SPRAWOZDANIA

Z ĆWICZEŃ LABORATORYJNYCH

BIOCHEMIA

WYDZIAŁ LEKARSKI I ROK KATEDRA BIOCHEMII LEKARSKIEJ UJ CM

KRAKÓW

Imię i nazwisko: ………………….………………………………

Numer grupy: …………

TERMINY ZAJĘĆ LABORATORYJNYCH (dzień tygodnia i godzina):

……………………………………………….

OSOBY PROWADZĄCE: …………………………………………………………………………..

SEMESTR ZIMOWY 2012/2013

2

ĆWICZENIE I

BIAŁKA I

DATA: ………… I. Elektroforeza białek surowicy krwi na pasku z octanu celulozy. 1. Przedstaw schemat rozdziału elektroforetycznego białek surowicy krwi (dołącz uzyskany wynik

przeprowadzonego rozdziału elektroforetycznego). Zaznacz początek wędrówki białek, położenie katody (-) i anody (+), kierunek migracji i pozycje poszczególnych frakcji białek surowicy krwi.

2. Wyjaśnij rolę biologiczną tej frakcji białek, która występuje w najwyższym stężeniu w analizowanej surowicy krwi.

II. Widma absorpcyjne pochodnych hemoglobiny.

1. Dołącz (lub narysuj) widmo absorpcyjne (450–650 nm) każdej z badanych pochodnych

hemoglobiny. Wskaż maksima absorbancji (max).

Oksyhemoglobina Deoksyhemoglobina

3

Methemoglobina Cyjanmethemoglobina

2. Zaznacz stopień utlenienia jonu żelaza w każdej z badanych pochodnych hemoglobiny.

3. Umieść w tabeli wartości długości fali, w zakresie widzialnym, przy których obserwuje się maksimum absorbancji każdej z pochodnych hemoglobiny.

Pochodna hemoglobiny Maksimum absorbancji

(max)

Stopień utlenienia jonu żelaza

Oksyhemoglobina Deoksyhemoglobina Methemoglobina Cyjanmethemoglobina

4. Która z pochodnych hemoglobin jest wykorzystywana do oznaczenia całkowitego stężenia hemoglobiny we krwi? Wyjaśnij, w jaki sposób otrzymuje się tą pochodną i uzasadnij taki wybór.

III. Obliczanie wartości pI dla białek i peptydów z wykorzystaniem programu PTOOLS.

1. Na podstawie podanego składu aminokwasów (tabela poniżej) albuminy surowicy ludzkiej, oblicz jej pI (N- końcowym aminokwasem jest asparaginian, C-końcowy aminokwasem jest leucyna). Określ ładunek białka w pH fizjologicznym (7.4).

pI: ……………………………………….

ładunek w 7,4: ………………………….

4

2. Na podstawie uzyskanych krzywych miareczkowania 2 białek (program PTOOLS) -

produktów trawienia trypsyną hemoglobiny A i hemoglobiny S:

A: Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys- S: Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys-

zasugeruj zakres pH odpowiedni dla elektroforetycznego rozdziału tych 2 białek (HbA i HBS)

………………………………………………….

Uzasadnienie: ……………………………………………………………………………

………………………………………………………………………………………………

Skład aminokwasowy albuminy ludzkiej

Aminokwas Kod trój- literowy Zapis jednoliterowy Liczba reszt

Alanina Ala A 62

Arginina Arg R 24

Asparagina Asn N 17

Asparaginian Asp D 36

Cysteina Cys C 35

Glicyna Gly G 12

Glutaminian Glu E 62

Glutamina Gln Q 20

Histydyna His H 16

Izoleucyna Ile I 8

Leucyna Leu L 61

Lizyna Lys K 59

Metionina Met M 6

Fenyloalanina Phe F 31

Prolina Pro P 24

Seryna Ser S 24

Treonina Thr T 28

Tryptofan Trp W 1

Tyrozyna Tyr Y 18

Walina Val V 41

Całkowita ilość aminokwasów 585

LICZBA PUNKTÓW Data:

Test Wykonanie Suma pkt. Podpis asystenta:

5

ĆWICZENIE II

KINETYKA ENZYMATYCZNA

DATA: …………

1. Oblicz stężenie początkowe nadtlenku wodoru w każdej z mieszanin reakcyjnych.

TABELA I

Próbka 0.02 M Gwajakol

(cm3)

1 mM H2O2

(cm3)

Bufor pH = 6.0

(cm3)

Początkowe stężenie

H2O2 (mM)

1 1 0.2 0.8

2 1 0.3 0.7

3 1 0.4 0.6

4 1 0.5 0.5

5 1 0.8 0.2

2. Umieść w Tabeli II uzyskane wartości absorbancji produktu reakcji przy długości fali 470 nm. Oblicz stężenie (c) tetragwajakolu (TG) w trakcie przebiegu reakcji w każdej z mieszanin.

Prawo Lamberta- Beera: A = k c l

gdzie: A – absorbancja próbki mierzonej przy 470 nm,

k = 26.6 cm-1 mM-1 (współczynnik absorbancji dla tetragwajakolu przy 470 nm) l = 1 cm. Obliczone wartości wpisz do Tabeli II. Tabela II. Stężenie tetragwajakolu (TG) w trakcie przebiegu reakcji

Początkowe stężenie H2O2

...... mM H2O2 ...... mM H2O2 ...... mM H2O2 ...... mM H2O2 ...... mM H2O2

czas [min] A470 TG

(mM) A470

TG (mM)

A470 TG

(mM) A470

TG (mM)

A470 TG

(mM)

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3. Narysuj, dla wybranej mieszaniny reakcyjnej, wykres zależności stężenia tetragwajakolu od

czasu trwania reakcji (krzywa kinetyczna). Dołącz wykres do sprawozdania. 4. Dla wybranego stężenia początkowego H2O2 oblicz szybkość początkową reakcji (v0) na

podstawie wykreślonej krzywej kinetycznej reakcji.

V0 = dla [H2O2] =

6

5. Za pomocą programu SIMFIT oblicz wartości prędkości początkowych reakcji dla każdej z mieszanin reakcyjnych. Uzyskane wartości wpisz do Tabeli III.

Tabela III.

6. Sporządź krzywą zależności prędkości początkowej (v0) od stężenia nadtlenku wodoru [H2O2] (v0 względem [S]). Wykres dołącz do sprawozdania.

7. Oblicz wartości 1/vo i 1/[H2O2] i wpisz do Tabeli IV.

Tabela IV.

8. Sporządź wykres 1/vo od 1/[H2O2] (krzywa Lineawera-Burka). Dołącz wykres do sprawozdania. 9. Wyznacz wartości Vmax [mM/min] i Km [mM]. Wyniki wpisz do Tabeli V. 10. Za pomocą programu SIMFIT oblicz wartości Km i Vmax. Wyniki wpisz do Tabeli V. Porównaj

oba zestawy uzyskanych parametrów reakcji. Tabela V. Wartości Km and Vmax dla reakcji katalizowanej peroksydazą

11. Oblicz wartość kcat. Stężenie peroksydazy jest równe 1nM.

LICZBA PUNKTÓW Data:

Test Wykonanie Suma pkt. Podpis asystenta:

Próbka [H2O2 ] mM vo (mM · min-1)

1

2

3

4

5

Próbka 1/ [H2O2] (mM-1) 1/v0 (min · mM-1)

1 2 3 4 5

Km (mM) Vmax (mM · min-1)

Z wykresu ][

11

Sversus

vo

Z obliczenia SIMFIT

kcat=

7

ĆWICZENIE III

BIAŁKA II

DATA: …………

I. Wykonanie widma absorpcyjnego roztworu albuminy surowicy wołowej – BSA.

1. Dołącz (lub narysuj) widmo absorpcyjne (190-350nm) roztworu albuminy surowicy wolowej.

2. Wskaż maksima absorbancji (max).

3. Napisz wartości długości fali, w zakresie pomiarowym, przy których obserwuje się maksimum absorbancji dla badanej próbki.

………………………..

…………………………

4. Wyjaśnij jakie może być praktyczne wykorzystanie oznaczania absorpcji promieniowania elektromagnetycznego w zakresie UV w próbkach biologicznych.

5. Na podstawie wykonanego widma absorpcyjnego roztworu albuminy surowicy wołowej – BSA, obliczyć stężenie dla badanej próbki.

Współczynnik absorbancji przy 280 nm wynosi 0,667 (mg/mL)-1 x (cm)-1

8

II. Oznaczenie stężenia białka całkowitego w surowicy krwi.

1. Oblicz zawartość białka w probówkach zawierających roztwór standardowy białka.

*BSA = albumina surowicy wołowej

2. Narysuj, na papierze milimetrowym krzywą standardową:

absorbancja przy 540nm (próbki 1-6) (rzędna) vs zawartość białka w próbce (odcięta). Dołącz wykres do sprawozdania.

3. Oblicz stężenie białka w surowicy krwi (próbka nr 7). Wynik przedstaw w następujących jednostkach: mg/mL oraz % (g na 100mL surowicy).

Białko całkowite w surowicy (mg/mL)

Białko całkowite w surowicy (%)

4. Porównaj i skomentuj swoje wyniki z prawidłowym stężeniem białka w surowicy ludzkiej, które

wynosi ................ ,

…………………………………………………………………………………………

……………………………………………………………………………………………………………...

III. Rozdział mieszaniny hemoglobiny i jonów chlorkowych na kolumnie

SEPHADEX G-25

1. Przedstaw zasadę działania sit molekularnych, stosowanych do rozdziału składników mieszaniny białek i soli. Przedyskutuj uzyskany wynik wykorzystując podstawy stosowanej techniki i krótko omów jej praktyczne wykorzystanie.

2. Przedstaw obraz rozdziału mieszaniny hemoglobiny i jonów chlorkowych uzyskany za pomocą sączenia molekularnego.

Numer probówki

Roztwór standardowy

(25 mg/mL BSA*) (L)

Surowica

(L)

Woda

(L)

Odczynnik biuretowy

(mL)

Ilość białka w próbce

(mg)

Absorbancja 540 nm

1 (kontrola)

0 0 250 1 0 0

2 25 0 225 1

3 50 0 200 1

4 75 0 175 1

5 100 0 150 1

6 125 0 125 1

7 (badana) 0 25 225 1

9

0 brak

1 niskie

2 średnie

3 wysokie

czerwony kolor- stężenie frakcji hemoglobiny

i opalizujący - osad AgCl

Objętość eluatu (mL)

WNIOSKI: ………………………………………………………………………………………………………..

………………………………………………………………………………………………………..

LICZBA PUNKTÓW Data:

Test Wykonanie Suma pkt. Podpis asystenta: