Spektrometria mas MALDI-TOF/TOF

Warszawa, 16.04.2012

Kazimierz DąbrowskiKatedra Chemii i Technologii PolimerówWydział Chemiczny PW

Rok Odkrycie Nazwiska badaczy1911 Zbudowanie pierwszego spektrometru mas Joseph John Thomson1918 Opracowanie źródła jonów EI Arthur Jeffrey Dempster1930 Zastosowanie spektrometrii mas w chemii organicznej R. Conrad1942 Pierwszy sprzedany spektrometr mas Consolidated Energy Corporation1946 Analizator czasu przelotu (TOF) William E. Stephens

1953 Spektrometr o podwójnym ogniskowaniu E. G. Johnson i A. O. Nier

1953 Kwadrupolowy analizator masy W. Paul i H. Steinwedel1958 Połączenie spektrometru mas z chromatografem gazowym (GC)

1966 Sekwencjonowanie peptydów przy pomocy spektrometru mas K. Biemann, C. Cone, B. R. Webster i B. P. Arsenault

1966 Jonizacja Chemiczna (CI) B. Munson i F. H. Field1968 Jonizacja przez Elektrorozpylanie (ESI) Malcom Dole1981 Metoda jonizacji przez bombardowanie szybkimi atomami (FAB) Michael Barber

1983 Opracowanie metody jonizacji przez desorpcję laserem przy udziale matrycy – MALDI (Nagroda Nobla z Chemii w 2002 roku)

Koichi Tanaka, Michael Karas i Franz Hillenkamp

1984 Pułapka jonowa G. C. Statford, P. E. Kelly, J. E. P. Syka, W. E. Reynolds i J. F. J. Todd

1984 Wykorzystanie elektrorozpylania (ESI) do analizy biopolimerów (Nagroda Nobla w 2002 roku) Gall Lydia (ZSRR), John Fenn (USA)

Najważniejsze odkrycia w historii spektrometrii mas

Spektrometr masowy – instrument pozwalający na precyzyjny pomiar stosunku masy do ładunku (m/z) analizowanych substancji.

Rozdzielczość spektrometru – wartość liczbowa informująca o możliwości rozróżnienia na widmie masowym pików o zbliżonych masach. W przypadku pojedynczego piku wartość określająca dokładność oznaczenia masy cząsteczkowej (atomowej) substancji analizowanej.Jeśli spektrometr masowy w danym momencie analizy posiada rozdzielczość R=1000 istnieje możliwość rozróżnienia pików o m/z=1000 oraz m/z=1001. Dla izolowanego piku rozdzielczość definiuje jego szerokość połówkową, tzn. dla R=1000 i piku o m/z=1000 stosunek jego wysokości do szerokości w 0,5 wysokości wynosi co najmniej 10 (H/L0,5h>=10)

Jon molekularny – jon obdarzony ładunkiem (ładunkami) powstający w wyniku fragmentacji próbki w źródle jonów

Jon fragmentacyjny – jon powstały w wyniku spontanicznej fragmentacji substancji (np. podczas jonizacji metodą EI) lub uzyskany techniką tandemowej spektrometrii masowej. Dostarcza informacji o strukturze substancji analizowanej.Addukt - jon powstały poprzez przyłączenie do analizowanej substancji np. jonu sodowego

Proteom - PROTEin complement of the genOME (ogół białek kodowanych przez genom)Dalton - jednostka masy, dokładnie odpowiada 1,0000 na skali mas atomowych

Dekonwolucja - uzyskanie rzeczywistej masy substancji z widma pików wielokrotnie zjonizowanych

Matryca - niskocząsteczkowe związki organiczne absorbujące promieniowanie lasera.

Podstawowe definicje

Najczęściej stosowane skróty

EI (Electron Impact) - jonizacja elektronami

MALDI (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization) - jonizacja laserem wspomagana matrycą

ESI (Electrospray Ionization) - jonizacja przez rozpylanie w polu elektrycznym

HPLC (High Performance Liquid Chromatography) - wysokosprawna chromatografia cieczowa)

MS/MS (Tandem Mass Spectrometry) - tandemowa spektrometria masowa

TOF (Time of Flight Analyser) - analizator czasu przelotu

PSD (Post Source Decay) - rozpad poza źródłem jonów

m/z - stosunek wartości masy do liczby ładunków

DIOS (Desorption/Ionization on Porous Silicon) - desorpcja/jonizacja na porowatym krzemie

ICP (Inductively Coupled Plasma) - jonizacja plazmą wzbudzoną indukcyjnie

Idea działania spektrometru mas

• źródło jonów – urządzenie, w którym następuje jonizacja cząsteczek przy użyciu różnorodnych technik, z których część prowadzi do pękania wiązań chemicznych na skutek czego dochodzi do ich podziału na mniejsze fragmenty. Inne techniki powodują tylko naładowanie cząsteczek bez ich fragmentacji,

• analizator – w którym wcześniej powstałe jony ulegają rozdziałowi na podstawie stosunku ich masy do ładunku.

• detektor – urządzenie "zliczające" jony napływające z analizatora.

Jonizacja próbki

Twarda technika jonizacjiJon molekularny typu [M+.]Bogate widmo fragmentacyjne

Łagodna technika jonizacjiPozorny jon molekularny [M+H]+ lub [M-H]-

Brak fragmentacji

Jonizacja próbki cd.

Jonizacja próbki – lasery używane w technice MALDI

Nitrogen laser:pro: well structured energy profilecontra: slow (maximum 50Hz)

Nd:YAG laser:pro: fast (up to 1000Hz)contra: Gaussian energy profile (non-structured)

Smartbeam/Smartbeam II(modified Nd:YAG laser):pro: fast (up to 1000Hz)pro: well structured energy profile

A. Holle, A. Haase, M. Kayser, J. Höhndorf, Journal of Mass Spectrometry, 41, 705-716 (2006)

Matryce

Procesy zachodzące pod wpływem impulsu laserowegoAbsorpcja promieniowania głównie przez materiał matrycy.Odparowanie próbki na głębokość 2-3 l i wyrzucenie strumienia gazów prostopadle do jej powierzchni.Dysocjacja termiczna matrycy.Tworzenie jonów (głównie H+, Na+, K+).Reakcje jonów z badaną substancją i matrycą. Możliwe drogi:- dysocjacja termiczna z utworzeniem pary kation-anion- oderwanie elektronu- oderwanie bądź przyłączenie protonu- przyłączenie kationu bądź anionu

Matryce

Pożądanymi cechami matrycy MALDI są:•dość niska masa cząsteczkowa, co sprzyja łatwemu odparowaniu, ale wystarczająco duża, by odparowanie nie nastąpiło przed pomiarem, np. w czasie przygotowywania próbki;

•rozpuszczalność w rozpuszczalniku kompatybilnym z analitem;

•kwasowość, by ułatwić protonowanie cząsteczek analitu;

•obecność grup polarnych (hydrofilowych) w cząsteczce, co umożliwia rozpuszczanie matrycy w roztworach wodnych;

•stabilność w warunkach wysokiej próżni;

•wspomaganie jonizacji analitu;

•zdolność intensywnej absorpcji promieniowania UV lasera; zwykle wymóg ten spełnia związek, posiadający układ sprzężonych wiązań podwójnych C=C (dlatego często matrycami są pochodne aromatycznych kwasów karboksylowych, często nienasyconych, np. kwasu cynamonowego).

Matryce

Sinapic acidKwas 3-5-dimetoksy-4-hydroksy cynamonowy

SINAproteiny

Gentisic acidKwas 2-5-dihroksy benzoesowy

DHBpeptydy

2-(4-Hydroxyphenylazo)benzoic acidKwas 2-(4-hydroksyfenylazo)- benzoesowy

HABAPeptydy, polimery

Dithranol1,8-Dihydroksyantracen-9(10H)-on

DITpolimery

α-Cyano-4-hydroxycinnamic acidKwas α-Cyano-4-hroksy cynamonowy

CHCA, α-CHCAPeptydy, lipidy

2,4,6-Trihydroxyacetophenone2,4,6-trihroksy acetofenon

THAPoligonukleotydy

Tryb liniowy

Tryb liniowy

Jak zwiększyć rozdzielczość?

• Pulsed ion extraction – polepszenie ogniskowania jonów

• Optymalizacja przygotowania próbki – homogenizacja

• Użycie reflektronu

Optymalne przygotowanie próbki

Najczęściej stosowane metody nanoszenia próbki (analitu i matrycy) to:

1. Metoda wysychającej kropli (dried droplet method) – jednowarstwowa:Przyrządza się osobno roztwór próbki i roztwór matrycy w tym samym rozpuszczalniku, lub – jeśli to niemożliwe – w dwóch kompatybilnych; niekiedy jeszcze używa się trzeciego roztworu - środka kationizującego, np. soli metalu (możliwe są różne rozpuszczalniki i stężenie). Wszystkie roztwory miesza się, a uzyskaną mieszaninę (0,5÷1 μl) umieszcza na płytce MALDI (MALDI target) i pozostawia do wyschnięcia na powietrzu. Wadą tej metody jest powolne wysychanie próbki, co może prowadzić do rozdzielenia kryształów matrycy próbki i soli kationizującej.Modyfikacjami tej metody są: zastosowanie odparowywania próżniowego lub odparowywanie w strumieniu ultraczystego azotu. W obu przypadkach otrzymuje się drobniejsze kryształy, lepszą rozdzielczość i powtarzalność oraz intensywność sygnałów.

2. Metoda cienkiej warstwy (thin-layer method) – dwuwarstwowa:Roztwór matrycy w odpowiednim rozpuszczalniku (np. dla CHCA – roztwór nasycony w acetonie) nanosi się na płytkę MALDI i pozwala mu się wyschnąć, otrzymując cienką warstwę matrycy. Następnie 1 μl roztworu analitu nanosi się na wierzch uzyskanej powierzchni matrycy i suszy.

3. Nanoszenie przez rozpylanie. Wariantami tej metody są: osadzanie strumieniem powietrza (air spray deposition) i osadzanie przez elektrosprej (electrospray sample depositon).

4. Metoda mieszania ciał stałych (solid/solid sample preparation):Metoda polega na bardzo dokładnym mieszaniu drobno sproszkowanych matrycy i próbki (bez rozpuszczalnika) i prasowaniu całości w pastylkę. Stosuje się ją dla niektórych poliamidów, nierozpuszczalnych w pospolitych rozpuszczalnikach organicznych

Epot = zeU Ekin = 1/2mv2

zeU = 1/2mv2 v = (2zeU/m)1/2

t = L×(1/2eU)1/2×(m/z)1/2

Tryb reflektronu

Tryb reflektronu

Profil izotopowy

Profil izotopowy

C41H69N13O14S[M+H]+: 1000.4880[M+H]+: 1001.1409

C112H164N29O34S2

[M+H]+: 2524.1510[M+H]+: 2525.8196

C253H363N55O75S[M+H]+: 5404.6075[M+H]+: 5407.9984

Masa monoizotopowaMasa średnia

Kalibracja

tof= tdelay + tacc + tdrift

F = E q = M a

tacc = d √(2m/Uze)

d = a/2 tacc2 E = U/d q = z e

tdrift= L √(m/2zeU)

tof=tdelay + d √(2m/Uze) + L √(m/2zeU)

tof=tdelay + (d √(2/Ue)+L √(1/2Ue)) × √(m/z)

t = C0+C1√(m/z)

MALDI–ToF/ToF

Ion path in TOF1 region (linear TOF)Ion path in TOF2 region (reflectorTOF)Ion source1 = MALDI ion sourceIon source2 = LIFT re-acceleration cellPCIS = Timed ion gatePLMS = Post LIFT meta stable suppressor

MALDI–ToF/ToF

Montaudo G, J. Polym. Sci. A: Polym. Chem. 34, 1996, 439-447

Za pomocą MALDI można wyznaczyć następujące parametry polimerów:• Mn, Mw, PD• grupy końcowe polimeru• budowę kopolimeru

MALDI–ToF w badaniach polimerów

A6B4C

A7B3C

A8B2C

A9BC

A10C

A7B4C

A8B3C

A9B2C

A10BC

A11C

A8B4C

A9B3C

A10B2C

A11BC

A11C

A B C

Polimery polarne: poliwęglany, politlenki olefin Polikwasy, poliestry, polimery słabo polarne (np. polistyren) Polisacharydy, teflon, poliolefiny

mass discrimination effect

Liu, J.; Loewe, R. S.; McCullough, R. D. Macromolecules1999, 32, 5777 -5785.

MALDI mass spectra of a poly(alkylthiophene) fractionated with acetone, hexanes, methylene chloride, THF, and chloroform

• Badane mogą być związki stałe, ewentualnie ciecze nielotne (ciśnienie w komorze pomiarowej < 10-7 Torr).• Do pomiaru używamy zazwyczaj 5 mg substancji. Próbki można dostarczać albo już odważone (proszę podać masę

próbki), lub w większych pojemnikach.• W razie tzw. wyższej konieczności do pomiaru wystarczy: substancji typu biologicznego (np. peptydu) 0,1 - 10 pmol,

polimeru 50 - 200 pmol.• Można również dostarczyć próbkę w postaci roztworu w dowolnym, ale koniecznie lotnym i niekorodującym

rozpuszczalniku (prosimy o podanie stężenia roztworu !)• Możliwy jest pomiar próbki nierozpuszczalnej, ale wówczas musi być ona w postaci możliwie drobnego proszku.

Należy jednak podkreślić, że wyniki takiego pomiaru będą znacznie gorszej jakości, niż próbek rozpuszczalnych.• Kategorycznie odmawiamy przyjmowania podejrzanych, dymiących cieczy zawierających stężone lotne kwasy (np.

HCI, HNO3) oraz substancji korodujących typu POCI3, wolne aminy, fenole, merkaptany itd.• Aby proces tworzenia jonów przebiegał możliwie wydajnie, próbka powinna być jak najczystsza. W szczególności

nie powinna zawierać:• nadmiaru soli nieorganicznych z grupy litowców i miedziowców,• detergentów !!!,• buforów, zwłaszcza fosforanowych,• substancji silnie alkalizujących (reagują z matrycą),

• W przypadku polimerów, co do których zachodzi podejrzenie, że mogą zawierać frakcje znacznie różniące się masą cząsteczkową ( np. Mn = 1 500 i Mn = 30 000) niezbędne jest wstępne rozdzielenie próbki na frakcje.

• Prosimy o podanie spodziewanej masy cząsteczkowej, bądź przynajmniej zakwalifikowanie próbki do jednego z następujących przedziałów: < 5000; 5000-20000; > 20000

• Do badanej próbki (lub grupy próbek) prosimy dołączyć „Zlecenie wykonania badania MALDI-ToF” (druk dostępny na stronie: www.ch.pw.edu.pl/~maldi )

Wskazówki dla PT Klientów

• M. Karas, D. Bachmann, F. Hillenkamp; Analytical Chemistry, 57, 2935-2939 (1985)

• K. Tanaka, H. Waiki, Y. Ido, S. Akita, Y. Yoshida, T. Yoshida; Rapid Communications in Mass Spectrometry, 2, 151-153 (1988)

• R. C. Beavis, B. Chait, K.G. Standing; Rapid Communications in Mass Spectrometry, 3, 233-237 (1989)

• M. Karas, M. Glückmann, J. Schäfer; Journal of Mass Spectrometry, 35, 1-12, (2000)

• R. Zenobi and R. Knochenmuss; Mass Spectrometry Reviews, 17, 337-366 (1998)

• G. Montaudo, M. S. Montaudo, and F. Samperi, “ Mass Spectrometry of Polymers ”, ed. G. Montaudo and R. P. Lattimer, 2002 , CRC Press, Boca Raton, FL, 419.

Polecana literatura

Dziękuję za uwagę…