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Staphylococcus epidermidisのslime産 生株 に よ る

biofilm形 成 と抗 菌剤 の作 用 につい て

藤沢薬品工業株式会社開発研究所

池 田 文 昭 横 田 好 子 峯 靖 弘

(平成3年1月14日 受付)

(平成3年3月4日 受理)

Key words: S. epidermidis, slime, biofilm, antibacterial activity

要 旨

Staphylococcus aureusお よび11菌 種 のcoagulase negative Staphylococcus計598株 につい てslimeの

産生 の有 無 を測定 しslimeの 産生 とbiofilmの 形成 の 関連性 を検 討 した.slimeの 強 い産 生 を示 した株 は

S. epidermidisの み に認 め られ16%(42/263)の 頻 度 であ った.S. epidermidisのslime強 産 生株 と非 産

生株 の 医療用 シ リコンデ ィスク(Sデ ィス ク)に 対 す る付着 率 は2.3～14.8%の 範 囲で菌 株間 で差 異が あ

る もの のslime産 生 の有 無 との関 連性 は認 め られ なか った.し か し,菌 を付着 させ たSデ ィスクを培 養

す る と,slime産 生株 の みがSデ ィスク表面 の菌 数 が著 し く増 加 し肉眼 的 に も観察 可能 なbiofilmを 形 成

した.Biofilm形 成過程 を走査 電顕 で観察 す る と菌体 表 面 に分 泌 され たslimeと 考 え られ る突 起様 構 造

が 出現 し,こ れを架 橋 として菌 が凝集 してい る像 が認 め られ た.Biofilm形 成後 のS. epidermidisに 対 す

るcefazolin (CEZ), cefmetazoleお よびflumoxefの 殺 菌 作用 は菌 付着直 後 に比較 して著 しく低 下 した

がCEZの ヒ ト血 清中 濃度 シ ミュ レー シ ョンモ デル におい てCEZはS.epidermidisの 菌 数 の減少 と,形

成 されたbiofilmを 消失 させ た.

緒 言

医療技術の向上および発展は重症患者の救命率

を著 しく改善 させた反面,留 置カテーテル等の医

療材料を介 しての汚染が増加してい る.特 に,輸

液療法におい ては敗血症を誘発するケースが多 く

その際に分離 される'菌としてcoagulase negative

Staphylococcms(CNS)が 増加傾 向にある1)3).また,

人工臓器手術 の術後感染 においてもCNSの 分離

頻度が最 も高い と報告されてい る6).CNSは 人工

異物表面に付着 し易 くまた菌体分泌物を集積 した

状態,い わゆるbiofilmを 形成し,生 体防御因子や

抗菌剤に対す る抵抗性 を獲得す ると言われてい

る7).

我 々 はS. epidermidisが 人 工 異 物 上 にbiofilm

を 形 成 す る主 な原 因 がslimeの 産 生 に あ る と考 え

医 療 用 シ リコ ン シ ー トを 直 径7mmに 切 りぬい た

デ ィス ク を用 いbiofilmの 形 成 お よび 促 進 要 因 と

そ の形 成 過 程 に お け る抗 菌 剤 の 作 用 時 の挙 動 に つ

い て検 討 した.

材 料 お よび 方 法

1. 使 用 菌 株

臨 床 分 離 のS. aureus 32株 お よ びcoagulase

negative Staphylococcus 11菌 種,566株 を 用 い た.

2. 使 用 薬 剤

cefazolin(CEZ,藤 沢 薬 品), cefmetazole

(CMZ,三 共)お よ びHumoxef(FMOX,塩 野 義

製 薬)を 用い た.

3. Slime産 生 能 の測 定

Cristensenら の 簡 便 法8)を 用い た.す な わ ち

別刷請求先:(〒532)大 阪市淀川区加島2-1-6

藤沢薬 品工業株式会社,開 発研究所

池 田 文昭

平成3年7月20日

876 池田 文昭 他

Trypticase soy agar (glucose不 含, TSA, BBL)

で20時 間 培 養 し た 菌 体 を 試 験 管 に 分 注 し た

Trypticase soy broth (O.25% glucose含 有, TSB,

BBL)でMcFarland No.1の 濁 度 に 調 製 し37℃

で20時 間 静 置 培 養 した.菌 液 を 静 か に 捨 てphos-

phate buffer saline (PBS, ph7.0)で1回 洗 浄

後 サ フ ラ ニ ン液 を加 え室 温 で30分 間 静 置 した.サ

フ ラ ニ ン液 を 捨 てPBSで2回 洗 浄 後 室 温 で 乾 燥

して 試 験 管 壁 へ の付 着 の 有 無 お よび 強 弱 を 肉 眼 判

定 した.

4. 感 受 性 測 定

MICの 測 定 は 日本 化 学 療 法 学 会 標 準 法9)に よ っ

た.す な わ ち,感 受 性 測 定 用 培 地 にMueller

Hinton agar(MHA, Difco)を 用い,各 菌 株 の

一 夜 培 養 液 の100倍 希 釈 菌 液 を ス タ ン プ接 種 し,

37℃ で18時 間 培 養 後 菌 の 発 育 の有 無 を 判 定 した .

5. シ リコ ン デ ィス ク の作 成

医療 用 シ リコ ン シ ー ト(サ イ ラス テ ィク社 製)

を 切 り抜い て直 径7mmの デ ィス ク(Sデ ィス ク と

略)を 作 成 し,121℃,15分 間 オ ー トク レ ー プ滅 菌

した.

6. Sepidermidisの 付 着 能 の測 定

TSAで20時 間 培 養 し た 菌 体 をPBSで

A540nm=0.5に 懸 濁 し,そ の50μlをSデ ィス ク に

滴 下 し て37℃,1時 間 静 置 し た.菌 液 を 除 去 後

PBSで2回 洗 浄 したSデ ィス ク をPBS5mlを 分

注 した 試 験 管 に入 れ ボ ル デ ッ ク ス ミキ サ ー で1分

間 以 上 激 し く撹 拌 し てSデ ィ ス ク よ り菌 体 を 剥

が し,さ らに 超 音 波 洗 浄 器(Ultrasonic c1eaner B-

220, Branson社 製)に5分 間 浸 け て 菌 体 を分 散 さ

せ た 後,生 菌 数 を 測 定 した .

7. Biofilm形 成 能 の 測 定

上 述 の 方 法 で 菌 を 付 着 させ たSデ ィス ク を ペ

ト リ皿 に 分 注 したTSBに 浸 し ゲ ル 振 盪 器 で緩 や

か に 撹 拌 し な が ら37℃ で 培 養 した .経 時 的 にS

デ ィ ス ク を採 取 し てPBSで2回 洗 浄 後PBS 5ml

を分 注 した 試 験 管 に入 れ ボ ル テ ック ス ミキ サ ー で

2分 間 以 上 激 し く撹 拌 し てSデ ィ ス ク よ り菌 体

を 剥 が し,さ らに超 音 波 洗 浄 器 に5分 間 浸 け て菌

体 を 分 散 さ せ た 後 生 菌 数 を 測 定 し た.一 部 のS

デ ィス ク は メ タ ノ ー ル 固 定 後 単 染 色 し てbiofilm

形 成 の 有 無 を 肉 眼 的 に観 察 した.

8. Biofilm形 成 時 の 抗 菌 剤 の殺 菌 作 用

菌 付 着 直 後 お よ び そ の 後TSBで4時 間 培 養 し

てbiofilmを 形 成 し たSデ ィス ク を抗 菌 剤 を 含 有

し たTSBに37℃ で3時 間 浸 した 後Sデ ィス ク表

面 の 生 菌 数 を 測 定 し た.ま た,ヒ ト血 中 濃 度 に

simulateし たin vitro kinetic modelに お け る殺

菌 作 用 に つ い て も検 討 した.す な わ ちCEZお よ

びFMOXの2g,1時 間 点滴 静 注 を12時 間 間 隔 で

3回 繰 り返 した 時 の ヒ ト血 清 中 濃度 推 移 を ス テ ッ

プ ワ イ ズ に 再 現 し,4時 間 培 養 してbiofilmを 形

成 したS. epidermidisに 対 す る殺 菌 作 用 を 測 定 し

た.こ の場 合, biofilm形 成Sデ ィス ク を0か ら8

時 間 ま で に 一 定 時 間 間 隔 に各 々 次 の 濃度 の 抗 菌 剤

含 有 培 地 に 移 し,8か ら12時 間 は 抗 菌 剤 非 含 有 培

地 に 移 した.こ の 操 作 を3回 繰 り返 し,各 時 点 の

生 菌 数 を 測 定 した.

9. 走 査 電 子 顕 微 鏡 に よ る観 察

Biommの 形 成 状 態 を 調 べ るた め に 走 査 電 子 顕

微 鏡 に よ る観 察 を 行 な った.す な わ ち菌 を 付 着 さ

せ たSデ ィス グ を1.5%glutaraldehydeお よ び

2%OsO4で2重 固 定 し,エ タ ノー ル 系 列 に て 脱 水

後,酢 酸 イ ソ ア ミル に置 換 した.臨 界 点 乾 燥 した

試 料 を 白金 蒸 着 し,日 立 走 査 電 子 顕 微 鏡S-450で

観 察 した.

結 果

1. Staphylococcusのslime産 生

臨 床 分 離 のStaphylococcus aureusお よ び

coagulase negative Staphylococcus計12菌 種, 598

株 のslimeの 産 生 能 を 検 討 した結 果, 288株(48%)

にslimeの 産 生 を 検 出 した(Table 1) .菌 種 別 で

はS. aureus(22/32, 69%)お よびS. epidermidis

(177/263,68%)が 他 菌 種 よ りも高 頻 度 にslimeを

産 生 し た.特 にslimeを 強 く産 生 す る 株 はS

epidermidisの み で そ の 頻 度 は16%(42/263)で

あ った.

2. S. epidermidisの 付 着 性

S. epidermidisのslime強 産 生 株(4株)と 非 産

生 株(4株)のPBS懸 濁 液 をSデ ィス クに1時 間

接 触 させ た後 の 付 着 菌 数 を 測 定 し接 触 菌 量 に 対 す

る付 着 率 を 算 出 した(Table 2).

感染症学雑誌 第65巻 第7号

S. epidermidisのbiofilm 877

Table 1 Qualitative assessment of slime

production* of 598 strains of staphylococci

*All strains were tested for adherence to glass culture

tubes as described by Cristensen et al

Table 2 Adherence of S. epidermidis to silicone

disc

*1 Number of colony -forming units bound to silicone

disc (n=3) after incubation for 1 h. *2 Adherent cells/input inoculated cells .

S. epidermidisのSデ ィス ク へ の 付 着 率 は

2.3～14.8%の 範 囲 に あ り,菌 株 間 で 変 動 は 認 め ら

れ る も の の 付 着 率 とslimeの 産 生 性 との 関 連 性 は

見 出 さ れ な か った.

3. S. epidermidisのbiofilm形 成

S. epidermidisを 付 着 さ せ たSデ ィス ク を

TSBで 培 養 した 時 のSデ ィス ク表 面 の 菌 数 の 変

化 をFig.1に 示 し た.Slime産 生 株 で あ るNo.

7005お よ びNo.7020は 時 間 経 過 と共 に菌 数 が 増

加 し20時 間 培 養 後 に は108な い し は107cfu/discに

Fig. 1 Kinetic of the sessile population of S.

epidermidis adhered to silicone discs. Adherent

bacteria were grown in TSB. No. 7005 and No.

7020 were slime producing strains ; No. 7003 and

No. 7012 were non-producing strains.

Fig. 2 Photographs of silicone discs with adherent S. epidermidis stained with methylene blue.

Adherent bacteria (No. 7005, slime producing strain ; No. 7003, non-producing strain) were cultivated in TSB.

達 した.一 方 非 産 生 株 で あ るNo.7003お よ びNo.

7012は20時 間 培 養 後 で も付 着 直 後 の 菌 数 に比 べ ほ

とん ど変 化 な か った.

上 記 のS. epidermidis No.7005お よ びNo.

7003を 付 着 させ たSデ ィス ク をTSBで 培 養 した

時 のSデ ィ ス ク 表 面 の 単 染 色 像 をFig.2に 示 し

た.No.70G5を 付 着 させ たSデ ィ ス ク は培 養4時

平成3年7月20日

878 池田 文昭 他

間 目よ り表面が菌層で覆われて肉眼的に観察可能

なbiOfilmを 形成 し,時 間依存的にbiofilmが 肥厚

していく像が観察 された.し かし,NO.7003で は

biofilmの 形成は全 く認められなか った.さ らに

Biofilm形 成過程を走査電子顕微鏡で観察す ると

Sデ ィスクに付着 したNo.7005は2時 間培 養後

には菌体表面に突起様構造物が出現 し4時 間培養

後 に はSデ ィス ク 全 面 を 菌 層 で 覆 った が,No.

7003で は 菌 体 表 面 に 変 化 は 認 め ら れ な か った

(Fig.3).

4. Biofilm形 成S. epidermidisに 対 す る β-

lactam剤 の 殺 菌 作用

S. epidermidis No.7005のSデ ィ ス ク 付 着 直

後 お よ び4時 間培 養 してbiofilmを 形 成 し た 時 の

Fig. 3 Scanning electron micrographs of silicone discs with adherent S. epidermidis grown in TSB. Adherent bacteria (No. 7005, slime producing strain ; No. 7003, non-producing strain)

were cultivated for 2h (No. 7005, A; No. 7003, C) and 4h (No. 7005, B: No. 7003, D). Bar,1μm.

感染症学雑誌 第65巻 第7号

S. epidermidisのbiofilm 879

Fig. 4 Effect of CEZ, CMZ and FMOX on the sessile population of a S. epidermidis No. 7005

biofilm

CEZ, CMZお よ びFMOXの3時 間 作 用 時 の 殺 菌

作 用 を 検 討 した(Fig.4).尚,本 菌 株 に対 す る

CEZ, CMZお よ びFMOXのMICは 各 々3.13,

6.25お よ び3.13μg/mlで あ った.付 着 直 後 の 菌 に

対 して は3剤 共,作 用 濃 度 に対 応 した 殺 菌 作 用 を

示 した が,biofilm形 成 後 で はい ず れ も 明 らか に 殺

菌 作 用 が 低 下 した.

臨 床 で の 効 果 を 予 測 す る 目的 でCEZお よ び

FMOXの2g投 与 時 の ヒ ト血 中 濃 度simulation

系 に お け る殺 菌 作 用 を検 討 した(Fig.5).CEZの

1回 投 与 時 の 作 用 で は8時 間 後 に 約3オ ー ダ ーの

著 明 な 菌 数 減 少 を 示 し,薬 剤 フ リーに した 後 に も

再 増 殖 は 認 め られ な か った.2回 目以 後 の作 用 で

は殺 菌 作 用 は低 下 す る も の の3回 の 繰 り返 し に

よ って10cfu/disc以 下 の菌 数 に減 少 させ る こ とが

で きた.一 方,FMOXで は 初 回 作 用 に よ り約2

オ ー ダ ーの 菌 数 が 減 少 した が,薬 剤 フ リー とな っ

た4時 間 の 間 に 再 増 殖 が 認 め られ,3回 の 繰 り返

し作 用 に よ っ て103cfu/disc程 度 の 菌 数 が 残 存 し

た.

考 察

Coagulase negative S如ρ勿lo6o6ms (CNS)は

従来非病原菌あるいは汚染菌 として取 り扱われて

来たが人工異物を挿入す る医療技術の発達 と使用

頻度の増加に伴い これに付随した各種の感染症を

惹起するようになった3)5)6)10).

S. epidermidisを 主 としたCNSに よる感染症

の発症機構は十分解明されてい るとは言 えない

が,多 くの場合医療材料の挿入時に皮膚などに常

在する本菌が汚染し人工異物表面に菌体および菌

体外産物 よりなるマ トリックス(biofilmと 定義 さ

れる)を形成すると考えられてい る11).Biofilmの

形成は付着,引 き続い てお こる増殖およびslime

等 の産生 に よって構築 され てい ると考 え られ

る12)13)が,全てのCNSがslimeを 産生す るのか,

また各種 の細菌 か ら産 生 されるslime様 物質 と

CNSの それが化学的あるいは生化学的に同一 の

ものか否かについ ては殆 どわかってい ない.

我 々は11菌 種 に 分 類 され たCNSに つい て

slime産 生の頻度および産生量を検討 した結果,

S. aureusお よびCNSの598株 中約40%の 株 に

slimeの 産生を認めた.し かし,そ の産生量は菌種

菌株により異な り,明 らかに強い産生を認めたの

はS.epidermidisの み で263株 中42株(16%)で

平成3年7月20日

880 池田 文昭 他

Fig. 5 Effect of CEZ and FMOX on the sessile population of a 4-h S. epidermidis biofilm in

in vitro simulation model of human serum concentration (2g, 1h drip infusion)

あ った.東 乗 ら14)はS. epidermidis RP-62Aの 産

生 す るslimeよ り単 離 し たpolysaccharideが 本

菌 株 の カ テ ー テ ル へ の 付 着 を 阻 害 す る こ と か ら

slimeが 付 着 に関 与 し てい る 可 能 性 を 示 した.ま

た, Espersenら15)はS.epidermidisのslime産 生

能 と本 菌 の シ リコ ン カ テ ー テ ル の 付 着 率 に 正 の 相

関 が あ る と報 告 してい る.一 方, Peterら13)はS.

epidermidisのslimeは カ テ ー テ ル に 付 着 した 後

に 産 生 さ れ る こ と を 見 出 し,Falcieriら16)もim

oiooモ デ ル の 検 討 か らslimeの 産 生 は カ テ ー テ

ル の 付 着 に 直 接 影 響 しない こ とを示 した.こ の よ

うに, slimeがS. epidermidisの 付 着 に重 要 な 役

割 を 演 じてい るか ど うか は 明 確 に され てい ない.

我 々 はS. epidermidisのslime強 産 生 株 と非 産

生 株 を 医 療 用 シ リ コ ン シ ー トよ り作 製 し たS

ディスクに付着させた ところ,付 着菌数はslime

産生の有無に関係な く,む しろその後の増殖過程

におい てslime産 生株 は時間依存的 にSデ ィス

ク表面 の菌数 が増 加 し,肉 眼的 に観察可 能 な

biofilmを 形成することを確認 した.こ のbiofilm

形成過程を走査電子顕微鏡で観察すると,付 着 し

た菌体の表面にslimeの 分泌と考えられる突起様

構造物が出現し,そ れを架橋 として菌が次 々に凝

集してbiommが 形成 されることが明 らかになっ

た.S. epidermidisのSlimeの 産生は種 々の糖や

ア ミノ酸によって促進 されることが知られてい る

が,我 々はbiofilmの 形成にも培地 中にグル コー

スをはじめ本菌が代謝分解可能な糖類の添加が不

可欠であることを確認 した(未発表 データ).こ の

ことか らもbiofilmの 形成にslimeが 重要な役割

感染症学雑誌 第65巻 第7号

S.epidermidisのbiofilm 881

を演 じてい ることが うらずけられる. Slimeの 正

確 な物理化学的性質 は検討 してい ない がBays-

ton & Pennyら17)が 述べてい るmucoid様 物質 と

同一かあるいはそれに類似す るもので,お そ らく

complex glycoconjugateで あろうと推察してい

る7).

S. epidermidis No.7005に よって形成 された

biofilmにCEZ, CMZお よびFMOXを 作用 させ

たところ,何 れの薬剤 も付着直後の菌に比較 して

殺菌作用が著 しく低下 した.Biofilmと い う一種

の菌集塊に対 しては菌量の影響や静止期の菌の増

加により抗菌剤の効果の低下が予想されるが,そ

れ以外 の抵抗性の要 因 として本菌 の産生 した

slimeに よって抗菌剤 がbiofilm内 の菌へ浸透な

いし拡散するのを阻害 される可能性 も十分考えら

れる.こ の可能性はslimeの 産生を促進す る培地

で測 定 したS.epidermidisに 対 す る抗菌 剤 の

MICがMHBの そ れ よ りも高い とい うPeters

ら7)の成績によっても支持 されてい る.

体内に挿入 したカテーテルなどに一旦biofilm

が形成 されると抗菌剤等による除菌は困難で汚染

した これら異物を取 り除 くことが第一の対策 とさ

れてい るが,カ テーテル挿入後の菌血症の約半数

が化学療法のみで改善を見た との報告2)もある.

しかし,抗 ブ ドウ球菌活性を示す種々の薬剤の常

用投与量の治療において どの程度biofilmの 除菌

が可能かあるいは どの程度biofilm形 成が阻止さ

れるかについ て詳 しい検討は行われていない.そ

こで,我 々は臨床での効果を予測する目的でCEZ

およびFMOXの2g,1時 間点滴静注を した時の

ヒト血清中濃度シ ミュレーシ ョンモデルで本菌株

のbiofilmに 対す る殺菌作用 を検 討 した結果,

biofilm形 成初期段階では抗菌剤の作用 によって

biofilmの 形成を阻止 あるいは延長 させることが

可能であった.し かし,成 熟 したbiofilmに 対 して

は強力な抗菌活性をもつ薬剤でも十分な効果は期

待できない ことが予測された.カ テーテル留置は

各種 の感染症において抗菌剤難治の原因となるこ

とは多 くの臨床例で報告 されてい るが,こ のよう

な異物 の挿 入を必要 とす る患者 の多 くはCom-

promoised hostで あ り,生 体内防御能の低下と併

せて高カロリー輸液 などが実施される場合にはそ

の成分中にglucoseや ア ミノ酸等が多 く含有 され

ることか らbiofilm形 成条件は整ってい ると言っ

ても過言ではない.医 療技術の向上が 目覚ましい

現在,外 界環境 と生体内とが直接接触する機会の

増加が予想されそれだけ汚染の機会 も増えると考

えられる.血 液材料からの分離菌の動向をみても

わかるように生体に定着率の高い黄色ブ ドウ球菌

や皮膚などの常在菌で異物に付着 し易いCNSの

増加傾向18)19)はこれ らの背景を映してい ると言え

る.従 って,今 後医療用挿入異物の素材の改善あ

るいは汚染菌の導入を防 ぐための無菌対策につい

ての検討が望まれる.

本実験 はStaphylococcusの 医療材料 表面で の

biofilm形 成に限定 して検討 したものであるが,異

物挿入時に限 らず慢性気管支炎等でも緑膿菌など

の菌 によってbiofilm形 成が観察 され,難 治感染

や感染反復の原因 となる と考 えられてい る20).

biofilmの 形成は抗菌剤療法の限界を示す もの と

考 えられ,今 後 はbiofilmを 構築 してい るslime

様物質に分解活性を示す物質の検索も必要かもし

れない.

稿を終えるにあたり,本実験に御協力いただいた小河原

美紀氏および寺谷紀子氏に謝意を表します.

文 献

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510―521, 1990.

Formation of Biofilm by Slime Producing Staphylococcus epidermidis and Bactericidal Activity of Cefazolin

Fumiaki IKEDA, Yoshiko YOKOTA & Yasuhiro MINE Department of Chemotherapy, Product Development Laboratories, Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd.

Slime production was studied in a total of 598 strains of Staphylococcus aureus and 11 species of coagulase negative staphylococci and the relationship of the slime production and biofilm formation was investigated.

The high slime production was obtained in 42 of 263 strains (16%) of S. epidermidis only. The adherence of S. epidermidis to biomedical silicone discs (S discs) and biofilm formation were investigated in vitro in high slime producing and non-producing strains. The adherence rates of S. epidermidis to the S discs ranged from 2.3 to 14.8%. There was no relationship between slime

production by S. epidermidis and the adherence rates. Biofilm was formed only in slime producing strains with cell growth on the S discs when they were incubated. The process of the biofilm formation was obtained by scanning electron microscopy; there were many projections, probably slime secreted from the cells, on the cell surface, and picture showing agglutination of cell by crosslinking. The bactericidal activity of cefazolin, cefmetazole and flumoxef against S. epidermidis after formation of the biofilm decreased more markedly than that before formation. Cefazolin reduced the number of S. epidermidis and eliminated the formed biofilm in an in vitro simulation model of serum concentration in human after drip infusion of 2 g of cefazolin.

感染症学雑誌 第65巻 第7号