Spektrometria mas
description
Transcript of Spektrometria mas
Spektrometria masSpektrometria mas
ZNACZĄCE POSTACIE SPEKTROMETRII MASZNACZĄCE POSTACIE SPEKTROMETRII MAS
1st MSJoseph John Thomson (1856 - 1940) Cambridge University, Great Britain; Nobel Prize in Physics 1906
Ion ChemistryFrancis William Aston(1877 - 1945)Cambridge University, Great Britain; Nobel Prize in Chemistry 1922
Ion Trap Technique Wolfgang Paul(1913 - 1993) University of Bonn, Germany; Nobel Prize in Physics 1989
ESI of Biomolecules John B. Fenn (1917)Virginia Commonwealth University, Richmond, Virginia
Fragmentation MechanismsFred W. McLafferty(1923)Cornell UniversityIthaca, New York
Peptide Sequencing using MSKlaus Biemann (1926)MIT, Cambridge, Massachusetts
MALDIFranz Hillenkamp (1936)University of Münster, Germany
Mechanisms and ApplicationsR. Graham Cooks (1941)Department of Chemistry, Purdue UniversityWest Lafayette, Indiana
Mechanism of MALDI & ESIMichael Karas (1952)University of Frankfurt, Germany
Joseph Thompson: IZOTOPY HELUJoseph Thompson: IZOTOPY HELU
1911
ZASADA POWSTAWANIA WIDMA MASZASADA POWSTAWANIA WIDMA MAS
Droga jonów w polu elektrycznym i magnetycznym: rezultatDroga jonów w polu elektrycznym i magnetycznym: rezultatdziałających sił:działających sił:
• Siła pola magnetycznegoSiła pola magnetycznego (F (Fmm))• Siła odśrodkowaSiła odśrodkowa (F (Fcc))• Energia kinetyczna w polu elektrycznymEnergia kinetyczna w polu elektrycznym (E) (E)
Fmm = Bev B = natężenie pola magnetycznego
Fcc = mv2/r v = prędkość cząstkiEk = eU = ½ mv2 e = ładunek jonu
m = masa cząstki r = promień toru U = natężenie pola elektrycznegoEk = energia kinetyczna cząstki
2
222
2m
reBmeU
FFmm = F = Fcc
BBev = mvev = mv22//rr
v = v = BBer/mer/m
2U
rB
e
m 22
ZASADA POWSTAWANIA WIDMA MASZASADA POWSTAWANIA WIDMA MAS
WIDMO MASOWEWIDMO MASOWE
Stosunek masy jonu do jego ładunku w funkcjiintensywności sygnału
m/z
Inte
nsy
wn
ość
1 Th = 1 1 Th = 1 Dalton/liczbę ładunków/liczbę ładunków
MASY ATOMOWE - IZOTOPYMASY ATOMOWE - IZOTOPY
Węgiel 12C 12.0000* 98.89
13C 13.0033 1.11
Chlor 35Cl 34.9689 75.77
37Cl 36.9659 24.23
* Masa uznana jako dokładnie 12 przez UPAC
Symbol Masa atomowa Zawartość izotopu, %
M(C) = 0.9889(12.0000) + 0.0111(13.0033) = 12.011
M(Cl) = 0.7577(34.9689) + 0.2423(36.9659) = 35.453
SKŁAD IZOTOPOWY NIEKTÓRYCHSKŁAD IZOTOPOWY NIEKTÓRYCH PIERWIASTKÓWPIERWIASTKÓW
11HH 1.0081.008 1.007831.00783 99.9999.9922HH 2.014102.01410 0.0160.016
1212CC 12.01112.011 12.0000 (std)12.0000 (std) 98.8998.891313CC 13.0033613.00336 1.11 1.11
1414NN 14.006714.0067 14.0031 14.0031 99.6499.641515NN 15.000115.0001 0.36 0.36
1616OO 15.999415.9994 15.9949 15.9949 99.7699.761717OO 16.999116.9991 0.04 0.041818OO 17.999217.9992 0.20 0.20
1919FF 18.99818.998 18.998418.9984 100.0100.0
2828SiSi 28.085528.0855 27.9769 27.9769 92.1792.172929SiSi 28.976528.9765 4.71 4.713030SiSi 29.973829.9738 3.12 3.12
3232SS 32.06632.066 31.9721 31.9721 9955..00443333SS 32.971532.9715 0.76 0.763434SS 33.967933.9679 4.20 4.20
3535ClCl 35.452735.4527 34.9689 34.9689 75.7775.773737ClCl 36.965936.9659 24.2324.23
SKŁAD IZOTOPOWY NIEKTÓRYCHSKŁAD IZOTOPOWY NIEKTÓRYCH PIERWIASTKÓWPIERWIASTKÓW
SKŁAD IZOTOPOWY NIEKTÓRYCHSKŁAD IZOTOPOWY NIEKTÓRYCH PIERWIASTKÓWPIERWIASTKÓW
3131PP 30.973830.9738 30.9738 30.9738 100.0100.0
7979BrBr 79.909479.9094 78.9183 78.9183 50.5250.528181BrBr 80.916380.9163 49.4849.48
126126II 126.9045126.9045 126.9045 126.9045 100.00100.00
M(Br):M(Br): [% [% 7979Br x 78.9183] + [% Br x 78.9183] + [% 8181Br x 80.9163] Br x 80.9163]
[50.52 x 78.9183] + [49.48 x 80.9163] = 79.9094[50.52 x 78.9183] + [49.48 x 80.9163] = 79.9094
SKŁAD IZOTOPOWY NIEKTÓRYCHSKŁAD IZOTOPOWY NIEKTÓRYCH PIERWIASTKÓWPIERWIASTKÓW
C1 C10 C100
m/z R.I.
X 100
X+1 1.1
m/z R.I.
X 100
X+1 11.0
m/z R.I.
X 100
X+1 110
X+2 60
X+3 22
m/z
SKŁAD IZOTOPOWY – OBWIEDNIA IZOTOPOWASKŁAD IZOTOPOWY – OBWIEDNIA IZOTOPOWA
Masa cząsteczkowa respiryny C33H40N2O9
Masy atomowe: Masy izotopów:
C: 33 x 12.011 = 396.363 C: 33 x 12.0000 = 396.000
H: 40 x 1.0079 = 40.316 H: 40 x 1.0078 = 40.312
N: 2 x 14.0067 = 28.013 N: 2 x 14.0031 = 28.006
O: 9 x 15.9994 = 143.995 O: 9 x 15.9949 = 143.954
608.687608.687 608.272608.272
MASA CZĄSTECZKOWA MASA CZĄSTECZKOWA
MASA MONOIZOTOPOWAMASA MONOIZOTOPOWA
PORÓWNANIE PROFILU IZOTOPOWEGO PORÓWNANIE PROFILU IZOTOPOWEGO WIDMA ZMIERZONEGO I OBLICZONEGOWIDMA ZMIERZONEGO I OBLICZONEGO
WIDMO MAS A STRUKTURA MOLEKUŁYWIDMO MAS A STRUKTURA MOLEKUŁY
Jonizacja cząsteczek wiązką elektronów
RODZAJE JONIZACJIRODZAJE JONIZACJI
Miękka
Twarda
METODY JONIZACJIMETODY JONIZACJI
WIDMO EI KWASU OCTOWEGOWIDMO EI KWASU OCTOWEGO
ZALEŻNOŚĆ STOPNIA FRAGMENTACJIZALEŻNOŚĆ STOPNIA FRAGMENTACJI OD SIŁY POLA ELEKTRYCZNEGOOD SIŁY POLA ELEKTRYCZNEGO
To MS
Orifice Plate
Curtain Plate
Drying Gas
Curtain Gas
LC
Droplet Formation
Desolvation & Fission
Gas Phase Ion Generation
5kV
Nebulizing Gas
ESIESI
++
+++
REDUKCJA KROPLI I POWSTAWANIE JONÓWREDUKCJA KROPLI I POWSTAWANIE JONÓW
ESIESI
Tryb jonów dodatnich
Tryb jonów ujemnych
[M+H]+
[M+nH]n+ i [M+Na+]+
[M-H]-
•[M-nH]n- i [M+I-]-
• PotrójnyPotrójny KwaKwadrupol (QqQ)drupol (QqQ)– 2 kwadrupole filtrujące masy i jedna cela
zderzeń.
• Pułapka jonowaPułapka jonowa (IT) (IT)– Pojedyncza pułapka działa jako analizator
mas i cela zderzeń.
• HybrydyHybrydy ( (npnp. LIT). LIT)– Instrument wygląda jaki QqQ ale jeden
kwadrupol pełni rolę pułapki jonów.
ESIESI
Q1 Q2 Q3Q0
Cela zderzeńFiltrowanie jonów Filtrowanie jonów
POTRÓJNY KWADRUPOLPOTRÓJNY KWADRUPOL
Akumulacja jonów
• Q1 selkcjonuje [M+H]+ • Q2 fragmentuje wyselkcjonowany jon.• Q3 filtruje i monitoruje tylko wybrany jon.
Q0 Q1 Q2 Q3
N2 CAD Gas
Precursor ion selection
Ion accumulation
Fragmentation
POTRÓJNY KWADRUPOLPOTRÓJNY KWADRUPOL
WIDMO ESI ZWIĄZKU O NISKIEJ MASIEWIDMO ESI ZWIĄZKU O NISKIEJ MASIE
WIDMO ESI SYNTETYCZNEGO WIDMO ESI SYNTETYCZNEGO OLIGONUKLEOTYDUOLIGONUKLEOTYDU
WIDMO ESI KOMPLEKSÓW 18-C-6 WIDMO ESI KOMPLEKSÓW 18-C-6 Z KATIONAMI LITOWCÓWZ KATIONAMI LITOWCÓW
WIDMO ESI PEPTYDU O MASIE 16952,20 DaWIDMO ESI PEPTYDU O MASIE 16952,20 Da
ROZDZIELCZOŚĆ SPEKTROMETRU MASROZDZIELCZOŚĆ SPEKTROMETRU MAS
FRAGMENTACJA ŁAŃCUCHA PEPTYDOWEGOFRAGMENTACJA ŁAŃCUCHA PEPTYDOWEGO
y3
b2
y2 y1
b3a2 a3
HO NH3+
| |
R1 O R2 O R3 O R4
| || | || | || |H -- N --- C --- C --- N --- C --- C --- N --- C --- C --- N --- C -- COOH | | | | | | | H H H H H H H
b2-H2O
y3 -H2O
b3- NH3
y2 - NH3
FRAGMENTACJA ŁAŃCUCHA PEPTYDOWEGOFRAGMENTACJA ŁAŃCUCHA PEPTYDOWEGO
FRAGMENTACJA ŁAŃCUCHA PEPTYDOWEGOFRAGMENTACJA ŁAŃCUCHA PEPTYDOWEGO
G V D L K
mass0
Inte
nsity
mass0
MS/MSIdentyfikacja
peptydu
IDENTYFIKACJA PEPTYDÓW/BIAŁEK PRZYIDENTYFIKACJA PEPTYDÓW/BIAŁEK PRZY UŻYCIU MS/MSUŻYCIU MS/MS
TANDEM MSTANDEM MS
Peptide Mass Fingerprinting (PMF)
„„ODCISK PALCA” W MSODCISK PALCA” W MS
p53
G6PDH
Trypsin+ Gel punch
PROTEOMIKA - MSPROTEOMIKA - MS
Trx
MPSER……
GTDIMRPAKID
……
HPLCdo MS/MSMPSERGTDIMRPAKID......
BIAŁKOBIAŁKO PEPTYDYPEPTYDY(tryptic peptides)(tryptic peptides)
ENZYMATYCZNA HYDROLIZA BIAŁEK ENZYMATYCZNA HYDROLIZA BIAŁEK DO PEPTYDÓWDO PEPTYDÓW
>Białko 1acedfhsakdfqeasdfpkivtmeeewendadnfekqwfe
>Białko 2acekdfhsadfqeasdfpkivtmeeewenkdadnfeqwfe
>Białko 3MASMGTLAFD EYGRPFLIIK DQDRKSRLMG LEALKSHIMA AKAVANTMRT SLGPNGLDKMMVDKDGDVTV TNDGATILSM MDVDHQIAKL MVELSKSQDD EIGDGTTGVV VLAGALLEEAEQLLDRGIHP IRIAD
Sekwencja Masa (M+H) Peptydy trypt.
4842.05
4842.05
14563.36
acedfhsakdfgeasdfpkivtmeeewendadnfekgwfe
acekdfhsadfgeasdfpkivtmeeewenkdadnfeqwfe
SQDDEIGDGTTGVVVLAGALLEEAEQLLDR2DGDVTVTNDGATILSMMDVD HQIAKMASMGTLAFDEYGRPFLIIK2TSLGPNGLDKLMGLEALKLMVELSKAVANTMRSHIMAAKGIHPIRMMVDKDQDR
BIBLIOTEKA PEPTYDÓW TRYPTYCZNYCHBIBLIOTEKA PEPTYDÓW TRYPTYCZNYCH
RT: 0.01 - 80.02
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80Time (min)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Relati
ve Ab
undanc
e
13891991
1409 21491615 1621
14112147
161119951655
15931387
21551435 19872001 21771445 1661
19372205
1779 21352017
1313 22071307 23291105 17071095
2331
NL:1.52E8
Base Peak F: + c Full ms [ 300.00 - 2000.00]
S#: 1708 RT: 54.47 AV: 1 NL: 5.27E6T: + c d Full ms2 638.00 [ 165.00 - 1925.00]
200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000
m/z
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
850.3
687.3
588.1
851.4425.0
949.4
326.0524.9
589.2
1048.6397.1226.9
1049.6489.1
629.0
LC
S#: 1707 RT: 54.44 AV: 1 NL: 2.41E7F: + c Full ms [ 300.00 - 2000.00]
200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000
m/z
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
Rel
ativ
e Ab
unda
nce
638.0
801.0
638.9
1173.8872.3 1275.3
687.6944.7 1884.51742.11212.0783.3 1048.3 1413.9 1617.7
MS
MS/MSIon
Source
MS-1collision
cell MS-2
TANDEM MSTANDEM MS
SSeekkwweennccjjaa
S#: 1708 RT: 54.47 AV: 1 NL: 5.27E6T: + c d Full ms2 638.00 [ 165.00 - 1925.00]
200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000
m/z
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
Rel
ativ
e Ab
unda
nce
850.3
687.3
588.1
851.4425.0
949.4
326.0524.9
589.2
1048.6397.1226.9
1049.6489.1
629.0
MS/MS instrumentMS/MS instrument
Analiza przy użyciu baz danych
ANALIZA DANYCHANALIZA DANYCH
PMF online• Mascot
• www.matrixscience.com
• ProFound– http://129.85.19.192/profound_bin/WebProFound.exe
• MOWSE• http://srs.hgmp.mrc.ac.uk/cgi-bin/mowse
• PeptideSearch• http://www.narrador.embl-heidelberg.de/
GroupPages/Homepage.html
• PeptIdent• http://us.expasy.org/tools/peptident.html