Splicing alternativo

Jorge Estefano S. de Souza

Agenda

1- Splicing Alternativo.-- Splicing.-- Tipos de Splicing Alternativos.-- Elementos Reguladores de Splicing.

2- Identificação e Anotação de Splicing Alternativo.-- Por Full-lengths e ESTs.-- Por RNA-seq.

3- Splicing alternativo e diversidade genética.

Transcrição.

Splicing.

O Splicing é um processo que remove os introns e junta os exons depois da transcrição do RNA.

Ele consiste na retirada dos íntrons de um mRNA precursor, sendo um dos processos necessários para formar um mRNA maduro funcional.

O splicing ocorre predominantemente em células eucarióticas, já que o DNA das células procarióticas não possui introns.

Splicing.

Essa excisão dos introns do mRNA é um evento muito importante e requer uma extrema precisão das moléculas envolvidas no processo. A exclusão ou o acréscimo de um único nucleotídeo em um exon pode levar a uma alteração da fase de leitura e à produção de uma proteína completamente diferente da original ou defeituosa.

Splicing.

Splicing.

Gene - um segmento de DNA ou RNA que carrega a informação genética.

Exon - a região de um gene que é traduzido em proteína.

Intron - uma região de um gene que não é traduzido em proteína

Splicing – o processo no qual os introns são removidos e exons são unidos para ser traduzido em uma única proteína

Um gene, uma proteína?

O nosso proteoma (o acervo protéico) apresenta ~100.000 proteínas!

Como o número de genes é inferior ~30.000, a resposta parece estar no "splicing".

Em 1977 foi observado por Richard Roberts e Phillip Sharp que um dado genes foi transcrito da mesma forma, mas resultou em duas moléculas de RNA maduros diferentes. Cada uma delas resultando em dois polipeptídios distintos que poderiam ter funções distintas em momentos diferentes, ou em células diferentes.

Splicing Alternativo.

Splicing Alternativo.

O processo pelo qual os exons de um pré-mRNA se ligam de maneiras diferentes durante o splicing de RNA.

Splicing alternativo é um modo comum de regulação dos genes dentro das células, sendo usado por 90-95% dos genes humanos.

Ele pode alterar drasticamente a função de um gene em diferentes tipos de tecidos  ou mesmo inativar o gene completamente .

Splicing alternativo está correlacionado com muitas doenças.

Splicing Alternativo.

Elementos reguladores.

Elementos reguladores.

Agenda

1- Splicing Alternativo.-- Splicing.-- Tipos de Splicing Alternativos.-- Elementos Reguladores de Splicing.

2- Identificação e Anotação de Splicing Alternativo.-- Por Full-lengths e ESTs.-- Por RNA-seq.

3- Splicing alternativo e diversidade genética.

Identificação de Splicing Alternativo por Full-lengths e ESTs.

Identificação de Splicing Alternativo por Full-lengths e ESTs.

Identificação de Splicing Alternativo por Full-lengths e ESTs.

Full-lengths e ESTs.

2005 56,037,734,462 52,016,762

2006 69,019,290,705 64,893,747

2007 83,874,179,730 80,388,382

2008 99,116,431,942 98,868,465

GenBank DataYear Base Pairs Sequences

Full-lengths e ESTs.

Next Generation Sequencing.

-Existem hoje no mercado 4 novos equipamentos de seqüenciamento, os quais usam tecnologias diferentes caracterizadas pela grande quantidade de dados produzidos.

Next Generation Sequencing.

-Então sem o poder computacional adequado não se tem processamento de dados e muito menos analise.

-Duas dessas tecnologias (Illumina-GLX e SOLiD) geram dezenas ou centena de gigabases de DNA por corrida.

-O processamento das seqüências geradas requerem demandas computacionais cada vez mais significativas.

Identificação de Splicing Alternativo por RNA-seq.

Não há uma maneira "correta" de analisar dados  RNA-seq .

Mas há dois métodos principais:

- Alinhamento direto de reads  (spliced  ou unspliced ) a um  genoma ou transcriptoma.

- Assembly dos reads seguido por  alinhamento.

Background.

• A primeira tarefa após obter o seus reads (de qualquer plataforma) é determinar o local correspondente no genoma de referência a partir do qual cada um deles derivam.

Denominado alinhamento genômico ou "mapeamento“.

Background.

Muitos dos alinhadores “next-gen” disponíveis, se valem de duas principais abordagens :

• Genoma "indexado" na memória: memória proporcional ao tamanho do genoma.

• Reads indexados na memória: memória proporcional ao número reads.

• Informações de pareamento é usado para selecionar a colocação ideal de reads como um par.

•Alguns podem permitir  mais mismatches, alinhamento com gap.

Background: Comuns convenções de alinhamento para  next-gen.

• Multi-map reads (reads que podem ser alinhados  em vários locais, com pontuação igual) têm apenas um local relatado.

• Alguns alinhadores permite que todos os alinhamentos sejam relatados (ou até um número máximo).

• Formato / detalhes do output  de alinhamento variam

• Muitos grupos estão começando a padronizar para formato SAM

Representação eficiente de alinhamento

Recuperação rápida, compatível com os viewers  next-gen   (por exemplo, IGV)

• Aquivo BAM é o ponto de partida para a maioria das análises .

Background: Desvantagens para cada estratégia.

1. Alinhamento no genoma. computacionalmente caro.Nunca é uma boa idéia simplesmente alinhar dados de RNA-seq  no genoma, precisa de alinhadores capazes de considera seqüências de junções exon-exon  no 'genoma').

2. Alinhamento no transcriptoma.Reads decorrentes de estruturas  não-gênica podem ser "à força" (e erroneamente) alinhado nos genes.

Valores incorretos expressão do gene. Falsos positivos SNVS. Muitos outros problemas potenciais.

3. Assembly. Baixa expressão = difícil / impossível montar.

Contigs fragmentados devido à repeats requer grandes quantidades de memória.

Background:

Background: Benefícios para cada estratégia.

1. Alinhamento no genoma. Permite o mapeamento de reads em locis não anotados. Uma melhor definição dos introns. Potencial para novas descobertas biológicas.

1. Alinhamento no transcriptoma. computacionalmente barato. Spliced (exon junção) reads mapeado corretamente. Reads pareados, distância e junção pode ajudar a distinguir isoformas.

3. Assembly. Pode fornecer uma visão mais  longa do transcrito. Permite a detecção de transcritos quiméricos. Não precisa necessariamente de um genoma.

Por que não tratar RNA-seq reads como seqüências de DNA genômico?

Reads que atravessam um ou mais junções exon-exon não vão alinhar corretamente ao genoma.

Pares de reads terão distância de pareamento maior que o esperado.

Construção das bases de dados usando informações genéticas publicamente disponíveis.

Integração

ESTs

mRNAs

SAGE

Dados genômicos

SNPs Ontologias

OMINMPSS

Mutações Array

Dados de Illumina-GLX, SOLiD, 454-Roche.

Novas Tecnologias e novos desafios.

Softwares

BWA, BWA*Novoalign, MOSAIKBowtie, TopHatSpliceMap,RNA-Mate,QPALMA

ABySS,Velvet

Trans-ABySS(uses BLAT)

ScriptureCufflinksALEXA-Seq

Image from Haas & Zody, 2010

Agenda

1- Splicing Alternativo.-- Splicing.-- Tipos de Splicing Alternativos.-- Elementos Reguladores de Splicing.

2- Identificação e Anotação de Splicing Alternativo.-- Por Full-lengths e ESTs.-- Por RNA-seq.

3- Splicing alternativo e diversidade genética.

Splicing alternativo e diversidade genética

Neste estudo nós usamos variações de nucleotídeo único (SNV) e dados de cDNAs para comparar a diversidade genética de ESRs localizados em exons constitutivos e alternativos.

Nossos resultados mostram que variações no ESSs, e não em ESEs, são mais comumente associados com splicing alternativo.

Splicing alternativo e diversidade genética

Para esse estudo oito conjuntos de elementos reguladores (seis ESEs e dois ESSs) foram obtidos. Quatro (SF2_IgM, SRP40, SRP55 e SC35) dos seis conjuntos de dados foram descobertos in vitro, utilizando a metodologia SELEX enquanto os outros dois foram descobertas in silico.

Splicing alternativo e diversidade genética

Splicing alternativo e diversidade genética

1- Classificação dos exons.

2- Identificar os eventos de splicing.

3- Mapear os ESRs nos exons

4- Mapear os SNVs nos exons

5- Mapear SNVs exonicos em ESRs motifs publicos

6- Encontrar SNVs isoforma associada e definir ESR putativos

Splicing alternativo e diversidade genética

6- Encontrar SNVs isoforma associada e definir ESR putativos

Splicing alternativo e diversidade genética

Primeiro achado:

A densidade de SNVs em exons alternativos é 10% superior quando comparada com exos constitutivos (P-valor = 2,53-102 ).

Skipping = 5,01, Criptico = 5,19 e Retenção = 5,17 SNVS por 1000 nt.

Esta diversidade genética reduzida de exons skipping em relação a outras formas de exons alternativos podem refletir uma forte restrição seletiva.

Este resultado está de acordo com os achados de Wang, E. et al., que mostrou que exons skipping são mais conservados entre quatro genomas de mamíferos.

Splicing alternativo e diversidade genética

Exons alternativos são enriquecidos em ESRs quando comparado com exons constitutivos.

Segundo achado:

Splicing alternativo e diversidade genética

Exons alternativos mostram maior proporção de ESRs modificados por SNVs que exons constitutivos.

Terceiro achado:

Splicing alternativo e diversidade genética

As observações que o exons alternativos mostram uma maior densidade de SNVS, ESRs e também uma maior proporção de ESRs modificados pela SNVS, sugerem que esta variação genética pode até certo ponto, ser um dos fatores causais que distingui splicing alternativo e constitutivo.

De fato vários estudos analisaram o impacto do polimorfismo de nucleotídeo único na regulação da expressão de isoformas de maneira tecido-específicos e não específicos e validaram alguns SNPs causais ocorrendo em reguladores de splicing.

Splicing alternativo e diversidade genética

Entre o conjunto de seqüências derivadas do SNVs isoforma-associada descobrimos que aproximadamente 86% continham pelo menos um ESR já descritos.

Um passo a mais:

Splicing alternativo e diversidade genética

Estes resultados sugerem que a influência do SNVS em alguns tipos de splicing alternativo ocorrem predominantemente através de seus efeitos sobre a ESSs.

ESS associados com splicing alternativo são mais modificado por SNVs.

Splicing alternativo e diversidade genética

Analisando a polaridade das mudanças impostas pelo SNVs podemos discriminar ainda mais o efeito do SNVS em ESSs?

T->G T

Se assumirmos que o alelo derivados aumenta a variabilidade, permitindo a utilização de alternativos exon / intron, podemos tentar entender melhor o efeito da SNVs nos ESS através da definição de um padrão de ganho ou perda ESSs com o surgimento de um alelo derivado.

Splicing alternativo e diversidade genética

T->G T

Analisando a polaridade das mudanças impostas pelo SNVs podemos discriminar ainda mais o efeito do SNVS em ESSs?

Splicing alternativo e diversidade genética

Os resultados aqui apresentados apóiam a visão de que ESRs têm uma maior diversidade genética nos exons alternativos quando comparado com exons constitutivos.

Acreditamos que esta variação genética pode ser até certo ponto uma das principais características distintivas de splicing alternativo e constitutivo.

Além disso, fornecemos evidências que esse efeito deve-se principalmente através SNVs agindo em ESSs.

Considerações Finais.