffer. Ein Größenmarker mit Komponenten von 0,5-10 kb (DNA

Ladder, New England BioLabs) ließ eine Größeneinschätzung der PCR-Amplifikate zu.

Zur Anfärbung der DNA-Banden dient Ethidiumbromid (EtBr), welches in GC-Paare der

DNA interkaliert und diese im UV sichtbar macht. Die Ethidiumbromidfärbung (etwa 15

min in 2 µg/ml EtBr in TAE-Puffer) wurde im Anschluss an die Elektrophorese

durchgeführt und die Gele im UV-Durchlicht bei 312 nm fotografiert.

Methoden

43

5.10 Isolierung von DNA aus dem Agarose-Gel

Die gewünschte DNA-Bande wurde mit einem Skalpell sorgfältig aus dem Gel

herauspräpariert. Die Extraktion der DNA erfolgte unter Verwendung des QIAquick Gel

Extraktions Kits nach den Herstellerangaben, wobei 30 µl DNA eluiert wurden.

5.11 Klonierung von DNA-Fragmenten

5.11.1 Insertion von DNA-Fragmenten in ein Plasmid-Vektor

Das sauber präparierte DNA-Fragment und sein Klonierungsvektor sollten zueinander

passende Enden von klebriger (überhängender/ sticky) oder glatter (blunt) Beschaffenheit

aufweisen. Dazu wird das PCR-Produkt mit der gleichen Restriktionsendonuclease

behandelt, wie der Vektor selbst.

Eine andere Variante bietet sich bei der blunt-ended-Ligation durch die Nutzung der

kontrollierten Exonuclease- bzw. terminale Desoxynukleotid-Transferase-Aktivität von

Klenow- oder T4 Polymerasen (z.B. Pfu, Tli und Taq) zur Herstellung glatter Enden

(Sambrook et al., 1989). Die Taq-Polymerase fügt ein einzelnes A-Desoxynukleotid an

das 3'-Ende doppelsträngiger DNA-Fragmente in einer Nicht-Template-abhängigen

Polymerisationsreaktion (non-template-dependent extension reaction) an (Clark, 1988).

In Gegenwart von dATP wird das zu klonierende PCR-Amplifikat mit Taq-DNA-

Polymerase für 30 min bei 70°C inkubiert und anschließend mit dem pGEMR-T-Vektor

(Promega) ligiert.

Der linearisierte Vektor beinhaltet ein einzelnes 3'-terminales Thymidin an jedem Ende,

welches komplementär zum A-Überhang des Inserts passt (Kobs, 1996). So kann ohne

weitere Vorbehandlung durch DNA-Ligasen und unter ATP-Verbrauch, Vektor und PCR-

Produkt nach dem Prinzip von Feretti und Sgaramella (1981) miteinander verknüpft

werden.

Die Ligation fand nach den Angaben des Herstellers (Promega) unter Verwendung des

pGEMR-T-Vektor-Liagationssystems entweder in 1 h bei RT oder über Nacht bei 16°C

statt. Dabei wurde die gesamte Menge an extrahiertem PCR-Produkt verwendet.

Insert-tragende Plasmide verfügen über eine höhere Molekülgröße und sind damit in der

Gelelektrophorese leicht von nichtrekombinanten Plasmiden unterscheidbar. Auf diese

Weise wurde einer Transformation mit nichtliegierten Plasmiden vorgebeugt.

Die rekombinanten Plasmide konnten nun in einem geeigneten Klonierungsorganismus

amplifiziert werden. Sich schnell vermehrende Zellen wie E. coli sind dafür prädistiniert.

Methoden

44

5.11.2 Herstellung von elektrokompetenten E.-coli-Zellen

Für einen DNA-Transfer in E. coli müssen die Zellen zunächst transformationskompetent

gemacht werden, denn E. coli verfügt über kein natürliches Transformationssystem.

Dieser Organismus kann demnach ohne Vorbehandlung nackte, zirkuläre DNA nicht aus

dem umgebenden Medium aufnehmen.

Die Elektroporation wird mit einer hohen Transformationseffizient von 109-1010 E. coli-

Kolonien/µg Plasmid-DNA beschrieben. Dazu werden E.-coli-Zellen aus der

exponentiellen Wachstumsphase bei einer OD600 von 0,5-0,6 geerntet, 5 min auf Eis

gekühlt und anschließend 3-mal bei 0°C mit 10 % Glycerin gewaschen. In 10 % Glycerin

resuspendiert, wurden die Zellen als 100 µl Aliquote bei -80°C tiefgefroren. Die

Zellkonzentration betrug etwa 1-3x1010/ml.

5.11.3 Elektroporation von E.-coli-Zellen

Für die Elektroporation nach Dower et al. (1988) wurde ein Aliquot elektrokompetenter E.-

coli-Zellen auf Eis aufgetaut. Vorsichtig erfolgte die Zugabe von 10 µl Ligationsansatz.

Nach einer Inkubation von 30-60 s auf Eis wurde der Mix in eine sterile, eisgekühlte

Elektroporationsküvette (Elektrodenabstand: 2 mm) überführt. Durch das Anlegen einer

kurzzeitigen Hochspannung von 1,8-2,5 kV für 4-8 ms werden die Membranen für einen

Moment durchlässig, sodass die Aufnahme der Plasmid-DNA in die Zelle stattfinden kann.

Diese Arbeiten wurden in einer Elektroporationskammer eines Gene-PulserTM-Geräts

(BioRad) realisiert. Der Gene-Pulser wurde dabei auf 25 µF und 1,8-2,5 kV, der Pulse-

Controller auf 200 Ω eingestellt. Um ein Durchschlagen der zu transformierenden DNA zu

verhindern, sollte ein möglichst ionenarmes bis -freies Milieu vorhanden sein.

Nach erfolgter Elektroschock-Behandlung wurde sofort 1 ml 2TY-Medium hinzugegeben

und die Zellen für 1 h bei 37°C unter Schütteln inkubiert. Anschließend erfolgte eine

Plattierung auf einem ampicillinhaltigen Selektivnähragar (2TY-Medium mit 100 µg/ml

Ampicillin). Die Platten wurden 24-48 h bei 37°C bebrütet.

5.11.4 Präparation von E.-coli-Klonen

Die auf dem Selektivnähragar gewachsenen Klone wurden separat in etwa 4 ml

Selektionsnährmedium (2TY-Flüssigmedium) über Nacht bei 37°C kultiviert. Gut

gewachsene Kulturen wurden mit etwa 5000 rpm abzentrifugiert. Die Präparation der

Plasmid-DNA aus den pelletierten Zellen erfolgte nach den Anweisungen des QIAprep-

Methoden

45

Spin-Miniprep-Kit-Protokolls. Pro Klon konnten auf diese Weise etwa 30-50 µl Plasmid-

DNA mit einer Konzentration von etwa 0,2-0,7 µg/µl gewonnen werden.

5.12 DNA-Sequenzierung und Sequenzvergleiche

Die Klone wurden nach der Sanger-Methode in gelgestützten DNA-

Sequenzierungsverfahren analysiert. Die Auftrennung der erzeugten, basenspezifisch

endenden DNA-Populationen erfolgte auf quervernetzten Polyacrylamidgelen entweder im

Plattenverfahren (Humbolt-Universität, Berlin) oder in gelgefüllten Glaskapillaren

(Abteilung Infektionsbiologie, HKI).

Die Sequenzen wurden in der NCBI-Datenbank (www.ncbi.nlm.nih.gov) auf Homologien

zu Peptidsynthetasen untersucht.

5.13 Immunologische Methoden

Mit dem Ziel der Lokalisation von Ampullosporin in produzierenden S. ampullosporum-

Zellen wurden monospezifische Antikörper gegen das Peptidmolekül hergestellt. Durch

Immunogold-Markierung können diese in Ultradünnschnitten im Elektronenmikroskop

sichtbar gemacht werden.

In einem zweiten Ansatz erfolgte eine Kaninchen-Immunisierung mit

gelfiltrationsgereinigten Sepedonium-Proteinextrakten.

Die Herstellung beider Antiseren erfolgte in der Abteilung Wirkstoffprüfung des HKI’s unter

der Leitung von Dr. Härtel.

5.13.1 Herstellung von Antikörpern gegen Ampullosporin

Für diesen Zweck wurde das Peptid Ampullosporin an Rinderserumalbumin (BSA)

gebunden. Die Kopplung erfolgte durch Glutardialdehyd, d. h. 2,77 mg Ampullosporin

wurden in 400 µl 50 % EtOH gelöst und anschließend vorsichtig mit 3,34 mg BSA, gelöst

in 300 µl 0,1 M NaHCO3-Puffer, vereinigt. 10 µl einer 100 % Glutardialdehydlösung

bewirkte die Vernetzung der Komponenten. Nach einer Inkubationszeit von 20 min wurde

die Reaktion mit 200 µl 1 M Glycin-Lösung abgestoppt. Der Ansatz wurde über eine PD

10-Säule entsalzt, was zur Beseitigung ungebundenen Ampullosporins sowie

überschüssigen Glutardialdehyds führte.

Das Protein wurde mittels 0,01 M NaHCO3-Lösung in einem Volumen von 2,5 ml eluiert.

Das Eluat wies einen Proteingehalt von 673,94 µg/ml auf, sodass insgesamt etwa 1,3 mg

Protein für die erste Immunisierung von 2 Kaninchen zur Verfügung gestellt werden

Methoden

46

konnte. Vorher wurde jedoch der Kopplungserfolg geprüft. Im positiven Falle würde man

einen Shift des Isoelektrischen Punktes von BSA erwarten, nachweisbar mittels

Isoelektrischer Fokussierung.

Für eine verstärkte Immunreaktion, d. h. zur Erhöhung des Antikörpertiters werden sog.

Adjuvansien (Freunds Adjuvans) der Antigenlösung beigemischt. 1 ml Maus spezifischem

MPL+TDM+CWS-Adjuvans-System (Sigma, M6536) wurde bei jedem

Immunisierungsschritt und Kaninchen verwendet.

Nach Ablauf von 4 Wochen erfolgte eine zweite Immunisierung durch eine intravenöse

Injektion von etwa 1 mg Protein pro Kaninchen, wobei die doppelte Menge an

Ampullosporin und BSA unter analogen Bedingungen gekoppelt wurden. Weitere 12 Tage

später wurde durch eine Herzpunktion die Entblutung vorgenommen und aus 2 Kaninchen

65 ml Serum gewonnen.

5.13.2 Aufreinigung der Ampullosporin-Antikörper

Zunächst wurden die Proteine sukzessive mit 38 % und 64 % Ammoniumsulfat gefällt. Die

in A. dest resolubilisierten Präzipitate ergaben zusammen ein Volumen von 70 ml. Diese

wurden auf eine Protein A-Säule zur Separation der Immunglobuline G appliziert. Nach

einer Spülung mit 42 ml 0,5 M NaCl-Lösung erfolgte die Elution der IgG durch 25 ml 1 M

Essigsäure. Das Eluat wurde mit 14 g Ammoniumsulfat gefällt, in wenig A. dest

aufgenommen und ein pH von 5,0 eingestellt. Mehrere Materialien und Strategien der

Affinitätschromatographie (AC) kamen zum Einsatz. Im folgenden werden jedoch nur die

Schritte der erfolgreich angewandten AC mit NHS-SepharoseTM 4B Fast Flow (Amersham

Pharmacia) zusammengefasst:

Kopplung von Ampullosporin (AS) an das Säulenmaterial

15,3 mg Ampullosporin wurden in 800 µl MeOH gelöst und zu 2–3 g NHS–SepharoseTM

4B Fast Flow, suspendiert in ca. 3 ml Phosphatpuffer, hinzugegeben. Dabei kam es zu

einer partiellen Ausflockung von Ampullosporin, die durch Zugabe weiterer 2 ml MeOH

aufgelöst wurde.

§ Kopplung erfolgt durch 4 stündiges Schütteln bei Raumtemperatur

§ Filtration über eine Glassinterfritte (Filtrat entspricht Fraktion B)

§ Über-Nacht-Inkubation der Sepharose in ca. 4 ml 1 M Tris-HCL (pH 7,3) bei 4°C unter

permanenten Schütteln

§ Filtration über eine Glassinterfritte (Filtrat entspricht Fraktion C)

§ Aussortierung ausgefallener Ampullosporin-Kristalle und Lösung dieser als Fraktion A

in 200 µl EtOH

Methoden

47

§ Waschen der Sepharose mit ca. 7 ml 40 %igem EtOH

§ anschließend über Nacht bei 4°C sanft in 40 % EtOH schütteln

§ Abziehen der EtOH-Lösung und erneutes Spülen der Sepharose mit 40 % EtOH

(Fraktion D, 9 ml) vor Verwendung der Säule

§ Equilibrierung der Säule mit dem Puffer der Antikörpersuspension (Puffer C)

Überprüfung des Kopplungserfolges über den quantitativen Ampullosporin-Nachweis

(HPLC) in allen Fraktionen:

§ Ampullosporin vor der Kopplung an Sepharose: 11,78 mg

(Ausgangskonzentration)

§ nicht gekoppeltes Ampullosporin aus Fraktion A: 1,11 mg

§ nicht gekoppeltes Ampullosporin aus Fraktion B: 1,26 mg

§ nicht gekoppeltes Ampullosporin aus Fraktion C: 0,47 mg

§ nicht gekoppeltes Ampullosporin aus Fraktion D: 1,22 mg

§ Gesamtmenge an gekoppeltem Ampullosporin: 7,72 mg

Vorbereitung des Serums:

Fraktionen, vorwiegend Durchlauf- und Spülfraktionen aus vorangegangenen

Separationschromatographien, die im Dot Blot eine positive Immunantwort gegenüber

dem Antigen Ampullosporin aufwiesen, wurden vereinigt und mit gesättigter NH4SO4-

Lösung 80 %ig gefällt. Das Pellet wurde in 20 ml Puffer C wieder gelöst.

Der scharf abzentrifugierte Überstand wurde auf die Affinitätssäule appliziert.

Durchführung der Affinitätschromatographie

1. Konditionierung der Säule mit:

(1) 50 ml Puffer C

(2) 5 ml A. dest

(3) 20 ml Lösung E

(4) 5 ml A. dest

(5) 20 ml Puffer C

2. Auftrag von 20 ml Serum

3. Waschen mit 50 ml Puffer C sowie 5 ml A. dest

4. Elution mit 20 ml Lösung E

5. Waschen der Säule mit 50 ml Puffer C sowie 5 ml A. dest

Methoden

48

Alle einzelnen Auftrage-, Wasch- und Elutionsschritte wurden im isokratischen Verfahren

bei einem Fluß von 2-3 ml/min und bei Raumtemperatur durchgeführt. Das Eluat wurde in

ca. 1,3 ml-Fraktionen gewonnen und anschließend im Dot-Blot-Verfahren parallel zu den

Durchlauf- und Spülfraktionen auf Immunaktivität getestet.

5.13.3 Herstellung von Antikörpern gegen das HMWP1- und HMWP2-

Protein

Zur Gewinnung von Antikörpern gegen die vermutlich an der Ampullosporin-Biosynthese

beteiligten Proteine HMWP1 und HMWP2 wurden doppelte Gelfiltrationen (wiederholt

aufgetragener Proteinextrakt) als Immunisierungsmaterial verwendet.

Eine erste Immunisierung erfolgte durch intradermale, subkutane, intramuskuläre sowie

intraperitionale Applikation mit 0,46 mg Protein, gelöst in 3 ml Puffer A unter Zugabe von

1 ml Adjuvanz (vergleiche Punkt 5.13.1). Nach 3 Wochen wurde mit 0,3 mg

gelfiltrationsgereinigter Proteinlösung, versetzt mit 0,1 ml Adjuvanz, aufgefrischt und nach

weiteren 3 Wochen entblutet. Aus etwa 90 ml Vollblut ließen sich ca. 40 ml Serum

gewinnen, deren Immunglobuline G (IgG) analog zur Aufarbeitung der Ampullosporin-

Antikörper, nach der Ammoniumsulfatfällung, über die Protein-A-Säule separiert wurden.

Eine affinitätschromatografische Aufreinigung der spezifischen Antikörper gegen HMWP1

und HMWP2 fand nicht statt.

5.13.4 Tests zur Bestimmung der Immunaktivität

5.13.4.1 Dot-Blot-Immunoassay

Bei diesem Test handelt es sich um eine hochempfindliche Protein- bzw. Antikörper-

Nachweismethode. Dabei werden auf eine, mit dem Antigen beschichtete

Nitrozellulosemembran die zu testenden, antikörperhaltigen Fraktionen aufgetropft.

Sekundäre, markierte („labeled“) Anti-Kaninchen-Antikörper koppeln an das primäre

Kaninchen-IgG, welches nur im Falle einer vorausgegangenen, spezifischen

Immunreaktion mit dem Antigen auf dem Blot vorhanden ist. Je nach „Label“-Reagenz

kann die Immunbindung durch eine Phosphatase- oder Peroxidase-Reaktion angefärbt

werden. Bereits geringe Mengen von 1-20 ng Antigen bzw. Antikörper und weniger lassen

sich durch diese Immunbindungsreaktion nachweisen.

Der Test wurde für die Titerbestimmung während der Immunisierung sowie zur Kontrolle

der einzelnen Aufreinigungs- und Separationsschritte bei der Isolierung monospezifischer

Antikörper gegen Ampullosporin genutzt. Für eine ausreichende Präsenz von

Methoden

49

Ampullosporin auf dem Blot erfolgte eine Kopplung mit einem großen Trägermolekül. Es

war darauf zu achten, das dieser Träger keine Kreuzreaktion mit dem zur Immunisierung

eingesetzten Agens BSA zulässt. So wurde im Immunoblot-Assay als Antigen ein

Ampullosporin-Streptokinase-Komplex eingesetzt. Die einzelnen Schritte des Dot-Blot-

Verfahrens sind im folgendem dargestellt:

Herstellung des Ampullosporin-Streptokinase-Komplexes

§ 4 mg Ampullosporin, gelöst in 800 µl 50% EtOH wurden vorsichtig zu 7 mg

Streptokinase, gelöst in 640 µl 0,1M NaHCO3-Puffer mit 0,5M NaCl (pH 8,0) gegeben.

§ Die Suspension wurde gut gemixt und durch Zugabe von ca. 1 % Glutardialdehyd die

Vernetzung initiiert.

§ 15 min Inkubation

§ Abstoppen durch 200µl 1M Glycin-Lösung (Lösung wird braun und bleibt klar)

§ Die Lösung ist stabil und wurde bei –20°C bis zu ihrem Einsatz aufbewahrt.

Immun-Dot-Blotting

§ Beschichtung einer Nitrocellulose-Membran (NC-Membran) mit dem Ampullosporin-

Streptokinase-Komplex

§ Blockierung mit Blotpuffer 2 für mindestens 1 h unter sanftem Schwenken bei

Raumtemperatur

§ Auftragen von ca. 20 µl Antiserum aus den einzelnen Säulenfraktionen der

Affinitätschromatographie über die Absaug-Auftrageapparatur

§ Sanftes Schwenken der NC-Membran in Blotpuffer 2 für mindestens 1 weitere Stunde

bei Raumtemperatur

§ Spülen der Membran, etwa 3-4 mal für je 5-10 min in PBS-Puffer (Blottpuffer 1)

§ Beschichtung der Membran mit einem sekundären, markierten Antikaninchen-

Antikörper (z. B. AntiKaninchen-IG6‘-Peroxidase, 1:2000 in Blotpuffer 1 verdünnt) für

mindestens 1 h bei Raumtemperatur unter stetigem, sanftem Schwenken

§ Spülen der Membran, etwa 3 bis 4 mal für je 5-10 min in PBS-Puffer (Blottpuffer 1)

§ Blotentwicklung je nach Labelreagenz

Es wurden Peroxidase- oder Phosphatase-markierte sekundäre Antikörper verwendet,

wobei im ersteren Fall meist sehr kurze Reaktionszeiten von max. 5 min zu beachten

waren. Beide Reaktionen sollten zur Minimierung von Hintergrundreaktionen im Dunkel

ablaufen. Nach dem Abstoppen mit Kochsalzlösung bzw. EDTA bei

Phosphatasereaktionen wurde die Membran unter Filterpapier getrocknet.

Methoden

50

5.13.4.2 Western– Blot- Analyse

Bei der Western- oder Immunoblot-Analyse werden die antigenen Proteine nicht wie im

Dot-Blot-Verfahren auf eine NC-Membran getropft, sondern von einem Gel aufgeblottet.

Der Vorteil besteht in der Trennung eines Proteingemisches in der vorherigen

Gelelektrophorese, sodass nach dem Transfer der Proteine auf die Membran (Towbin et

al., 1979) spezifische Antigen-Antikörper-Reaktionen detektiert werden können. Demnach

ist leicht bestimmbar, gegen welche Proteine Antikörper vorliegen.

Das Blotten erfolgte in einer Blot-Transfer-Einheit von BioRad bzw. Hoefer Scientific

Instruments. Dabei wurde das Gel luftblasenfrei auf eine NC-Membran gelegt und von 2-4

mittelstarken, Transferpuffer-getränkten Filterpapierscheiben fest in eine entsprechende

Vorrichtung eingespannt. Der Transfer der Proteine findet unter Anlegung eines

elektrischen Stroms von ca. 30-50 mA (je nach Apparatur) in der Transferpuffer-gefüllten

Blotting-Kammer statt. Nach ca. 2-3 h wurde das Blot-Verfahren beendet, konnte jedoch

auch über Nacht bei Verringerung der Stromstärke auf 20 mA fortgesetzt werden.

Die Immundetektion erfolgte analog zum Immun-Dot-Blotting, nur dass in diesem Falle

der Antikörper in einer angepassten Verdünnung im Blotpuffer 2, gleichmäßig auf der

Membran verteilt bzw. die Membran in einem ausreichenden Volumen an Antiserum-

Blotpuffer-2-Suspension geschwenkt wurde.

5.13.5 Immunelektronenmikroskopie

Mycelpellets aus ampullosporinproduzierenden Kulturen mit einem Durchmesser von

etwa 2 mm wurden kurz mit Phosphatpuffer (pH 7,2) gewaschen und für eine

Immunelektronenmikroskopie unter Anwendung des Post-Embedding-Immunogold-

Labeling-Verfahrens vorbereitet. Im folgenden sind die einzelnen Schritte der Präparation

des biologischen Materials bis hin zur Immundetektion aufgeführt.

Fixierung

§ Die Fixierung erfolgte in drei Varianten:

a) Kaliumpermanganat – Fixierung (nicht für Immundetektion geeignet):

2 % KMNO4 in PBS, pH 7,2, für 30 min bei RT

b) Paraformaldehyd (PFA)-Glutardialdehyd (GA)-Fixierung, modifiziert nach

Karnovsky (1965)

4 % PFA mit 0,1 % GA für 4 h bei RT

c) PFA-GA-Fixierung:

2 % PFA mit 1 % GA für 4 h bei RT

Methoden

51

§ Abziehen der Fixierlösung und Spülen mit Phosphatpuffer, pH 7,2

§ 2-stündige Inkubation in 0,05 M NH4Cl-Puffer zur Abbindung von Aldehydgruppen,

wodurch eine Reduzierung der Untergrundreaktionen bei der Immunbehandlung

angestrebt wird

§ Über-Nacht-Inkubation in PBS bei 4°C mit mehrfachem Pufferwechsel

§ Entwässerung in aufsteigender Ethanol-Reihe durch jeweils 30 minütige Inkubation in

30, 50, 70, 80, 90 und 100 % EtOH, wobei letzterer Schritt für je 15 min 3-mal

wiederholt wurde

Harzeinbettung

Zwei verschiedene Acrylharze kamen zum Einsatz: LR-White und Unicryl (British Biocell

International). Die Einbettung erfolgte stufenweise, zunächst im EtOH-Harz-Verhältnis 1:1

für 1 h bei RT, anschließend 2-mal für 1 h in 100 % Harz. Dies bewirkte eine sukzessive

Ethanol-Verdrängung. Eine langsame Harzinfiltration wurde über 2 Tage bei 4°C realisiert.

Bei der Einfüllung der Harze in Gelatinekapseln, sinkt die Probe bei guter Entwässerung

sofort ab. Die Polymerisation der Harze erfolgte in den Gelatinekapseln unter Sauerstoff-

Abschluss bei 50°C (LR-White: 1 Tag; Unicryl: 2 Tage).

Ultramikrotomie

§ Gelatinekapseln entfernen

§ Trimmen (Anspitzen) der Probe zu einer Pyramide mit einer Fläche von etwa

0,25 mm2 an einer Fräsmaschine (Ultratrim, Reichert Leika)

§ Schneiden der getrimmten Probe in Ultradünnschnitte (UDS) mit einer Stärke von 50-

70 nm am Ultramikrotom (Reichert Ultra Cut S)

Immunhistochemie

§ Auflegen der Schnittbänder (UDS) auf relativ großmaschige Grids (100 mesh, Gold)

§ Antrocknen der UDS auf den Grids

§ Blockierung mit 1 % Ziegenserum (Sigma) in PBS für 30 min

§ Beschichtung der UDS mit dem unverdünnten Primärantikörper (aufgereinigter,

monospezifischer Ampullosporin-Antikörper), etwa 20-30 µl pro Grid, für 1 h bei RT

§ 5-maliges Waschen der Grids mit PBS-1 %-Ziegenserum für je 10 min

§ Beschichtung der UDS mit einem sekundären, goldmarkierten Anti-Kaninchen-

Antikörper (BBI Anti-Rabbit- IgG-10 nm/15 nm-Au-labeled) für 1 h bei RT

§ 3-maliges Waschen der Grids mit PBS für je 10 min

§ 5-maliges Waschen der Grids mit A. tridest, anschließend Trocknen

Methoden

52

§ Doppelkontrastierung unter CO2-Abzug durchführen, d. h. Abdeckeln der Reaktion mit

Natronkalk-gefüllter Abgaskolonne:

- Beschichtung der Grids mit 2,5 % Uranylacetat (UA) in A. dest

- 3-maliges Waschen mit A. tridest

- 5-minütige Beschichtung der Grids mit Reynolds-Reagenz für eine

Kontrastverstärkung

- 3-maliges Waschen mit A. tridest, anschließend Trocknen

Negativkontrollen wurden in gleicher Prozedur unter Ausschluss des Primärantikörpers

gewonnen. Auf diese Weise ist es möglich, unspezifische Bindungen des sekundären

Antikörpers festzustellen.

Die fertig präparierten, immunmarkierten Ultradünnschnitte konnten nun im

Transmissionselektronenmikroskop CEM 902 A (Zeiss) bei einer

Beschleunigungsspannung von 80 kV ausgewertet werden.

5.14 Allgemeine Methoden

5.14.1 Bestimmung der Trockenbiomasse

Die Trockenbiomasse wurde über die optische Dichte im Einstrahlphotometer Spekol

1200 der Firma Analytik Jena GmbH bei einer Wellenlänge von 610 nm bestimmt.

Dazu wurde eine repräsentative Probe gleichmäßig homogenisiert und einer 3-5-fach-

Bestimmung unterzogen. Als Blindwert diente die gut abzentrifugierte Kulturlösung. In

einem empirischen Verfahren nach Monod (1949) und Schächter (1958) wurde ein

spezifischer Extinktionskoeffizient für Sepedonium ampullosporum ermittelt.

Somit konnte die Trockenbiomasse folgendermaßen berechnet werden:

344,0)( Probe

SEE

TBMBW ⋅−

= mit TBM Trockenbiomasse [g/l]

EProbe Extinktion, Probe

EBW Extinktion, Blindwert

S Küvetten-Schichtdicke [cm]

0,344 spez. Extinktionskoeffizient [gcm/l]

Methoden

53

5.14.2 Glucose–Bestimmung

Die Messmethode basiert auf der enzymatischen Umsetzung von Glucose mit einer

membranimmobilisierten Glucose-Oxidase unter Bildung von Glucono-δ-Lacton und

Wasserstoffperoxid. Dieses (H2O2) zerfällt an einer Platinanode und verursacht einen

Elektronenstrom, der sich proportional zu der eingesetzten Glucosekonzentration verhält.

Diese Reaktionen finden an einer Sonde, einem Glucosemessfühler des YSI 2700

SELECT auf Grundlage der von L. Clark (1984) erarbeiteten Fühlertechnologie statt.

5.14.3 Maltose–Bestimmung

Die Analyse der Maltose-Konzentration in der Kulturlösung erfolgte mittels HPLC unter

Verwendung einer Anionenaustauschsäule YMC–Pack Polyamin II. Diese Säule enthält

eine polymerbeschichtete Aminophase, d. h. sekundäre und tertiäre Aminogruppen. So

können polare Substanzen, wie Zucker stärker retinieren. Im isokratischen Verfahren

wurden diese mit 66 %igem Acetonitril verzögert eluiert. Die Detektion erfolgte über den

Brechungsindex mittels eines RI-Detektors (JASCO, RI-930).

5.14.4 Stickstoff–Analyse

Bei der Verwendung anorganischer Stickstoffquellen zur Kultivierung von S.

ampullosporum, wurde der Stickstoffgehalt in der Kulturlösung mit einer

Destillationseinheit der Firma BÜCHI nach dem Kjeldahl–Prinzip bestimmt. Der Stickstoff

wird in Form von Ammoniak durch Wasserdampf und hohe Temperaturen aus der Probe

ausgetrieben und in einer Titrationseinheit aufgefangen. Es erfolgt eine Titration, bei der

die eingesetzte Schwefelsäure der Menge an Ammoniak proportional ist.

Die meisten Kultivierungsmedien enthielten jedoch organisch gebundenen Stickstoff in

Form von Pepton oder Aminosäuren. Nur ein Totalaufschluss nach dem Kjeldahl – Prinzip

erlaubt eine genaue Gesamtstickstoffbestimmung und mögliche Bilanzierung. Dieser

konnte jedoch nur in Form eines Stickstoff(gesamt)-Küvettentests der Firma MERCK

(1.14763.0001) nachgeahmt werden, wobei kein 100 %-iger Aufschlussgrad erzielt wird,

die Ergebnisse demnach nur unter Vorbehalt berücksichtigt wurden.

5.14.5 Phosphat–Analyse

Zur Bestimmung der Phosphatkonzentration in der Kulturlösung diente der PMB-

Phosphat-Testkit der Firma MERCK.

Methoden

54

Ein gut zentrifugierter Kulturüberstand wurde mit A. dest 1:1000 verdünnt und mit den Kit-

Reagenzien versetzt, die durch eine chemische Umsetzung des Phosphats eine

konzentrationsabhängige Blaufärbung der Lösung verursachten. Die Proben wurden bei

712 nm in einem SQ 118–Photometer der Firma MERCK analysiert.

5.14.6 Aminosäure–Analyse in Kulturlösungen

Um Aussagen über die Metabolisierung der in einigen Medien angebotenen Aminosäuren

zu treffen, wurden diese mittels Umkehrphasen-HPLC, unter Verwendung einer unpolaren

RP 18–Säule (LiChrospherR, 250 x 4 mm, 5 µm Partikelgröße) quantitativ analysiert. Für

eine Detektion der Aminosäuren im UV–VIS- bzw. DAD-Detektor erfolgte vor der

chromatographischen Auftrennung eine Derivatisierung mit Dabsylchlorid

(Vorsäulenderivatisierung), nach einer Methode von Knecht und Chang (1986).

Der Überstand aus 4 ml Probe wurde lyophilisiert und anschließend in 40 µl

Derivatisierungspuffer und 70 µl Dabsylchloridlösung solubiert, wobei sich diese Mengen

auf einen Aminosäure-Gehalt von ca. 2 mg beziehen. Bei höher zu erwartenden

Aminosäurekonzentrationen erfolgte eine entsprechende, mengenmäßige Angleichung

der eingesetzten Lösungen. Nach einer Inkubation von 15 min bei 70°C wurden die

abgekühlten Proben mit 390 µl Verdünnungspuffer auf 500 µl aufgefüllt. Die Proben

waren bis zu 6 Monate bei 4°C lagerbar.

Trennung und Analyse der Aminosäuren erfolgte mittels HPLC, bei einer

Säulentemperierung von 40°C und einer konstanten Flussrate von 1 ml/min.

Folgende Laufbedingungen wurden realisiert:

Zeit (min) Konzentration

an Laufmittel A (%)

Konzentration

an Laufmittel B (%)

0 85 15

18 60 40

28 45 55

32 30 70

34 30 70

36 85 15

40 85 15

Zur Detektion bei 436 nm diente ein DAD-Detektor SPD M 10 Avp (Shimadzu).

Methoden

55

5.14.7 Ampullosporin–Bestimmung

Kulturen von Sepedonium ampullosporum wurden für die Produktanalytik ohne vorherige

Trennung von Mycel und Kulturlösung mit Ethylacetat im Verhältnis 1:1 über Nacht

extrahiert. Für einen effektiveren Extraktionsprozess wurden die Mycelpellets in

Gegenwart des Lösungsmittels homogenisiert. Nach völliger Trocknung des Extraktes am

Rotationsverdampfer (173 mbar / 40-45°C) erfolgte eine Lösung in einem geringen

Volumen Methanol (1-2 ml). Über massenspektrometrische (CID-MS/MS) (Ritzau &

Heinze et al., 1997) und dünnschichtchromatografische Methoden (Verwendung von

Kieselgel-Platten, Laufmittel-Gemisch (a) n-Butanol/Essigsäure/Wasser = 48/18/24

(b) n-Propanol/25% NH4OH = 7/3; RF-Wert~0,6, Nguyen et al., 2002) konnte

Ampullosporin sehr leicht qualitativ nachgewiesen werden.

Die Konzentrationsbestimmung der Substanz erfolgte mittels HPLC (Ritzau et al., 1997).

Als Trennsäule diente eine RP18–Säule (Grom Nucleosil, 100 x 3 mm, Partikelgröße: 5

µm).

Folgende Laufbedingungen wurden realisiert:

Zeit (min) Konzentration an Elutionsmittel (ACN, 100 %)

1 0,5

16 99,5

17 99,5

20 0,5

22 STOP

Ampullosporin konnte bei einer Absorption von 210 bis 230 nm und bei einer

Retentionszeit von 12 bis 16 min detektiert werden. Die Konzentrationsberechnung

erfolgte über die Peakflächen und eine stetig aktualisierte Standardkurve unter

Anwendung der Shimadzu-Software class vp 5.

5.14.8 Proteinbestimmung nach BRADFORD

Die nach Bradford (1976) eingesetzte Methode zur Bestimmung der Gesamt-

Proteinkonzentration wurde in Mikrotiterplatten sowie im Küvettenmaßstab durchgeführt.

Auf jeder Mikrotiterplatte wurde eine separate Eichkurve mit verschiedenen

Konzentrationen an BSA erstellt. 100 µl BSA– bzw. Probenlösung, versetzt mit 150 µl

Bradford-Reagens wurden jeweils als 3-fach-Bestimmung im TECAN-Plattenreader bei

Methoden

56

595 nm vermessen. Analog zur Testung in der Mikrotiterplatte, erfolgte die Bestimmung

auch in der Küvette unter Verwendung eines SHIMADZU – Spektralphotometers.

5.14.9 Down-Stream-Processing zur Aufreinigung und Isolierung von

Ampullosporin

Zum Zwecke der präparativen Gewinnung von Ampullosporin wurde ähnlich wie beim

analytischen Vorgehen zunächst eine Essigsäureethylacetat-Extraktion mit der zum

Kulturvolumen gleichen Menge an Lösungsmittel vorgenommen. Diese wurde 1-2-mal

wiederholt, besonders bei der Extraktion von bewachsenen Cerealien aus

Feststofffermentationen (vgl. Punkt 5.1.2.4).

Anschließend erfolgte eine Abtrennung wasserlöslicher Bestandteile durch eine Wasser-

Extraktion. Nach einer zusätzlichen n-Hexan-Extraktion wurde das Metabolitengemisch

auf einer Kieselgel-Chromatographie-Säule durch Anlegen eines Chloroform-Methanol-

Gradienten getrennt. Eine Feinreinigung und Separation der Zielsubstanz Ampullosporin

war durch Einsatz einer LH20-Säule und präparativer HPLC (analog den analytischen

Bedingungen) möglich.

Ergebnisse

57

6 Ergebnisse

6.1 Optimierung der Fermentationsbedingungen von Sepedonium

ampullosporum

Für die Untersuchung der Biosynthese des Sekundärmetaboliten Ampullosporin war es

notwendig, den Prozess der Produktbildung zu stimulieren, um somit eine ausreichende

Verfügbarkeit an katalytischen Enzymen zu gewährleisten. Dazu wurde die Verträglichkeit

verschiedener Substrate sowie der Einfluss von Substratlimitationen und Scherkraft auf

das Wachstum und die Ampullosporinbildung des Pilzes untersucht.

Zunächst musste jedoch für eine konstante Bereitstellung von zur

Ampullosporinproduktion fähigem Impfmaterial gesorgt werden. Bei Anzucht aus den

Masterkonserven wurde häufig das Aufspalten des Pilzes in zwei verschiedene Klone

beobachtet (Abb. 15). Ein Klon wies einen scheinbaren Differenzierungsdefekt aufgrund

des Fehlens der Ausbildung reifer, ausdifferenzierter, gelb bis orangefarbener

Alleuriokonidien auf. Bei diesem Klon, bezeichnet als A85/453-1/K.weiß, war keine

Ampullosporinbildung nachweisbar. Der ampullosporinbildende, ausdifferenzierende

gelbe Klon, bezeichnet als A85/453-1/K.gelb, musste demnach in einer zweiten

Überimpfung auf der Agarplatte separiert werden. Als Selektionsagar erwies sich der für

Pilze üblicherweise verwendete Malzagar als ungeeignet, da hier der langsamer

auskeimende weiße Klon zu schnell vom A85/453-1/K.gelb überwachsen wurde und

daher keine sichere Trennung des Mischklons erfolgen konnte. Deshalb wurde der Pilz

prinzipiell nur auf Zeolith-Agar oder Aminosäure-Agar kultiviert.

Abb. 15: Selektierter "weißer" (a) und "gelber" (b) Klon aus Sepedonium ampullosporum DSM 10602

nach Anzucht aus -80 °C - Konserven

Ergebnisse

58

Wie viele andere mycelbildende Organismen ließ sich Sepedonium ampullosporum zu

Beginn nur schwierig unter den Bedingungen der Produktbildung kultivieren (Schügerl et.

al, 1998).

Zunächst konnte ausschließlich in Emerskulturen, bevorzugt unter Verwendung

peptonhaltiger, zähflüssiger Mineralsalzmedien (Zeolith-Medium mit zähflüssigen, auf

Agar oder Glycerin basierenden Zusätzen, z. B. Rotigel), Ampullosporin nachgewiesen

werden (Abb. 16). Konzentrationen von maximal 8 bis 10 mg/l ließen sich dabei nach

etwa 1 bis 2 Wochen extrahieren. Da sich Emersprozesse nur bedingt analysieren und

beeinflussen lassen, des weiteren kurze Fermentationen mit hoher Produktausbeute

angestrebt wurden, sollte über die Schüttelkultur ein Submersverfahren etabliert werden.

Alle physiologischen und biosynthetischen Untersuchungen wurden in Submerskulturen

im 500 ml Schüttelkolben-Maßstab vorgenommen.

Abb. 16: Standkultur und Schüttelkultur von Sepedonium ampullosporum

6.1.1 Einfluss der Kohlenstoffquelle auf Zellwachstum und Produktbildung

Verschiedene Kohlenstoffquellen, wie Malz, Glycerin, Glucose, Saccharose und Maltose,

wurden hinsichtlich ihres Einflusses auf das Wachstum und die Ampullosporinbildung

getestet. Als Grundmedium diente das HK-0*-Medium mit jeweils substituierter C-Quelle.

In allen Fällen war Zellwachstum und somit die Fähigkeit der Verstoffwechslung der

angebotenen Kohlenstoffsubstrate nachweisbar.

Ampullosporinbildung wurde jedoch im Malzmedium gar nicht, bei Verwendung von

Glycerin und Saccharose erst sehr spät und nur in geringen Konzentrationen (0,5-1,5

mg/l) beobachtet. In Medien auf Glucose-, besser noch auf Maltose-Basis, wurde eine

Ergebnisse

59

verstärkte Sekundärmetabolit-Produktion registriert. Bei Einsatz unterschiedlicher

Konzentrationen an Maltose, war eine typische C-Metabolitrepression detektierbar (Abb.

17), d. h. Zuckerversorgung und Produktbildung verhalten sich reziprok.

Abb. 17: Ampullosporin- und Biomasseentwicklung bei der Kultivierung mit unterschiedlichen

Konzentrationen an Maltose;

die jeweils linke Säule (rot) entspricht der Maximalausbeute (nachgewiesene Konzentration) an

Ampullosporin, die rechte Säule (blau) der maximal erfassten Trockenbiomasse.

Auffällig war die trotz reichhaltigeren Nährstoffangebots nahezu gleichbleibende

Biomasseentwicklung. Im Gegensatz zur Ampullosporin-Bildung wird für das

Zellwachstum eine optimale Zuckerversorgung in einem Konzentrationsbereich zwischen

10 und 40 g/l Maltose angenommen.

Eine sich hier abzeichnende, wachstumsentkoppelte Produktbildung bestätigte sich auch

bei der Untersuchung weiterer Einflussfaktoren und kinetischer Betrachtung von

Wachstum und Ampullosporinbildung. Alle folgenden Versuche wurden mit 5-8 g/l Maltose

durchgeführt.

6.1.2 Einfluss der Stickstoffquelle auf die Produktbildung

Die Art und Konzentration der Stickstoffversorgung hatte einen erheblichen Einfluss auf

die Ampullosporinproduktion.

Nur unter Verwendung von Casein-Pepton bzw. Aminosäure-supplementierten Medien

konnte in Schüttelkulturen überhaupt Ampullosporin nachgewiesen werden. Zwei

interessante Effekte sind dabei besonders hervorzuheben.

6,40

5,26

0,550,15 0,11

1,44 1,32 1,18

2,38

1,48

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00

5 g/l 8 g/l 10 g/l 20 g/l 40 g/l

Maltose [g/l]

Am

pullo

spor

in [

mg/

l]; TB

M m

ax [

g/l]

Ergebnisse

60

Die Konzentration an eingesetztem Casein-Pepton erwies sich als bestimmender Faktor

bezüglich des Beginns der Produktbildung (Abb. 4). 2 g/l Pepton ermöglichten einen

frühen Start, sodass nach ca. 60 h das Maximum der spezifischen Produktbildungsrate

(kp) von 1,6 E-4 h-1 zur Bildung von ca. 15 mg/l Ampullosporin (akkumuliert nach 60 bis

120 h) bereits erreicht war. Analog dazu konnte erst nach ca. 220 h ein Produktmaximum

von immerhin 33 mg/l Ampullosporin bei einer Kultivierung mit 5 g/l Pepton festgestellt

werden (Abb. 18). Höhere Peptonkonzentrationen verursachten einen rapiden Rückgang

der Ampullosporinbiosynthese (bis gegen 0 ab 8 g/l Pepton).

Abb. 18: Der rote Graph zeigt die spez. Produktbildungsrate kp bei einer Kultivierung mit 2 g/l Pepton,

der blaue Graph kp bei 5 g/l Pepton.

Andere Stickstoffquellen, wie Hefeextrakt, Soytone, Natriumnitrat und Ammoniumsulfat

(Medium: HK-0*/4, 5, 6, 7) bewirkten nur eine geringfügige Ampullosporin-Bildung von

maximal 0,4 bis 1,5 mg/l. Wurden diese Medien jedoch mit α-Aminoisobuttersäure (α-Aib,

1 g/l, Medium: HK-0*/4a, 5a, 6a, 7a) supplementiert, wurde teilweise ein Anstieg der

Ampullosporinbildung bis um das 10-fache verzeichnet (Abb. 19).

-5,00E-05

0,00E+00

5,00E-05

1,00E-04

1,50E-04

2,00E-04

0 50 100 150 200 250

Kultivierungszeit [h]

kp [

h-1

] b

ei 2

g/l

Pep

ton

0,00E+00

1,00E-04

2,00E-04

3,00E-04

4,00E-04

5,00E-04

6,00E-04

7,00E-04

kp [

h-1

] b

ei 5

g/l

Pep

ton

kp [h-1], 2 g/lPeptonkp [h-1], 5g/lPeptonkp, 5 g/l

Ergebnisse

61

Abb. 19: Die blau ausgefüllten Säulen stellen die Ampullosporinkonzentration ohne die Ergänzung des

Mediums mit α-Aib dar. Als gelbe Säulen erscheinen die Ampullosporinausbeuten aus

entsprechend gleichen Medien mit α-Aib-Zusatz. Zum Vergleich wird die Ausbeute bei der

Kultivierung auf dem Standard-Peptonmedium, Säule 2, neben dem Aminosäure-Medium

(Verwendung aller Substrataminosäuren), Säule 1, dargestellt.

Einen frühen Startpunkt der Ampullosporinbiosynthese (nach ca. 40 h, Maximum nach

etwa 100 h) sowie vergleichsweise hohe Ausbeuten (bis 30 mg/l) wurden mit einem

Mineralsalzmedium erzielt (HK-0*/1), welches als einzige Stickstoffquelle die

Substrataminosäuren des Ampullosporinmoleküls beinhaltete (Abb.20). Dabei wurden

Trockenbiomassen von nicht mehr als 1,3 g/l bei einer sehr geringen spezifischen

Wachstumsrate von maximal 0,03 h-1 gebildet. Ein Ertragskoeffizient (YP/S=(dP/dt)/(dS/dt))

des Ampullosporins bezogen auf das verbrauchte Substrat Maltose von 0,005 wurde nicht

überschritten.

Die Konzentrationen der eingebrachten Aminosäuren wurden über den

Fermentationszeitraum verfolgt. Dabei war während der Ampullosporin-Bildungsphase

eine starke Abnahme des α-Aib's zu beobachten. Glutamin und Leucin erfuhren

gleichermaßen eine rasche Verstoffwechslung, sodass nach mindestens 90 bis 120 h

keine der drei Aminosäuren mehr nachgewiesen wurde. Alanin und Tryptophan hingegen

akkumulierten sich im Kulturmedium, obwohl sie in vergleichbaren, relativ geringen

Konzentrationen Anwendung fanden.

0

5

1 0

1 5

2 0

2 5

AS-M

edium

Pepto

n-Med

ium

Hefeex

trakt

Ammon

iumsul

fat

Natrium

nitrat

Am

pullo

spor

in [

mg/

l]

Ergebnisse

62

Abb. 20: Maltoseverbrauch, Biomasseentwicklung, gemessen an der Gesamt-Trockenbiomasse (keine

Differenzierung von Lebend- und Totzellen), sowie Ampullosporinakkumulation werden über

einen Kultivierungszeitraum von 120 h dargestellt.

6.1.3 Einfluss von Scherkraft auf die Ampullosporinbildung

In diesem Versuchsansatz wurde S. ampullosporum in gewöhnlichen Schüttelkolben

sowie mit Schikanen versehenen Erlenmeyerkolben unter Standardbedingungen (HK-0*-

Medium) mit jeweils zwei verschiedenen Rotationsgeschwindigkeiten von 90 rpm

(Standard) bis 200 rpm kultiviert. In Schikane-Kolben konnten, um einen Austrag zu

vermeiden, nicht mehr als 120 rpm realisiert werden. In Abb. 21 wurden neben bzw. über

den Produkt- bzw. Biomasse-Konzentrationen das jeweilige Erscheinungsbild der

Kulturen dargestellt. Darin ist klar die Reduktion des Pelletdurchmessers, die verstärkte

Eintrübung der Kultur und die eindrucksvolle Zunahme von Schaumbildung mit steigender

Scherbelastung zu erkennen. Kleine Pellets mit abgescherten Hyphen, kurze

Hyphenbruchstücke sowie ein hoher Anteil in das Medium sekretierten, lysierten

Zellmaterials konnte auch mikroskopisch nachgewiesen werden.

Mit erhöhtem Energieeintrag wurde eine sinkende Ampullosporinausbeute detektiert, was

auf einen reziproken Zusammenhang zwischen Ampullosporinbildung und

Scherkrafteinfluss schließen lässt.

Der mit Rotationsbeschleunigung und Schikanen gekoppelte verstärkte Sauerstoffeintrag

in die Kulturen zeigte keinen definierten Einfluss auf die Ampullosporinentwicklung. Im

Gegenteil, da mit zunehmender Rotationsgeschwindigkeit ein signifikanter Rückgang des

25,924,94

16,4

5,31

0,1400

1

2

3

4

5

6

0 20 40 60 80 100 120Kultivierungszeit [h]

Mal

tose

[g/l]

; TB

M [g

/l]

0

5

10

15

20

25

30

Am

pullo

spor

in [m

g/l]

Maltose

tbm

AS

Ergebnisse

63

Sekundärmetaboliten verzeichnet wurde (Abb. 21), besteht die Möglichkeit, dass ein

erhöhter Sauerstoffeintrag zusätzlich inhibierend auf den Sekundärmetabolismus und

somit auf die Ampullosporinbiosynthese einwirkt. Im Gegensatz zu dieser Annahme

könnte jedoch aufgrund der starken Schaumentwicklung ebenso eine Sauerstofflimitation

vorligen.

Abb. 21: Reziprokes Verhalten zwischen erhöhtem Scherkraft- und Sauerstoffeintrag und

Ampullosporinbildung; die jeweils linke Säule (rot) entspricht der maximal festgestellten

Ampullosporinkonzentration, die rechte, blaue Säule TBMmax (maximale Trockenbiomasse)

6.1.4 Scale-up-Experimente

Eine Maßstabsvergrößerung auf der Basis eines Submersverfahrens in Rühr-

Tauchstrahl-Bioreaktoren oder Blasensäulen, konnte nicht realisiert werden.

In diffus-filamentös gewachsenen Schüttelkulturen wurde nur stark reduzierte bis keine

Ampullosporinbildung nachgewiesen. Des weiteren schienen Differenzierungsprozesse,

wie die Ausbildung ausdifferenzierter, gelber Alleuriokonidien, eine Voraussetzung für die

Initialisierung der Ampullosporinbiosynthese zu sein. Daher wurden die

Fermentationsbedingungen (z. B. Einsatz von Schrägblattrührern) zur Expression des

gewünschten morphologischen Erscheinungsbildes angepasst. Ausdifferenzierendes,

18,48

5,39

3,79

0,3

5,76

4,353,25 3,168

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

90 rpm ohneSchikanen

200rpm ohneSchikanen

90rpm mitSchikanen

120rpm mitSchikanen

Am

pullo

spor

in [m

g/l];

TB

M-m

ax [g

/l]

Ergebnisse

64

pelletierendes Mycel konnte so auch im Rührbioreaktor kultiviert werden. Trotzdem wurde

kaum Ampullosporinbildung nachgewiesen (< 2 g/l). Ein großes Problem stellte die starke

Schaumbildung dar, die bereits nach 24 bis 48 h auftrat und weder mit mechanischen

Einbauten, wie Schaumzerschlägern, noch chemischen Zusätzen (Detergenzien) zu

unterbinden war (Abb. 22).

a) b)

Abb. 22: Fermentation im 5 l - Rührbioreaktor; a) Kulturgefäß mit ausdifferenziertem, pelletiertem Mycel;

starke Schaumbildung ersichtlich; b) mikroskopische Aufnahme eines Pellets mit ausgereiften

Alleuriosporen

Da bei Submerskultivierungen im Scale-up Produktsteigerungen ausblieben, wurden

Feststoff-Fermentationen für eine Maßstabsvergrößerung herangezogen.

In Kooperation mit der PROPHYTA GmbH, Insel Poel, wurde Sepedonium

ampullosporum auf einem Getreidemix, bestehend aus verschiedenen Cerealien, bis zu

einem Maßstab von 30 kg Trockensubstrat kultiviert.

Dabei wurden im Feststofffermenter auf einer Anzahl von Ebenen geringe Schichten

Substrat aufgeschüttet, die nach Sterilisation durch Versprühung des Inokulums

gleichmäßig beimpft wurden. Nach 2 bis 3 Wochen war das Substrat vollständig vom Pilz

bewachsen, gut erkennbar anhand der Orangefärbung (Abb. 23).

Die extrahierten Konzentrationen an Ampullosporin waren erstaunlich hoch und beliefen

sich auf bis zu 0,4 g/kg Trockensubstrat. Die Substanz konnte nach einer Extraktion mit

Essigsäureethylacetat, anschließender Abtrennung wasserlöslicher Bestandteile, erneuter

Extraktion mit n-Hexan und säulenchromatografischer Aufreinigungsmethoden (vergleiche

5.14.9) isoliert werden.

Ergebnisse

65

Abb. 23: Im Feststoffbioreaktor bewachsenes Getreidesubstrat

Aufgrund der relativ aufwendigen Prozedur, vorwiegend zur Abtrennung öliger

Bestandteile aus den Cerialien, wurde der Pilz einer Semifeststofffermentation

unterzogen. In Flüssignährmedium (HK-0*) getränktes, poröses Tonmaterial diente dabei

als Träger (Abb. 24). Durch eine Begasung mit feuchter Luft wurde die Kultur vor

Austrocknung bewahrt. Nach etwa ein bis zwei Wochen waren die Tonkügelchen partiell

stark von Mycel umwachsen. Der Vorteil dieser Kultivierung bestand in der Möglichkeit,

reines Mycel zu extrahieren. Dieses wurde inklusive dem Träger mit

Essigsäureethylacetat überschichtet. Zur Isolierung von Ampullosporin würde eine sich

sofort anschließende präparative HPLC-Fraktionierung genügen.

Es wurden jedoch nur Ausbeuten von etwa 9 mg/kg eingesetztem Granulat erreicht.

a) b)

Abb. 24: Kultivierung von Sepedonium ampullosporum auf in Flüssignährmedium getränkten

Tonkügelchen; a) Versuchsapparatur b) bewachsenes Tonmaterial

Ergebnisse

66

6.2 Biosynthese von Ampullosporin

Die im Ampullosporinmolekül vorkommende, nichtproteinogene Aminosäure

α-Aminoisobuttersäure (α-Aib) deutet auf eine nichtribosomale Peptidsynthese an großen

nichtribosomalen Peptidsynthetase-Komplexen (NRPS) zur Bildung von Ampullosporin

hin. Sollten, wie bei allen bisher beschriebenen eukaryontischen NRPS-Systemen, alle

katalytischen Funktionen auf einem multifunktionalen Enzym lokalisiert sein (Keating &

Walsh, 1999), wäre ein fast 2 MDa großes Protein zu erwarten.

Demnach wurden die Separations- und Aufreinigungsmethoden zur Isolierung bzw.

Aufkonzentrierung eines solch hochmolekularen Enzyms adaptiert. Erfahrungen zur

Präparation von δ-(L-Aminoadipyl)-L-Cysteinyl-D-Valin-Synthetase aus A. nidulans

(ACVS; van Liempt et al. 1989) bzw. der Cyclosporin-Synthetase als größtes bis dato

beschriebenes Enzym mit ca. 1,7 MDa (Zocher et al., 1986) wurden berücksichtigt, zumal

es sich gleichermaßen um fungale Enzymsysteme handelt.

6.2.1 Gewinnung der potentiellen Ampullosporinsynthetase(n) (HMWP)

Zellen aus 1 bis 5 Litern Schüttelkultur, die unter optimierten Fermentationsbedingungen

(im HK-0*- bzw. Aminosäure-Medium) kultiviert und zum Zeitpunkt der Produktbildung

(nach 48 - 120 h) geerntet wurden, dienten als Ausgangsmaterial zur Gewinnung der

potentiellen Ampullosporin-Synthetasen. In den meisten Fällen erfolgte statt einer

sofortigen Verarbeitung eine Lyophilisation des Zellmaterials. Dieses wurde bei -20°C

(besser noch -40 bis -80°C) bis zu 2–3 Monaten gelagert. Ein Konzentrationsverlust an

Zielproteinen ist bei diesem Verfahren erfahrungsgemäß nicht zu erwarten (Schwecke,

Dissertation, 1993, Zocher et al., 1986).

Das Lyophilisat wurde, wie unter 5.2 beschrieben, im Hochdruckhomogenisator bzw.

mittels French Press aufgeschlossen und mit Ammoniumsulfat gefällt (60 %). Auf diese

Weise wurde ein Gesamtproteinextrakt gewonnen, der verschiedenen

chromatografischen Aufreinigungsmethoden unterzogen wurde. Auf die Fällung der DNA

mit Polyethylenimin (van Liempt, 1988) oder Streptomycinsulfat (Jensen et al., 1988)

wurde jedoch verzichtet. Ähnlich wie bei der ACVS hätte auch in diesem Falle ein

anfänglicher Nichtnachweis der erwarteten hochmolekularen Proteinbanden auf einen

präzipitierenden Effekt DNA-fällender Reagenzien hindeuten können (Schwecke et al.,

1992). Diese Annahme bestätigte sich nicht. Dennoch wurde weiterhin eine Abtrennung

der Nukleinsäuren unterlassen.

Ergebnisse

67

Im Rohextrakt ampullosporinbildender Zellen waren zwei hochmolekulare Proteine mit

einer Größe von etwa 350 kDa und 1,5 MDa ersichtlich, die die Bezeichnung HMWP2

(350kDa) und HMWP1 (1,5 MDa) erhielten.

Die Größenbestimmung erfolgte im Vergleich zu anderen hochmolekularen NRPS-

Enzymen in der 5 %-SDS-PAGE. HMWP2 wurde dabei parallel zur Enniatin-Synthetase

(350 kDa; Haese et al. 1993) detektiert, wodurch eine Molmasse von etwa 350 kDa

angenommen wurde. HMWP1 lief kurz unterhalb der Cyclosporin-Synthetase (Abb. 25),

die mit einem Molekulargewicht von 1.689 MDa beschrieben wird (Weber et al., 1994).

Abb. 25: Molekulargewichtsabschätzung der zwei hochmolekularen, potentiellen Ampullosporin-

Synthetasen (Spur 2 und 4) durch Vergeich der RF-Werte im 5 %-Gel der SDS-PAGE mit

denen anderer hochmolekularer NRPS; Spur 1, Hochmolekulargewichts-Marker (HMW)

(Pharmacia), Spur 3, Enniatin-Synthetase, Spur 5, Cyclosporin-Synthetase.

Die Detektion beider Proteine korrelierte sehr stark mit dem Prozess der

Ampullosporinbildung (Abb 26). Wurden die Zellen erst nach der Akkumulation des

Sekundärmetaboliten geerntet, war auch ein Nachweis der Proteinbanden nicht mehr

möglich. So konnte nach 72 bis 96 h ein Maximum von HMWP2 und HMWP1 festgestellt

werden. Nach 48 h waren diese hingegen noch nicht bzw. nur sehr schwach detektierbar.

Ein ähnliches Bild zeigte sich nach 144 Kultivierungsstunden. Die Kinetik dieser Proteine

stimmte mit dem zeitlichen Produktnachweis überein (Abb. 26). Eine genaue

1 2 3 4 5kDa

350

220

170

a) b)

1.689~1.500

Ergebnisse

68

Konzentrationsbestimmung des Ampullosporins erfolgte über die analytische HPLC

(5.14.7).

Abb. 26: Korrelation von Ampullosporinbildung und Nachweis der hochmolekularen Proteine mit einem

Molekulargewicht von etwa 1,5 MDa und 350 kDa.

Rohproteinextrakte aus je 1 l Kultur wurden nach 48, 72, 96, 120 und 144 Kultivierungsstunden

geerntet. Etwa 47 µg Protein wurden je Probe in einem 5 %-igen SDS-PAA-Gel

elektrophoretisch aufgetrennt. In Spur M wurde ein Hochmolekulargewichtsmarker aufgetragen.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

48 Std. 72 Std. 96 Std. 120 Std. 144 Std.

Am

pu

llosp

ori

nko

nze

ntr

atio

n [

mg

/l]

~ 1.500

~350

~205

~116

kDa M 48 h 72 h 96 h 120 h 144 h

Ergebnisse

69

6.2.2 Reinigung der Zielproteine

6.2.2.1 Gelfiltration mit Superdex 200 HiLoad 16/60

Der mit 60 % Ammoniumsulfat gefällte Rohextrakt enthielt die Gesamtheit an

Zielproteinen, d. h. in allen weiter gefällten Extrakten (bis 80 %) wurden keine Proteine im

Bereich 350 kDa bzw. 1,5 MDa detektiert. Nach Aufnahme des Ammoniumsulfatpellets in

einem entsprechend geringeren Volumen an Puffer A (aus 5 l Kultur etwa 50 bis 100 ml)

wurde nicht wieder gelöstes Protein abzentrifugiert (10.000 bis 15.000 rpm). Der Anteil an

präzipitierten Zielproteinen war äußerst gering.

Das Zentrifugat konnte nach zusätzlicher Filtration über einen 0,2 µm-Filter auf die

Superdex-Säule geladen und im isokratischen Verfahren mit Puffer A nach der

Molekülgröße bzw. dem Molekulargewicht aufgetrennt werden. HMWP1 und HMWP2

eluierten bei einem Fluss von 1 ml/min und Verwendung von Superdex 200, 16/60 mit

einem Säulenbettvolumen von 120 ml nach etwa 36-48 ml, von einer 320 ml-Säule

(26/60) nach etwa 90-110 ml.

Ein typisches Elutionsprofil ist in Abb. 27 dargestellt. Der Grad der Aufreinigung wurde

nach jedem Schritt durch SDS-PAGE kontrolliert.

Auffällig erscheint die starke Assoziation von HMWP1 und HMWP2. Trotz einer

Massendifferenz von über 1 MDa eluierten beide Proteine zeitgleich. Dieses Phänomen

wurde auch bei der Anwendung weiterer Aufreinigungsmethoden beobachtet.

Durch die Gelfiltration wurde ca. 2,3 mg aufgereinigtes Protein aus 5 Litern Kultur mit

einem Gesamtproteingehalt von etwa 2,1 g angereichert.

Ergebnisse

70

Abb. 27: Bei 260 nm aufgenommenes Elutionsprofil, in Folge einer Gelfiltration über Superdex 200

(16/60), 120 ml Säulenvolumen; Es wurden 4 ml-Fraktionen gesammelt, die anschließend

mittels SDS/PAGE im 5 %-PAA-Gel getestet wurden. M bezeichnet die Markerspur (HMW,

PHARMACIA). In Spur 1–9 wurden die Fraktionen 9–17 aufgetragen. Die Zielfraktionen 11 und

12 mit HMWP1 und HMWP2 entsprechen den rot markierten Spuren 3 und 4.

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9

~1.500

kDa

~350

220

116

Ergebnisse

71

6.2.2.2 Aufreinigungsversuche mittels Anionenaustauschchromatographie an

High PerformanceTM Q-Sepharose und Mono QTM HR 5/5 sowie

Hydrophober Interaktionschromatografie an phenylsubstituierter

Sepharose

Das Eluat der Gelfiltration wies bereits einen hohen Reinheitsgrad auf. Der größte Anteil

der im Rohextrakt vorkommenden niedermolekularen Proteine konnte erfolgreich

abgetrennt werden (Abb. 28). Für eine weitere Separation von HMWP1 und HMWP2

kamen Methoden, deren Trennprinzip auf der unterschiedlichen Hydrophobizität der

Proteine basiert, zum Einsatz.

Trotz stark reduzierter Auftrags- und Elutionsgeschwindigkeiten (Q-Sepharose/Mono-

Q/Phenyl-Sepharose: 0,2 ml/min) konnte keine Trennung der Proteine erreicht werden.

Bei einem Salzgehalt (Ammoniumsulfat (AS) bzw. Natriumchlorid (NaCl)) von etwa

350 mM eluierte zunächst HMWP2, kurz darauf HMWP1. Obwohl die Kapazität der Mono-

Q-Säule auch in den darauffolgenden Versuchen nicht voll ausgelastet wurde, passierte

ein großer Teil der Zielproteine diese ohne zu retinieren.

Für die Trennung bzw. weitere säulenchromatografische Aufreinigung der vermeintlichen

Ampsynthetase-Proteine wurden die Zielfraktionen der Gelfiltration mit 1 M AS versetzt

und der mit 1 M AS in Puffer B (= Puffer D) equilibrierten Phenyl-Sepharose zugeführt.

Nach einer Spülung mit etwa 2 Säulenvolumina gleichen Puffers, erfolgte die Elution

durch sukzessiven Abfall der Salzkonzentration. Erst bei Zusatz von 40 % Ethylenglykol

im Puffer B eluierten die Zielproteine wiederum zeitgleich. Dies weist auf eine starke

Hydrophobizität der Proteine hin.

Ein Konzentrationseffekt konnte durch Anwendung der beschriebenen Methoden jedoch

kaum erreicht werden (Abb. 28). Neben den beiden Zielproteinen scheint ein weiteres mit

einer Größe von etwa 70-80 kDa gleichermaßen assoziiert. Auch dieses ließ sich durch

die angewandten Proteintrennungsmethoden nicht von den anderen separieren.

Ergebnisse

72

Abb. 28: Einzelne Stufen der Aufreinigung der potentiellen Enzyme der Ampullosporin-Biosynthese.

Neben dem HMW (Molekulargewichtsmarker, Spur M) sind in Folge der Rohextrakt (Spur 2),

die Ammoniumsulfatfällung (Spur 3, in allerdings geringerer Proteinkonzentration), die

Gelfiltration (Spur 4) und die Phenylsepharose-Elution (Spur 5) aufgetragen.

6.2.3 Biochemische Untersuchung von HMWP1 und HMWP2

6.2.3.1 Untersuchung auf NRPS-Aktivität

Wie unter 5.3 beschrieben können einzelne Teilreaktionen der nichtribosomalen

Peptidsynthese in vitro initiiert und durch Verwendung radioaktiv markierter Einsatzstoffe,

NRPS-Aktivität nachgewiesen werden.

Trotz zahlreicher Variationen der Bedingungen im ATP/PPi-Austausch und im Thioester-

Beladungs-Test, konnte weder eine ATP-abhängige Aminoacyladenylat- noch eine

Thioester-Bildung festgestellt werden.

Lange Inkubationszeiten (bis um das 3fache, d. h. bis zu 1 Std.) wurden realisiert, da auch

andere Beispiele von stark reduzierten Umsätzen der Synthetasen in vitro zeugen (z. B.

ACVS, Schwecke et al., 1992). Einmal konnte eine geringfügige Aktivierung von α-Aib

beobachtet werden. Durch die systematische Optimierung der Reaktionsbedingungen

sollte es möglich sein, Aktivitäten festzustellen.

Geringe Austauschraten im ATP/PPi-Austausch sprechen für eine hohe Adenylatstabilität

(Keller et al., 1984). Demzufolge wäre ein direkter Nachweis der Adenylatbildung als

„Hinreaktion“ wünschenswert. Zu diesem Zweck wurde ein mit [14C-αAib] inkubierter

M 2 3 4 5kDa

~1.500

~350

220

116

170

76

Ergebnisse

73

Testansatz über eine PD10-Säule gelfiltriert. Die ungebundene, niedermolekulare

Aminosäure eluiert später als die als Adenylat an das Enzym gebundene Aminosäure,

was ein Doppel-Peak-Elutionsprofil zur Folge hat (gestrichelter Graph, Abb. 29).

Aus ampullosporinproduzierender Kultur wurden 2300 µl Rohextrakt mit einem

Gesamtproteingehalt von 300 µg/ml mit 5mmol ATP und 25 mM MgCl2 sowie 3700 pmol14C-Aib (ergeben: 440.000 cpm) 15 min bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend

erfolgte die Trennung des Testansatzes über eine PD10-Säule in 400 µl-Fraktionen. Eine

Proteinelution wurde nach 0-3,5 ml (Fraktion 1-9; im Diagramm: 1-4) erwartet. Leider blieb

auch dieser Versuch ohne Erfolg.

0

5000

10000

15000

20000

25000

0 2 4 6 8 10 12 14Fraktionen

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100Radioaktivität [cpm]

Ideal-Elutionsprofil

Protein [µg/ml]

Abb. 29: Der gestrichelte, rote Graph gibt das Ideal-Elutionsprofil bei erfolgreicher Adenylatbildung mit

radioaktivmarkierter Substrataminosäure (erster Peak) wieder. Der grüne Graf zeigt die real

gemessenen Werte, die auf keine Bindung der Aminosäure an das Enzym schließen lässt. Des

weiteren werden die ermittelten Proteinkonzentrationen (gelber Graph) angegeben.

Im zweiten Schritt der Aktivierung der Substrataminosäuren werden diese kovalent an ihre

spezifische Thiolierungsdomäne gebunden. Die entstandenen Thioester sind im

Gegensatz zur Adenylat-Vorstufe säurestabil und können im Thioester-Beladungstest

nachgewiesen werden. Im Filterbindungstest wurden [14C]-markierte Substrataminosäuren

(Glutamin, Alanin und Aib) mit der Gelfiltration bzw. dem Proteinrohextrakt von

S. ampullosporum etwa 30 bis 60 min bei RT inkubiert. Nach Abstoppen der Reaktion und

folgender Inkubation des Proteinpellets mit 10% TCA für etwa 10 min würden

Ergebnisse

74

Thioesterbindungen erhalten bleiben. Das [14C] markierte Protein müsste dann, nach

Absaugen freier Aminosäuren über einen Glasfaserfilter, nachzuweisen sein. Leider

wurde keine Filteraktivität festgestellt.

Der Thiolierungsnachweis nach Keller (1987) (5.3.2) beruht auf der spezifischen Spaltung

von Thioesterbindungen durch Perameisensäure. Dadurch kommt es zur Freisetzung

vorher inkorporierter [14C]-markierter Aminosäuren. Diese sind mittels

Dünnschichtchromatografie abtrennbar und im Radiogramm eindeutig zu detektieren.

Unter 5.3.2 wurde diese Nachweismethode detailliert beschrieben. Daraus geht hervor,

dass bei NRPS-in-vitro-Aktivität die mit Wasser behandelte Ameisensäure-Fraktion

radioaktiv markiertes Protein aufweisen müsste. Im Testansatz mit Wasserstoffperoxid,

welches Ameisensäure in Perameisensäure überführt und somit die Freisetzung der

gebundenen radioaktiv markierten Aminosäuren verursacht, sollten nur noch freie

Aminosäuren radioaktiv nachweisbar sein.

Sepedonium-Proteinextrakte zeigten auf dem Dünnschichtchromatogramm keine

radioaktiven Spots, was auf eine nicht stattgefundene Bindung von Substrataminosäuren

schließen lässt.

6.2.3.2 WESTERN–Blot-Analyse mit spezifischen NRPS-Antikörpern

Eine Sepedonium-Gelfiltration wurde parallel zu anderen Peptidsynthetasen bzw. deren

Abbauprodukten und einer Negativkontrolle, dem Molekulargewichtsmarker mit

mindestens 5 verschiedenen Nicht-NRPS-Proteinen, auf ein 7,5 %-iges SDS-PAA-Gel

aufgetragen sowie anschließend auf eine Nitrocellulose-Membran geblottet. Ziel war,

HMWP1 und HMWP2 als potentielle Peptidsynthetasen auf Kreuzreaktivität mit NRPS-

Antikörpern zu testen. Aufgrund des modularen, prinzipiell gleichartig gestalteten Aufbaus

von Peptidsynthetasen mit gleicher Funktionalität einzelner Domänen, kreuzreagieren

häufig AK von Peptidsynthetasen mit anderen NRPS.

Diese Eigenschaft wird zum Nachweis neuer bzw. unbekannter NRPS genutzt.

Monospezifische Antikörper, die gegen ein hochkonserviertes Motiv, die SGTTGXPKG-

Sequenz, in der Adenylierungsdomäne der Tyrocidin-Synthetase hergestellt wurden

(Etchegaray et al., 1998), zeigten eine Immunbindung spezifisch an HMWP2 und HMWP1

(Abb 30). Das in der Aufreinigung auffällige, zusätzlich assoziierte 70 kDa-Protein

reagierte nicht. Die Abbauprodukte der Tyrocidin-Synthetase zeigten erwartungsgemäß

eine starke Immunraktion im Gegensatz zu den analog aufgetragenen ACVS- und

Surfactin-Synthetase-Fraktionen, die teilweise nur als Abbauprodukte vorlagen. In der

Markerspur wurde keine Antikörperreaktion festgestellt.

Ergebnisse

75

Abb. 30: Westernblot-Analyse unter Anwendung hochspezifischer NRPS-AK (Etchegaray et al., 1998),

die mit dem SGTTGXPKG-Motiv der Adenylierungsdomäne kreuzreagieren (b). In a) ist ein zum

Immunoblot analoges, Coomassie-Blau-gefärbtes Gel dargestellt. Spur 1: HMW, Spur 2:

S. ampullosporum -Gelfiltration mit HMWP2 und HMWP1, Spur 3: Surfactin-Synthetase-

Abbauprodukte, Spur 4: ACVS-Abbauprodukte, Spur 5: Tyrocidin-Synthetase-Abbauprodukte

6.2.3.3 Proteolyseverhalten

Für die Untersuchung der Domänenstruktur von modular aufgebauten Multienzymen, wie

z. B. nichtribosomale Peptidsynthetasen und Polyketidsynthasen, wurde eine limitierte

Proteolyse nach Aparicio (1994) angestrebt. Dabei kamen verschiedene proteolytische

Enzyme, wie Trypsin, Chymotrypsin, Papain, Elastase, Thermolysin, Endoproteinase Glu-

C und Arg-C als auch Bromcyan, welches spezifisch an Methioninresten schneidet, zum

Einsatz.

In Tabelle 1 wurden die verschiedenen Bedingungen, unter denen eine möglichst

sukzessive Fragmentierung der Zielproteine erreicht werden sollte, in der Literatur

angegebenen Standardeinstellungen gegenübergestellt. In zeitlichen Abständen von 2, 5,

10, 30, 60 min bis zu 24 h wurden die Proteolysereaktionen durch Zugabe von Laemmli-

Probenpuffer und Erhitzung auf 95°C (5 min) abgestoppt. Im 7,5-10%-SDS-Gel wurden

die Proben auf neuentstandene, niedermolekulare Protein- bzw. Fragmentbanden,

kontrolliert.

1 2 3 4 5 5 4 3 2 1

~ 1.500

350

205

11697

84

66

a) b)

kDa

Ergebnisse

76

proteolytisches Enzym/

Agens

Verhältnis

Enzym/Protein

(w/w)

Temperatur,

pH

Zusätze Proteolyse-

zeit

Trypsin empfohleneBedingungen

1 : 1000 ... 50 30 ... 37°C7,5 ... 8,1

N-Methyl-mopholin-acetat,NH4HCO3

2 – 18 h

realisierteBedingungen

bis 1 : 1 30 ... 37°C7,5

Na HCO3 bis zu 24 h

Chymo-trypsin

empfohleneBedingungenrealisierteBedingungen

wie bei Trypsin

Papain empfohleneBedingungen

37°C6,0 ... 7,0


1 : 125 ... 1 37°C7,0

bis zu 24 h

Elastase empfohleneBedingungen

1 : 200 30°C7,5

bis zu 60 min


1 : 200 ... 1 30°C7,5

bis zu 24 h

Thermolysin empfohleneBedingungen

1 : 1000 ... 50 50°C7,8 ... 8,1

wie beiTrypsin

4 – 12 h


1 : 125 ... 1 37°C7,5

bis zu 24 h

Endoprote-inase Glu-C

empfohleneBedingungen

1 : 200 ... 201 : 40

25 ... 37°C4,0 ... 7,8

NH4HCO3,Na2HPO4,Ammonium-acetat

2 – 18 h


1 : 40 ... 4 37°C7,5

Na2HCO3 5 – 12 h

Endoprote-inase Arg-C

empfohleneBedingungen

1 : 30 37°C4,0 ... 8,0

Ammonium-bicarbonat

2 – 18 h


1 : 30 37°C7,5

Na2HCO3 bis zu 24 h

Bromcyan empfohleneBedingungen

60facherÜberschuss

RTsauerDunkel-reaktion

Protein in70%Ameisen-säure

24 - 48h


bis zu600facherÜberschuss

RTsauerDunkel-reaktion

Protein in70%Ameisen-säure

ü. Nacht

Tab. 1: Proteolysebedingungen bei der Fragmentierung der Zielproteine; empfohlene

Proteolysebedingungen nach Aparicio et al. (1994); Tomasselli et al. (1986) ; Gross (1967) ;

Boehringer Mannheim Biochemica

Ergebnisse

77

HMWP1 und HMWP2 schienen trotz verstärkter Proteolyse-Bedingungen in den meisten

Fällen völlig inert. Bei Einsatz von Trypsin beispielsweise konnte bis zu einem Verhältnis

von Protease/Zielprotein wie 1/200-1/50 kaum eine Abnahme der hochmolekularen

Banden beobachtet werden (Abb. 31). Bei einem Verhältnis von 1/20 hingegen lag

scheinbar Totalproteolyse vor, da weder Ausgangsproteinbanden noch neue Fragmente

ersichtlich waren. Auch im Zwischenbereich, bei Protease/Protein-Verhälnissen von 1/30

und 1/40, konnten keine befriedigenden Ergebnisse festgestellt werden.

Um die Zugänglichkeit der Proteine für den proteolytischen Angriff der Enzyme zu

erhöhen, wurden diese vorher mit 1 % SDS und zusätzlich 1-20 mM DTT (je nach

Protease-Verträglichkeit) ca. 5 min bei 95°C gekocht.

Abb. 31: Auftrag, mit Trypsin unterschiedlich lang inkubierter, Gelfiltrationen auf ein 5%- SDS-Gel

Die mittels Gelfiltration teilgereinigten Proteinfraktionen enthielten neben den

hochmolekularen Zielproteinen auch noch eine Anzahl kleinerer Proteine. So konnten nur

mit geringer Wahrscheinlichkeit neu entstandene Proteinbanden als Fragmente von

HMWP2 bzw. HMWP1 erkannt werden.

Ein In-Gel-Verdau der einzelnen Proteine erlaubt hingegen eine genaue Zuordnung.

So wurden 420 µg Protein aus dem Eluat der Gelfiltration mit 10% TCA gefällt und auf

einem 5%igen SDS-Gel getrennt. HMWP1 und HMWP2 wurden ohne vorheriges

Anfärben ausgeschnitten, die Gelstückchen in Reaktionsgefäße überführt und lyophilisiert.

5 µg Endoproteinase Glu-C, gelöst in 200 µl Puffer inkubierten über 5 bis 12 h bei 37°C

mit HMWP1. Unter Annahme, dass etwa 10 % der Gelfiltration von den Zielproteinen

0' 0,5' 1' 2' 5' 60' 120'

1700

350

kDa

Ergebnisse

78

HMWP1/2 getragen werden, wurde somit ein Enzym/Protein-Verhältnis von mindestens

1/4 realisiert.

Ein Verdau von HMWP2 erfolgte unter Einsatz von 150 µg Chymotrypsin, gelöst in 200 µl

Puffer über eine Inkubationszeit von 1 bis 2 h. Die Reaktionen wurden durch etwa 20

minütiges Erhitzen der Ansätze auf 95°C und Zugabe von ca. 50 µl Proben(Laemmli)-

Puffer abgestoppt. Die Gelstückchen, die die gesamte Lösung aufgesaugt hatten, konnten

nun auf ein neues, mindestens 10 %-iges SDS-PAA-Gel aufgeschichtet werden.

Jedoch erst unter Anwendung reduzierender Laufbedingungen in der 10%-SDS-PAGE,

realisiert durch die Zugabe von 2-10 mM DTT zum Laufpuffer, wurden Fragmentbanden

im Größenbereich von etwa 80-20 kDa sichtbar (Abb. 32). Dieses Phänomen wurde auch

bei der proteolytischen Spaltung von Avidin mit Proteinase K beschrieben (Ellison et al.,

1995).

Abb. 32: Typisches Verdaugel in Vorversuchen (HMWP1 nur gering konzentriert, daher nur schwache

Proteinbanden). Unter reduzierenden Bedingungen in der SDS-PAGE, nach dem In-Gel-Verdau

von HMWP1, wurden die Fragmente sichtbar. Proteinbanden bei ca. 50 und 60 kDa, die aus

dem Blot eines stark ankonzentrierten Verdaugels ansequenzierbar waren, wurden mit roten

Pfeilen markiert. Noch unverdautes hochmolekulares Protein erscheint am oberen Rand des

rechten Geles (schwarzer Pfeil).

Nach dem Blotten der Proteinfragmente auf eine PVDF-Membran konnte aus HMWP1

eine 50 sowie eine 60 kDa-Proteinbande ansequenziert werden. Alle weiteren Proteine

waren entweder N-terminal blockiert oder zu gering konzentriert. Eine größere Menge an

Protein anzureichern, war aufgrund methodischer bzw. technischer Limitationen nicht

möglich. Somit standen 2 interne Aminosäuresequenzen, spezifisch aus dem

hochmolekularen HMWP1 für weitere Untersuchungen zur Verfügung.

Aminosäure-Sequenz 1: PSPLPN

Aminosäure-Sequenz 2: VFLV(T)(T)

205

978466

55

45

36

116

kDa M M

Ergebnisse

79

6.2.4 Screening nach NRPS codierenden Genen

6.2.4.1 Primerdesign

Die strukturelle und funktionelle Ähnlichkeit von Peptidsynthetasen, die sich in der

Ausprägung hochkonservierter Aminosäuresequenz-Motive wiederspiegelt, eröffnet die

Möglichkeit, mit degenerierten Oligonukleotiden nach unbekannten NRPS-codierenden

Genen zu screenen (Turgay & Marahiel, 1994).

Von diesen sog. "Core-Motiven" können Oligonukleotid-Primer abgeleitet werden. Da von

S. ampullosporum keine codierenden Sequenzen bekannt und somit Rückschlüsse auf

dessen Codon-Gebrauch nicht möglich waren, ließen sich zunächst nur stark

degenerierte Primer ableiten.

Ziel des Screenings ist es, nach erfolgreichem Annealing der eingesetzten Primer (jeweils

1 Vorwärts- und 1 Rückwärtsprimer) an der Template-DNA eine Amplifizierung des

eingeschlossenen DNA-Fragments zu erreichen. Der Einsatz degenerierter Core-Motiv-

Oligonukleotide in der Polymerasekettenreaktion (PCR) birgt den Vorteil, dass es sich nur

bei der Amplifizierung eines DNA-Fragments spezifischer Größe, um ein NRPS-Fragment

handeln kann. Die Lage bzw. Position der Core-Motive im Synthetase-Gen ist wie ihre

Sequenz selbst relativ stark konserviert. Nur die PCR-Produkte der eingeschlossenen

Fragmentgröße können demnach NRPS-Amplifikaten entsprechen. Alle anderen PCR-

Produkte scheiden als Hit von vorn herein aus, da diese in Folge von Mispriming-

Reaktionen gebildet wurden. Desweiteren ist eine genaue Lokalisation des Fragments in

einem Modul möglich.

In einer separaten Studienarbeit wurden insgesamt 367 Adenylierungs(A)-Domänen von

nichtribosomalen Peptidsynthetasen, die in der NCBI-Proteindatenbank geführt werden,

einem multiplen Alignment unterzogen (Wagemann, 2002). Zusätzlich wurden die A-

Domänen fungaler NRPS zusammengefasst und separat untereinander verglichen. Die

dabei auffälligen hochkonservierten Aminosäuremotive dienten als Grundlage für die

Konstruktion verschiedener, degenerierter Oligonukleotide.

Es handelt sich dabei um die Primer: Fung170, Fung 320, Fung 430, die in Vorwärts- und

Rückwärtsrichtung hergestellt und zur Minderung der Redundanz teilweise spezifiziert

wurden (Fung170neu etc.). Die Zahl in der Bezeichnung der Primer verweist auf die

Position der jeweiligen, konservierten Aminosäuresequenz in der A-Domäne.

In Position 170 beginnt das Core-Motiv: TSGT(S)TG. Benachbarte, häufig vorkommende,

jedoch nicht unmittelbar zum konservierten Motiv zählende Aminosäuren wurden bei der

Spezifizierung berücksichtigt (Fung170neu: Y(F)TSGT(S)T(S)GR(KVT)PK).

Ergebnisse

80

Fung320 wurde ausgehend von der Aminosäure-Sequenz: YGPTE in Position 320 kreiert

und Fung430 von: T(S)GDL, eine Sequenz, die fast am Ende der Adenylierungsdomäne

auftritt.

Bereits publizierte, von hochkonservierten Motiven abgeleitete Oligonukleotide, wie MTF

und MTR (siehe 4.5; Christiansen et al., 2001), fanden ebenso Einsatz wie in anderen

Arbeitsgruppen hergestellte, degenerierte Primer (Tib 1 und Tib 2; University of Sheffield,

AG Geoffry Turner).

Desweiteren kamen degenerierte Oligonukleotide, die während einer früheren

Studienarbeit kreiert wurden (Xiudan Xu, 2001) mit der Bezeichnung: NRPS_LowF,

NRPS_LowR, NRPS_HighF und NRPS_HighR zum Einsatz. Low und High beziehen sich

dabei auf den höheren und niedrigeren G/C-Gehalt der Primer.

NRPS_LowR, NRPS_HighR und MTR gehen auf das Aminosäure-Motiv: RIELGEIE, das

sich zwischen YGPTE und dem T(S)GDL-Motiv befindet und NRPS_LowF, NRPS_HighF

und MTF auf: KAGA(G)G(A) zurück, welches noch vor der TSGT(S)TG-Sequenz liegt.

Die aus HMWP1 erhaltenen internen Aminosäure-Sequenzen wurden gleichermaßen in

Nukleotidsequenzen übersetzt und als Mio1F bzw. Mio1R (Vorwärts- und

Rückwärtsprimer der Sequenz PSPLPN) sowie Mio2F und Mio2R (von VFLV(T)(T))

bezeichnet. Sollten NRPS-Fragmente mit diesen Oligonukleotid-Primern erhalten werden,

so ist das Protein HMWP1 als nichtribosomale Peptidsynthetase einwandfrei bestätigt.

Unter Punkt 4.5 sind alle degenerierten Primer beschrieben, die im Screening nach

NRPS-codierenden Genen auf dem Sepedonium-Genom Anwendung fanden. Ihre

Position auf der A-Domäne ist in Abb. 33 schematisch dargestellt.

Abb. 33: Hochkonservierte Aminosäure-Motive in der Adenylierungsdomäne von NRPS; das Motiv

LGG(H/D)S(L / I) ist ein Core-Motiv der Thiolierungsdomäne

0 100 200 300 400 500 600 AS

L(T/S)YxEL

LKAGGAYL(V/L)P(L/I)

YTSG(S/T)TGxPKG

IVNxYGPTE

G(V/L)ARGYL

Y(R/K)TGDL

KIRGxRIELGEIE

LPxYM(I/V)P

NGK(V/L)DR

LGG(H/D)S(L / I)

A - Domäne T - Domäne

Ergebnisse

81

6.2.4.2 PCR mit degenerierten Oligonukleotiden

Eine große Anzahl von Primerkombinationen wurde in der PCR, die die Amplifizierung

einer NRPS-Sequenz von dem Genom des S. ampullosporums erwirken sollte,

angewandt. Verschiedenste Reaktionsbedingungen für die PCR kamen zum Einsatz (5.8),

da unter Standard-PCR-Bedingungen keine oder ausschließlich Mismatch-Produkte, d. h.

durch fehlerhaftes Hybridisieren der Primer an der genomischen DNA entstandene

Fragmente, detektiert wurden.

So erfolgte eine Optimierung der Konzentrationen einzelner Reaktionskomponenten, wie

die der genomischen DNA, Primer und Magnesiumionen. Außerdem wurden

physikalische Parameter, wie die Temperatur und Einwirkzeit der einzelnen

Reaktionsabschnitte (Denaturierung, Hybridisierung bzw. Annealing und Polymerisation

bzw. Extension) modifiziert. Neben Gradienten- und Touch-Down-PCR fand auch die

Nested-PCR Anwendung (vgl. 5.8).

Unter ungewöhnlichen PCR-Bedingungen wurden die Primer Tib1 und Tib2 mit Erfolg bei

der Amplifizierung eines NRPS-Fragments aus Trichoderma ssp. von der Arbeitsgruppe in

Sheffield eingesetzt. Die Hybridisierungstemperatur betrug 35°C (bei einer

Schmelztemperatur von 36,9°C für Tib1 und 37,4°C für Tib2, lt. G/C-Regel) und die DNA-

Synthesezeit 2 min, statt gewöhnlich 30-60 s. Des weiteren wurden 40 Reaktionszyklen

durchgeführt.

Dieser Ansatz führte erstmalig zur Detektion einer DNA-Bande im Agarosegel, die der

erwarteten Größe von 300 bp entsprach.

Nach Amplifizierung des Fragments durch dessen Einsatz als Template in einer weiteren

PCR, wurde der gewonnene DNA-Abschnitt mit einem Plasmid ligiert und in E. coli

kloniert. Die DNA aus 12 verschiedenen Klonen wurde isoliert und sequenziert.

Es stellte sich heraus, dass alle Klone identisch waren und keine Homologien zu

nichtribosomalen Peptidsynthetasen aufwiesen. Demnach wurde in Folge eines

Misprimings ein inkorrektes DNA-Fragment mit zufällig richtiger Größe amplifiziert.

Durch optimierte PCR-Bedingungen und unter Anwendung der Touch-Down-PCR führte

letztlich eine einzige Primerkombination (NRPS_LowF und MTR) zum gewünschten Ziel.

NRPS_LowF und MTR ergaben bei alleinigem Einsatz gar keine bzw. 2 schwache

Produkte (MTR) in einer Größe kleiner 0,5 kb. Ein fehlerhaftes Hybridisieren der Primer

am genomischen Template in einem Abstand, sodass diese allein in Funktion eines

Vorwärts- und Rückwärtsprimers die Anhäufung von Nonsense-PCR-Produkten initiierten,

konnte demnach nahezu ausgeschlossen werden.

Ergebnisse

82

Die Kombination von NRPS_LowF und MTR ließ hingegen ein DNA-Fragment mit der

erwarteten Größe von ca. 900 bp als fast einziges amplifiziertes Produkt im Agarosegel

erscheinen (Abb. 34).

Als Kontrolle wurde genomische DNA des Pilzes Ustilago maydis eingesetzt. Dieser

enthält ein Gen, sid2, welches für eine nichtribosomale Peptidsynthetase, die in die

Ferrichrome-Biosynthese involviert ist, codiert.

Auch bei diesem Stamm konnte trotz des Einsatzes hochreiner DNA in allen anderen

PCR-Ansätzen kein NRPS-Fragment isoliert werden. Erst unter den beschriebenen

Touch-Down-Bedingungen wurde auch hier mit nur einer Primerkombination von 170Fneu

und NRPS_HighR ein zu NRPS homologes DNA-Fragment von etwa 800 bp amplifiziert

(Abb. 34).

Abb. 34: Applikation von PCR-Ansätzen auf Agarosegele. Unter (a) ist dabei das etwa 300 bp-Fragment,

welches mit der Primer-Kombination Tib1 und Tib2 angereichert wurde, markiert. Dieses DNA-

Stück besaß zwar die korrekte Größe jedoch keinerlei NRPS-Ähnlichkeit. In (b) wurden unter

optimierten und Touch-Down- Bedingungen durchgeführte PCR-Ansätze aufgetragen.

M bezeichnet die Molekulargewichts- bzw. Basenpaar-Markerspur, S das Sepedonium - und U

das Ustilago-Template. Mit roten Pfeilen sind die NRPS-Fragmente, die durch die Primer-

Kombination NRPS_LowF und MTR (Sepedonium ) sowie 170Fneu und NRPS_HighR

(Ustilargo) amplifiziert worden, gekennzeichnet. In den Spuren 2–6 wurden Proben aus anderen

PCR-Ansätzen aufgetragen.

S 2 3 4 5 6 M U

108654321,5

0,5

1

(b)

330 bp

kb

(a)

M S

Ergebnisse

83

Die auf dem Sepedonium-Template erfolgreich eingesetzten degenerierten

Oligonukleotide, NRPS_LowF/MTR, zeigten auf dem Ustilago-Genom keine

Hybridisierung. Das Gleiche galt für den umgekehrten Fall.

Die nur schwach erscheinenden Ethidiumbromid-Banden wurden in einer anschließenden

PCR ankonzentriert und wie unter Punkt 5.9–5.11 beschrieben weiter bearbeitet.

6.2.4.3 Sequenzierung der NRPS-DNA-Fragmente und Sequenzvergleiche

Aus der Plasmid-DNA der präparierten Klone wurde das Insert mit Hilfe markierter

Nukleotidanaloga, die zum Kettenabruch führen, gemäß dem Sanger-Verfahren (1977)

erneut amplifiziert. Die Folge sind DNA-Bruchstücke, die jeweils spezifisch mit einem der

Basenanaloga enden. Diese wurden in einer anschließenden, denaturierenden

Elektrophorese in Form von planaren Gelen oder gelbeladenen Kapillaren getrennt und

analysiert.

Im BLAST-Search der NCBI-Datenbank (www.ncbi.nlm.nih.gov) wiesen sich alle

Sepedonium-PCR-Produkte (9) durch starke Homologien zu fungalen sowie bakteriellen

nichtribosomalen Peptidsynthetasen als NRPS-Sequenzen aus.

Mit Hilfe des CAP-ASSEMBLY-Programms (http://bio.ifom-firc.it/cgi-

bin/Assembly/capassemble.pl) wurden die sequenzierten Inserts untereinander

verglichen. Alle analysierten NRPS-PCR-Produkte wurden demnach von ein und

derselben Adenylierungsdomäne amplifiziert, denn sie weisen alle die gleiche Sequenz

auf.

Das CAP-ASSEMBLY-Programm erstellt aus allen Sequenzdaten eine Consensus-

Sequenz (Contig), welche daher der größten analysierten Sequenz entspricht. Diese

zeigte im BLAST-Search der NCBI-Datenbank größte Ähnlichkeit zu tex1, der einzig

sequenzierten Peptaibolsynthetase (Trichoderma virens). In Abb. 35 ist ein Alignment des

Sepedonium-Contigs und tex1 dargestellt. Mehrere, in Abb. 33 aufgeführte NRPS-Core-

Motive konnten auf der Sepedonium-Sequenz identifiziert werden (in Abb. 35

hervorgehoben).

Für die Übersetzung der Nukleotid- in Aminosäuresequenzen sowie für ein direktes

Alignment mit anderen NRPS, deren Sequenzen im Datennetz des Internets zugänglich

waren, wurde auf verschiedene Programme im Internet zurückgegriffen

(http://us.expasy.org/tools/dna.html; http://prodes.toulouse.inra.fr./multalin.html).

Auf der Basis des, vom Sepedonium-Genom amplifizierten, NRPS-Fragments erfolgte die

Konstruktion eines sog. perfekten Primers. Dieser entspricht einem Stück analysierter

DNA-Sequenz von optimaler Primer-Länge. In der PCR wird dieser mit hoher

Wahrscheinlichkeit an der komplementären Sequenz der Template-DNA hybridisieren.

Ergebnisse

84

Der Primer mit der Bezeichnung SepAfor (vgl. 4.5) wurde in Kombination mit dem

degenerierten Primer Cdom1R, abgeleitet von einem Core-Motiv der

Kondensationsdomäne (HHXXXDGXS), eingesetzt. Auf diese Weise konnte im PCR-

Experiment ein weiteres NRPS-Fragment mit einer Größe von knapp 1,2 kb amplifiziert

und analysiert werden. Dieses entspricht der N-terminalen Verlängerung des ersten

Sepedonium-NRPS-Fragments auf eine Größe von etwa 2 kb.

Im CAP-ASSEMBLY-Programm wurden die Fragmente zusammengefügt und

anschließend einem erneuten Alignment unterzogen. Zum Peptaibolsynthetase-

codierenden Gen tex1 wurde eine noch größerer Ähnlichkeit als zuvor festgestellt (47 %

Identität und 66 % positive Übereinstimmungen). Die amplifizierte Sepedonium-Sequenz

wies dabei die höchste Homologie zu den zwei Glutamin-aktivierenden Modulen der tex1-

codierten Synthetase auf.

(AF469045) nonribosomal peptide synthetase Tex1; NRPS [Hypocreavirens] Length = 20925 Score = 471 bits (1211), Expect = e-131 Identities = 235/491 (47%), Positives = 330/491 (66%), Gaps = 18/491 (3%)

Query: 1 KAGGAYVPLDPSHPADRRQALVKEIHADFMXXXXXXXXXXXXMTKNMVELSTEL---LSS 57 KAGGA++PLDP HP +RR+ALV+E+ A+ M +T MVE + EL LSSTex1: 6885 KAGGAFLPLDPLHPRNRREALVQEVGAEIMIVSPSSSVPCEGLTSIMVEFTIELLEQLSS 6944

Query: 58 AYESIDCIIPQSDKPTPACGAYVIFSSGSTGKPKGMLIDHAAICTAFLSWRKIFGMDEXX 117 Y++ I+P+++ P+ AYV+F+SGSTGKPKG+L++H+A T+ L I+ +Tex1: 6945 RYDAFQEILPKAE---PSNAAYVLFTSGSTGKPKGVLMEHSAFATSTLGHGGIYNLSPAS 7001

Query: 118 XXXXXXXXXXDASVLEMFLTLLTGGIVCLPDDSQRLQDAPGFIREARVNAALLTPSFART 177 D S+ E+F TL GG VC+P + +RLQ AP F+REARVN A+LTPSF RTTex1: 7002 RVFQFSNYIFDGSLGEIFTTLSFGGTVCVPSEDERLQKAPSFMREARVNTAMLTPSFVRT 7061

Query: 178 ISPQHVPSLRTLIVGGEALTRDIVETWHGNVKLINGYGPSEACVYAVIHELQSGRDSPLT 237 +P+ VPSLR L++GGE ++D++ETW G ++L+NGYGP+EAC YA H+ + DSP TTex1: 7062 FAPEQVPSLRLLVLGGEPSSKDLLETWCGRLRLVNGYGPAEACNYATTHDFKP-TDSPHT 7120

Query: 238 IGRSHVHNLWIVDPENHNRLAPIGCVGEILIQGYPLAQEYINDEERTKRSFLAGVDWFPN 297 IGR WIVDP ++N+L PIGC+GE++IQG LA+ YIND +RTK SF+ VD PTex1: 7121 IGRGFNSACWIVDPTDYNKLTPIGCIGELIIQGNALARGYINDADRTKNSFITNVDCLP- 7179

Query: 298 LKGKDYDPRRFYKTGDLARYNWDGTVEYVGRRDTQVKLHGQRIELAEIDYSIKRALPSAA 357 K P RFY TGDL RY DG +EY+GR+DTQVKL GQR+EL EI+Y +K++L +Tex1: 7180 -KSIISGPHRFYLTGDLVRYTPDGQLEYLGRKDTQVKLRGQRLELGEIEYHVKKSLANIE 7238

Query: 358 HVAVEVIRTRSQETLMAFLSFKDELKEGQGFSQKTDTIQPLLDMDSEVRATILELAKEVK 417 HVAV+V + +TL+AF+SFK+++ G +L ++ ++R + + + +KTex1: 7239 HVAVDVAHRETGDTLIAFVSFKEKMATTSG---------NILLLNDDLRVALATIMEHLK 7289

Query: 418 TMLPGYMVPTIWIPMRDMPFIASMKIDRKQLRSIGEALTPEEFTTFSLATRDRIAPTTEL 477 LPGYMVP+ +P+R+MPFI SMK+DRK+L ++ AL+ EE T+FSL RD IAP+T +Tex1: 7290 MSLPGYMVPSTILPVREMPFITSMKVDRKKLTAMAAALSLEEITSFSLVKRDYIAPSTPM 7349

Query: 478 ELELRSLWAQL 488 E L +LWAQ+Tex1: 7350 EKNLANLWAQV 7360

Abb. 35: Alignment des S. ampullosporum -NRPS-Fragments mit tex1 aus Trichoderma virens ;

hochkonservierte Aminosäure-Sequenz-Motive sind hervorgehoben

Ergebnisse

85

6.2.4.4 PCR mit degenerierten Ketoacylsynthase-Primern zur Detektion von

PKS-codierenden Genen

Neben NRPS-spezifischen Oligonukleotid-Primern kamen auch von konservierten

Motiven der Ketoacylsynthase-Domäne abgeleitete Oligonukleotide zum Einsatz.

Diese sollten eine Amplifizierung von Polyketidsynthase-Fragmenten auf dem S.

ampullosporum-Genom ermöglichen. Moffitt und Neilan publizierten 2001 den

erfolgreichen Einsatz von DKF und DKR, ein Primer-Set, welches von konservierten KS-

Regionen der Microcystin-Synthetase abgeleitet wurde. Auf den Genomen verschiedener

Bakterien-Stämme, wie Nodularia und Mycobacteria, gelang unter Anwendung von DKF

und DKR eine Amplifizierung PKS-codierender Fragmente.

Dem einleitenden Denaturierungsschritt mit 94°C für 2 min folgten 30 Zyklen mit jeweiliger

Denaturierung bei 94°C/5 s, Primer-Annealing bei 60°C/10 s und Extension bei 72°C/60 s.

Im letzten DNA-Synthetisierungsschritt wurde eine Extensionszeit von 7 min realisiert.

Diese PCR-Bedingungen entsprechen den von Moffitt und Neilan beschriebenen

Angaben. Alle PCR-Reagenzien kamen in den bereits in der Touch-Down-PCR

angewandten Konzentrationen zum Einsatz.

Ohne weitere Anpassung der Reaktionsbedingungen ließen sich vom S. ampullosporum-

Genom, DNA-Fragmente der erwarteten Größe amplifizieren (Abb. 36). Statt eines

„richtigen“ Amplifikats wiesen sich zwei mit einer Größe von etwa 700 und 800 bp als

PKS-codierende Sequenzen aus. Im 800 bp-Segment werden Introns vermutet.

Nach der Klonierung der PKS-Fragmente in E. coli, wurden die Inserts aus 23 Klonen

isoliert und sequenziert. 5 verschiedene KS-Motive konnten dabei festgestellt werden.

Abb.36: DNA-Agarose-Gele mit aufgetragenen PCR-Ansätzen, die 700 und 800 bp große PKS-

Amplifikate aus dem S. ampullosporum -Genom enthalten

1

0,5

1

0,5~700 bp~800 bp

~800 bp

Ergebnisse

86

6.3 Auswertung immunologischer Experimente

6.3.1 Herstellung monospezifischer Antikörper gegen Ampullosporin

Ampullosporin, ein Peptid mit einem Molekulargewicht von nur 1,6 kDa, ist zu klein, um

ausreichend antigen zu sein (Mindestgröße 5-10 kDa). Dieser Nachteil lässt sich durch

die Kopplung an ein geeignetes Trägermolekül überbrücken. Rinderserumalbumin (BSA)

bewirkt im infizierten Organismus Kaninchen eine Immunantwort, die sich gegen jegliche

Epitope des gesamten Antigens richten kann, so auch möglicherweise spezifisch gegen

die Struktur des Ampullosporins.

Die Kopplung der Zielsubstanz an BSA wurde wie unter 5.13.1/2 beschrieben,

durchgeführt. Durch einen Shift des Isoelektrischen Punktes von nativem BSA konnte die

erfolgreiche Komplexbildung von Ampullosporin und seiner Trägersubstanz bestätigt

werden.

Trotz der Injektion eines spezifischen Antigens im Immunisierungsprozess wird eine

Vielzahl verschiedener Antikörper gebildet. Man unterscheidet 5 Antikörperklassen (A, D,

E, G, M), wobei nur die Immunglobuline der Klasse G, die IgG’s, als Träger der

Immunantwort auf das Antigen relevant sind.

Die IgG’s übertreffen mit 75 % die im Plasma und Extrazellularraum vorkommenden

anderen Immunglobuline. Sie lassen sich aufgrund ihrer Affinität zu bakteriellen Fc-

Rezeptoren z. B. durch das Staphylokokken-Protein-A von den restlichen Antikörpern

separieren. Trotzdem liegt nach Elution der IgG-Komponente von einer ProteinA-Säule

ein heterogenes Gemisch von Antikörpern vor, von denen der größte Teil gegen das

hochmolekulare Trägereagenz BSA gerichtet ist.

Das eigentliche Zielantigen Ampullosporin induzierte maximal Spuren spezifischer

Immunglobuline. Umso effizienter müssen nachfolgende Separationsmethoden sein.

Diese Funktion kann nur eine Affinitätschromatographie unter Nutzung einer mit

Ampullosporin gekoppelten Affinitätssäule erfüllen. Im ersten Versuch wurde

Ampullosporin direkt an Bromcyansepharose gekoppelt. Das Eluat zeigte jedoch keine

Immunantwort.

Ein ähnliches Ergebnis erwies sich bei Kopplung eines Streptokinase-Ampullosporin-

Komplexes an Bromcyansepharose. Durch die Verwendung eines solchen

Ampullosporinkomplexes wurde die Menge an repräsentierten Antigen erhöht sowie eine

Verlängerung des „Antigenarms“ in den passierenden Immunglobulin-Mix erreicht.

Jedoch erst bei Einsatz von NHS-SepharoseTM 4B Fast Flow (Amersham Pharmacia) als

Trägermaterial für das selektionierende Ampullosporin konnte eine erfolgreiche

Immunbindung monospezifischer Antikörper nachgewiesen werden (Abb. 37).

Ergebnisse

87

Jeder Separationsschritt wurde, wie bereits der Antikörpertiter während der

Immunisierung, über ein Dot-Blot-Immunoassay überprüft. Ein Nachweis spezifischer

Antikörper gegen Ampullosporin gelang durch seine Kopplung an einen “inerten“

Proteinträger, d. h. ein Protein, gegen das kein Antigen bzw. Antikörper im zu testenden

Serum vorliegt und somit keine Immunantwort provoziert. Streptokinase erfüllte diesen

Zweck und wurde als Kopplungsagenz eingesetzt.

Wie in Abb. 37 ersichtlich, zeigten die Elutionsfraktionen 16 und 17 eine monospezifische

Immunantwort gegen Ampullosporin. Im Analogtest mit BSA wurde nur bei diesen

Fraktionen eine differente Reaktion beobachtet, was auf eine gelungene Separation

spezifischer Ampullosporin-IgG’s von BSA-Antikörpern schließen lässt. Die Zielfraktionen

wurden vereinigt (Gesamtmenge etwa 2,5 ml) und für weitere Verwendungszwecke bei

–20°C gelagert.

Abb. 37: Dot-Blot-Immunoassay der Fraktionen der Affinitätschromatographie mit NHS-SepharoseTM

gegen Ampullosporin, gekoppelt an Streptokinase, und BSA; Fraktionen 2-5 (Durchlauf und

erste Waschfraktion) und 15 (Elutionsfraktion 10) zeigen auf beiden Blots eine Immunreaktion,

Fraktion 16 und 17 (rote Pfeile) hingegen monospezifisch nur gegen Ampullosporin

Ampullosporin-Streptokinase-Komplex BSA

Ergebnisse

88

6.3.2 Immunelektronenmikroskopie zur Lokalisation von Ampullosporin

Die Herstellung monospezifischer Antikörper gegen Ampullosporin war

Grundvoraussetzung für die Detektion des Antigens, des Sekundärmetaboliten

Ampullosporin, in der produzierenden Zelle. Das Interesse bezog sich weiterhin auf die

relative Verteilung im Pellet, um möglicherweise Rückschlüsse auf

Produktbildungsbedingungen zu ziehen.

Dazu wurden Pellets aus Kulturen mit nachweislich starker Ampullosporinakkumulation

(etwa 27 mg/l) geerntet und wie unter 5.13.5 beschrieben fixiert, in geeignete Acrylharze

eingebettet sowie in Ultradünnschnitte von 50–70 nm Stärke zerlegt. 3 verschiedene

Varianten der Fixierung wurden durchgeführt, wobei nur die Paraformaldehyd(PFA)-

Glutardialdehyd(GA)-Fixierung nach Karnovsky (1965) eine akzeptable Balance zwischen

Struktur- und Antigenitätserhaltung gewährleistete. Dabei war darauf zu achten, dass mit

wachsendem Anteil an Glutardialdehyd eine stärkere Vernetzung der Proteine auftritt, was

einen Maskierungseffekt und so eine Abnahme der Antigenität zur Folge hat.

Für die nachfolgenden immuncytochemischen Untersuchungen fanden demnach nur mit

4 % PFA und 0,1 % GA fixierte Proben (Fixierungsvariante (b)) Einsatz. Die

Immundetektion erfolgte mit dem beschriebenen Post-Embedding-Immunogold-Labeling-

Verfahren unter Verwendung der monospezifischen Ampullosporin-IgG’s als

targetsuchende Primärantikörper (Wright & Rine, 1989).

In den Abbildungen 38-42 sind verschiedene elektronenmikroskopische Aufnahmen mit

Markierungen durch kolloidale Goldpartikel (Partikelgröße: 10 nm) dargestellt. Diese sind

an Anti-Kaninchen-IgG’s gekoppelt, die als Sekundärantikörper fungieren. Die

stattgefundenen Immunbindungen mit dem Target Ampullosporin werden dadurch

sichtbar.

Da in den Negativ-Kontrollen keine Immunreaktionen beobachtet wurden (Abb. 38), kann

von einer erfolgreichen Immundetektion von Ampullosporin ausgegangen werden.

Dabei kam es zwar im gesamten Cytoplasma zum Nachweis von Goldpartikeln, jedoch

vorrangig im membranassoziiertem Bereich. Erstaunlich war die relativ gleichmäßige

Verteilung im gesamten Pellet. Zwischen dem stark unterversorgtem, subapikalen Kern

und der mit Nährstoffen versorgten apikalen Pellet-Hülle waren keine quantitativen

Unterschiede feststellbar.

Ergebnisse

89

Abb. 38: Negativkontrolle (M=1 : 12000)

(keine Goldpartikel im gesamten

Präparat)

Abb. 39: Schnitt durch zwei benachbarte Zellen

(M=1 : 12000); Immunreaktionen im

membran- assoziierten Bereich

Abb. 40: Detail-Vergrößerung aus Abb. 25 (M=1 : 48000)

0,5 µm

Ergebnisse

90

Abb. 41: Immunreaktionen im membran-

assoziiertem Bereich (M=1 : 28000)

Abb. 42: Immunreaktionen in verschiedenen

Teilen des Cytoplasmas (M=1 : 12000)

6.3.3 Antikörper gegen die putativen ampullosporinbiosynthetischen Proteine

HMWP1 und HMWP2

Im Gegensatz zur Immunisierung mit Ampullosporin, wiesen HMWP1 und HMWP2 mit

ihrem hohen Molekulargewicht auch ohne die Kopplung an ein Trägermolekül ein großes

Potential an Antigenität auf. Da eine spezifische Aufreinigung der Proteine mit

herkömmlichen säulenchromatografischen Methoden keinen Erfolg hatte, wurde versucht

aus ungefärbten 5 %-SDS-PAGE-Gelen die ausgeschnittenen Proteinbanden mit Puffer

zu extrahieren. Auf diese Weise konnte nur wenig Protein wieder gewonnen werden. Da

eine Immunisierung mit einer zähflüssigen PAA-Gel-Suspension nicht möglich war, wurde

auf eine doppelte Gelfiltration (wiederholt aufgetragener Enzymextrakt) zurückgegriffen.

Die erste Immunisierung erfolgte mit einem Gesamtproteingehalt von 0,46 mg, die 2. mit

0,3 mg, jeweils gelöst in 3 ml Puffer A. Analog zur Ampullosporin-Immunisierung wurden

die Proteinlösungen jeweils mit 1 ml Adjuvanz-Lösung versetzt.

Nach 6 Wochen wurde die Inkubation beendet, da bereits starke Immunreaktionen gegen

HMWP2 und HMWP1 im Western-Blot festgestellt werden konnten. Es erfolgte keine

monospezifische Separation der Zielantikörper, da für eine Affinitätschromatographie

sauber isolierte Proteinfraktionen nicht zur Verfügung standen. So wurde das

Antikörpergemisch im Immunoassay mit anderen Peptidsynthetasen eingesetzt. Dabei

wurden Kreuzreaktionen, jedoch nicht nur spezifisch mit den NRPS-Banden, ermittelt.

Diskussion

91

7 Diskussion

Das Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung des Stammes Sepedonium ampullosporum

hinsichtlich seiner Kultivierung und Biosynthese des Sekundärmetaboliten Ampullosporin.

Ein nichtribosomaler Peptidsynthetase-Komplex wurde als biosynthetisches System zur

Bildung des aus 15 Aminosäuren bestehenden Peptids mit der nichtproteinogenen

α-Aminoisobuttersäure (α-Aib) im Molekül vermutet.

Um eine möglichst große Menge an Enzym zu erhalten, war es nötig, den

Produktbildungsprozess zu stimulieren und produzierendes Zellmaterial zu ernten. Dazu

wurden verschiedene Kultivierungsbedingungen getestet und ein

Submersfermentationsverfahren im Schüttelkolbenmaßstab mit reproduzierbaren

Produktbildungseigenschaften und gesteigerter Ausbeute etabliert.

Zwei hochmolekulare Proteine, HMWP1 (~1,5 MDa) und HMWP2 (~350 kDa) konnten

teilgereinigt und ankonzentriert werden. Diese scheinen aufgrund ihrer Größe, ihres

Nachweises, der Kreuzreaktion mit spezifischen Peptidsynthetase-Antikörpern, in den

Prozess der Ampullosporin-Biosynthese involviert zu sein.

Mit degenerierten Peptidsynthetase-Primern erfolgte ein genetischer Nachweis einer

NRPS-Sequenz auf dem Sepedonium-Genom. Dabei handelt es sich mit großer

Wahrscheinlichkeit um ein Fragment eines Ampullosporin-Synthetasegens.

Ampullosporin selbst wurde durch die Immuncytochemische Elektronenmikroskopie

mittels monospezifischer Antikörper in der Zelle lokalisiert und seine Verteilung im

produzierenden Pilzpellet festgestellt.

7.1 Auswertung von Kultivierungsexperimenten

Wie viele mycelbildende Organismen, ließ sich auch Sepedonium ampullosporum unter

den Bedingungen der Produktbildung zunächst nur sehr schwierig kultivieren (Schügerl &

Seidel, 1998). So konnte Ampullosporin eingangs ausschließlich aus emers angezogenen

Kulturen extrahiert werden.

Außerdem kam eine genetische Instabilität des Pilzes erschwerend hinzu. Aus

tiefgefrorenen Konserven reaktiviertes Material neigte zum Aufspalten in einen

nichtproduzierenden Klon mit nachweislichem Differenzierungsdefekt und zum anderen in

den gewöhnlichen, gelb bis orange ausdifferenzierenden Stamm mit der Fähigkeit,

Ampullosporin zu produzieren. Dies lässt bereits eine typische Sekundärmetabolitkinetik,

wie sie oft bei Antibiotikabiosynthesen anzutreffen ist, vermuten (Vining, 1986). Die

Bildung und Ausreifung von Sporen, Konidien und/oder Luftmycel als Ausdruck der

Diskussion

92

Zytodifferenzierung unterliegt häufig den gleichen Regulationsmechanismen wie die Idio-

bzw. Produktionsphase, sodass beide Prozesse assoziiert sein können (Luckner, 1989).

In diesem Falle ist von einer wachstumsentkoppelten Produktbildung auszugehen. Die

Differenzierung und der Eintritt in die stationäre Phase wird im allgemeinen durch das

Aufbrauchen wachstumsfördernder Substrate aus dem Medium eingeleitet (Katabolit-

Regulation) (Demain, 1974).

So wurde ein zweistufiges Kultivierungssystem entwickelt. Die erste Phase bestand in der

Anzucht potentiell produzierender Zellen über 2 Vorkulturen. In der zweiten bzw.

Produktionsphase fand aufgrund der Kultivierungsbedingungen kaum

Biomassewachstum, jedoch Differenzierung und, wie in Abb. 18-20 (Kap. 6.1.2) deutlich

zu erkennen ist, die Ampullosporinbiosynthese statt.

Welche Substratlimitationen nun den Prozess der Ampullosporinbildung beeinflussen,

sollte in verschiedenen Kultivierungsexperimenten festgestellt werden.

Kohlenstoff(C)-Repression

Abb. 17 (6.1.1) zeigt eine offensichtliche C-Katabolit-Repression, d.h. mit zunehmender

Zuckerkonzentration nimmt die Ampullosporinkonzentration proportional ab. Dies ist ein

häufig beobachteter Zusammenhang bei phasenabhängigen Biosynthesen, wie er auch

bei Streptomyces cattleya bei der Bildung von Melanin-, Cephamycin C- und Thienamycin

auftritt (Lilley et al., 1981).

Im Gegensatz dazu wirkte sich eine Änderung der Phosphatkonzentration fast in jedem

Falle negativ auf den Produktbildungsprozess aus.

Einfluß der Stickstoffversorgung

Eine Stickstofflimitation führte wie auch beispielsweise bei der Gramicidin S-Synthese, ein

Produkt der nichtribosomalen Peptidbiosynthese (Kleinkauf & Gevers, 1969; Kleinkauf &

von Döhren, 1995), zum Rückgang der Ampullosporinausbeute.

Geringe Konzentrationen an Pepton von 2 g/l ermöglichten jedoch im Gegensatz zu

höheren Peptoneinsätzen von 5 g/l einen frühen Produktionsstart. Ein Maximum der

Produktbildungsrate, kp, wurde bei geringer konzentrierten Peptonmedien bereits nach

ca. 60 h festgestellt, bei höheren Peptonkonzentrationen (5 g/l Pepton) erst nach 220 h.

Allerdings konnten im letzteren Falle die doppelten Ausbeuten, von max. 33 mg/l (statt 15

mg/l) erzielt werden.

Diskussion

93

Geht man von einer nichtribosomalen Peptid-, d. h. Ampullosporinbiosynthese an einer im

Sekundärmetabolismus synthetisierten, multifunktionellen Enzymmatritze aus, so sollte

ein Maximun an Ausbeute, die Aufrechterhaltung des physiologischen Milieus und der

gesicherte Nachschub an Substrataminosäuren gewährleisten.

Höhere Peptonkonzentrationen ermöglichen wohl eine länger anhaltende Tropo- bzw.

Wachstumsphase, sodass Differenzierungs- und daran gekoppelte sekundärmetabolische

Mechanismen zunächst inhibiert werden (Aharonowitz, 1980). In der anschließenden

Produktionsphase könnte jedoch dann ein höheres Angebot an Substrataminosäuren

bzw. an Enzym, durch eine erhöhte Biomasse-Konzentration (max. 50 % mehr), für die

gesteigerte Produktausbeute sorgen.

Das Prinzip der gerichteten Biosynthese (directed biosynthesis, z. B. Krasnoff & Gupta,

1991, Kobel & Traber, 1982) die auf der Zugabe von Produktvorstufen, z. B.

Substrataminosäuren im Falle der nichtribosomalen Peptidsynthese, beruht, wurde auch

in der Ampullosporin-Fermentation angewandt.

In der Gramicidin S–Bildung konnte beispielsweise durch den Zusatz von Phenylalanin

die Ausbeute um das Doppelte erhöht werden (Demain & Matteo, 1976), bei der Synthese

von Arphamenin aus Chromobacterium violaceum durch Tyrosin und Phenylalanin sogar

um das 3–10fache (Gauvreau & Waring, 1984). Ähnliche Resultate erzielte man bei einer

Fütterung von L-Valin zu Kulturen von Tolypocladium inflatum für die Stimulierung der

Cyclosporin-Biosynthese (Produktkonzentrationen um das 5fache erhöht, Kobel & Traber,

1982). Bei verschiedenen Trichoderma-Stämmen erwirkte ein Feed von α-Aib, Glutamin

oder Arginin eine Steigerung der Peptaibol-Ausbeute, jedoch vorwiegend die

Neusynthese α-Aib-reicherer Analoga (Leclerec et al., 1997).

All diese Effekte konnten auch in der Ampullosporin-Biosynthese zumindest in Ansätzen

nachgewiesen werden. Im Produktionsmedium wurden dabei als einzige Stickstoffquelle

die 5 Substrataminosäuren L-Tryptophan, L-Leucin, L-Alanin, α-Aib und L-Glutamin

eingesetzt. Wie in Abb. 20 (6.1.2) dargestellt, initiierte dies einen frühen Produktionsstart

nach etwa 24 bis 48 h, verbunden mit einer hohen Ausbeute nach ca. 100–120 h, die

30 mg/l aber nicht übertraf.

Ampullosporin A stellt im Vergleich zu allen anderen detektierten Analoga, das Aib-

reichste Ampullosporin dar und wurde fast ausschließlich nachgewiesen.

Die Aminosäureanalytik zeigte eine unterschiedliche Verstoffwechslung der eingesetzten

Aminosäuren. α-Aib, Glutamin und Leucin waren bereits nach 90 bis 120 h nicht mehr

nachzuweisen. Dagegen erfolgte eine Akkumulation von Alanin und Tryptophan. Durch

eine Optimierung der Substrataminosäuren bzgl. der eingesetzten Konzentration und

zeitlicher Verabreichung (Feeding) könnten Ausbeutesteigerungen möglich sein.

Diskussion

94

Andere Stickstoffquellen wurden in der Submerskultivierung von S. ampullosporum zur

Gewinnung von Ampullosporin nur mit geringem Erfolg eingesetzt (6.1.2, Abb. 19).

Erstaunlich war jedoch die sofortige Ausbeuteerhöhung bis um das 10fache bei

Supplementierung synthetischer Medien mit α-Aib. Diese Aminosäure scheint somit ein

limitierender Faktor im Ampullosporinbiosynthese-Prozess zu sein.

Einfluß von Scherkraft und Scale up

Neben substratrelevanten Parametern, sind physikalische Einflussgrößen, wie

Temperatur, pH-Wert, Sauerstoff-Versorgung und Scherbelastung maßgeblich am

Wachstums- und Produktbildungsprozess beteiligt. Die Standardtemperatur von 24°C

wurde ähnlich wie der pH-Wert, der bei der Kultivierung mit Pepton kaum Schwankungen

unterlag, nicht verändert oder korrigiert. Da nur im Schüttelkolben reproduzierbare

Produktbildungseigenschaften beobachtet werden konnten, wurde der Einfluss von

Scherbelastung, verbunden mit gesteigertem Sauerstoffeintrag durch Variation der

Schüttlerdrehzahl und Einsatz von Schikane-Kolben realisiert und untersucht.

Vor allem bei mycelbildenden Organismen können erhöhte Scherraten einen Rückgang

der Produktbildung verursachen (Mitard & Riba, 1988). Auch ein in unserem Falle mit

höheren Drehzahlen verbundener Sauerstoff-Mehreintrag, kann die Enzymaktivitäten zur

Bildung antibiotischer Wirkstoffe (Penicillin N, Zhon et al., 1992) oder weiterer

Sekundärmetabolite (Gramicin S, Kleinkauf & von Döhren, 1987) negativ beeinflussen.

Mit zunehmendem Energieeintrag, ließ sich ein Rückgang der Pelletierung, eine

Eintrübung der Kultur sowie eine starke Schaumbildung beobachten (Abb. 21, 6.1.3).

Parallel wurde eine Abnahme der Ampullosporinbildung festgestellt, was einen reziproken

Zusammenhang gegenüber dem Scherkrafteinfuss bestätigt.

Die Rolle des Sauerstoffs lässt sich mit diesem Experiment jedoch nicht klären. Zwar ist

von einem erhöhten Gaseintrag mit zunehmender Rotationsgeschwindigkeit und

Verwirbelung auszugehen, jedoch inhibiert die feste Schaumkrone einen effektiven

Gasaustausch. So ist es auch möglich, anstelle einer Sauerstoff-Mehrversorgung, eine

Sauerstofflimitation induziert zu haben. Diese kann den Produktbildungsprozess sowohl

negativ als auch positiv beeinflussen.

Letztere Annahme unterstützt die, für den Sekundärmetabolismus scheinbar notwendige

Pelletierung, denn in filamentösen Kulturen konnte Ampullosporin nicht nachgewiesen

werden.

Die Messung der Konzentrationsprofile des Gelöstsauerstoffs in den Pellets begaster

Kulturen von Acremonium chrysogenum (Wittler et al., 1986) ergab, dass nur maximal 0,2

mm der Pelletschale mit Sauerstoff versorgt werden. Im Kernbereich beläuft sich die

Diskussion

95

Konzentration gegen null. Die Pellets in einer produzierenden Sepedonium-Submerskultur

wiesen eine Größe von etwa 2–4 mm auf, sodass ein großer Teil sauerstoff- wie auch

substratunterversorgt war. Eine Lokalisation von Ampullosporin in der Zelle sowie die

Feststellung seiner Verteilung im Mycelpellet, könnte Argumente für oder gegen einen

begünstigenden Einfluss von Sauerstoff- und/oder Substratlimitationen liefern.

So verwundert es nicht, dass eine Übertragung in den Rührbioreaktor sehr schwierig zu

gestalten war. Für eine Minimierung des morphologischen Stresses erfolgte eine

Anpassung der Kultivierungsbedingungen. Schrägblattrührer und geringe Drehzahlen

gestatteten eine Pelleterhaltung und Ausdifferenzierung des Mycels (Bildung gelber bis

orangener Alleuriokonidien). Trotzdem konnte kaum Ampullosporin nachgewiesen werden

(bis max. 2 mg/l).

Wie bereits im Scherkraft-Experiment auf Schüttelkolbenbasis, wurde im Bioreaktor

bereits nach etwa 48 h eine zähe Schaumkrone festgestellt. Als Gasaustausch-Inhibitor

könnte diese zusätzlich eine Erhöhung des CO2-Levels und damit eine Säuerung des

Mediums hervorrufen. Tatsächlich zeigte sich im Bioreaktor wie auch im

schaumbeladenen Schikanekolben ein abweichendes pH-Profil mit geringeren und zum

Ende hin abnehmenden pH-Werten, die jedoch 5,0 nicht unterschritten.

Die unterschiedlichen Gasverhältnisse im Schüttelkolben und Submersbioreaktor könnten

demzufolge einen entscheidenden Einfluss auf die Ampullosporinbildung ausüben.

Andere Submersverfahren, wie die Kultivierung in der Blasensäule und im

Tauchstrahlfermenter ermöglichten gleichermaßen keinen Nachweis der Ampullosporin-

Biosynthese.

Mit dem Ziel der Maßstabsvergrößerung zur Bereitstellung größerer Mengen an

Ampullosporin erwies sich jedoch die Feststoff-Kultivierung auf Getreide als

ausgesprochen prädistiniert. Ähnliche Verfahren zur Herstellung einer Reihe anderer, vor

allem pilzlicher Sekundärmetabolite (z. B. Gibberellinsäure aus Gibberella fujikoroi?,

Bandelier et al., 1997, CyclosporinA-Gewinnung aus Feststofffermentationen, Robinson et

al., 2001) werden auch in der Literatur beschrieben.

Ein Mix teilweise aufgeschlossener Cerealien wurde im Feststoff-Bioreaktor der

PROPHYTA GmbH autoklaviert, mit einem Sporeninokulum beimpft und über etwa 2–3

Wochen bei 24°C inkubiert. Bis zu 400 mg Ampullosporin-Reinsubstanz pro kg

Trockensubstrat konnten auf diese Weise hergestellt werden. Aufgrund der relativ

einfachen Prozedur und preiswerter Einsatzstoffe ergibt sich ein äußerst kostengünstiges

Verfahren, das sich ohne down-stream-processing auf 155,- € pro Gramm Reinsubstanz

beläuft. Im Vergleich dazu werden für chemische Synthesen von Ampullosporin z. Z.

Aufwendungen von etwa 2500,- € angegeben (Reissmann, persönliche Mitteilung).

Diskussion

96

7.2 Lokalisation von Ampullosporin mittels monospezifischer Antikörper

Ein nachweislich starkes Versorgungsgefälle innerhalb der Mycelpellets (Wittler et al.,

1986, Freudenberg et al., 1996) lässt eine Auswirkung auf die Ampullosporinbiosynthese

und somit Unterschiede im Vorkommen des Sekundärmetaboliten innerhalb des Pellets

vermuten.

Sollte eine Anhäufung von Ampullosporin nur im apikalen, gut versorgtem

Wachstumsbereich (Pelletschale), nicht aber im unterversorgtem subapikalen

Kernbereich festzustellen sein, so würde man auf einen negativen Einfluss von Substrat-

und/oder Sauerstofflimitationen auf den Sekundärmetabolismus schließen.

Tatsächlich wurde, wie in Kapitel 6.3.2 ausführlich beschrieben, eine relativ gleichmäßige

Verteilung von Ampullosporin über das gesamte Pellet hinweg detektiert. In den Abb. 38-

42 sind elektronenmikroskopische Aufnahmen von Ultradünnschnitten eines in Acrylharz

eingebetteten, produzierenden Pellets dargestellt. Diese wurden mit selbst hergestellten

(5.13.1) und monospezifisch aufgereinigten (5.13.2) Antikörpern gegen Ampullosporin

markiert. Eine Visualisierung der Immunbindung erfolgte durch Antikaninchen-

Immunogold-Antikörper (Goldpartikel-Größe: 10 nm). Alle Negativkontrollen (siehe 5.13.5)

wiesen keine Goldpartikel auf, sodass von einer positiven Detektionsmethode

ausgegangen werden kann (Platner & Zingsheim, 1986).

Immunbindungsreaktionen wurden fast ausschließlich intrazellular, im gesamten

periplasmatischen Raum, jedoch vorrangig in Membrannähe festgestellt. Selbst in der

Pelletmitte, wo durch Zelllyse exkretiertes Material zu vermuten wäre, wurde ein ähnliches

Bild aufgenommen. Folglich könnte auf eine Ampullosporinsynthese sowohl im gut

versorgtem apikalen als auch im unterversorgtem Kernbereich des Pellets geschlossen

werden. Dies würde einen begünstigenden Einfluss von Sauerstoff- und/oder

Substratlimitationen auf den Sekundärmetabolismus bestätigen. Unter Berücksichtigung

des Substrat- und Metabolitentransports innerhalb von Hyphen ist es jedoch möglich,

dass eine Ampullosporin-Biosynthese nur im nährstoffversorgtem Pellet-Randbereich

stattfindet. Der Pelletkern stellt in diesem Falle nur ein Reservoir zur Speicherung von

Metaboliten dar.

Der Ort der Ampullosporinbiosynthese und der des Substanz-Nachweises stimmen nicht

zwangsläufig überein. Daher war es trotz einer erfolgreichen Ampullosporin-Detektion

nicht möglich, die Korrelation von Substrat- und/oder Sauerstofflimitation und

Ampullosporinbildung gesichert nachzuweisen bzw. zu dementieren.

Diskussion

97

7.3 Auswertung erster Untersuchungsergebnisse der Biosynthese von

Ampullosporin

Aus Ampullosporin-produzierendem Zellmaterial konnten zwei stark miteinander

assoziierte, hochmolekulare Proteine angereichert werden, deren Nachweis streng mit der

Produktbildung korrelierte (Abb. 26, 6.2.2.1).

Wie bereits erwähnt, wurde mindestens ein multifunktionelles Enzym als katalytische

Einheit für die nichtribosomale Peptid(Ampullosporin)-Biosynthese postuliert (Keating &

Walsh, 1999). Dieses besitzt einen modularen Aufbau, wobei jedes Modul für die

Erkennung, Bindung und Verknüpfung einer spezifischen Substrataminosäure mit den an

den anderen Modulen aktivierten Aminosäuren verantwortlich ist (Prinzip des

Thiotemplate-Mechanismus, Lipmann, 1973). Bei Annahme einer durchschnittlichen

Modulgröße von etwa 110 kDa (Schwarzer & Marahiel, 2001) wäre im Falle des 15

Aminosäuren-aktivierenden, Ampullosporin-synthetisierenden Enzyms, unter

Berücksichtigung von Linker- und eventuellen Intron-Bereichen, eine fast 2 MDa große

Synthetase (NRPS) zu erwarten.

Die CyclosporinA-Synthetase weist ein MW von knapp 1,7 MDa auf, obwohl das Produkt

nur aus 11 Aminosäuren besteht. Diese werden jedoch z. T. methyliert bzw. epimerisiert,

d. h. posttranslational an zusätzlichen Domänen auf der Synthetase modifiziert, was das

höhere MW erklärt (siehe 3.3; Stachelhaus & Marahiel, 1995).

Die Aufreinigung der Proteinrohextrakte erfolgte unter Anwendung üblicher

Proteintrennmethoden (5.2.4/ 6.2.2) mit dem Ziel, die für die Ampullosporin-Biosynthese

erwartungsgemäß exprimierten, hochmolekularen Proteine möglichst isoliert

anzureichern. Dabei wurde die Gelfiltration analog zur Separierung vieler anderer

Peptidsynthetasen (ACVS, Schwecke et al., 1992, Tyrocidin-S., Pfeifer et al., 1995,

GramicidinS-S., Kleinkauf et al., 1969, Cyclosporin-S., Zocher et al., 1986 u.a.) als erste

Feinreinigungsmethode eingesetzt.

Das Kontrollgel in Abb. 28 (6.2.2.2) beweist einen verhältnismäßig guten

Aufreinigungseffekt. Die Größe der zwei ankonzentrierten, hochmolekularen

Proteinbanden wurde mit 350 (HMWP2) und etwa 1500 kDa (HMWP1) im 5 %-SDS-PAA-

Gel durch den Vergleich ihres Laufverhaltens mit dem anderer hochmolekularer Proteine

bestimmt. Ein Protein wurde kurz unterhalb der Cyclosporin A-Synthetase (~1,7 MDa; aus

Tolypocladium inflatum), das andere gleichauf mit der Enniatin-Synthetase (350 kDa; aus

Fusarium oxysporum) detektiert.

Trotz Anwendung der hydrophoben Interaktions- (mit Phenylsepharose) und

Anionenaustauschchromatographie mit Q-Sepharose bzw. Mono-Q (vgl. 6.2.2.2) gelang

keine Trennung der Proteine, HMWP1 und HMWP2.

Diskussion

98

Als weitere stark assoziierte Komponente stellte sich ein kleineres, etwa 70 bis 80 kDa

großes Protein heraus (Abb. 28). Da dieses im Gegensatz zu HMWP2 und HMWP1 nicht

mit Peptidsynthetase-Antikörpern kreuzreagierte, könnte es sich um ein Protein in

Funktion eines Chaperons handeln, d. h. zur katalytischen Funktionalität des bzw. der

Synthetasen beitragendes Hilfsenzym (v.Döhren, persönliche Mitteilung). Die Größe von

etwa 70 kDa würde dieser Vermutung nicht widersprechen (MW der monomeren

Chaperone etwa 10 bis 60 kDa; hsp70 (Hitzeschock-Protein) mit 70 kDa).

Allerdings besteht auch die Möglichkeit, dass dieses Protein ein Bruchstück einer NRPS

darstellt. Mit etwa 70 kDa verkörpert es nur einen Teil eines Moduls, welches die

antikörperspezifische Region SGTTGXPKG auf der Adenylierungsdomäne nicht enthalten

könnte. Im Modell der Ampullosporinsynthetasen (Abb. 43) wird als zusätzlicher

Bestandteil ein Polyketidsynthase-Modul angenommen. Das ca. 70 kDa-große Protein

könnte demnach auch aus dieser katalytischen Einheit stammen. Beide Hypothesen

würden die ausbleibende Kreuzreaktion erklären.

7.3.1 HMWP1 und HMWP2 als potentielle Ampullosporin-Synthetasen

Ausgehend von den Größenverhälnissen von HMWP1 und HMWP2, ihrer strengen

Korrelation mit der Ampullosporinbildung sowie ihrer Kreuzreaktion mit hochspezifischen

Antikörpern (Etchegaray et al., 1998), wird das in Abb. 43 dargestellte

Ampullosporinsynthetase-Modell postuliert. Die Verteilung der katalytischen Einheiten

wurde dabei willkürlich gewählt. Demzufolge kann sowohl das kleinere als auch das

größere Protein die beginnenden Module tragen.

Im dargestellten Modell sind die ersten beiden aminosäureaktivierenden Module (für

Tryptophan und Alanin) auf dem 350-kDa-Protein nach einem vollständigen, ketoacyl-

inkorporierendem Modul lokalisiert. Dieses wird als acetylierende, katalytische Einheit

vermutet, denn Peptaibole weisen immer einen acetylierten N-Terminus auf.

Bestätigt wird die Annahme durch das von Wiest et al., im März, 2002 veröffentlichte,

vollständig sequenzierte erste Peptaibolsynthetase-codierende Gen, tex1 aus Hypocrea

(Trichoderma) virens. Es handelt sich dabei um die bisher größte bekannte, kontinuierlich

codierende Region (ORF) von ~63 kb zur Synthese eines 18 Aminosäure-

inkorporierenden NRPS-Systems (Wiest et al., 2002). Das intronlose Gen tex1 codiert für

ein Protein von 20.925 AS, was auf ein MW von etwa 2,3 MDa schließen lässt. Diese

bisher größte Peptid- und Peptaibolsynthetase wurde in Proteinextrakten des

Produzenten Hypocrea virens noch nicht nachgewiesen.

Diskussion

99

Abb

. 43:

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Diskussion

100

Die N-terminale Aminosäuren der tex1-codierten Synthetase zeigen starke Homologien zu

Ketoacylsynthase- sowie in weiterer Folge zu Acyl-Transferase-Domänen.

Ketosynthase-Domänen fungieren als Kondensationsdomänen (analog den NRPS-C-

Domänen). Ein hochkonserviertes Cystein sorgt für den Transfer des upstream-

lokalisierten Acylrestes zunächst auf die eigene Domäne (Bindung an der SH-Gruppe)

und katalysiert im Anschluss die Kondensation mit dem am nächsten ACP gekoppelten

Acyl-Monomer.

Ihre Position als Starter-Einheit ist ungewöhnlich. Normalerweise ist in Starterposition eine

Acyltransferase (AT-Domäne) analog der A-Domäne bei NRPS lokalisiert. Diese ist für die

Substratspezifität verantwortlich. Trotzdem gibt es verschiedene Beispiele, die belegen,

dass auch mit einer AT-Spezifizierung verschiedene CoA-Substrate inkorporiert werden

können (z. B. bei der Erythromycin-Synthase DEBS1, die neben Propionyl- und

Methylmalonyl-CoA in vitro auch Acetyl-, n-butyryl, und isobutyryl-CoA akzeptiert; Lau,

Cane & Khosla, 2000, Staunton & Weissman, 2001).

KS-Domänen in Starterposition zeichnen sich jedoch durch eine Substratspezifizierungs-

und Decarboxylierungs-Funktion aus. So berichtet Bisang et al. (1999) von KSQ-„Loader“-

Domänen von TypI–Polyketidsynthasen, mit einer Decarboxylierungs- (speziell:

Acetylierungs-) Funktion. DEBS1-Konstrukte, die mit einer KSQ-Starter-Einheit versehen

wurden, produzierten in vitro nur noch in Gegenwart von Malonyl-CoA das Triketid

Lacton 3 (Bisang et al., 1999). Keine weiteren Substrate wurden im Gegensatz zur

nativen DEBS1-Synthase (in vitro) mehr akzeptiert. Durch die KSQ-Domäne wurde

Malonyl-CoA zu Acetyl-CoA decarboxyliert, sodass spezifisch eine Übertragung von

Acetyl-CoA auf den nächsten, am Enzym aktivierten Acylrest erfolgte.

Eine KS-„Loader“-Domäne im Peptaibol-Synthetase-Cluster gewährt demzufolge die

Acetylierung der N-Termini von Peptaibolen, was ein Strukturmerkmal dieser Peptid-

Klasse darstellt.

In der Position des KS-spezifischen, hochkonservierten Cycteins werden bei den KS-

„Loader“-Domänen andere Aminosäuren detektiert. KS-Starter-Domänen, die im

Niddamycin-, Tylosin-, Monensin- sowie Pikromycin-Biosynthese-Cluster festgestellt

wurden (Bisang et al., 1999, Xue et al., 2000), weisen anstelle des Cysteins ein Glutamin

(daher KSQ-Domänen) auf.

Im Starter-Modul EpoA des Epothilon-Biosynthese-Clusters wurde in „Loader“-Position

eine KS-Einheit mit einem Tyrosin (KSY) statt dem KS-typischen Cystein ermittelt (Julien

et al., 2000). Diese KSY-Domäne zeigt wie der KSQ-Loader eine Substratspezifität für

Malonyl-CoA und eine Decarboxylierungsfunktion. Die gleichen Funktionen werden von

einer KSS-Loader-Domäne bei Pimaricin (Aparicio et al., 2000) beschrieben.

Diskussion

101

Die KS-Domäne in Starter-Position der Peptaibolsynthetase, welche von tex1 codiert wird,

zeigt erwartungsgemäß eine von KSC-Domänen abweichende Sequenz. Sie trägt anstelle

des konservierten Cysteins zwar kein Glutamin, Tyrosin oder Serin, aber ein Prolin (Abb.

44, rot markiert). Eine ähnliche Funktionalität wie die der beschriebenen „Loader“-

Domänen wird vermutet.

Mit Hilfe der publizierten PKS–Primer DKF und DKR, die von hochkonservierten PKS-

Regionen der Microcystin-Synthetase abgeleitet wurden (Moffitt & Neilan, 2001), gelang

auch eine Amplifizierung von 700–800 bp großen PKS-Sequenzen aus dem Sepedonium-

Genom.

Von 23 sequenzierten Klonen konnten insgesamt 5 verschiedene KS-Fragmente

detektiert werden (vgl. 6.2.4.4).

Die Sequenzanalyse ließ auf Typ I–Ketosynthase-Amplifikate schließen, die jedoch alle

das KS-spezifische, hochkonservierte Cystein im KS-Core-Motiv: TACSSSLVAL

aufwiesen (Kakavas et al., 1997) (Abb. 44).

Da Sepedonium ampullosporum neben Ampullosporin noch weitere Sekundärmetabolite,

wie z. B. das Polyketid Phomalacton produziert, ist es gut möglich, Bereiche aus anderen

PKS-Genclustern amplifiziert zu haben. Erst die Aufklärung flankierender DNA-Bereiche

wird zeigen, ob es sich bei einem der analysierten KS-Fragmente um ein Stück aus dem

Gencluster der Ampullosporinsynthetasen handelt und ob sich auch im Modell der

Ampullosporin-Biosynthese die KSQ-/KSS-/ KSY bzw. KSP-Theorie bestätigt.

200

Contig5 ....TGPGLT IDTACSSSAV AVHQACRAII SGECSTALAG GTHVITSPVW

Contig4 ....TGPSIT YDTACSSSAV AIHSACMAIR SGECSAALAG GVHLITSPAL

Niddamycin_Modul4 ....QGPALT VDTACSSSLV ALHLAVQSLR RGECDLALAG GTTVMATPTV

Gibberella_fujikuroi ....HGPSMT IDTACSSSLV AVHQAIQTLR SGESEVAIAA GANLILTPGM

Contig3 ....HGPSMT IDTACSSSMV CVNEAVQALR SGTSRVAVAC GTNLLLSPFM

Contig2 ....NLPSMT IRTACSSALV CLNEACAAIQ RGVCEGAIVA GCTLIMAPGT

Niddamycin_Modul1 ....RGPSLV VDTGQSSSLV AVALAVESLR GGTSGIALAG GVNLVLAEEG

Tex1 ADPFVSSSMV AKSSPSPSLV ALHEACCAVQ SGDARSAVVV GSSLVLDIED

Contig1 ....SGASVT IDTACSSGLV AVHLACQNLR LGDSKMETVS FHFHAMET..

Abb. 44: Alignment der analysierten KS-Fragmente (Contig 1-5) aus Sepedonium ampullosporum mit

anderen KSC-, einer KSQ- sowie einer KSP-Domäne aus der Peptaibolsynthetase, codiert von

tex1

Diskussion

102

Im Modell der Ampullosporin-Synthetasen erscheint nach 13 vollständigen NRPS-

Modulen, die auf HMWP1 lokalisiert wurden, als Schlussmodul eine Dehydrogenase (DH),

welche den C-Terminus zum Alkohol reduziert (Abb. 43).

Auch am Ende der tex1-codierten Peptaibolsynthetase wird eine solche katalytische

Einheit aufgrund von 51–88 % Homologie zur 3-β-Hydroxysteroid-DH bzw. zur Alkohol-

DH-Domäne (Wiest et al., 2002) postuliert.

Die Besonderheit der im Modell beschriebenen Ampullosporin-Synthetasen bestünde

darin, dass sich nicht alle katalytischen Funktionen auf ein und demselben Protein

befinden, im Gegensatz zu allen bisher beschriebenen eukaryontischen NRPS-Systemen

(Keller & Schauwecker, 2001; Keating & Walsh, 1999; Kleinkauf & von Döhren; 1990).

7.3.2 Auswertung der Aktivitätstests

Verschiedene Teilreaktionen der nichtribosomalen Peptidbiosynthese, wie die

Aminoacyladenylat-Bildung, Thioester-Beladung bis hin zur Biosynthese können in vitro

realisiert werden. Die Aktivität des bzw. der Enzyme wird durch die Anwendung radioaktiv

markierter Einsatzstoffe nachgewiesen.

Die meisten publizierten nichtribosomalen Peptidsynthetasen bestätigen diese Theorie,

obwohl die Reaktionsbedingungen in den einzelnen Tests meist individuell zu adaptieren

waren. So konnte bei der ACVS aus Streptomyces clavuligerus (Schwecke et al, 1992)

wie auch aus Flavobacterium (van Liempt, 1988) lange Zeit kein ATP/PPi-Austausch in

Abhängigkeit von α-Aminoadipinsäure beobachtet werden. Erst bei sehr hohen

Konzentrationen der Substrataminosäure erfolgte eine positive Reaktion. Der ermittelte

Km-Wert von 12 mM lag damit weit über dem üblichen Konzentrationsoptimum von etwa

1 mM (Schwecke, Dissertation, 1993). Ähnliche Probleme wurden bei sid2 aus Ustilago

maydis beschrieben, wo keine Aktivierung von Ornithin und Derivaten beobachtet werden

konnte (unveröffentlichte Daten, v. Döhren). Da der ATP/PPi-Austausch auf der Bildung

und dem Zerfall von Adenylaten bei ATP-Überschuss ohne anschließende Thiolierung

beruht, geben niedrige Umsätze ein Indiz für Adenylate mit erhöhter Stabilität (von Döhren

et al., 1997).

Im Falle der Ampullosporin-Synthetasen erfolgte trotz zahlreicher Variationen der

Reaktionsbedinungen in den einzelnen Tests (vergleiche 6.2.3.1) weder ein

reproduzierbarer ATP/PPi-Austausch noch konnten eine Thioesterbeladung oder gar in-

vitro-Biosynthese mit den Substrataminosäuren nachgewiesen werden. Der

Proteinrohextrakt wurde zur Volumenreduzierung vor der Gelfiltration bevorzugt

lyophilisiert. Diese Methode birgt jedoch die Gefahr, dass insbesondere sehr große

Proteine Konformationsänderungen unterliegen und somit inaktiv werden können

Diskussion

103

(Aktivitätsverluste bei z. B. ACVS-, Hyaluronatlyase-Konzentrierung mittels

Lyophilisierung, persönliche Mitteilungen). Demzufolge wurden nichtlyophilisierte

Fraktionen der Gelfiltration wie auch reine Rohextrakte getestet. Diese Bemühungen

blieben gleichfalls ohne Erfolg. Eine beim Lyophilisieren des unaufgeschlossenen Mycels

hervorgerufene Deaktivierung der Enzyme ist kaum anzunehmen, sodass auf diesen

Schritt nicht verzichtet wurde (Zocher et al., 1986; Weckwerth et al., 2000; Schwecke et

al., 1992).

Eine mögliche Erklärung für die gänzliche NRPS-in-vitro-Inaktivität könnte die Blockierung

der Enzyme mit fest gekoppelten/gebundenen Substrataminosäuren sein, infolge dessen

keine zusätzlich eingesetzten Aminosäuren, eine Acyladenylat- oder gar Thioesterbildung

hervorzurufen vermochten.

Weiterhin besteht nach wie vor die Aussicht, durch ein verändertes

Konzentrationsverhältnis der Einsatzstoffe (ATP, PPi, Metallionen, Enzym und

Substrataminosäuren) im ATP/PPi-Austausch eine Aktivität der Enzyme festzustellen.

7.3.3 Proteolyseverhalten der potentiellen Ampullosporin-Synthetasen

HMWP1 und HMWP2

Über die proteolytische Spaltung der hochmolekularen Zielproteine HMWP1 und HMWP2

wurden Bruchstücke angestrebt, deren N-terminale Aminosäuresequenz bestimmt und in

Nucleotidsequenz übersetzt werden sollte. Die auf diese Weise konstruierten

Oligonucleotidprimer würden aufgrund nur weniger bekannter codierender

S. ampullosporum-Sequenzen, die keinen realistischen Codon-Usage zulassen, nach wie

vor einen u. U. relativ hohen Degenerierungsgrad aufweisen. Allerdings handelt es sich in

diesem Falle um spezifische Fragmente aus HMWP1 bzw. HMWP2, sodass bei

erfolgreicher PCR, HMWP1- bzw. HMWP2-codierende DNA-Amplifikate angereichert

werden. Ihre mögliche Homologie zu NRPS-codierenden Sequenzen würden HMWP1

und HMWP2 als nichtribosomale Peptidsynthetasen bestätigen.

Aparicio zeigte 1994 die erfolgreiche Anwendung einer limitierten Proteolyse zur

Untersuchung der Domänstruktur der Polyketidsynthase DEBS1 aus dem erythromycin-

bildenden Stamm Saccharopolyspora erythraea. Die Lokalisation der Fragmente in der

Primärstruktur konnte durch N-terminale Sequenzanalyse beschrieben und die Funktion

einzelner Domänen durch Sequenzvergleiche festgestellt werden.

Wie unter Punkt 6.2.3.3 beschrieben, kamen in dieser Arbeit eine Reihe verschiedener

proteolytischer Enzyme wie auch Bromcyan als rein chemisches, spaltendes Agens zum

Einsatz. Die in der Literatur ausgewiesenen optimalen Proteolysebedingungen schienen

die Proteine HMWP1 und HMWP2 in keiner Weise anzugreifen. Selbst um vielfach

Diskussion

104

erhöhte Protease-Konzentrationen und Inkubationszeiten (Tab. 1) bewirkten trotz

zusätzlicher Anwendung denaturierender (entfaltender) Verbindungen, wie SDS und DTT

kaum eine Fragmentierung der Zielproteine.

Ein ähnliches Verhalten wurde auch von Avidin, einem tetrameren Protein, welches Biotin

mit hoher Affinität bindet, beschrieben (Ellison et al., 1995). Jedoch bei Zugabe des

starken Reduktionsmittels DTT zum Laufpuffer (2–10 mM) konnten Spaltprodukte im

SDS-PAA-Gel detektiert werden.

Dies spricht für eine starke Assoziation der Fragmente über S-S-Brücken, die auch bei

der Proteolyse von HMWP1 und HMWP2 zu beobachten war.

Die zu Anfang angestrebte domänenerhaltende Fragmentierung war durch die

denaturierenden Maßnahmen allerdings nicht mehr möglich. Im nativen Zustand stellen

die Linker-Regionen zwischen den einzelnen Domänen leichter zugängliche Targets für

proteolytische Enzyme dar. Unter denaturierten Bedingungen ist dieser Vorteil

aufgehoben. So konnte es nur noch Ziel sein, interne Fragmente zu gewinnen, deren N-

terminale Sequenz eine Detektion der Protein-codierenden Region auf dem S.

ampullosporum-Genom erwirken sollte.

Da säulenchromatografisch aufgereinigte Proteinextrakte neben HMWP1 und HMWP2

noch weitere Proteine enthielten, konnte nur über einen In-Gel-Verdau (6.2.3.3) dieser

Proteinbanden, die Untersuchung der richtigen Fragmente realisiert werden.

Es gelang die Ansequenzierung zweier Fragmente, wobei die prolinreiche Aminosäure-

Sequenz 1: PSPLPN stark für eine Linker-codierende Region in einem NRPS-Gen spricht

(Gokhale & Khosla, 2000). Linker sind nur wenige Aminosäuren-lange Abschnitte

innerhalb von Proteinen mit einer Multidomänen-Struktur. Sie stellen die

Verknüpfungsregionen zwischen den Domänen dar.

7.3.4 Screening nach NRPS-codierenden Genen

Die aus den AS-Sequenzen 1 und 2 abgeleitete Oligonucleotid-Primer Mio1 und Mio2

wurden zusammen mit von allgemeinen Core-Motiven der Adenylierungsdomäne

abgeleiteten Primern in einer Vielzahl von PCR-Ansätzen eingesetzt (6.2.4). Da die Lage

der internen Sequenzen (Mio1, Mio2) im Protein nicht bekannt war, erwies es sich als

äußerst schwierig, beim Auftreten mehrerer PCR-Produkte, potentielle NRPS-Fragmente

auszuwählen. Alle analysierten Klone wiesen keine NRPS-Homologien auf.

Wie unter Punkt 6.2.4.2 und 6.2.4.3 beschrieben ließ sich nur mit einem Primer-Paar:

NRPS_LowF und MTR2 ein NRPS-codierendes Fragment vom S. ampullosporum-Genom

amplifizieren. Dieses zeigte größte Homologien zum NRPS-Gen tex1 aus Trichoderma

Diskussion

105

virens (Abb. 36), die bisher einzige publizierte Peptaibolsynthetase-Gensequenz (Wiest et

al., 2002).

Demzufolge liegt die Vermutung sehr nah, mit dem vom S. ampullosporum-Genom

amplifizierten NRPS-Fragment, einen Teil des Peptaibolsynthetase-Clusters zur

Biosynthese von Ampullosporin erfasst zu haben.

Die Lokalität des NRPS-Fragments aus S. ampullosporum in einem Modul ist aufgrund

der konservierten Lage der Core-Sequenzen bekannt. Es enthält demnach alle

Aminosäuren, die zur Ausbildung der substratspezifischen „Tasche“ beitragen (Challis et

al., 2000, Stachelhaus et al., 1999).

In der Annahme, dass Domänen, die die gleiche Aminosäure aktivieren, homologe

Taschen aufweisen (Turgay & Marahiel, 1994), wurde ein Vergleich mit bekannten „AS-

Codes“ zur Aktivierung bestimmter Substrataminosäuren vorgenommen (vgl. 3.3). Doch

wie bereits die Arbeit von Wiest et al. verdeutlicht, variiert der „AS-Code“ für die

Aktivierung ein und der selben Substrataminosäure sogar innerhalb eines Proteins

teilweise bis zu fast 50 %. Demzufolge war es nicht überraschend zunächst keine

eindeutige Homologie des „AS-Codes“ des NRPS-Fragments aus S. ampullosporum zu

bisher bekannten AS-Codes festzustellen.

Wie unter 6.4.2.3 beschrieben, wurde die amplifizierte NRPS-Sequenz aus dem

Sepedonium-Genom bis zu dem konservierten C-Domänen-Motiv: HHXXXDGXS

verlängert. Dieses größere NRPS-Fragment von knapp 2 kb wies noch stärkere

Homologien zum tex1-Gen (Identities: statt 45 %; Positives: statt 63 %) auf. Als beste Hits

stellten sich die zwei Glutamin-aktivierenden Module heraus (die einzigen im tex1-

codierten Enzym). Demzufolge liegt die Schlussfolgerung nahe, ein Fragment eines

glutaminaktivierenden Moduls einer Ampullosporin-Synthetase amplifiziert zu haben.

Im Produktspektrum von Sepedonium ampullosporum tritt ein weiteres Peptaibol, das nur

aus 5 AS bestehende Peptaibolin (Hülsmann et al., 1998), auf, welches stammspezifisch

als Haupt- (Stamm: i1009, siehe 4.3) oder kaum detektierbare Minorkomponente (Stamm:

DSM 10602, siehe 4.3) nachzuweisen ist. Für dessen Synthese wird eine separate NRPS

vermutet.

Da im Peptaibolin kein Glutamin enthalten ist, wird das Sepedonium-NRPS-Fragment als

Fragment eines Ampullosporin-Synthetase-Gens weiterhin fundiert.

Ausblick

106

8 Ausblick

Die hier vorgestellten Arbeiten zur Biosynthese und biotechnologischen Gewinnung von

Ampullosporin bieten eine umfangreiche Basis für eine detaillierte Aufklärung des

Produktbildungsprozesses.

Ein Ziel besteht darin, das im Schüttelkolbenmaßstab etablierte

Submersfermentationsverfahren, in einen Bioreaktor mit definierten Bedingungen zu

überführen. Eine Maßstabsvergrößerung konnte zwar mit Erfolg in Form einer Feststoff-

Kultivierung umgesetzt werden. Diese Prozesse sind jedoch nur sehr beschränkt

regulierbar. Außerdem erschweren die extrahierten Begleitkomponenten aus den

komplexen Getreidesubstraten das down-stream-processing.

Der bisherige Versuch, durch die Einstellung physikalischer Einflussparameter im

Bioreaktor ähnliche Verhältnisse wie im Schüttelkolben zu realisieren und dadurch eine

Produktbildung zu erreichen, schlug fehl. Trotzdem ist es möglich, insbesondere durch die

Änderung der Gasverhältnisse im Submersbioreaktor, auch hier die Produktbiosynthese

zu stimulieren. Wie die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, wirkt sich eine getriggerte

(gerichtete) Biosynthese zugunsten der Ampullosporin-Bildung aus. Eine Optimierung der

Substrateinsätze könnte dabei zu weiteren Ausbeute-Steigerungen führen.

Stammspezifische Selektionsarbeiten wurden im Rahmen dieser Arbeit nicht

vorgenommen. Verschiedene Beispiele vor allem fungaler Sekundärmetabolit-

Produzenten belegen jedoch den Einsatz geeigneter Leistungs-Mutanten als

Voraussetzung für die Etablierung eines submersen Produktionsverfahrens (z. B.

CyclosporinA-Gewinnung, Traber et al., 1989, Kobel & Traber, 1982, Agahatos et al.

1987, Lee et al., 1997).

Für eine Verifizierung des Ampullosporinsynthetase-Modells ist zumindest die Gewinnung

von Teilsequenzen aus dem NRPS-Cluster von Sepedonium ampullosporum, aus dem

bisher nur ein Fragment einer Adenylierungsdomäne amplifiziert werden konnte,

notwendig. Dabei ist noch nicht zweifelsfrei nachgewiesen, ob es sich tatsächlich um ein

Fragment aus einem Ampullosporin-Biosynthese-Gen handelt.

In einem ersten Schritt zur Bestätigung oder Revidierung dieser Annahme ist es möglich,

auf der Grundlage des Genomic-Walking eine weitere Verlängerung des bereits

amplifizierten NRPS-Fragments in 3’- und 5’-Richtung zu erreichen (Weber et al., 2000).

Aufgrund der Domänen-Organisation: T-C-A-T, könnte auf diese Weise die Gensequenz

eines vollständigen Moduls analysiert werden.

Ausblick

107

Durch heterologe Expression dieses Moduls in einem geeigneten Expressionsorganismus

wäre es möglich, die Substratspezifität zu verifizieren. Die Annahme, es handle sich

aufgrund der starken Homologie zu den glutaminaktivierenden Modulen der tex1-

codierten Peptaibol-Synthetase um ein glutaminaktivierendes Modul einer Ampullosporin-

Synthetase, wäre mit dieser Methode nachweisbar. Eine Anzahl von Beispielen belegen

die erfolgreiche Anwendung dieser Methode bis hin zur Expression vollständiger und

funktionsfähiger nichtribosomaler Peptidsynthetasen und ihrer Produkte (Lu et al., 2002,

Trauger & Walsh, 1999, Tang et al., 2000, Schauwecker et al., 1998).

Im Zuge des Genomic-Walking ist die Primer-Paarung eines perfekten Sepedonium-

NRPS-Primers mit einem HMWP1-spezifischen Primer (Mio1F/R bzw. Mio2F/R) von

besonderem Interesse. Sollte sich mit dieser Konstellation ein NRPS-Fragment

amplifizieren lassen, wäre bereits die Zugehörigkeit des HMWP1-Proteins (eine

potentielle Ampullosporin-Synthetase) zu dem partiell sequenzierten NRPS-Gen, mit

größter Homologie zu einem Peptaibolsynthetase-Gen, bestätigt.

Eine Sequenzierung eines NRPS-Genclusters setzt zunächst die Etablierung einer Gen-

Bibliothek von Sepedonium ampullosporum voraus.

Die weitere Bearbeitung und Aufklärung des Ampullosporin-Synthetase-Genclusters wird

aufgrund der postulierten Aufteilung der katalytischen Funktionen auf 2 Synthetasen

gerechtfertigt. Diese Eigenschaft ist bisher nur von bakteriellen Systemen bekannt.

Der Linker-Region zwischen den beiden Synthetasen HMWP1 und HMWP2 kommt dabei

ein besonderes Interesse zu, da diese den funktionellen Anschluss der zweiten

Synthetase an die erste gewährt. Eine interessante Frage ist, inwieweit Homologien zu

analogen Linker-Regionen in bakteriellen Systemen bestehen.

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Danksagung

Bei allen, die auf das Zustandekommen dieser Arbeit durch ihre Unterstützung positiven

Einfluss genommen haben, möchte ich mich herzlich bedanken.

Mein Doktorvater, Prof. Wolfgang A. Knorre sei an erster Stelle genannt. Vor allem für

die Überlassung des Themas, der Gewährung eines weiten Bearbeitungsspielraums, der

Ermöglichung der Teilnahme an interessanten Tagungen und die kritische Durchsicht des

Manuskripts bin ich sehr dankbar.

Durch einen glücklichen Zufall machte ich Bekanntschaft mit der Arbeitsgruppe PD Dr.

Hans von Döhren, TU Berlin. Dies war der Beginn einer sehr fruchtbaren, interessanten

und für mich unheimlich förderlichen Zusammenarbeit, ohne die der wichtigste Teil dieser

Arbeit, die proteinchemischen und genetischen Ampullosporin-Biosynthese-

Untersuchungen, nicht möglich gewesen wäre. Auf Grundlage dieser Erkenntnisse war

die Involvierung in ein bestehendes EUROFUNG-Projekt möglich, was mir die

Gelegenheit zur Teilnahme verlieh.

Für die freundliche Aufnahme in seinem Labor, materielle und finanzielle Unterstützung

der Arbeiten und die hilfreichen, angenehmen nicht nur fachlichen Diskussionen und

Gespräche bin ich Hans von Döhren überaus dankbar, nicht zuletzt für die Übernahme

eines Gutachtens dieser Arbeit.

Doch mein besonderer Dank gilt seinem Verweis an Dr. Torsten Schwecke, AG von

Döhren, Berlin. Seiner geschätzten fachlichen Kompetenz, seinem unermüdlichen,

zielstrebigen Einsatz ist es zu verdanken, dass wir trotz des geringen Zeitlimits und der

„widerborstigen Protein-Eigenschaften“ sehr interessante biosynthetische Erkenntnisse

gewinnen konnten. Er weihte mich in die „Geheimnisse“ und „Tücken“ des genetischen

und proteinchemischen Arbeitens ein. In voller Missachtung von Pausen- oder

Ruhezeiten trug er entscheidend zum Gelingen der Arbeit bei. Außerordentlich dankbar

bin ich ihm für seine selbstverständliche Aufnahme meiner Person über mehrere Wochen

in Berlin, die vielen anregenden, tiefsinnigen, hilfreichen und humorvollen fachlichen wie

auch privaten Gespräche und Diskussionen. Vielen Dank auch für seine intensive und

kritische Durchsicht des Manuskripts.

Einem weiteren glücklichen Umstand verdanke ich die Zusammenarbeit mit Dr. Jörg-H.

Ozegowski. Er half mir entscheidend bei der Herstellung und monospezifischen

Aufreinigung der Ampullosporin-Antikörper. Des weiteren konnte ich stets auf seine

tatkräftige Unterstützung, seinen Ideenreichtum und langjährige Erfahrung bei allen

proteinchemischen Arbeiten und Fragestellungen zurückgreifen. Dafür bin ich ihm sehr

dankbar.

In diesem Zusammenhang möchte ich mich auch für die Immunisierungsarbeiten und

Serumgewinnung bei den Antikörperherstellungen, welche von der Arbeitsgruppe Dr.

Albert Härtl, hier besonders hervorzuheben Fr. Ursula Stöckel, unkompliziert und

prompt übernommen worden, ganz herzlich bedanken.

Mein riesiger Dank gilt auch Kathrin Buder, IMB, die alle

immunelektronenmikroskopischen Arbeiten durchgeführt hat. Mit ihrem umfangreichen

Know-How, reichen Schatz an Erfahrungen und ihrer überaus hilfsbereiten Art sorgte sie

für den erfolgreichen Einsatz der Antikörper.

Meinem Praktikanten und späteren HiWi, Fabian Axthelm, möchte ich an dieser Stelle

nochmals für sein Engagement, Eigeninitiative und Durchhaltevermögen, gerade bei den

tristen Kultivierungsarbeiten danken. Er sorgte für eine lustige Atmosphäre im und

außerhalb des Labors, was den Alltag stark aufwertete.

In diesem Zusammenhang möchte ich meiner lieben Labor-Kollegin Renate Presselt

einen ganz besonderen Dank für ihre Freundlich- und Liebenswürdigkeit, ihren Frohsinn

und ihrem stets motivierenden Einfluss aussprechen. Auch die herrlichen Gartenpartys

werde ich nicht vergessen.

Auch allen anderen Mitarbeitern des Naturstoff-Technikums danke ich für die offene,

freundliche Atmosphäre, die angenehmen oftmals sehr lustigen Frühstücksrunden und

geselligen Treffen auf der Bowlingbahn oder zu Wandertagen oder anderen Anlässen.

Martin Roth sei hier noch mal hervorzuheben, aufgrund seiner kritischen Durchsicht des

Manuskripts, verbunden mit hilfreichen Anmerkungen.

Kerstin Herold, Matthias Kronen und Beatrice Liedtke danke ich für die netten,

humorvollen und hilfreichen Stunden im und außerhalb des Labors.

Ina Löschmann und Denise Lenk, Abt. Infektionsbiologie, dem Sequenzierlabor der

Humbolt-Universität, Berlin sowie Fr. Häselbart, TU Berlin, danke ich für die

Durchführung der Gen- bzw. Aminosäure-Sequenzierarbeiten.

Meiner Familie danke ich nicht nur für die moralische Unterstützung in dieser Zeit.

Schließlich möchte ich meinem Mann, Thomas, meinen innigsten Dank vermitteln, dafür,

dass er stets zu mir gehalten hat, mich in Momenten der nahen Verzweiflung immer

wieder aufbaute, mich motivierte nicht aufzugeben, mich in jeder Hinsicht unterstützte, für

seine Liebe, sein Vertrauen, seine Geduld.

Ehrenwörtliche Erklärung:

Hiermit erkläre ich, dass mir die geltende Promotionsordnung der Fakultätbekannt ist, die vorliegende Arbeit selbständig, nur unter Verwendung derangegebenen Hilfsmittel und Literatur angefertigt und bisher keiner anderenHochschule als Dissertation oder Prüfungsarbeit vorgelegt wurde.

Kathrin Reiber, Jena, 04.11.2002

Lebenslauf

Persönliche Daten:

Name: Kathrin Reiber, geb. Bethge

Anschrift: Waldstr. 01; 07751 Isserstedt

Geboren: 24.02.1974 in Halle/ Dölau

Familienstand: verheiratet seit 1995

Schulausbildung

Sept. 1981 - 19990: 10 Jahre Allgemeinbildende PolytechnischeOberschule in Halle

Sept. 1990 – 1992: Abitur an der Erweiterten Oberschule bzw. Gymnasium„im Bildungszentrum“ in Halle-Neustadt

Hochschulstudium

Sept. 1992 - Sept. 1996: 4 Jahre „Biotechnologie“ mit Diplomabschluß an derFachhochschule „Anhalt“ in Köthen

April 1996 - Sept. 1996: Diplom am Robert Koch Institut in Wernigerode;Referenzzentrum für Staphylokokken bei Herrn Prof.Dr. W. WitteThema:„Untersuchungen zur Populationsstruktur undAntibiotikaresistenz von Staphylococcus aureus-Stämmen aus Infektionen in Gebietskrankenhäusern“

Praktika

Juli/August 1992: 2 Monate im Rahmen eines VorpraktikumsUmweltlabor Blösien (Merseburg; Sachsen Anhalt)

Sept. 1995 – Februar 1996 6 Monate im Rahmen des Praxissemesters im Institutfür Bioanalytik, Umwelt-Toxikologie undBiotechnologie, Halle – Lettin unter Anfertigung einerPraktikumsarbeit mit dem Thema:„Untersuchung von Dekontaminationsverfahrenmineralölkontaminierter Betonböden“

Berufliche Tätigkeiten

1.12.1996 - 28.02.1997: Wissenschaftlicher Mitarbeiter am Robert-Koch-Institutin Wernigerode

01.03.1997 - 31.12.1998: Wissenschaftlicher Mitarbeiter am HKI; AbteilungNaturstoffmikrobiologie bei Herrn Prof. Dr. W. Fleck

01.01.1999 - 31.03.2002: Doktorandin in der Abteilung Naturstofftechnikum amHKI unter der Betreuung von Prof. W.A. KnorreThema:Studien zur Biosynthese des fungalenSekundärmetaboliten Ampullosporin und Untersuchungder Kultivierungsbedingungen des ProduzentenSepedonium ampullosporum

Fremdsprachen Englisch

Studien zur Biosynthese des fungalen Sekundärmetaboliten ... · Peptaibol-Synthetase-codierenden...

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