StaphylococcusDra. Elsa Masae MamizukaUSPDr. Antnio Carlos PignatariDiretor do Laboratrio Especial de Microbiologia - LEMC

ndiceIntroduo a cocos Gram-positivos Caractersticas do Gnero StaphylococcusStaphylococcus aureusEnzimas ExtracelularesTestes de aglutinao rpida para coagulasePadres de HemliseRegulao de Fatores de VirulnciaStaphylococcus epidermidisOutras espcies de StaphylococcusIdentificao simplificada dos cocos Gram positivo de importncia clnicaChave Geral para a Identificao de StaphylococcusStaphylococcus saprophyticusDeteco de resistncia de Staphylococcus aureus oxacilina e ou vancomicinaResistncia aos AntibiticosStaphylococcus aureus resistente oxacilina-ORSAMtodos laboratoriais para a deteco da resistncia oxaclina ( meticilina)Resistncia VancomicinaDeteco da VISA/VRSARelao de drogas testadas para Staphylococcus aureus e relatadas no antibiograma

Introduo a cocos Gram-positivos Os cocos Gram positivos (CG+) compem um grupo de grande importncia clnica. So responsveis por inmeras e variadas afeces e sndromes. Os CG+ anaerbios facultativos de importncia clnica pertencem a uma de duas famlias: Micrococcaceae ou StreptococcaceaePesquisa de catalase na bactria

A partir da caracterizao da amostra como CG+ atravs da colorao de Gram, a determinao da famlia feita pela prova da catalase. A prova da catalase consiste em colocar uma amostra de bactria em contato com o perxido de hidrognio, e pesquisar a formao de bolhas de oxignio.Introduo a cocos Gram-positivos

Micrococcaceae+As bactrias desta famlia so catalase POSITIVASStreptococcaceae-As bactrias desta famlia so catalase NEGATIVASIntroduo a cocos Gram-positivos

Esta estrutura caracterstica lembra cachos de uva. Caractersticas do Gnero Staphylococcus

As sp mais importantes na clnicaS. lugundensisS. schleiferiS. sciuriS. lentusS. caseolyticusS. hyicusS. chromogenesS. intermediusS. delphiniS. carnosusS. simulansS. cohniiS. xylosusS. saprophyticusS. gallinariumS. kloosiiS. equorumS. arlettaeS. epidermidisS. capitisS. warneiS.saccharolyt.S. capraeS. hominisS. haemolyticusS. auricularisS. aureusCaractersticas do Gnero Staphylococcus

As mais importantes no laboratrio clnico so:S. lugundensisS. schleiferiS. sciuriS. lentusS. caseolyticusS. hyicusS. chromogenesS. intermediusS. delphiniS. carnosusS. simulansS. cohniiS. xylosusS. saprophyticusS. gallinariumS. kloosiiS. equorumS. arlettaeS. epidermidisS. capitisS. warneiS.saccharolyt.S. capraeS. hominisS. haemolyticusS. auricularisS. aureusCaractersticas do Gnero Staphylococcus

Staphylococcus aureusDe todas as espcies do gnero, o S. aureus o mais importante. responsvel pelo segundo maior nmero de infeces em seres humanos. O S.aureus est presente no trato respiratrio superior, especialmente nas narinas, de aproximadamente 60% da populao em geral, e assim permanece sem causar doena em condies normais.

O gnero Staphylococcus composto por vrias espcies: S. lugundensisS. schleiferiS. sciuriS. lentusS. caseolyticusS. hyicusS. chromogenesS. intermediusS. delphiniS. carnosusS. simulansS. cohniiS. xylosusS. saprophyticusS. gallinariumS. kloosiiS. equorumS. arlettaeS. epidermidisS. capitisS. warneiS.saccharolyt.S. capraeS. hominisS. haemolyticusS. auricularisS. aureusCaractersticas do Gnero Staphylococcus

O nome aureus significa dourado em latim, qualidade atribuda ao pigmento amarelado caracterstico produzido pela bactria. Staphylococcus aureus

Enzimas ExtracelularesA enzima extracelular mais importante a coagulase. A produo de coagulase exclusiva ao Staphylococcus aureus, sendo inclusive, um critrio para a identificao de uma amostra como pertencente espcie. coagulaseprotrombinaFibrinognioFibrinaEstafilotrombinaCausa coagulaoFatores de Virulncia do StaphylosStaphylos no o nico que produz coagulase

No laboratrio clnico, faz-se um ensaio com plasma de coelho. A bactria em questo inoculada num tubo com plasma de coelho. Se o plasma coagular, a espcie S. aureus. Staphylococcus aureusSe no coagular deixar mais 20h, totalizando 24h verificar novamente

Staphylococcus aureus

Testes de aglutinao rpida para coagulaseTesta a presena de proteina A e fator de coagulao (clamping factor)Fornece resultado + em 5 a 20 seg.Mostra correlao de 80% com mt.classicopreo e mbalagem com 150un. U$116.00 Teste de aglutinao do latex azul para deteco do clumping factor e protein A associado Staphylococcus aureus Resultado em 60 segSensibilidade/especificidade: 99/92%Inclui partcula de latex , carto p/teste, haste, e controles positivo e negativoPreo: embalagem de 105 um. U$ 105.62Validade 18 meses

Padres de Hemliseesverdeado

Regulao de Fatores de VirulnciaOs fatores de virulncia produzidos por S. aureus no so expressados a toda hora, so dependentes da fase de crescimento da bactria.tempono de clulas Protena A adesinas coagulase hemolisinasToxinas Alimento em abundncia Protena A adesinas coagulase hemolisinas toxinas alimentoTaxa estacionria

A segunda espcie mais importante do gnero Staphylococcus o Staphylococcus epidermidis. O Staphylococcus epidermidis faz parte da flora normal da pele e da mucosa de seres humanos e animais superiores. Staphylococcus epidermidisImportante na infeco hospitalar

O Staphylococcus epidermidis uma espcie bem menos virulenta do que S. aureus. No apresentam a produo de coagulase e algumas cepas apresentam a produo muito tmida de certas enzimas proteolticas. Todavia, isto no significa que S. epidermidis no possa ser patognico. Esta espcie tem muitos fatores de adeso e forma muito biofilme, sendo perigosa para pacientes que fazem uso de material invasivo de plstico (cateter, prteses, stents, etc.).Staphylococcus epidermidis

O Staphylococcus epidermidis um risco para pacientes imunocomprometidos e para usurios de drogas intravenosas, podendo causar endocardite e infeces generalizadas no-piognicas. Staphylococcus epidermidis pode causar septicemia, endocardite, peritonite, ventriculite e infeces em locais com prtese.Staphylococcus epidermidis

Outras espcies de StaphylococcusNo laboratrio clnico, usualmente se faz a diferenciao entre Staphylococcus coagulase positiva (S. aureus) e Staphylococcus coagulase negativa (no aureus). Os Staphylococcus coagulase negativa de interesse so subdivididos em dois grupos: saprophyticus e no saprophyticus, baseado na sua suscetibilidade novobiocina.

No laboratrio clnico, usualmente se faz a diferenciao entre Staphylococcus coagulase positiva (S. aureus) e Staphylococcus coagulase negativa (no aureus). Os Staphylococcus coagulase negativa de interesse so subdivididos em dois grupos: saprophyticus e no saprophyticus, baseado na sua suscetibilidade novobiocina.Outras espcies de Staphylococcus

GneroCatal.Motilidade NaCl 5% OxidaseAerbio TtradeEstrito Staphylococcus +neg+negnonoPlanococcus+ ++neg+varivelMicrococcus + neg+ +varivelvarivelEnterococcusnegvarivel+negnonoStreptococcus negnegvarivelnegnonoAerococcus negneg+ negno+Stomatococcus * varivelnegnegnegnovarivel

* aderente ao meioIdentificao simplificada dos cocos Gram positivo de importncia clnica

Chave Geral para a Identificao de StaphylococcusCoco GRAM +Micrococcaceaecatalase+Streptococcaceae-DNAse+Staphylococcus sp.Sensvel novobiocina?-Coagulase-Staphylococcus aureus++Staphylococcusno saprophyticusStaphylococcus grupo saprophyticus

Outras espcies de StaphylococcusNo laboratrio clnico, usualmente se faz a diferenciao entre Staphylococcus coagulase positiva (S. aureus) e Staphylococcus coagulase negativa (no aureus). Os Staphylococcus coagulase negativa de interesse so subdivididos em dois grupos: saprophyticus e no saprophyticus, baseado na sua sensibilidade novobiocina.

Chave Geral para a Identificao de Staphylococcus Espcies de Staphylococcus do grupono saprophyticus(Grupo epidermidis)Espcies de Staphylococcus do grupo saprophyticusS. saprophyticusS. cohniiS. xylosusS. epidermidis S. haemolyticusS. hominisS. capitisS. warneri

Staphylococcus saprophyticusO Staphylococcus saprophyticus de interesse clnico pois frequentemente causa infeco do trato urinrio, especialmente em mulheres, podendo chegar a causar cistite, uretrite e pielonefrite, e em casos extremos bacteremia.As outras espcies de Staphylococcus de interesse clnico causam infeces parecidas com o S. epidermidis, e o tratamento igual. Logo, o mais importante discriminar o Staphylococcus coagulase positiva (S. aureus) do Staphylococcus coagulase negativa.

Deteco de resistncia de Staphylococcus aureus oxacilina e ou vancomicina

Resistncia aos AntibiticosSir Alexander FlemingA primeira vez que um antibitico foi usado, clinicamente, foi contra uma infeco por Staphylococcus aureus.

A penicilina funcionou bem contra infeces estafiloccicas at os anos 60, quando rapidamente comearam a surgir cepas resistentes penicilina.Resistncia aos Antibiticos

Para contornar o problema, foi criado o beta-lactmico sinttico meticilina, que era resistente ao das beta-lactamases.meticilinaResistncia aos AntibiticosAnel b-lactmico

A meticilina funcionou bem at os anos 70, quando comearam a surgir as cepas resistentes a meticilina (MRSA). meticilinaResistncia aos Antibiticos

Resistncia aos AntibiticospenicilinaPBP2aTodo antibiticos beta-lactmico se liga a enzimas que participam da sntese da parede celular chamadas PBPs (Protenas Ligadoras de Penicilina). O MRSA desenvolveu uma outra PBP, chamada PBP2' ou PBP2a. Esta PBP plenamente funcional mas no tem afinidade por beta-lactmicos.

(PVN) ligadora de penicilina = enzima

Resistncia aos AntibiticosDevido a este mecanismo de resistncia, as cepas MRSA/ORSA so resistentes no s penicilina, mas a todos os antibiticos beta-lactmicos!

No laboratrio clnico, deve-se reportar num antibiograma resistncia a todos os beta lactmicos (inclusive cefalosporinas e carbapenemas s vezes so suscetveis = ocorre apenas in vitro) quando a amostra for MRSA mesmo quando so sensveis a alguns beta lactmicos in vitro.

A PBP2a codificada pelo gene mecA. Este gene carreado num elemento gentico mvel chamado de Cassete Cromossmico Estafiloccico mec (SCCmec).

b la: b -lactamase; CIM em m g/ml; Subp-R: subpopulao resistente. Staphylococcus aureus resistente oxacilina-ORSA

ModalidadeNivel de expressomecAPBP2ablaCIM meticilinaFreq deSubp-RMaioriaSubp-RBorderline-BORSABaixo- - +++8- - MOD-SABaxo- PBP 1,3,4+8- - HeterogneaBaixo+++1,5-3200107 HeterogneaMedio+++6-1240010-5 HeterogneaAlto+++10-200800103HomogneaAlto+++/- 8008001

Mtodos laboratoriais para a deteco da resistncia oxaclina ( meticilina)Para detectar a resistncia a oxacilina no laboratrio clnico, pode-se utilizar atcnica de disco difuso em gar (Kirby-Bauer).

Tambm pode-se detectar cepas MRSA atravs de um gar screening de oxacilina que gar Mller-Hinton com NaCl a 4% e uma concentrao de oxacilina de 6g/mL de oxacilina. O crescimento de uma ou mais colnias indica resistncia a oxacilina.

Para a determinao da concentrao inibitria mnima de oxacilina, o mtodo de macrodiluio em caldo deve ser feito com caldo Mller-Hinton com uma concentrao final de 4% de NaCl.

O estudo das CIM mediante prova de E-test com fita de oxacilina uma alternativa vlida em casos de dvida, com uma eficcia diagnstica praticamente similar ao do mtodo de referncia de diluo em gar hiper salino, a concentrao crtica de 6 g/ml de oxacilina (NCCLS,1997).

Sistemas automatizados de micro diluio nem sempre oferecem sensibilidade, especificidade e eficcia suficientes para a deteco deste tipo de cepas, quando comparado aos mtodos de referncia (Snchez, 1998),

Um mtodo alternativo, rpido e eficaz, embora nem sempre aplicvel em rotina, a deteco do gene mecA, por mtodos de amplificao por PCR (Murakami et al., 1991). Este mtodo teria a vantagem de no estar sujeito s condies do crescimento da cepa, podendo ser aplicado em grande nmero de isolados, empregado em casos de dvida com valores de CIM prximo do limite. Mtodos laboratoriais para a deteco da resistncia oxacilina ( meticilina)

Resistncia VancomicinaO mecanismo de resistncia vancomicina em Staphylococcus aureus ainda no foi elucidado, e parece ser bem mais complexo do que ocorre em Enterococcus, envolvendo uma multiplicidade de genes. Em S. aureus, ocorrem fenmenos bizarros e pouco ortodoxos em relao resistncia vancomicina. Primeiramente, a morfologia das colnias de VRSA heterognea, dando a impresso de contaminao. VSSAVRSAVRSA

VSSA

VRSA

VRSA

Resistncia aos AntibiticosEm 1997, foi relatada no Japo, a primeira cepa clnica de Staphylococcus aureus resistente vancomicina (VRSA), pelo Prof. Keiichi Hiramatsu, da Univesidade Juntendo em Tquio.

Em 2000, foram encontradas as primeiras 5 cepas de Staphylococcus aureus resistentes vancomicina (VISA) no Brasil, num Hospital de referncia de queimados.

Infection Control & Hospital Epidemiology. 22(7):443-448, July 2001.

ISOLATION IN BRAZIL OF NOSOCOMIAL STAPHYLOCOCCUS AUREUS WITH REDUCED SUSCEPTIBILITY TO VANCOMYCINOliveira Geraldo A. MD; Dell'Aquila, Adriana M. MD; Masiero, Rita L. Pharm; Levy, Carlos E. PhD; Gomes, Marcia S. Pharm; Cui, Longzhu PhD; Hiramatsu, Keiichi PhD; Mamizuka, Elsa M. PhDFaculty of Pharmaceutical Sciences, University of Sao Paulo (Oliveira, Levy, and Mamizuka) General Public Hospital, Sao Paulo, Brazil (Dell'Aquila, Masiero, and Gomes) Department of Bacteriology, Juntendo University, Tokyo, Japan. (Cui, and Hiramatsu)Resistncia aos Antibiticos

Outro fenmeno comum oxacilina e a vancomincina a ocorrncia da resistncia heterognea (hetero-resistncia) de S. aureus a estes antibiticos. Ocorre que certas cepas apresentam um MIC baixo de vancomicina (

Quando o resultado plotado num grfico obtm-se trs possibilidades distintas de curva: VRSAhetero-VRSAVSSAResistncia VancomicinaSensvel Vancomicina

Observou-se tambm, por morfometria, que enquanto as cepas sensveis vancomicina apresentavam um espessamento da parede celular normal, VRSA apresentavam uma espessura bem maior, e a hetero-VRSA ficando entre a VRSA e VSSA

Resistncia Vancomicina

Parece portanto, que a resistncia vancomicina est ligada a uma exacerbao da sntese da parede celular, em que inmeros genes regulatrios estariam envolvidos. At agora, todavia, ningum parece saber por certo quais genes esto envolvidos e at que ponto. Uma das grandes limitaes no estudo do mecanismo de resistncia vancomicina em S. aureus que a emergncia da resistncia um fenmeno ainda raro. Existem ainda poucas cepas no Mundo atualmenteResistncia Vancomicina

Deteco da VISA/VRSA

Deteco da VISA/VRSAPelo laboratrio de referncia

Resistncia a MacroldeosOs macroldeos so antibiticos de primeira escolha s para Streptococcus pneumoniae, dentre os Gram positivos.

Os macroldeos utilizados na clnica so: Eritromicina Claritromicina AzitromicinaO lanamento dos novos macroldeos recentemente aumentou o uso destas drogas.

Resistncia a MacroldeosOs macroldeos so inibidores da sntese protica bacteriana. Os ribossomos bacterianos tm duas subunidades: 30S e 50S.

Resistncia a Macroldeos

A resistncia aos macroldeos ocorreu pela primeira vez, em 1953. A bactria metilava o rRNA que perdia afinidade aos macroldeos. A metilao feita por uma adenina N6-metiltransferase, cujo gene denominado erm [Erythomycin Ribosome Methilation].

Os genes erm geralmente esto localizados em elementos genticos mveis, tal como transposons, geralmente inseridos no cromossoma. Alguns destes transposons residem em plasmdios.

Os genes erm muitas vezes esto associados presena de genes que conferem resistncia tetraciclina (genes tet).

Resistncia a Macroldeos

Resistncia a Macroldeos

Estes antibiticos so denominados como pertencentes ao grupo MLS

Resistncia a MacroldeosClindamicina(mal indutor)Eritromicina (bom indutor)Achatamento do Halo

Relao de drogas testadas para Staphylococcus aureus e relatadas no antibiogramaPara Staphylococcus aureus e coagulase negativos oxacilina resistentes, no testar cefalosporinas, penicilinas de amplo espectro ou Imipenem, pois falso resultados sensveis podem ocorrer.

S. saprophyticus mantem boa sensibilidade e no precisam ser testados pois dificilmente apresentam resistncia SMXTMP, quinolonas e nitrofurantona, (drogas de escolha).

Staphylococcus aureus ou coagulase negativos sensveis penicilina so sensveis a todos os beta-lactmicos. Testar pelo disco de penicilina e no de ampicilina. Se produtoras de beta-lactamase pelo testes acidimtrico, iodomtrico ou da cefalosporina cromognica(nitrocefin) considerar resistente a ampicilina e penicilina.

Staphylococcus resistente a penicilina produtor de penicilinase e resistente a todas as penicilinas: ampicilina, amoxicilina, piperacilina e ticarcilina. A associao de penicilinas com inibidores: sulbactam, clavulanato e tazobactam s tero atividade para os estafilococos oxacilina-sensveis.

Staphylococcus aureus e outros coagulase negativos quando resistentes oxacilina considerar como resistentes a :Penicilinas (penicilina, ampicilina com e sem inibidor de beta-lactamase[sulbactam], amoxicilina com e sem inibidor [clavulanato], piperacilina com e sem inibidor, Ticarcilina com e sem inibidor), cefalosporinas de 1a, 2a, 3a, 4 , Aztreonam( droga sem atividade contra Gram positivos), e Carbapenens(Imipenem, Meropenem e ertapenem)

Staphylococcus spp com teste para gene mecA+= oxacilina R (existem testes de aglutinao especficos para detectar este gene.

Staphylococcus spp podem desenvolver resistncia durante a terapia com quinolonas, por isso amostras diferentes devem ser sempre testadas e no repetir o antibiograma anterior.

Todo Staphylococcus aureus com halo para vancomicina 14mm deve-se testar a CIM e aqueles com CIM4g enviar a Laboratrio de referncia.

Relao de drogas testadas para Staphylococcus aureus e relatadas no antibiograma

Prevalncia de resistncia

Prevalncia de resistncia