Struktura mikrobne združbe
-
Upload
truongdung -
Category
Documents
-
view
232 -
download
1
Transcript of Struktura mikrobne združbe
1
Določanje strukture
mikrobne združbe
2
Določanje strukture mikrobne združbe
• mikroskopija
• gojenje (fiziološka različnost)
• FAME, PLFA
• imunološki testi
• tipizacije (fagotipizacija, ribotipizacija)
• analiza DNA in RNA (16S rRNA, PCR, ARDRA, DGGE, RFLP,
RAPD, DNA/RNA sonde, metagenomika)
• GFP
3
Nivoji ločljivosti za posamezne metode
družina rod vrsta sev
RFLP
ribotipizacija
DNA amplifikacija (AFLP, AP-PCR, rep-PCR, RAPD, ARDRA)
fagotipizacija
serologija
cimologija
elektroforeza vseh proteinov
DNA-DNA hibridizacija
4
Nivoji ločljivosti za posamezne metode
družina rod vrsta sev
%GC
poliamini, kinoni
FAME
celična stena
fiziološki testi (Biolog, API)
rRNA
DNA probe
DNA sekvence
5
Klasični fenotipski testi
Redukcijo nitratov do nitritov lahko določimo s SA+NEDA reagentom
Hidroliza arginina povzroči sproščanje amonija, ki ga lahko detektiramo s Neslerjevim reagentom
Hidroliza UREAe povzroči sproščanje amonija, ki sprememni pH in posledično barvo gojišča
6
Hitri testi za identifikacijo mikroorganizmov: Biolog
• v mikrotitersko ploščo dodamo različne vire ogljika in nacepimo neznane mikroorganizme (npr. okoljski vzorec)
• zaradi rasti mikroorganizmov pride do spremembe barve tetrazolijevih soli (meri aktivnost dehidrogenaz)
• odčitamo rezultate
• s pomočjo podatkovne baze identificiramo mikroorganizem
7
Hitri testi za identifikacijo mikroorganizmov: API
• celice nacepimo v liofilizirana
gojišča, ki smo jih predhodno
omočili
• rast mikroorganizmov se kaže
kot sprememba barve
• s pomočjo numeričnih oznak za
spremembo barve določimo
kodo, ki jo primerjamo z
znanimi vnosi v podatkovni bazi
8
Hitri testi za identifikacijo mikroorganizmov
Rapid ANA MicroRespRapid One
MicroID VITEK
BBL Crystal Riboprinter
9
Določanje strukture mikrobne združbe na osnovi makromolekul
- lipidi
- proteini
- nukleinske kisline
10
Molekularna identifikacija - FAME (Fatty Acid Methyl Esters)
V celicah je veliko različnih lipidov (> 100), ki so zastopani v različnih
deležih. Za analizo lipide izoliramo, modificiramo do metilnih estrov,
analiziramo s plinsko kromatografijo. Kromatogrami lipidnih profilov
dajejo značilne vzorce, ki jih med seboj primerjamo.
Pri analizi uvrstimo lipide v več skupin:
- nasičene maščobne kisline
- nenasičene maščobne kisline
- ciklopropanske maščobne kisline
- razvejane maščobne kisline
- hidroksilne maščobne kisline
11
Zakaj uporabljamo maščobne kisline (predvsem fosfolipide - PLFA)?
• so esencialne komponente vsake žive celice in imajo uporabne
biomarkerje, ker so strukturno zelo raznolika skupina molekul z
visoko biološko specifičnostjo
• lahko jih uporabljamo za oceno aktivne biomase, zato ker je:
- fosfatna skupina je tako po propadu organizma porabljena
- običajno fosfolipidov ne najdemo v rezervnih snoveh mikrobov
- običajno so zastopani v dokaj konstantnih deležih v biomasi
12
PLFA ločljivost
• primerjava celotnega PLFA vzorca z multivariantno statistiko
pokaže na spremembe v mikrobni združbi
• sprememba določene PLFA komponente je indikator za
spremembo specifične skupine mikrorganizmov
13
Procedura
• ekstrakcija
• separacija lipidov
• saponifikacija/metilacija
• GC analiza
• podatkovna analiza in intepretacija
14
Ekstrakcija maščobnih kislin iz tal
– 1-25 g tal (zračno suha tla)
– kloroform : metanol : fosfatni pufer (2:1:0.8)
– centrifuga, filtracija in odstranjevanje kloroforma
– sušenje z N2
15
Separacija lipidov
• uporaba silicijeve kolone. Lipide ločimo z naslednjimi eluenti:
- nevtralne lipide s kloroformom
- glikolipide z acetonom
- fosfolipide z metanolom
• metilacija z uporaba 2M KOH raztopljenega v MeOH
• uporaba GC-FID
– uporaba standardov za identifikacijo kromatografskih pikov
16
Primer kromatograma identifikacija s standardi
min14 16 18 20 22 24 26 28 30
pA
20
40
60
80
100
120
FID1 A, (C:\DOCUME~1\JENN\MYDOCU~1\RESEARCH\GC-FID~1\08120312.D)
15:0i
16:0
19:0 cy
18:2 w6,9 18:1 w9c
18:1 w7c
15:0a
14:0
16:0 10 Me
12.
990
13.
161
13.
387
13.
618
13.
726
13.
899 14.
131
14.
480
14.
739
15.
009
15.
174
15.
418
15.
581
15.
677
15.
823
15.
926 16.
146
16.
492
16.
884
17.
003
17.
292
17.
399
17.
622
17.
736
17.
910
18.
127
18.
318
18.
569
18.
951
19.
093
19.
192
19.
317
19.
483 1
9.62
3 1
9.76
4 1
9.90
1 2
0.00
6 2
0.07
6 2
0.37
2 2
0.46
8 2
0.76
8 2
1.06
2 2
1.18
5 2
1.31
1 2
1.41
6 2
1.51
3 2
1.67
1 21.
838
21.
972
22.
365
22.
535
22.
804
22.
933
23.
141
23.
308
23.
408
23.
590
23.
686
23.
892
24.
049
24.
199
24.
321
24.
423
24.
496
24.
603
24.
872
25.
151
25.
289
25.
545
25.
751
25.
975
26.
171
26.
272
26.
361
26.
480
26.
689
26.
913
27.
064
27.
247
27.
359
27.
465
27.
594
27.
895
28.
052
28.
228
28.
490
28.
659
28.
837
28.
941
29.
035
29.
131
29.
376
29.
609
29.
863
18:0 10 Me
17
Nomenklatura maščobnih kislin
• Maščobne kisline označujemo tako,
da najprej označimo skupno število ogljikovih atomov,
nato število dvojnih vezi,
mesto formiranja zadnje dvojne vezi gledano od metilne skupine
molekule označimo z ω,
• v primeru, ko gledamo od karboksilnega dela molekule označimo
mesto formiranja zadnje dvojne vezi z ∆.
18
Primer nomenklature maščobnih kislin
ime: 5,8,11,14,17-eicosapentaenojska kislina trivialno ime: EPAkratka oznaka: 20:5ω3
pomeni, da gre za 20-C maščobno kislino s 5 dvojnimi vezmi,
zadnja se začenja na poziciji 3 od metilnega dela,
ostale dvojne vezi so na mestih 5, 8, 11, 14, in 17
19
Nomenklatura maščobnih kislin
• predpona i in a označujeta izo in anzeizo maščobno kislino,
anteizo je razvejanje na tretjem ogljikovem atomu od konca verige
• -cy pomeni ciklopropansko maščobno kislino
• -Me pomeni metilno razvejanje iz karboksilnega dela verige
• okrajšave t pomeni trans konfiuracijo dvojne vezi
• okrajšave c pomeni cis konfiuracijo dvojne vezi
20
Primer nomenklature maščobnih kislin
• kratka oznaka: i16:0
maščobna kislina ima metilno skupino na prvem ogljikovem
atomu iz w konca
• kratka oznaka: 10Me16:0
maščobna kislina ima metilno razvejanje na 10 ogljikovem
atomu iz karboksilnega konca
21
Interpretacija
maščobne kisline mikrobna skupina
15:0i, 17:0i, 15:0a, G pozitivne bakterije
i15:0, i17:0, cy17:0, cy19:0 anaerobne G negativne bakterije
16:1ω8c, 16:1ω5c, 16:1ω8t, 18:1ω8c, 18:1ω8t, 18:1ω6c
metanotrofi
20:5, 22:6 barofili/psihrofili
cy17:0, cy19:0, 18:1∆11c G negativne bakterije
10 Me18:0, 10 Me17:0, 10 Me16:0 aktinomicete
18:2ω6,9, 18:1ω9c, 18:3ω6, 18:3ω3 glive
20:3ω6, 20:4ω6 protozoji
20:5ω3, 18:3ω3 alge
10Me16:0, i17:1ω7, i17:1ω6 sulfat reducirajoče bakterije
16:1ω5 arbuskularne mikorizne glive
18:2ω6 cijanobakterije
22
Interpretacija
• vsoto naslednjih maščobnih kislin lahko uporabimo za določanje
bakterijske biomase: i15:0, a15:0, i16:0, 16:1ω9, 16:1ω7t, i17:0,
a17:0, 17:0, cy17:0, 18:1ω7 in cy19:0
• naslednji dve maščobni kislini lahko uporabimo za določanje
biomase gliv 18:2ω6,9 in 18:1ω9c
• ciklopropilne maščobne kisline so značilne za stacionarno fazo, do
njihove produkcije pride pri stresnih pogojih (prekurzorja za cy17:0
in cy19:0 sta:16:1ω7c in 18:1ω7c)
23
Prednosti PLFA
• omogoča bolj natančno določanje žive biomase kot fumigacijske metode
• lahko detektiramo mikrobno strukturo v naravnih vzorcih
brez predhodnega gojenja
• uporabno za detekcijo sprememb strukture v različnih talnih,
vodnih in vzorcih iz sedimenta
• relativno enostavna omogoča veliko število vzorcev
24
Pomankljivosti PLFA
• ne omogoča določanje vrstne sestave
• arhej ne moremo določiti natančno
• ne more določiti maščobnih kislin v zelo nizkih koncentracijah,
ki pa lahko kljub temu predstavljajo pomembne skupine
• PLFA profilom ne moremo direktno vezati na funkcijo ekosistema
• podatkovna baza je vezana na maščobne profile
pridobljene iz bakterij v čistih kulturah
25
Proteinski vzorci
• elektroforetska primerjava proteinov neznanega izolata z
elektroforetskim profilom znanega mikroorganizma
• uporaba pulzne elektroforeze ali 2D elektroforeze
• za kompleksne okoljske vzorce manj primerno, ker zahteva gojitev
mikroorganizmov v čisti kulturi
26
Rezultati analize skupnih proteinov različnih sevov Lactococcusov in Lactobacillov
27
2D Gel elektroforeza - princip
SDSPAGE
IEF
pH
28
Identifikacija proteinov z MS in 2D gel
29
Mikrosekvenciranje
elektro-blotting
• generira sekvenco z N-terminalnega dela• uporabna za nizke koncentracije proteina (5-50 ng)• lahko preberemo do 20 aminokislin, kar omogoča ID proteinov• relativno počasna
30
Proteinski čipi (Protein Arrays)
razporeditev protiteles razporeditev antigenov razporediterv ligandov
Detekcija z: MS, fluorescenco, SPR, electrokemijsko, radioaktivnost
31
“Funkcionalni” proteinski čipi
Niklova prevleka
32
Imunološke metode za identifikacijo
Uporabljamo označeno protitelo, ki ga vežemo na mikrobni antigen.
Specifično vezavo protitelesa na antigen določimo z:
• imunofluorescenco
• radioimunskimi testi (RIA - radioimumunoassay)
• encimsko imunsko reakcijo (ELISA - Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
• encimsko reakcijo kombinirano s fluorescenco (ELFA - Enzyme Linked
Fluorescence Assay)
• aglutinacijo
• imunomagnetno precipitacijo (IMS - Immuno Magnetic Separation)
33
ELISA
protein
E
S P
ELISA
protitelo z encimom
34
Metode za določanje strukture mikrobne družbe na
osnovi nukleinskih kislin
• sekvenciranje
• DNA – DNA hibridizacije
• PCR
• kloniranje
• metagenomika
35
Molekularne metodevzorec
ekstrakt DNA
PCR in kloniranje
knjižnica klonovsekvenciranje in ID
pregled klonov
individualni kloni
T-RFLP
PCR
restrikcija
profil združbe
dizajn in izbira ustreznih prob
FISH
mikroskopija
36
Molekularna identifikacija: sekvenciranje DNA
C G A C T C G A T T C 5’ DNA, ki jo sekvenciramo3’
radioaktivno označen začetnik
-AG-AGCTAAG
-A-AGCTA-AGCTAA
-AGCT -AGCddGTP ddATP ddTTP ddCTP
G A T C
avtomatsko sekvenciranje s fluorescenčno označenimi dideoksi nukleotidi
7654321
37
Molekularna identifikacija: GC deleži
Organizmi s podobnimi
fenotipi imajo podobna GC
razmerja. Po drugi strani
pa imajo organizmi lahko
podobne GC deleže,
vendar so taksonomsko in
filogenetsko različni.
38
Hibridizacija DNA
vrsta A vrsta B vrsta C
T T T C C G A AA G C A A T G C T C G T T A C G
A G T T T C A AT C
GT T A C G
Tarčna DNA in neznana DNA sta delno homologni in zato delno hibridizirata.
T C G T T A C G
Tarčna DNA in nznana DNA sta nehomologni in ne hibridizirata.
Tarčna DNA in označena neznana DNA sta homologni in zato dobro hibridizirata.
39
Molekularna identifikacija - restrikcijska analiza
vrsta A vrsta BDNADNA
Restrikcijsko analizo lahko naredimo za celoten genom (RFLP
makrorestrikcijska analiza), ali pa za izbrani gen (npr. ribotipizacija).
Predhodno lahko željeni del DNA namnožimo s PCR in tako dobimo
AFLP profil.
40
RAPD - PCR, (Random Amplification of Polymorphic DNA)
• uporabljamo za identifikacijo specifične variabilnosti med vrstami
• izbrane začetne oligonukleotide za amplifikacijo kromosomske DNA
uporabljamo pri manj strogih pogojih PCR namnoževanja (npr. nižje
temperature), kar omogoča vezavo tudi na nesorodno DNA
• zaradi variabilnosti DNA različnih organizmov
pride do različnega števila in velikosti PCR pomnožkov,
kar omogoča identifikacijo
41
AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)
• s PCR selektivno pomnožimo restrikcijske fragmente,
ki smo jih predhodno dobili z restrikcijskimi endonukleazami
• PCR pomnožke ločimo z gelsko elektroforezo
• AFLP ne zahteva predhodnega poznavanja specifičnih zaporedij DNA
in poteka z uporabo dveh specifičnih oligonukleotidnih začetnikov
• metoda je predvsem uporabna za tipizacijo
in preiskavo DNA različnega izvora
42
SSCP (single stranded conformationalpolymorphysm)
• PCR pomnožke segrejemo na 95 oC in jih nato zelo hitro ohladimo
• enovrvična DNA se zvije v 3D strukturo, ki je odvisna od baznih parov
• različne DNA imajo različne 3D strukture,
ki različno hitro potujejo na elektroforezi
• pri homolognih DNA fragmentih dobimo eno liso pri heterolognih
pa dve (občutljivost za mutacije, npr. insercije, delecije)
43
Heterodupleks analiza
• dva PCR pomnožka sta zmešana v enekih deležih in denaturirana
pri 95 oC
• mešanica se nato počasi ohladi
• med ohlajanjem pride do renaturacije in tvorbe heterodupleksov
• vsaka napaka pri nalaganju se bo poznala kot različna 3D
struktura in posledično različna mobilnost na elektroforezi
44
Molekularna identifikacija: ribotipizacija
• polimorfizem na celotnem genomu se velikokrat kaže tudi na
posameznih genih
• geni za ribosomsko RNA so običajno evolucijsko stabilni
in imajo zaradi tega bolj enostaven restrikcijski vzorec
• naredimo RFLP polimorfizem genov za rRNA
• po encimskem razrezu DNA identificiramo rDNA fragmente s Southeren
blot analizo
• primerjamo restrikcijske vzorce različnih organizmov
45
Molekularna identifikacija - FISH z ribosomsko tarčo
mikroskopija
Vezava označene probe naribosome tarčnega organizma
A T T C G A C
46
Sestava bakterijskega ribosoma
23S rRNA + 5S rRNA
50S
30S
16S rRNA
23S rRNA ~ 2900 nukleotidov
5S rRNA ~ 120 nukleotidov
16S rRNA ~ 1500 nukleotidov
47
Bakterijski ribosom
30S50S proteini
rRNA
48
16S rRNA
49
Določanje 16S rRNA sekvence
mikroorganizem
izolirana DNA
16S rRNA gen
PCRpomnoževanje
DNA
Sekvenciranje 16S rRNAPCR pomnožka
50
ekstrakcija DNA
Konstrukcija klonske knjižnice iz rDNA
kloniranje pomnoženih genov v E. coli
pomnožitev DNA s PCR
ekstrakcija individualnih DNA fragmentov in elektroforeza
sekvenciranje in identifikacija
.. ..
.
..
. ..gojitev E.coli, prenos na titrske plošče
51
Ločevanje PCR pomnožkov
Če želimo ločit PCR pomnožke 16S rRNA,
potem je navadna gelska elektroforeza nezadostna,
ker so vsi pomnožki približno enako veliki.
Alternative:
• ARDRA
• TRFLP
• ITS-RFLP
• DGGE
• TGGE
52
ARDRA-PCR 16S rDNA (amplified ribosomal DNA restriction analysis) Staphilococcov
53
Terminal Restriction Fragment Length
Polymorphism (T-RFLP)
Fluorescenčni primer
mesto, kjer reže encim
profil združbe
C A B E Dvrsta A
vrsta B
vrsta C
vrsta D
vrsta E
54
DGGE (denaturating gradient gel electrophoresis)
• majhni DNA fragmenti potujejo pri elektroforezi skozi
poliakrilamidni gel v gradientu formamida ali urea
• DNA fragmenti se pri kritični koncentraciji denaturanta raztopijo
(iz dvojne vijačnice nastane enojna) pri tem se jim spremeni
struktura in se prenehajo gibati v električnem polju
• GC spona na enem koncu prepreči popolno razpiranje vijačnic
• zaradi razlik v sestavi DNA dobimo raztapljanje pri različnih
koncentracijah denaturanta
55
TGGE (temperature gradient gel electrophoresis)
• majhni DNA fragmenti potujejo pri elektroforezi skozi
poliakrilamidni gel v temperaturnem gradientu
• DNA fragmenti se pri kritični temperaturi raztopijo pri tem se jim
spremeni struktura in se prenehajo gibati v električnem polju
• GC spona na enem koncu prepreči popolno razpiranje vijačnic
• zaradi razlik v sestavi DNA dobimo raztapljanje pri različnih
temperaturah
• lahko uporabljamo tudi za analizo RNA in proteinov
56
ITS-RFLP (Intergenic spacer-restriction fragment
length polymorphism)
ITS2ITS1
začetni oligonukleotid v 18S
18S 5.8S 28S
začetni oligonukleotid v 28S
5.8S
PCR produkt
57
Metode za nukleinske kislinevzorec
ekstrakt DNA
PCR in kloniranje
knjižnica klonov
pregled klonov
sekvenciranje in IDdizajn prajmerjev za vrsto ali gen
Q-PCR
kventifikacija vrste ali gena
reverzna transkripcijaDNA
ekstrakt mRNA
kvantifikacija genske ekspresije
58
Kvantitativni real-time PCR
3’5’
5’3’
R Q
3’5’
5’3’
3’5’
5’3’
3’5’
5’3’
polimerizacija
RQ
ločevanje fluorescenčne probe
QRpolimerizacija komnčana
QRcepitev fluorescenčne probe
S cepitvijo fluorescenčne
probe se sprosti quenching
fluorofora, kar omogoča
povečan kvantni prinos
fluorescence.
59
DNA mikročipi za določanje strukture mikrobne združbe
• mikročip je sestavljen iz več različnih celotnih genomskih DNA
iz dobro okrakteriziranih referenčnih organizmov
ali pa iz okoljskih vzorcev
• dodamo izolirano DNA in ugotavljamo hibridizacijo z znanimi
vrstami, kar nam omogoča določitev strukture mikrobne združbe
• uporabni za nativne vzorce, za sledenje sprememb v združbi zaradi
polucije ali druge fizikalno-kemijske spremembe
60
2003 Metagenomika
• vzamemo okoljski vzorec
• pridobimo celotno DNA
• sekvenciramo DNA (shot gun tehnika)
• z matematičnimi algoritmi obdelamo dobljene sekvence
• preverimo kateri genomi in kateri geni so prisotni v vzorcu
61
Diverziteta ali podobnost mikroorganizmov, ki tvorijo mikrobno združbo
Katerakoli metoda,
ki nam omogoča kvantitativno razlikovanje med mikroorganizmi
je uporabna za izgradnjo statističnih sorodstvenih dreves
(npr. PLFA, 16s rRNA).
62
Evolucijske razdalje
Povprečno število različnih nukleotidov na 100 nukleotidov.
7.107.397.557.51E
3.042.982.98D
1.571.51C
1.45B
DCBA E
A 0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
A in B sta si najbližja, zato ju združimo A B
63
Evolucijske razlike
Povprečno število različnih nukleotidov na 100 nukleotidov.
7.107.397.53E
3.042.98D
1.54C
DCA-B
Primer izračuna razdalja od klade (A-B) do C = (A-C+B-C)/2 = (1.51+1.57)/2 = 1.54
Od vseh klonov je najbližje A-B kladi klon CA BC
64
Evolucijske razlike
Število različnih nukleotidov na 100 mest.
7.107.46E
3.00D
DA-B-C
A BCDEPrimer izračuna razdalja od klade (A-B-C) do D = (A-D+B-D+C-D)/3 = (2.98+2.98+3.04)/3 = 3.0
Od vseh klonov je najbližje kladi A-B-C klon D. Klada A-B-C je zelo blizu politomije, kjer ne moremo zanesljivo ločiti, katera vrsta se je evolucijsko prej ločila.