HANDOUT PRAKTIKUM FTS STERIL

STERILITY TEST

REVISI

Disusun oleh:

Putut Wibisono (098114132)

Lia Susanti (098114135)

LABORATORIUM TEKNOLOGI FORMULASI SEDIAAN STERIL

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2012

STERILITY TEST

Sterilitas didefinisikan sebagai kondisi bebas dari adanya mikroorganisme hidup.

Sterilitas merupakan syarat yang mutlak bagi sediaan injeksi. Suatu sediaan yang berlabel

steril, berarti telah melewati persyaratan USP (National Compendial Sterility Test

Requirements) untuk tes sterilitas. Tes sterilitas menurut USP merupakan estimasi

probabilitas, tidak merupakan hasil yang sebenarnya. Hal ini dikarenakan uji sterilitas

merupakan uji yang bersifat destruktif, sehingga tidak semua sediaan diuji sterilitasnya,

hanya sebagian saja sehingga hasilnya merupakan hasil sebagian sampel batch. Selain itu

kemungkinan untuk terjadinya kontaminasi yang bersifat accidental selama uji sterilitas.

Untuk sterilisasi akhir memiliki Sterility Assurance Level (SAL) paling sedikit 10-6

.

Uji sterilitas dilakukan dengan menginkubasi sampel pada media yang sesuai. Adanya

mikroba dibuktikan dengan terjadinya kekeruhan. Media yang digunakan haruslah memiliki

komposisi yang sesuai dan memberikan kondisi pertumbuhan mikroba yang optimal yaitu

nutrisi yang sesuai, pH, temperatur, waktu inkubasi yang cukup, sel mikroba tunggal yang

akan tumbuh dengan progresi geometrik.

Sampling

Pengambilan sampel untuk lebih dari 500 artikel adalah minimal 20, sedangkan untuk

100-500 artikel adalah tidak kurang dari 10. Untuk large volume parenteral product (volume

lebih dari 100 mL per wadah) paling sedikit 2% dari batch. Maksimal sampling untuk 1 lot

adalah 40.

Persyaratan sampling menurut USP dan European Pharmacopeia (EP) Sterility Test

Section ditunjukkan oleh tabel 1.

Tabel 1. Persyaratan sampling menurut USP dan European Pharmacopeia (EP)

Sterility Test Section (Akers, 2002).

Media Kultur

Dua media primer menurut USP dan EP adalah fluid thioglycollate medium (FTM)

dan soybean-casein digest (SCD) atau trypticase soy broth (TSB). FTM dapat digunakan

untuk mikroba aerob dan anaerob. Untuk produk berminyak, FTM ditambahkan polysorbate

80 sebagai agen emulsifikasi untuk dispersi lipofilik produk di media hidrofilik. Komposisi

dan kegunaannya ditunjukkan pada tabel 2.

Tabel 2. Komposisi dan kegunaan FTM (Akers, 2002).

TSB memiliki pH yang sedikit lebih tinggi dibandingkan FTM, dan lebih

meningkatkan pertumbuhan mikroba aerobic dibandingkan FTM. Komposisi TSB dan

kegunaannya ditunjukkan pada tabel 3.

Tabel 3. Komposisi dan kegunaan TSB (Akers, 2002).

Waktu dan Suhu Inkubasi

Waktu dan temperatur inkubasi yang dipersyaratkan untuk uji sterilitas menurut USP

ditunjukkan pada tabel 4.

Tabel 4. Waktu dan temperatur inkubasi (Akers, 2002).

Waktu inkubasi diperlukan yang cukup panjang karena adanya siklus untuk

pertumbuhan mikroba, dimana terdapat karakteristik lag time dari kurva pertumbuhan

kebanyakan mikroba.

gambar 1. Siklus hidup dan mati bakteri

Metode Uji Sterilitas

Terdapat 2 metode uji sterilitas yaitu Direct Transfer/Direct Inokulation Method dan

Membrane Filtration (MF) Method.

A. Direct Transfer/Direct Inokulation Method

Merupakan metode sterilitas yang sifatnya konvensional. Terdapat 3 langkah untuk

metode ini yaitu:

1. Membuka tutup wadah sampel secara aseptik

2. Menggunakan syringe yang steril untuk inokulasi sampel pada media

3. Injeksi setengah volume sampel di media FTM dan setengahnya di media TSB

Produk steril yang digunakan untuk metode ini antara lain: nonfilterable liquids,

ointments and oils insoluble in isopropyl myristate, solids to test media, purified cotton,

gauze, surgical dressings, sutures, and related articles, sterilized devices.

B. Membrane Filtration (MF) Method

Metode yang lebih dipilih karena lebih mudah dikerjakan. Langkah dasar metode ini

adalah:

1. Unit steril disiapkan dan disterilkan

2. Sampel dilewatkan filter dalam kondisi aseptic

3. Filtrasi dengan pertolongan vacuum

4. Membran dihilangkan secara aseptik dan dipotong setengah

5. Setengah bagian membran ditempatkan pada 100 mL FTM dan setengahnya pada 100

mL TSB.

Produk steril yang diuji dengan metode ini antara lain: liquids miscible with aqueous

vehicles, liquids immiscible with aqueous vehicles, less than 100 ml per container

ointments and oils soluble in isopropyl myristate, prefilled syringes, solids for injection

other than antibiotics, antibiotic solids for injection, antibiotic solids, bulks, and blends,

sterile aerosol products, devices with pathways labeled sterile.

Pemeriksaan Uji Sterilitas

Untuk uji sterilitas perlu dilakukan pengusutan terhadap hal-hal yang akan

berpengaruh terhadap kontaminasi sampel. Hal itu meliputi:

1. Identifikasi organisme pada uji sterilitas

2. Mencatat tes laboratorium dan penyimpangannya

3. Mengawasi lingkungan area produksi

4. Mengawasi personel

5. Product presterilization bioburden

6. Review catatan produksi

7. Sejarah manufacturing

Uji sterilitas pada antibiotik dan protein

Metode ini dimaksukan untuk menghilangkan sifat anti mikroba yang tertinggal

setelah proses filtrasi dengan membrane filtrasi. Misalnya, residu penicillin dibilas dengan

cairan penisillininase dimaksudkan untuk meng-inaktifkan penicillin tersebut. Sedangkan tes

sterilitas protein yaitu memodifikasi protein dengan viskositas tinggi(albumin) memalui

membrane filter dan agar tidak memberikan efek samping pada hewan uji lebih dari 1 menit.

Pengendalian dalam uji sterilitas

Uji sterilitas sangat dimungkinkan dapat dikacaukan oleh banyak hal, misalnya:

lingkungan dan kontaminan. Maka dari itu pengendalian pada tahap uji steril sangat

diperhatikan untuk menghindarkan ketidakvalidnya suatu data atau hasil dari produk steril

yang dihasilkan. Maka pengendalian dilakukan saat pembuatan sediaan hingga pengawasan,

meliputi: pengendalian lingkungan produksi (kelembaban, jumlah partikel, kontruksi

bangunan pabrik, dll) dan pengendalian teknisi operator atau personil (pemahaman, pelatihan,

teknik aseptis, dll).

Ada beberapa tipe dari control uji sterilitas sediaan

1. Kontrol positif: yaitu pengujian aktifitas media kultur tanpa sampel sediaan dengan

pemberian mikroba setelah dilakukan dalam waktu inkubasi tertentu.

Kontrol positif ini bertujuan untuk mengetahui apakah bakteri bisa tumbuh di media

yang digunakan.

Gambar 2. Mikroba yang digunakan pada

Growth Promotion Test (Akers, 2002)

2. Kontrol negatif: yaitu pengujian sterilitas dari media dalam waktu tertentu tanpa

sediaan dan tanpa pemberian mikroba setelah di sterilkan.

3. Uji pertumbuhan mikroba: yaitu pengujian terhadap aktifitas pertumbuhan mikrroba

pada media yang telah disterilkan selama masa inkubasi tertentu. Dengan syarat ada

pengaruh antimikroba pada system, jumlah pemberian mikroba diketahui, dan

perlakuan kondisi inkubasi yang sesuai.

4. Kontrol untuk metode membrane filtrasi. Dengan cara membran hanya dialiri dengan

pelarut.

Validitas dari uji sterilitas

Sediaan steril adalah sedian yang bebas dari kontaminan mikroba, namun bukan

berarti harus mempunyai daya antimikroba. Dalam validasi uji steril digunakan mikroba

konsentrasi kecil, dimaksudkan untuk menghitung daya mikroba setelah diinokulasi dan di

inkubasi. Pada kasus ini produk steril dapat bebas dari mikroba dalam range waktu tertentu

dilihat dari metode, jenis mikroba, dan konsentrasi yang diberikan.

Keterbatasan dalam uji sterilitas

Dari aturan USP secara garis besar ada tiga kendala dalam uji sterilitas

1. Sejumlah varian kecil sampel tidak bisa untuk mempresentasikan jumlah sediaan

dalam jumlah besar.

2. Ketidakmampuan dari media kultur dalam pertumbuhan mikroba, sehingga data tidak

valid.

3. Tidak dapat menghindari kontaminan yang tidak disengaja pada proses produksi.

Maka dari itu dilakukan cara untuk meminimalkan masalah yang timbul saat uji sterilitas,

misalnya: meningkatkan pengetahuan dan pemahaman tentang proses sterilisasi,

menghindari kondisi lingkungan yang tidak menguntungkan selama pembuatan dan

pengujian, dan pendidikan atau pelatihan personil dalam prosedur pengujian sterilitas.

Masalah sampling dan representasi statistik

Pada masalah ini terkait dengan probabilitas pengujian sampel terhadap syarat

yang di tentukan. Misalnya disyaratkan tidak lebih 0,1% maka dari 1000 sediaan tidak

lebih dari 1, dan jika hanya menggunakan 10 sampel apakah keseluruhan sampel

dikatakan steril.

Masalah faktor pendukung pertumbuhan pada kontaminan mikroba

Pada media kultur dapat menjadi faktor pertumbuhan yang baik suatu mikroba

yang tidak diinginkan,maka perlu disterilkan dan dikondisikan agar mikroba yang

tidak diinginkan tidak tumbuh dengan baik.

Masalah kontaminasi dan kebocoran

Pertumbuhan mikroba dari media uji harus berasal dari sampel bukan dari

kontaminasi lingkungan. Maka dari uji dibutuhkan control positif dan negatif untuk

mengetahui apakah pertumbuhna bakteri berasal dari sampel bukan dari kontaminasi.

Maka kondisi lingkungan dan personil perlu diperhatikan untuk menhindari

kontaminan dari lingkungan.

ISOLATION CHAMBERS AND ROBOTIC STERILITY TEST UNITS

Seperti sudah dijelaskan sebelumnya penyebab kontaminasi paling besar berasal dari

lingkungan dan personil. Pada metode ini sengaja menghilangkan tugas manusia sebagai

pekerja digantikan oleh robot atau mesin. Karena pengaruh manusia sangat besar terhadap

kontaminasi maka dari itu metode ini sangat meminimalkan unsur manusia dalam proses.

Kerugian dari sistem uji sterilitas mesin adalah menambah beban instalasi akan

pemeliharaan, kecepatan yang lebih lambat dalam melakukan tes sterilitas, dan kompleksitas

dalam pemeliharaan sistem.

Validasi sistem uji sterilitas robot melibatkan di sedikitnya lima unsur:

1. Memvalidasi prosedur manual saat ini.

2. Memvalidasi semua operasi mesin, baik hardware dan perangkat lunak

3. Memvalidasi pola aliran udara laminar dalam sistem.

4. Memvalidasi tingkat partikel dalam dan sekitar ruang uji.

5. Memvalidasi desinfeksi sistem. Perasetat asam tidak boleh digunakan sebagai desinfektan

dalam sistemmesin karena hal itu menyebabkan masalah korosif. Desinfektan yang dapat

diterima untuk robot sistem adalah ampfil, sporicidin, atau hidrogen peroksida 3%.

Gambar 3. Schaeffer Engineering hard-walled isolation barrier system for sterility

testing (Akers, 2002)

Validation of Barrier Isolation and Associated Sterilization Systems

Adalah suatu system kompleksitas dari pembuatan produk dan pengujian produk steril

agar didapatkan suatu produk yang baik, meliputi:

1. Design: yaitu penentuan rancangan tentang proses pengkondisian agar didapat suatu

produk steril. Misal, tentang konsep Laminar Air flow, dll.

2. Location of the Isolator: penempatan khusus operator di mana tidak disyaratkan pada

tempat produksi sediaan. Dimaksudkan untuk keselamatan dari operator.

3. Installation Qualification: harus mencakup rincian keterangan tentang semua aspek

mekanik dari sistem, seperti sebagai dimensi, konfigurasi internal, nomor urut peralatan,

cetak biru, pesanan pembelian, pasokan listrik, spesifikasi alat, suplai vakum, dan manual

peralatan.

4. Operational Qualification: yaitu memverifikasi operasional kerja yang dilakukan

operator, sebelum proses produksi berjalan. Dapat dilihat dari kebocoran, kelembaban,

aliran udara, temperatur (kesesuaian sistem).

5. Performance Qualification: yaitu memverifikasi aspek fungsional dalam proses produksi

oleh operator. Misal kinerja personil apakah sudah aseptis.

6. False-Negative Evaluation

Teknik dan Prosedur untuk Menjamin Sterilitas

Karena jaminan sterilitas didasarkan pada fungsi probabilitas, sterilitas tidak pernah

dapat dibuktikan kecuali seluruh sediaan dilakukan uji sterilitas. Selain itu, seperti sudah

dibahas, uji sterilitas sendiri memiliki keterbatasan tertentu. Oleh karena itu, sterilitas produk

tidak bisa diuji dengan jaminan mutlak bahwa setiap produk steril. Namun, jaminan sterilitas

produk dapat dicapai dengan proses kerja dan kepatuhan terhadap berbagai prosedur. Ini

termasuk (a) alat sterilisasi dan validasi metode sterilisasi dengan menggunakan fisik dan

biologis indikator, (b) kontrol dari kondisi lingkungan di mana produk parenteral diproduksi,

terutama ketika proses pengolahan aseptik dilakukan, dan (c) pelatihan personil teknik

aseptik yang ketat.

Alat Sterilisasi Dan Validasi Metode Sterilisasi

Jaminan sterilitas produk parenteral tergantung pada proses yang dilakukan untuk

mensterilkan produk. Semakin besar kontrol, semakin besar jaminan sterilitas. Proses kontrol

sterilitas melibatkan pengetahuan dan manajemen variabel proses seperti suhu, tekanan,

konsentrasi, kelembaban, konfigurasi beban, dan filter integritas dan variabel produk seperti

komposisi larutan dan viskositas, spesifikasi kemasan, dan konten mikroba.

Empat metode dasar yang digunakan untuk mensterilkan sediaan parenteral:

1. Panas, baik basah (uap) dan kering.

2. Gas, terutama etilen oksida.

3. Radiasi, terutama kobalt 60, iradiasi gamma dan berkas elektron.

4. Filtrasi melalui membrane filter.

Mekanisme dan teknik dari masing-masing proses harus dipahami dan dikendalikan

dengan baik untuk untuk mendapatkan jaminan tambahan terhadap produk steril.

Untuk mengetahui tingkat sterilitas suatu proses dan produk dapat digunakan

indikator biologis. Metode ini dapat sebagai indikator dilihat dari produk yang dapat menjadi

tempat berkempang biak suatu mikroba kontaminan. Selain itu indikator biologis bisa

menjadi faktor validasi masa hidup produk steril.

Kontrol Lingkungan

Suatu tempat produksi dan pengujian produk steril sangat mutlak diatur sedemikian

rupa untuk menghindari dari kontaminan lingkungan. Seperti contoh runag kelas 100 yaitu

tidak ada lebih dari 100 partikel dengan ukuran 0,5µ𝑚 atau lebih dalam 1ft kubik.

Maka ada perlu penanganan khusus untuk mendapatkan suatu syarat tempat produksi

sediaan steril:

1. Laminar air flow(LAF)

Yaitu suatu kondisi penghilangan partikel pada lingkungan produksi, dengan metode

memberikan semburan udara dalam ruang produksi, namun dengan ketentuan udara

yang dialirkan mengalami prakondisi penyaringan yang sangat ketat.

Gambar 4. Vertical laminar air flow bench (Akers, 2002)

Gambar 5. Horizontal laminar air flow bench (Akers, 2002)

2. Design and Maintenance of Aseptic Areas

yaitu merancang suatu tempat produksi sediaan steril agar dapat memenuhi

persyaratan tempat produksi. Dilihat dari: sirkulasi udara, kelembaban, sirkulasi air,

material sediaan, operator, peralatan, kontruksi bangunan, dll.

3. Methods of Evaluating the Environment

Yaitu pengujian apakah tempat produksi memenuhi syarat atau tidak.

Pengujian dibedakan menjadi 2,yaitu: air sampling dan surface sampling.

- Air sampling:

Slit-Air Sampler : yaitu pengujian aliran udara dengan media agar untuk

mengetahui pertumbuhan bakteri. Media agar diletakkan pada lubang sirkulasi

udara.

Liquid Impinger : yaitu menggunakan alat vakum untuk mengambil lembab

dari udara kemudian hasil cairan tersenut diinkubasi dalam agar.

Electronic Air Particle Counters: menggunakan alat untuk menghitung partikel

di udara, namun tidak bisa untuk membedakan partikel yang layak atau tidak

dalam lingkungan.

Settling Plates : yaitu penggunaan media dalam plat ditempatkan di beberapa

titik ruangan, dibuka selama 2-4 jam kemudian diinkubasi. Cara ini paling

sederhana, namun satu plate tidak diketahui volume udara yang diwakili.

Centrifugal Air Sampler : yaitu mensentrifugasi udara dengan kecepatan

tertentu untuk mendapatkan partikel, kemudian hasinya diinkubasi.

Sieve Impaction Air Sampler : yaitu penyaringan udara partikel udara

diendapkan dalam membrane, kemudian hasil endapan diinkubasi.

- Surface-Sampling Methods

Rodac Plates : yaitu pembuatan agar padat steril kemudian diusapkan pada

permukaan dari ruangan yang telah dipilih. Kemudian agar dimasukan dalam

media dan diinkubasi.

Swab-Rinse Test : yaitu pengambilan cuplikan dari permukaan ruangan

dengan kapas steril kemudian diusapkan pada media dan diinkubasi.

Training Personel

Syarat sediaan steril mutlak bebas dari kontaminan, maka sediaan sangat rentan

terhadap kontaminan dari lingkungan dan operator pekerja. Maka pemahaman prosedur

kerja aseptis sangat diperlukan untuk menjamin kesterilan dari produk.

Dari GMP memberikan aturan dasar pengetahuan kerja secara aseptis:

1. Aturan umum untuk diikuti jika seseorang bekerja di ruang steril

2. Tepat teknik kerja

3. Tepat penggunaan meja kerja LAF atau lingkungan steril lainnya

4. Khusus operasional sangat penting menggunakan prinsi aseptis dalam melakukan uji

sterilitas

5. Tepat pembersihan pada akhir tes steril (peralatan, tempat kerja, dll)

Alternatif uji sterilitas

Sudah dijelaskan diatas bahwa keterbatasan uji sterilitas dari USP, misalnya; sedikit

sampel tidak bisa untuk mempresentatifkan kesterilan seluruh produk, perlu dilakukan uji

pada seluruh produk. Maka persyaratan ini tidak cocok dilakukan di apotek ataupun pada

rumah sakit karena beberapa keterbatasan yaitu : ruang laboratorium, biaya, waktu, prosedur.

Dari masalah tersebut disarankan bahwa syarat uji steril dapat diganti atau dengan syarat

alternatif lain yang sesuai.

Beberapa metode sederhana dapat digunakan sebagai indikator bahwa produk tersebut

steril misanya : penginkubasian sampel pada media dan ditentukan aktivitas mikroba, serta

perlakuan sediian difiltrasi dengan Millipore.

Pada pengujian sterilitas alternatif ini tentunya dibantu fase eksternal dari sistem

untuk menjaga validitas dari hasil uji (negatif palsu). Beberapa faktor yang dapat

dikendalikan untuk mencegah kontaminan waktu pengujian : ruangan pendekatan yang sesuai

dengan ruang steril, kondisi aseptis, pemahaman pekerja tentang prosedur aseptis, dan

penggunaan alat dan bahan yang benar dan steril.

DAFTAR PUSTAKA

Akers, M. J., dan Larrimore D. S., 2002, Parenteral Quality Control, Marcel Dekker, New

York, pp. 1-109

---------, 2004, Guidance for Industry, Sterile Drug Products, Produced by Aseptic

Processing, Current Good Manufacturing Practice, Pharmaceutical CGMPs

DISKUSI

1. Bagaimana bisa mengetahui apakah media yang digunakan bisa untuk tumbuhnya

mikroba?

Jawab : dengan melakukan Growth Promotion Test, yaitu dengan cara menambahkan

mikroba pada media. Mikroba yang digunakan antara lain: Staphylococcus aereus,

Pseudomonas aeroginosa, atau Candida albicans. Dari sini akan diketahui apakah

media yang digunakan bisa untuk pertumbuhan mikroba tersebut.

2. Sediaan apa yang bisa digunakan untuk sterility test Direct Transfer/Direct

Inocolution Method dan Membrane Filtration Method?

Jawab :

- Direct Transfer/Direct Inocolution Method

nonfilterable liquids, ointments and oils insoluble in isopropyl myristate, solids to

test media, purified cotton, gauze, surgical dressings, sutures, and related articles,

sterilized devices.

- Membrane Filtration Method

liquids miscible with aqueous vehicles, liquids immiscible with aqueous vehicles,

less than 100 ml per container ointments and oils soluble in isopropyl myristate,

prefilled syringes, solids for injection other than antibiotics, antibiotic solids for

injection, antibiotic solids, bulks, and blends, sterile aerosol products, devices

with pathways labeled sterile.

3. Apabila didapatkan hasil positif palsu/negative palsu bagaimana penanganannya?

Jawab :

- Mengecek proses sterility test yang digunakan dan mencari letak kesalahan dalam

proses sebab positif palsu diperoleh karena terjadi kontaminasi selama pengujian

yang dilihat dari perbedaan hasil pada replikasi.

- Mengecek sensitivitas metode yang digunakan.