SPEKTROFOTOMETRIULTRAVIOLET DAN TAMPAK (VISIBLE)

A. Radiasi Elektromagnetik

Radiasi Elektromagnetik, yang mana sinar ultraviolet dan sinar tampak

merupakan salah satunya, dapat dianggap sebagai energi yang merambat dalam

bentuk gelombang. Beberapa istilah dan hubungan digunakan untuk

menggambarkan gelombang ini.

Panjang gelombang merupakan jarak linier dari suatu titik pada satu gelombang

ke titik yang bersebelahan pada gelombang yang berdekatan.

Dimensi panjang gelombang adalah panjang (L) yang dapat dinyatakan dalam

centimeter (cm), atau yang lebih umum adalah dalam unit-unit berikut :

1 angstrom = 10-8 cm = 10-10 m

1 nanometer (nm) = 10-7 cm

= 10-9 m

= 1 milimikron (mµ)

= 10 Ǻ (10 angstrom)

1 mikrometer (mµ) = 10-6 m = 10-4 cm = 1 mikron (µ)

Satuan nanometer (nm) saat ini dipilih daripada satuan yang pemakaiannya lebih

kuno yakni milimikron (mµ). Huruf latin lamda (λ) merupakan symbol yang

umum digunakan untuk panjang gelombang (Rohman, 2007).

Frekuensi merupakan banyaknya gelombang yang melewati suatu titik

tertentu dalam satuan waktu. Dimensi frekuensi adalah seper waktu (T-1) dan

satuan yang digunakan biasanya detik-1. Satuan frekuensi juga dapat dinyatakan

sebagai putaran perdetik atau Hertz (Hz). Frekuensi biasanya disimbolkan dengan

huruf latin nu (υ). Bilangan gelombang merupakan seper panjang gelombang (1/λ)

sehingga satuannya adalah 1/panjang. Jika panjang gelombang dinyatakan dengan

cm-1 (Rohman, 2007).

Ada hubungan antara energi yang dimiliki radiasi elektromagnetik,

frekuensi, dan panjang gelombang yang bersangkutan :

E = h υ .......................................................................(10-1)

υ = .........................................................................(10-2)

Dengan menggabungkan persamaan (10-1) dan (10-2) maka akan diperoleh

persamaan berikut :

E = ........................................................................(10-3)

Yang mana :

E = Energi radiasi cahaya

h = tetapan planck yang harganya 6,626 x 10-34 joule

c = kecepatan cahaya yang harganya 2,998 x 1010 cms-1

λ = panjang gelombang

(Rohman, 2007).

Warna sinar tampak dapat dihubungkan dengan panjang gelombangnya.

Sinar putih mengandung radiasi pada semua panjang gelombang di daerah sinar

tampak. Sinar pada panjang gelombang tunggal (radiasi monokromatik) dapat

dipilih dari sinar putih (sebagai contoh dengan alat prisma). Warna-warna yang

dihubungkan dengan panjang gelombang diringkas pada tabel. Pada kolom ketiga

dari tabel ini disebutkan juga warna komplementer, yang mempunyai makna

sebagai berikut : jika salah satu komponen warna putih dihilangkan (biasanya

dengan absorpsi) maka sinar yang dihasilkan akan nampak sebagai komplemen

warna yang diserap tadi. Jadi jika warna biru (450 sampai 480 nm) dihilangkan

dari sinar putih tersebut (atau warna biru diabsorbsi) maka radiasi yang dihasilkan

adalah warna kuning (Rohman, 2007).

Tabel 1. Hubungan antara warna dengan panjang gelombang sinar tampak

Panjang gelombang Warna yang diserap

Warna yang

diamati/warna

komplementer

400 – 435 nm Ungu (lembayung) Hijau kekuningan

450 – 480 nm Biru Kuning

480 – 490 nm Biru kehijauan Orange

490 – 500 nm Hijau kebiruan Merah

500 – 560 nm Hijau Merah anggur

560 – 580 nm Hijau kekuningan Ungu (lembayung)

580 – 595 nm Kuning Biru

595 – 610 nm Orange Biru kekuningan

610 – 750 nm Merah Hijau kebiruan

B. Spektrum Absorpsi

Spektrofotometer dapat digunakan untuk mengukur besarnya energi yang

diabsorpsi /diteruskan. Jika radiasi yang monokromatik melewati larutan yang

mengandung zat yang dapat menyerap, maka radiasi ini akan dipantulkan,

diabsorpsi oleh zatnya dan sisanya ditransmisikan.

I0 = Ir + Ia + It

Pengaruh Ir dapat dihilangkan dengan menggunakan blanko/kontrol

sehingga :

I0 = Ia + It

(Harmita, 2006)

Lambert dan Beer telah menurunkan secara empirik hubungan antara

intensitas cahaya yang ditransmisikan dengan tebalnya larutan dan hubungan

antara intensitas tadi dengan konsentrasi zat (Harmita, 2006)

Hukum Lambert – Beer :

A = log = γ . b . c = a . b . c

Dimana :

A : serapan

I0 : intensitas sinar datang

It : intensitas sinar yang diteruskan

γ : absorbtivitas molekuler (mol.cm. It-1)

a : daya serap (g.cm. It-1)

b : tebal larutan / kuvet

c : konsentrasi (g. It-1. mg. ml-1)

(Harmita, 2006)

Penyimpangan-penyimpangan Hukum Beer :

Pada konsentrasi rendah, grafik hubungan dari serapan dengan konsentrasi

biasanya merupakan garis lurus. Pada konsentrasi yang lebih tinggi kurva ini

dapat membelok ke arah absis atau ordinat. Penyimpangan ini disebabkan oleh

kondisi percobaan yang tidak dipenuhi lagi, yaitu :

1. Cahaya tidak cukup monokromatis

2. Cahaya sampingan (stay radiation) mengenai detektor

3. Kepekaan detektor berubah

4. Intensitas sumber cahaya dan amplifier dari detector berubah-ubah karena

tegangan tidak stabil.

5. Pada desiasi-asosiasi keseimbangan kimia berubah, misalnya pada

perubahan pH larutan

6. Larutan berfluoresensi

7. Suhu larutan berubah selama pengukuran.

Seperti diketahui bahwa Beer hanya berlaku untuk cahaya monokromatis.

Dalam praktek hal ini sukar dipenuhi karena derajat kemonokromatisan

ditentukan oleh lebar celah yang digunakan. Makin kecil lebar celah,

makin monokromatis cahaya yang diperoleh, akan tetapi intensitas cahaya

yang mengenai detector juga makin kecil sehingga kepekaan berkurang

(Harmita, 2006).

C. Penyerapan Radiasi oleh Molekul

Semua molekul mempunyai energi yang dapat digambarkan menjadi beberapa

fenomena.

(1) Molekul secara keseluruhan dapat bergerak yang kejadian ini disebut

dengan translasi ; energi yang berhubungan dengan translasi disebut

dengan energi translasional, Etrans

(2) Bagian molekul (atom atau sekelompok atom) dapat bergerak karena

berkenaan satu sama lain. Gerakan ini disebut dengan vibrasi dan

energinya dinamakan dengan energy vibrasional, Evibr

(3) Molekul dapat berotasi pada sumbunya dan rotasi ini dikarakterisasi

dengan energy rotasional, Erot

(4) Di samping bentuk gerakan-gerakan tersebut, suatu molekul memiliki

konfigurasi elektronik, dan energinya (energi elektronik) tergantung pada

keadaan elektronik molekul (Rohman, 2007).

Energi suatu molekul merupakan jumlah dari komponen-komponen energi

translasional, vibrasional, rotasional, dan elektronik :

E = Etrans+ Evibr + Erot + Eelek

(Rohman, 2007).

Menurut teori mekanika kuantum, komponen-komponen energi translasional,

vibrasional, rotasional, dan elektronik dapat dianggap hanya memiliki nilai

tertentu pada suatu molekul tertentu ; dan energi-energi ini dikatakan

terkuantisasi. Level energi Etrans, Evibr, Erot , dan Eelek berhubungan erat dengan

struktur molekulnya. Kita dapat mengharapkan bahwa tidak ada 2 molekul yang

mempunyai energi translasional, vibrasional, rotasional, dan elektronik yang

identik (Rohman, 2007).

Jika suatu molekul bergerak dari suatu tingkat energi yang lebih rendah maka

beberapa energi akan dilepaskan. Energi ini dapat hilang sebagai radiasi dan dapat

dikatakan telah terjadi emisi radiasi. Jika suatu molekul dikenai suatu radiasi

elektromagnetik pada frekuensi yang sesuai sehingga energi molekul tersebut

ditingkatkan ke level yang lebih tinggi, maka terjadi peristiwa penyerapan oleh

molekul. Supaya terjadi absorpsi, perbedaan energi antara dua tingkat energi harus

setara dengan energi foton yang diserap. Secara matematis, pernyataan ini dapat

diekspresikan dengan :

E2 – E1 = h . v

E2 = energi pada tingkat yang lebih rendah

E1 = energi pada tingkat yang lebih tinggi

v = frekuensi foton yang diabsorpsi

(Rohman, 2007).

Sinar ultraviolet dan sinar tampak memberikan energi yang cukup untuk

terjadinya transisi elektronik. Dengan demikian spektra UVdan spektra tampak

dikatakan sebagai spektra elektronik. Keadaan energi yang lebih rendah disebut

dengan keadaan dasar (ground state). Transisi-transisi elektronik akan

meningkatkan energi molekuler dari keadaan dasar ke satu atau lebih tingkat

energi tereksitasi (Rohman, 2007).

Terbentuknya pita spectrum disebabkan oleh terjadinya eksitasi elektronik

lebih dari satu macam pada gugus molekul yang sangat kompleks (Rohman,

2007).

D. Penyerapan Sinar UV-Vis oleh Molekul

Penyerapan radiasi sinar ultraviolet dan sinar tampak oleh spesies atom atau

molekul (M) dapat dipertimbangkan sebagai proses dua langkah : Proses yang

melibatkan eksitasi menjadi panas sesuai dengan persamaan berikut :

M + hv M*

(Rohman, 2007).

Hasil reaksi antara M dengan foton (hv) merupakan partikel yang tereksitasi

secara elektronik yang disimbolkan dengan M*. Waktu hidup M* sangat pendek

(10-8 – 10-9 detik), dan keberadaannya dapat diakhiri dengan berbagai macam

proses relaksasi. Kebanyakan tipe melibatkan konversi energi eksitasi menjadi

energi panas, sesuai dengan persamaan berikut :

M* M + panas

(Rohman, 2007).

Penyerapan sinar UV dan sinar tampak pada umumnya dihasilkan oleh

eksitasi electron-elektron ikatan, akibatnya panjang gelombang pita yang

mengabsorpsi dapat dihubungkan dengan ikatan yang mungkin ada dalam suatu

molekul (Rohman, 2007).

Ada tiga macam proses penyerapan energi UV dan sinara tampak yaitu :

(1) Penyerapan oleh transisi elektron ikatan dan elektron anti ikatan

(2) Penyerapan oleh transisi electron d dan f dari molekul kompleks

(3) Penyerapan oleh perpindahan muatan (Rohman, 2007).

(1) Penyerapan oleh transisi electron ikatan dan elktron anti ikatan (electron

sigma, σ ; electron phi, π ; electron tidak berikatan atau non-bonding

elektron, n)

(a) Elektron sigma (σ)

Orbital molekul ikatan yang menyebabkan terjadinya ikatan

tunggal disebut ikatan sigma. Elektron yang menempatinya disebut

elektron sigma. Distribusi rapat muatan dalam orbital sigma adalah

simetris di sekeliling poros ikatan, sedangkan pada orbital sigma anti

ikatan atau sigma star tidak simetris (Rohman, 2007).

(b) Elektron phi (π)

Orbital phi terjadi karena overlapping dua atom p. Distribusi rapat

muatan dalam orbital phi adalah sedemikian rupa sehingga sepanjang

poros ikatan antara kedua atom terdapat suatu daerha yang disebut

dengan daerah nodal (nodal lane) yang dalam daerah ini rapat

muatannya rendah (Rohman, 2007).

(c) Elektron bukan ikatan (n = nonbonding elektron)

Disebut non-bonding elektron karena elektron tersebut tidak ikut serta

dalam pembentukan ikatan kimia dalam suatu molekul (Rohman,

2007).

Diagram tingkat energi elektronik :

Keterangan :

garis pertama σ* , garis kedua π*, garis ketiga n, garis keempat π, dan

garis kelima σ

i. Transisi sigma-sigma star (σ σ*)

Energi yang diperlukan untuk transisi ini besarnya sesuai dengan

energi sinar yang frekuensinya terletak di antara UV vakum (kurang dari

180 nm). Jenis transisi ini terjadi pada daerah UV vakum sehingga kurang

bermanfaat untuk analisis dengan cara spektrofotometri UV-Vis (Rohman,

2007).

ii. Transisi non-bonding elektron – sigma star (n σ*)

Jenis transisi ini terjadi pada senyawa organik jenuh yang mengandung

atom-atom yang memiliki elektron bukan ikatan (elektron n). Energi yang

diperlukan untuk transisi ini lebih kecil disbanding transisi σ σ*

sehingga sinar yang diserappun mempunyai panjang gelombang lebih

panjang, yakni sekitar 150-250 nm. Kebanyakan terjadi pada gelombang

200nm. Nilai ε = 100-3000 L.cm-1.mol-1 (Rohman, 2007).

iii. Transisi n π* dan transisi π π*

Untuk memungkinkan terjadinya transisi jenis ini, maka molekul

organik harus mempunyai gugus fungsional yang tidak jenuh sehingga

ikatan rangkap dalam gugus tersebut memberikan orbital phi yang

diperlukan (Rohman, A. dan Ibnu G., 2008).

Perbedaan antara transisi n π* dan transisi π π* adalah :

n π* π π*

Absorptivitas molar (ε) antara 10-

100 L.cm-1.mol-1

Biasanya, pelarut yang polar

menyebabkan pergeseran biru

atau hypersochromic shift

(pergeseran pita serapan ke arah

panjang gelombang yang lebih

pendek)

Absorptivitas molar (ε) antara

1000-10.000 L.cm-1.mol-1

Biasanya, pelarut yang polar

menyebabkan pergeseran merah

atau bathochromic shift

(pergeseran pita serapan ke arah

panjang gelombang yang lebih

panjang)

(Rohman, 2007).

Kromofor-kromofor organik

Kromofor merupakan semua gugus atau atom dalam senyawa organik

yang mamapu menyerap sinar UV dan sinar tamapak. Pada molekul

organik dikenal pula istilah ausokrom yang merupakan gugus fungsional

yang mempunyai elektron bebas seperti : -OH, -O, -NH2, dan -OCH3 , yang

memberikan transisi n π*. Terikatnya gugus ausokrom pada gugus

kromofor akan mengakibatkan pergeseran pita absorpsi menuju ke panjang

gelombang yang lebih besar (Rohman, 2007).

(2) Penyerapan yang melibatkan elektron d dan f

Kebanyakan ion-ion logam transisi menyerap di daerah UV dan

sinar tampak. Untuk seri lantanida dan aktanida, proses absorpsi

dihasilkan oleh transisi elektronik elektron-elektron 4f dan 5f; sementara

itu untuk logam-logam golongan transisi pertama dan kedua, yang

bertanggung jawab terhadap absorpsi adalah elektron-elektron 3d dan 4d

(Rohman, 2007).

(3) Penyerapan karena perpndahan muatan

Untuk tujuan analisis, spesies-spesies yang menunjukkan

penyerapan karena perpindahan muatan sangat penting karena

absorptivitas molarnya sangat besar (ε > 10.000 L.cm-1.mol-1 ) (Rohman,

2007).

Dengan demikian, senyawa-senyawa kompleks akan memberikan

sensitifitas yang tinggi; dalam artian senyawa-senyawa kompleks mudah

dideteksi dan ditentukan kadarnya. Beberapa ion anorganik menunjukkan

penyerapan yang disebabkan oleh perpindahan muatan, karenanya

kompleks-kompleks ini disebut dengan kompleks perpindahan muatan

(charge-transfer complexes). Contoh kompleks ini yang umum adalah

kompleks besi (III) dengan tiosinat atau senyawa fenolik, dan besi (II)

dengan o-fenantrolin dan ferisianida (Rohman, 2007).

E. Instrumentasi Spektrofotometri UV-Vis

Spekrofotometer yang sesuai untuk pengukuran di daerah spektrum ultraviolet

dan sinar tampak terdiri atas suatu sistem optik dengan kemampuan menghasilkan

sinar monokromatis dalam jangkauan panjang gelombang 200-800 nm (Rohman,

2007).

Suatu diagram sederhana spektrofotometer UV-Vis ditunjukkan oleh

gambar berikut:

Dengan komponen-komponennya meliputi sumber-sumber sinar, monokromator,

dan sistem optik.

a. Sumber-sumber lampu; lampu deudetrium digunakan untuk daerah UV pada

panjang gelombang dari 190-350 nm, sementara lampu halogen kuarsa atau

lampu tungsten digunakan untuk daerah visibel (pada panjang gelombang

antara 350-900 nm) (Rohman, 2007).

b. Monokromator; digunakan untuk mendispersikan sinar ke dalam komponen-

komponen panjang gelombangnya yang selanjutnya akan dipilih oleh celah

(slit). Monokromator berputar sedemikian rupa sehingga kisaran panjang

gelombang dilewatkan pada sampel sebagai scan instrumen melewati

spektrum (Rohman, 2007).

c. Optik-optik ; dapat didesain untuk memecahkan sumber sinar sehingga sinar

melewati 2 kompartemen, dan sebagaimana dalam spektrofotometer berkas

ganda (double baem), suatu larutan blanko dapat digunakan dalam satu

kompartemen untuk mengkoreksi pembacaan atau spektrum sampel. Yang

paling sering digunakan sebagai blanko dalam spektrofotometri adalah semua

pelarut yang digunakan untuk melarutkan sampel atau pereaksi (Rohman,

2007).

F. Penggunaan Spektrofotometri UV-Vis

Penggunaan spektrofotometri sebagai sarana penentuan struktur senyawa

memiliki sejarah yang panjang. Reaksi nyala yang populer berdasarkan prinsip

yang sama dengan spektrofotometri. Di pertengahan abad ke-19, kimiawan

Jerman Robert Wilhelm Bunsen (1811-1899) dan fisikawan Jerman Gustav

Robert Kirchhoff (1824-1887) berkerjasama mengembangkan spektrometer

(Gambar 13.2). Dengan bantuan alat baru ini, mereka berhasil menemukan dua

unsur baru, rubidium dan cesium. Kemudian alat ini digunakan banyak kimiawan

untuk menemukan unsur baru semacam galium, indium dan unsur-unsur tanah

jarang. Spektrofotometri ntelah memainkan peran penting dalam penemuan gas-

gas mulia (Takeuchi, 2009).

Metoda penyelidikan dengan bantuan spektrometer disebut spektrometri.

Dengan sumber cahaya apapun, spektrometer terdiri atas sumber sinar, prisma, sel

sampel, detektor dan pencatat. Fungsi prisma adalah untuk memisahkan sinar

polimkromatis di sumber cahaya menjadi sinar monokromatis, dan dengan

demikian memainkan peran kunci dalam spectrometer (Takeuchi, 2009).

Dalam spektrometer modern, sinar yang datang pada sampel diubah panjang

gelombangnya secara kontinyu. Hasil percobaan diungkapkan dalam spektrum

dengan absisnya menyatakan panjang gelombang (atau bilangan gelombang atau

frekuensi) sinar datang dan ordinatnya menyatakan energi yang diserap sampel

(Takeuchi, 2009).

Salah satu contoh instrumentasi analisis yang lebih kompleks adalah

spektrofotometer UV-Vis. Alat ini banyak bermanfaat untuk penentuan

konsentrasi senyawa-senyawa yang dapat menyerap radiasi pada daerah

ultraviolet (200 – 400 nm) atau daerah sinar tampak (400 – 800 nm). Analisis ini

dapat digunakan yakni dengan penentuan absorbansi dari larutan sampel yang

diukur (Sastrohamidjojo, 1991).

Umumnya spektrofotometri dengan sinar ultraviolet (UV) dan sinar tampak

(VIS) dibahas bersama karena sering kedua pengukuran dilakukan pada waktu

yang sama. Karena spektrofotometri UV-VIS berkaitan dengan proses berenergi

tinggi yakni transisi elektron dalam molekul, informasi yang didapat cenderung

untuk molekul keseluruhan bukan bagian-bagian molekulnya. Metoda ini sangat

sensitif dan dengan demikian sangat cocok untuk tujuan analisis. Lebih lanjut,

spetroskopi UV-VIS sangat kuantitatif dan jumlah sinar yang diserap oleh sampel

diberikan oleh ungkapan hukum Lambert-Beer. Menurut hukum ini, absorbansi

larutan sampel sebanding dengan panjang lintasan cahaya d dan konsentrasi

larutannya c (Beran, 1996).

Prinsip penentuan spektrofotometer UV-Vis adalah aplikasi dari Hukum

Lambert-Beer, yaitu:

A = - log T = - log It / Io = ε . b . C

Dimana : A = Absorbansi dari sampel yang akan diukur

T = Transmitansi

I0 = Intensitas sinar masuk

It = Intensitas sinar yang diteruskan

ε = Koefisien ekstingsi

b = Tebal kuvet yang digunakan

C = Konsentrasi dari sampel

Penyebab kesalahan sistematik yang sering terjadi dalam analisis

menggunakan spektrofotometer adalah:

a) Serapan oleh pelarut

Hal ini dapat diatasi dengan penggunaan blangko, yaitu larutan yang berisi

matrik selain komponen yang akan dianalisis.

b) Serapan oleh kuvet

Kuvet yang biasa digunakan adalah dari bahan gelas atau kuarsa.

Dibandingkan dengan kuvet dari bahan gelas, kuvet kuarsa memberikan

kualitas yang lebih baik, namun tentu saja harganya jauh lebih mahal. Serapan

oleh kuvet ini diatasi dengan penggunaan jenis, ukuran, dan bahan kuvet yang

sama untuk tempat blangko dan sampel.

c) Kesalahan fotometrik normal pada pengukuran dengan absorbansi sangat

rendah atau sangat tinggi, hal ini dapat diatur dengan pengaturan konsentrasi,

sesuai dengan kisaran sensitivitas dari alat yang digunakan. (melalui

pengenceran atau pemekatan) (Sastrohamidjojo, 1991).

Dengan mengukur transmitans larutan sampel, dimungkinkan untuk

menentukan konsentrasinya dengan menggunakan hukum Lambert-Beer. Karena

spektrofotometri UV-VIS sangat sensitif dan spektrometernya dapat dibuat

dengan ukuran yang sangat kecil, metoda ini khususnya sangat bermanfaat untuk

analisis lingkungan, dan khususnya cocok untuk pekerjaan di lapangan (Miller,

2000).

Hukum Lambert-Beer dipenuhi berapapun panjang gelombang sinar yang

diserap sampel. Panjang gelombang sinar yang diserap oleh sampel bergantung

pada struktur molekulsampelnya. Jadi spektrometri UV-VIS dapat digunakan

sebagai sarana penentuan struktur. Sejak 1876, kimiawan Swiss-Jerman Otto

Nikolaus Witt (1853-1915) mengusulkan teori empiris warna zat (yang ditentukan

oleh panjang gelombang sinar yang diserap) dan struktur bagian-bagiannya.

Menurut teori ini, semua senyawa berwarna memiliki beberapa gugus tak jenuh.

Gugus fungsi semacam ini disebut dengan kromofor. Semua senyawa pewarna

dan pigmen memiliki kromofor (Miller, 2000).

Terdapat beberapa faktor lain yang harus diperhatikan sehubungan dengan

warna senyawa. Panjang konjugas linear adalah faktor yang penting. Misalnya,

warna merah ß-karoten berasal dari sistem terkonjugasi, dan warna ini cocok

dengan hasil perhitungan kimia kuantum. Terdapat beberapa gugus fungsi, seperti

-NR2, -NHR, -NH2, -OH dan -OCH3, yang memiliki efek memekatkan warna

kromofornya. Semua ini disebut auksokrom.

Struktur ß-karoten. Warna merah wortel dan tomat adalah akibat sistem

terkonjugasi yang panjang ini.

Namun, tidak mungkin menyimpulkan struktur senyawa dari senyawa dari

warnanya atau panjang gelombang sinar yang diserapnya (Takeuchi, 2009).

Untuk mengatasi kesalahan pada pemakaian spektrofotometer UV-Vis maka

perlu dilakukan kalibrasi. Kalibrasi dalam spektrofotometer UV-Vis dilakukan

dengan menggunakan blangko:

Setting nilai absorbansi = 0

Setting nilai transmitansi = 100 %

Penentuan kalibrasi dilakukan denganikuti prosedur sebagai berikut:

a. Dilakukan dengan larutan blangko (berisi pelarut murni yang digunakan

dalam sampel) dengan kuvet yang sama.

b. Setiap perubahan panjang gelombang diusahakan dilakukan proses kalibrasi.

c. Proses kalibrasi pada pengukuran dalam waktu yang lama untuk satu macam

panjang gelombang, dilakukan secara periodik selang waktu per 30 menit

(Beran, 1996).

Dengan adanya proses kalibrasi pada spektrofotometer UV-Vis ini maka akan

membantu pemakai untuk memperoleh hasil yang kaurat dan presisi (Beran,

1996).

G. Aspek Kualitatif dan Kuantitatif dalam Spektrofotometri UV-Vis

Spektra uv-vis dapat digunakan untuk informasi kualitatif dan sekaligus dapat

digunakan untuk analisis kuantitatif.

1. Aspek Kualitatif

Data spectra UV-Vis secara tersendiri tidak dapat digunakan untuk

identifikasi kualitatif obat atau metabolitnya. Akan tetapi jika digabung

dengan cara lain seperti spektroskopi infra merah, resonansi magnet inti,

dan spektroskopi massa, maka dapat digunakan untuk maksud identifikasi/

analisis kualitatif suatu senyawa tersebut. Data yang diperoleh dari

spektroskopi UV dan Vis adalah panjang gelombang maksimal, intensitas,

efek pH, dan pelarut; yang kesemuanya itu dapat diperbandingkan dengan

data yang sudah dipublikasikan (Published data). Dari spectra yang

diperoleh dapat dilihat, misalnya:

a. Serapan (absorbansi) berubah atau tidak karena perubahan pH. Jika

berubah, bagaimana perubahannya apakah dari batokromik ke

hipsokromik dan sebaliknya atau dari hipokromik ke hiperkromik, dan

sebaliknya (Ghalib dan Rohman, 2007).

b. Obat-obat yang netral misalnya kafein, kloramfenikol; atau obat-obat

yang berisi auksukrom yang tidak terkonjugasi seperti amfetamin,

siklizin dan pensiklidin (Ghalib dan Rohman, 2007).

2. Aspek Kuantitatif

Dalam aspek kuantitatif, suatu berkas radiasi dikenakan pada

cuplikan (larutan sampel) dan intensitas sinar radiasi yang diteruskan

diukur besarnya. Radiasi yang diserap oleh cuplikan ditentukan dengan

membandingkan intensitas sinar yang diserap jika tidak ada spesies

penyerap lainnya. Intesitas atau kekuatan radiasi cahaya sebanding dengan

jumlah foton yang melalui satu satuan luas penampang per detik. Serapan

dapat terjadi jika foton/ radiasi yang mengenai cuplikan memiliki energy

yang sama dengan energy yang dibutuhkan untuk menyebabkan terjadinya

perubahan tenaga. Kekuatan radiasi juga mengalami penurunan dengan

adanya penghamburan dan pemantulan cahaya, akan tetapi penurunan

karena hal ini sangat kecil jika dibandingkan dengan proses penyerapan

Gholib dan Rohman, 2007).

Penggunaan analisa kuantitatif didasarkan pada hukum Lambert-

Beers yang menyatakan hubungan empiris antara intesitas cahaya yang

ditransmisikan dengan tebalnya larutan (hukum Lambert/ Bouguer) dan

hubungan antara intensitas tadi dengan konsentrasi zat (hokum Beers).

Hukum Lambert-Beers:

A Log = ε.b.c= a.b.c

(Henry, 2009).

Dimana :

A = serapan

Io = intensitas sinar yang datang

It = intensitas sinar yang diteruskan (ditransmisikan)

ε = absorbtivitas molekuler/ konstanta ekstingsi

a = daya serap

b = tebal larutan/ kuvet

c = konsentrasi (Henry, 2009).

Dalam hukum Lambert-Beers tersebut ada beberapa pembatasan yaitu:

Sinar yang digunakan dianggap monokromatis

Penyerapan terjadi dalam suatu volume yang mempunyai penampang

luas yang sama

Senyawa yang menyerap dalam larutan tersebut tidak tergantung

terhadap yang lain dalam larutan tersebut

Tidak terjadi peristiwa fluoresensi atau fosforisensi

Indeks bias tidak tergantung pada konsentrasi larutan (Ghalib dan

Rohman, 2007).

Analisis kuantitatif denga metode spektrofotometri UV-Vis dapat

digolongkan atas tiga macam pekerjaan, yaitu:

1. Analisis zat tunggal atau analisis satu komponen

2. Analisis kuantitatif campuran dua macam zat atau analisis dua

komponen

3. Analisis kuantitatif campuran tiga macam zat atau lebih (analisis multi

komponen) (Ghalib dan Rohman, 2007).

Dalam Farmakope, metode spektrofotometri UV-Vis digunakan

untuk menetapkan kadar senyawa obat dalam jumlah yang cukup banyak.

Metode ini biasanya mendasarkan pada penggunaan nilai suatu obat.

Spektrofotometri yang digunakan harus telah terkalibrasi dengan benar.

Nilai merupakan absorbansi suatu senyawa yang diukur pada

konsentrasi 1% b/v (1 g/100 mL) dan dengan kuvet yang mempunyai

ketebalan 1 cm pada panjang gelombang dan pelarut tertentu. Manfaat lain

dari informasi nilai adalah terkait dengan apakah senyawa tersebut

cukup sensitif diukur dengan spektrofotometer UV-Vis (Ghalib dan

Rohman, 2007).

Cara lain untuk menetapkan kadar sampel adalah dengan

menggunakan perbandingan absorbansi sampel dengan absorbansi baku,

atau dengan menggunakan persamaan regresi linier yang menyatakan

hubungan antara konsentrasi baku dengan absorbansinya. Persamaan

kurva baku selanjutnya digunakan untuk menghitung kadar dalam sampel

(Ghalib dan Rohman, 2007).

H. Spektra UV untuk Beberapa Molekul Obat

Berikut akan diuraikan beberapa tipe spectra UV molekul obat :

1. Enon Steroid

Kromofor-kromofor kebanyakan senyawa obat mendasarkan

pada modifikasi kromofor pada cincin benzene. Salah satu kelompok

senyawa yang tidak sesuai dengan kelompok ini adalah steroid

(karena tidak memiliki cincin benzene) (Rohman, 2007).

Jenis spectra ini umum untuk golongan steroid dan

kesemuanya mempunyai absorbansi maksimal sekitar 240 nm dengan

insentitas serapan yang mirip. Adanya tambahan ikatan rangkap

pada betametason dibandingkan dengan hidrokortison tidak

memberikan perbedaan yang cukup besar pada absorbansisnya di

panjang gelombang maksimal. meskipun demikian, bentuk pita

absorbsi betametason berbeda dengan bentuk pita pada hidrokortison

(Rohman, 2007).

Steroid BM λmaks Nilai E

Hidrokortison 362,5 240 435

Betametason 392,5 240 390

Klobetason

butirat479,0 236 330

Betametason

natrium fosfat516,4 241 296

Tabel di atas meringakas data beberapa struktur steroid dan

menggambarkan adanya efek berat molekul (BM) pada nilai E. Kekuatan

kromofor enon adalah mirip untuk keseluruhan steroid karena nilai E

berdasarkan pada absorbansi larutan 1% b/v. Nilai E akan turun jika BM

steroid naik. Hal seperti ini berlaku untuk semua molekul (Rohman, 2007).

2. Efedrin : Suatu Kromofot Tipe Steroid (mengandung inti benzen)

Efedrin mempunyai kromofor cincin benzene yang paling sederhana

dan mempunyai spektum yang mirip benzene dengan pita simetri telarang

yang lemah pada ± 260nm dengan nilai E=12. Sebagaimana benzene,

efedrin juga mempunyai intensitas serapan maksimum di bawah 200nm.

hal ini dapat dimengerti karena pada efedrin tidak ada gugus polar atau

auksokrom yang berikatan secara langsung dengan gugus kromofor inti

benzene.

Obat-obat yang mempunyai kromofor seperti efedrin antara lain :

difenil hidramin, ibuprofen, dan dekstro propoksifen.

3. Ketoprofen : Kromofor Benzen yang Diperpanjang

Dalam kasus ini, kromofor inti benzene telah diperpanjang dengan 4

ikatan rangkap akibatnya simetri cincin benzene di ubah. Demikian juga,

pita absorbs yang kuat pada benzene di 204 nm mengalami pergeseran

batokromik dan memberikan λmaks di 262nm dan nilai E=647.

Obat-obat lain yang mempunyai kromofor benzene yang diperpanjang

antara lain : siproheptadin, dimentindin, protriptilin dan zimeldin

(Rohman, 2007).

4. Prokain : Auksukrom gugus amino

Pada prokain, kromofor benzene diperpanjang engan gugus C=O. di

samping itu, prokain juga mempunyai auksokrom yang berupa gugus

amino. Pada kondisi basa, prokain mempunyai E=1000, sedangkan pada

kondisi asam nilai E prokain sebesar 100. Hal ini disebabkan karena

pokain pada kondisi basa mempunyai sepasang electron pada gugus –NH2

yang dapat berinteraksi dengan kromofor untuk memberikan pergeseran

hiperkromik. Dalam kondisi asam, gugus amino ini akan terprotonasi

akibatnya gugus amino tidak lagi berfungsi sebagai auksokrom. Meskipun

demikian, jika proton ini dihilangkan dari prokain dengan

mengkondisikannya dalam lingkungan basa maka akan tetap memberikan

pergeseran hiperkromik dan tetap memiliki nilai E sebesar 1000. Dari sini,

dapat dimengerti bahwa prokain dan obat-obat lain yang mempunyai

kromofor dan auksokrom sejenis dengan prokain lebih baik dilakukan

analisis kuantitatif dalam kondisi basa, sebab pada kondisi basa prokain

mempunyai sensitifitas yang lebih tinggi disbanding pada kondisi asam.

Obat-obat yang mempunyai kromofor seperti prokain antara lain :

prokainamid da peroksimetakain. Penting untuk dicatat bahwa obat-obat

anestesi local seperti bupivakain dan lignokain tidak termasuk dalam

kategori ini, disebabkan kelompok senyawa ini merupakan amida aromatic

dan sepasang electron bebas pada nitrogen tidak tersedia sepenuhnya

karena adanya gugus C=O yang bersifat gugus penarik electron (Rohman,

2007).

5. Fenileprin : Auksukron Gugus Hidroksil

Kromofor fenileprin tidak diperpanjang akan tetapi struktur

fenileprin mempunyai gugus hidroksi fenolik. Gugus hidroksi fenolik ini

dapat berfungsi sebagai auksokrom baik pada kondisi asam ataupun basa.

Dalam kondisi asam, fenileprin mempunyai 2 pasang electron bebas,

sedangkan pada kondisi basa fenileprin mempunyai 3 pasang electron

bebas yang dapat berinteraksi dengan kromofor cincin benzene. Fenileprin

dan senyawa-senyawa yang mempunyai kromofor dan auksokrom sejenis

lebih baik ditetapkan kadarnya dalam kondisi basa daripada dalam kondisi

asam sebab pada kondisi basa fenileprin mempunyai sensitifitas yang

tinggi disbanding pada kondisi asam (Rohman, 2007).

DAFTAR PUSTAKA

Beran, J.A. 1996. Chemistry in The Laboratory. John Willey & Sons.

Harmita. 2006. Analisis Kuantitatif Bahan Baku dan Sediaan Farmasi. Cipta

Kreasi Bersama. Jakarta.

Henry, Arthur. 2009. Analisis Spektrofotometri UV-Vis Pada Obat Influenza

Dengan Menggunakan Aplikasi Sistem Persamaan Linier. http: //repository.

gunadarma.ac .id: 8000/ browse.php?nfile=177 (diakses tanggal 8 November

2009)

Miller, J.N and Miller, J.C. 2000. Statistics and Chemometrics for Analytical

Chemistry, 4th ed, Prentice Hall. Harlow.

Rohman, A. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Pustaka Pelajar. Yogyakarta.

Sastrohamidjojo, H, 1991. Spektrofotometri. Liberty. Yogyakarta.

Takeuchi, Yoshito. 2009. Metode Spektrofotometri. Available online on

http//www.chem-is-try.org. [Diakses pada 07 Oktober 2009]

SPEKTROFOTOMETRI

ULTRAVIOLET DAN TAMPAK (VISIBLE)

Kelompok 6 :

1. Sisca Seftiani Putri (260110070079)

2. Diatri Mariana H (260110070081)

3. Elis Ronasih (260110070083)

4. Annisa Nur Utami P. (260110070085)

5. Petrus Topaga (260110070087)

6. Dea Gilang Kancanawatie (260110070089)

7. Ayu Soffi Cholifati (260110070091)

8. Reynaldi Firmansyah (260110070093)

9. Dhani Adriati K. (D1E050002)

KIMIA FARMASI ANALISIS I

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS PADJADJARAN

2009