Spettroscopie biologiche

•Tecniche di assorbimento–IR –UV-Vis–Dicroismo circolare–Assorbimento atomico

•Tecniche di emissione–Fluorescenza–Emissione atomica

•Tecniche di diffusione–Light scattering–Raman–Resonance raman

Spettroscopia vibrazionale (IR)

IR transparent Salt PlatesIR transparent Salt Plates

Light PathLight Path(shown by red line)(shown by red line)

Spettroscopia UV-Vis

E

n

* n *

C=C (-*) 62 000 cm-1 160 nm H2O (n-*) 60 000 cm-1 167 nm C=O (n-*) 34 000 cm-1 295 nm

h

Orbitali di Frontiera

HOMO: Highest Occupied Molecular OrbitalLUMO: Lowest Unoccupied Molecular Orbital

Spettro di assorbimento della clorofilla:

Sono visibili due transizioni principali a 670 nm (rosso) e 430 nm (blu).

fond

ecc

I0()I)

lCA

IIA

0log

l

C =concentrazione

Legge di Lambert-Beer:

I0()

Cromofori nelle proteine

Il legame peptidico (210

nm)

Ponte disolfuro(250 nm)

Centrato a 280 nm

Dicroismo circolare (CD)

Cromofori in ambienti asimmetrici assorbono in modo diverso radiazioni

polarizzate circolarmente in senso opposto

Ellitticità in relazione alla legge di Lambert-Beer

[] = 3298 ∆

A = Al - Ar = llc - rlc = lc

• Legame peptidico (180 - 250 nm)

• Residui aromatici (250 - 350 nm)

Curve di denaturazione termica di proteine

Fluorescenza

Spettrofotofluorimetro

SorgenteMonocromatori

Io λ1

Detector

Campione

Luce emessa, λ2

Spettri di eccitazione e spettri di emissione

Nuclease Folded protein

Unfolded protein

Typical result:

FRET