Spezialvorlesung 2004, Folie 1 Aktuelles aus der Forschung betr. Immunologie Beda M. Stadler „Blut...

Spezialvorlesung 2004, Folie 1

Aktuelles aus der Forschung betr. Immunologie

Beda M. Stadler„Blut und Abwehr“

Spezialvorlesung 2004

Lernziele• Einblick in die Forschung• Vertiefung und Vernetzung Blockinhalt• Was für eine Dissertation soll ich machen?• Wie schreibt man ein Paper?• Soll ich Forscher werden?• Grundlagen vs angewandte Forschung?


Pocken als Forschungsprojekt

• Beobachtung• Literatur• Fragestellung• Wahl der

Methoden• Finanzierung• Forschungsplan• Publikation• Umsetzung• Akkzeptanz

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Forschungsprojekt: Dissertation

• Beobachtung• Literatur • Fragestellung• Wahl der Methoden• Finanzierung• Forschungsplan• Publikation• Umsetzung• Akkzeptanz

"Pure red-cell aplasia due to

anti-erythropoietin antibodies"


FallbeschreibungEin 1915 geborener Patient wurde im April1998 wegen einer chronisch progredientenNiereninsuffizienz unserem nephrologischenAmbulatorium zugewiesen. Die Abklärungen(Normwerte in Klammern) ergaben eine chronischeNiereninsuffizienz bei beidseitigenSchrumpfnieren unklarer Ätiologie, eine normochrome,normozytäre hyporegeneratorischeAnämie: Hämoglobin 9,3 g/dl (12,3–15,8),Retikulozyten korrigiert 11‰ (5–18); einensekundären Hyperparathyreoidismus: intaktesParathormon 429 pg/ml (10–65) sowie eineleichte metabolische Azidose. Die Erythropoietinkonzentrationim Serum war mit 27,9 U/ml(40–400) bei einem Hämatokrit von 28%(41–53) erniedrigt. Die Kreatinin-Clearancebetrug 16 ml/min/1,73 m2 (70–120). Wegenweiterer Verschlechterung der Nierenfunktionwurde bei dem biologisch deutlich jüngerenPatienten im Juli 1998 eine chronische Hämodialysebehandlungeingeleitet.

Bereits im April 1998 wurde wegen der renalenAnämie bei einem Hämoglobinwert von 9,3g/dl (12,3–15,8) eine Behandlung mit Epoetinalpha (Eprex®) subkutan in einer Dosis von10000 U (138 U/kg Körpergewicht) wöchentlicheingeleitet. Wegen eines Eisenmangels –Transferrinsättigung 8,5% (20–40), Ferritin27,3 mg/l (10–330) – wurde gleichzeitig eineperorale Eisensubstitution begonnen. Unterdieser Therapie kam es innerhalb von 2 Monatenzu einem Anstieg des Hämoglobinwertesbis auf 13 g/dl. In den folgenden Monatenkonnte unter Reduktion der Epoetindosis derHämoglobinwert auf >11 g/dl eingestellt werden(Siehe nächste Folie).

Dr. Gérald Keusch, Stadtspital Waid, Zürich


Klinischer VerlaufHämoglobin (g/dl)

Retikulozyten (%0)

EPO Dosis (U/kg Körpergewicht/Woche)




Übersichtsartikel EPO? PRCA? Autoimmunität?

Originalarbeiten Methoden? In vitro/in vivo

Modelle?


Literatur1. Schellekens H. Bioequivalence and the immunogenicity of biopharmaceuticals. Nat Rev Drug Discov2002; 1:457–4622. Bergrem H, Danielson BG, Eckardt K-U, Kurtz A, Stridsberg M. A case of antierythropoietin antibodies following

recombinant human erythropoietin treatment. In: Erythropoietin: Molecular Physiology and Clinical Application. Marcel Dekker, New York, NY,1993:266–275

3. Peces R, de la Torre M, Alcázar R, Urra JM. Antibodies against recombinant human erythropoietin in a patient with erythropoietin-resistant anemia. N Engl J Med1996; 335:523–524

4. Prabhakar SS, Muhlfelder T. Antibodies to recombinant human erythropoietin causing pure red cell aplasia. Clin Nephrol1997; 47:331–335

5. Casadevall N, Dupuy E, Molho-Sabatier P, Tobelem G, Varet B, Mayeux P. Autoantibodies against erythropoietin in a case with pure red-cell aplasia. N Engl J Med1996; 334:630–663

6. Casadevall N, Nataf J, Viron B et al. Pure red-cell aplasia and antierythropoietin antibodies in patients treated with recombinant erythropoietin. N Engl J Med2002; 346:469–475

7. Krantz SB. Pure red-cell aplasia. N Engl J Med1974; 291:345–3508. Casadevall N. Antibodies against rHuEPO: native and recombinant. Nephrol Dial Transplant2002; 17 [Suppl 5]:42–47 9. Weber G, Gross J, Kromminga A, Loew HH, Eckardt K-U. Allergic skin and systemic reactions in a patient with pure red

cell aplasia and anti-erythropoietin antibodies challenged with different epoetins. J Am Soc Nephrol2002; 13:2381–238310. Gershon SK, Luksenburg H, Cote TR, Braun MM. Pure red-cell aplasia and recombinant erythropoietin. N Engl J

Med2002; 346:1584–158611. Krüger A, Schröer W, Röhrs F, Vescio G. PRCA in a patient treated with epoetin beta. Nephrol Dial Transplant2003;

18:1033–103412. Storring PL, Tiplady RJ, Gaines Das RE et al. Epoetin alfa and beta differ in their erythropoietin isoform compositions and

biological properties. Br J Haematol1998; 100:79–8913. Skibeli V, Nissen-Lie G, Torjesen P. Sugar profiling proves that human serum erythropoietin differs from recombinant

human erythropoietin. Blood2001; 98:3626–363414. Cavill I, Williams JD. Benefits of recombinant human erythropoietin. Lancet2002; 360:1606–1607

15. etc...


Haematopoiese

Erythropoietin (EPO)

EPOEPO


Erythrozytenentwicklung

Erythroblast

Retikulozyt


Sauerstoff, EPO und die Niere


EPO Produktion

peritubuläresKapillarnetzwerk

Interstitielle Zellen des peritubulären Kapillar- netzwerks der Niere produzieren EPO


Erythropoietin (EPO)

EPO ist ein Zytokin,wird rekombinant hergestellt


Therapeutische Eiweisse


Anaemie

• Häufig assoziert mitschweren Nierenschäden

• Symtome: Müdigkeit, Atemnot und verminderte Mobilität

• Der primäre Defekt ist ein EPO Mangel

• Konservative Behandlung mit Eisen und Folsäure • Blut Transfusionen bei schweren Anaemien

(Risiko: Eisen Überdosierung, Infekte und Allosensibilisierung)


Pure Red Cell Aplasia (PRCA)

• PRCA– sehr selten – selektiver Defekt des

Konochenmarks in der Erythrozyten Produktion

• Schwere Anaemie, weisse Blutzellen und Plättchen normal

• Zwei Typen– congenital– erworben


Infektionen

Thymoma

Haematologische Malignien

Solide Tumoren

Nierenversagen

Rheumatologische Krankheiten

Schwerer Ernährungsmangel

ABO-inkompatible Knochenmark Transplantation

Schwangerschaft

Idiopathisch

Medikamente (EPO?)

Gründe: erworbene PRCA

Antikörper

gemeinsamerNenner?


Antikörper gegen Zytokine?

z.B. anti-InsulinAntikörper gegen

natürliches undrecombinantesInsulin

“anti-insulin” in 95 hits


Antikörper & therap. Proteine1/100,000 1/10,000 1/1,000 1/100 1/10 1/11/1,000,000

2

4 5 1

3

6

7

8

9

10

1414

12

11

13

94 rHu-growth hormone rHu-erythropoietin scrHu-TPA 1414

61 Bovine insulin Salmon calcitonin 11 IFN alfa 2b

72 Porcine insulin 12GM-CSF IFN beta 1a, 1b

3 138rHu-insulin rHu-factor VIII IL-2

105 Gonadotropin-releasing hormone IFN alfa 2a

rHu=recombinant humanrHu=recombinant human




Gibt es natürliche Antikörper gegen EPO?


Was verursacht eine PRCA?

• Immunisierung?• Präexistierende natürliche

anti-EPO Autoantikörper?• existiert eine

Autoimmunkrankheit?• Induzieren Blutransfusionen

eine PRCA?• Moleculares Mimikry durch

Xenoantigene?


Anti-EPO Antikörper

Zucker oder Eiweiss? Spezifität und pathophysiologische Rolle?

EPOEPO


Physiologische Rolle




Hypothese ablehnen Negative Kontrolle

Hypothese bestätigen Positive Kontrolle

Laborausrüstung Geräte Know How

Bewilligungen Tierversuche Einschlussverordnung


Antikörper Nachweis

ELISAEnzyme Linked ImmunoSorbent Assay

Antigen (EPO)

Spez. Antikörper

Enzym markierterAntikörper Substrat

farblos

farbig


Affinitätschromatographie

Antigen (EPO)Antigen (EPO)

Gel (Agarose)

AntiserumAntiserumSalz

SpezifischeSpezifischeAntikörperAntikörperSerumbestandteileSerumbestandteile

und ungebundene Antikörperund ungebundene Antikörper


Neutralisierendes Epitop


anti-EPO Antikörper

EPO abhängigeTF-1 Zellen mit EPO Rezeptor rhEPO

Negative Kontrolle

Positive Kontrolle

AntikörperTest

Neutralisierende Antikörper

Funktionelle Assays




Ethik Wissensch. Freiheit Staatl. Förderung

SNF CTI/KTI Inst. Budget

Private Förderung Stiftungen Industrie


Wer bezahlt die Forschung?



• Beobachtung• Literatur • Fragestellung• Wahl der


Methoden Etablierung

Pilotexperimente Resultate go/no go Entscheide


Anti-EPO in normalen Seren

Blut Spender

Normal(n=17)

SLE(n=22)

Rheumatic (n=50)

Allergic (n=21)

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7A

nti-E

PO A

ntik

örpe

r (EL

ISA

)


IVIG

330ml (11.2 g)Elution (pH=2.75)

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18Fraction No.

OD

280

EPO-Säule

EPO Affinitätssäule

1.125 mg


Gereinigte anti-EPO Antikörper

Effluent der rhEPO-Säule

Eluate der rhEPO- Säule

0

0.5

1

1.5

0.1 1 10 100 1000

Antikörper Konzentration mg/ml

OD

450Fractionen Test

im EPO ELISA


Neutralisierende anti-EPO

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

neg. Contr. pos. Contr. neutral.anti-EPO

normalerAntikörper

EPO 0.1U/mlGM-CSF 0.1ng/ml

100% Hemmung

Zellp

rolif

erat

ion

OD

562-

650




Wie schreibt manein Paper?

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Wie schreibt man ein Paper

Schreiben Publizieren• Resultate• Diskussion• Einführung• Zusammenfassung• Referenzen• Fussnoten• Titel

• Titel• Zusammenfassung• Einführung• Resultate• Diskussion• Referenzen• Fussnoten




Patent? Produkt? Businessplan? Finanzierung? Kommunikation Marketing


Innovationsprozess

Grundlagenforschung

Angewandte Forschung F&E

Wissens-Valorisierung

Mar

ktId

eeScience to Market


“The valley of Death”

(t)0- 3- 10 + 3

Grundlagen-forschung

(CHF)

? Markt


Zusammenfassung

• Beobachtung• Literatur • Fragestellung• Wahl der


Wer vertritt die Wissenschaft?

Raus aus dem Elfenbeinturm

Proaktive Kommunikation


Proaktive Kommunikation

Fragen?

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