Spektrofotometri - legeforeningen.no · betingelser for pH, løsningsmiddel, temp. etc ε- molar...
Transcript of Spektrofotometri - legeforeningen.no · betingelser for pH, løsningsmiddel, temp. etc ε- molar...
1
Spektrofotometri
Olav KlingenbergAvdeling for medisinsk biokjemi
OUS-Rikshospitalet
2
• Lys• Basale konsepter
– Transmittans– Absorbans
• Instrumentering• Anvendelse• Feilkilder
3
Lys
• Bølge- og partikkelegenskaper - fotoner• Energi: proporsjonal med lysets frekvens
omvendt proporsjonal med bølgelengde
Fotometri - måling av lysSpektrofotometri - måling av lysintensitet ved valgt(e) bølgelengde(r)
Elektromagnetisk stråling
Kosmisk stråling10-9 nm (10-18 m)
Radiobølger1000 km (106 m)
Lysca 380-750 nm
4
• Ulike stoffer kan absorbere lys i deler av spekteret
Abs
orba
ns
Noen basale størrelser
5
Transmittans
• Refleksjon• Absorbert av løsningsmiddel
-Disse faktorene må elimineres
I0 IST=IS/I0
6
T for analytt:
IS/IR
Transmittans
I0 IS
T=100%I0 IR
Sample
Referanse
T=IR/I0
T=IS/I0
7
• A=-Log(IS/IR)=-LogT
Transmittans - Absorbans
Absorbans Transmittans
0,1 ~79,4 %1 10 %2 1 %3 0,1 %
8
Beer-Lamberts lov
A=abcA - Absorbansa - absorptivitet b - Lysvei (cm)c - konsentrasjon
Når b=1 cm og c er uttrykt i mol/L uttrykkes a som ε.
ε er konstant for et gitt stoff ved gitt bølgelengde og gitte
betingelser for pH, løsningsmiddel, temp. etc
ε - molar ekstinksjonskoeffisient eller molar absorbtivityForutsetninger:
Monokromatisk lysLav abs. av løsn.middelIkke optisk interferensIkke pågående kjemisk reaks.Konsentrasjonsnivå →
9
Anvendelse av Beer-Lamberts lov
• A=abc• a=A/bc• Ac/bccc= Au/bucu
• Ac/cc= Au/cu
• cu=cc*Au/Ac
• cu=Au*K
A - Absorbansa - absorptivitet b - Lysvei (cm)c - konsentrasjon
Subscript c - calibratorSubscript u - ukjent
K - Kalibreringskonstant funnet ved måling av absorbans av kalibrator med kjent konsentrasjon
10
Spektral båndbredde• Instrumentets lys• Smal spektral båndbredde gunstig,
særlig ved smale absorbanstopper.• Forutsetning for Beer-Lamberts lov• Øker sensitivitet og linearitet• Naturlig båndbredde- båndbredde
ved halvparten av max absorbsjon• Spektral båndbredde≤10% av
naturlig båndbredde
Koproporfyrin I
1 nm
10 nm
20 nm naturligbåndbredde
11
Instrumentering - to hovedtyper
enkeltstråle
12
Instrumentering
dobbeltstråle(in space eller in time)
13
-Gløde-LASER
Lyskilde Monokromator Kuvette Detektor
14
GlødeLASER
Lyskilde Monokromator
PrismeDiffr.gitter(Filter)
Kuvette Detektor
15
GlødeLASER
Lyskilde Monokromator
PrismeDiffr.gitter(Filter)
Kuvette
Glass-lysKvarts-UVPlast-begge-
engangs
Detektor
16
GlødeLASER
Lyskilde Monokromator
PrismeDiffr.gitter(Filter)
Kuvette
GlassKvartsPlast
Detektor
FotomultiplikatorrørFotodiode-fotosensitivt
halvledermateriale-resolusjonTidBølgelengde
Lys
17
Anvendelse
• Klinisk enzymymology• Fargebindingsassay• Kromogene assay
18
Klinisk enzymologi• Måle endring i kons av substrat eller produkt• Redusert absorbans fra substrat • Økt absorbans fra produkt (best)
Tid
A
Lag
Optimalisering av reaksjon
Tid Tid Tid
[Pro
dukt
]
[Pro
dukt
]
[Pro
dukt
]
19
Fast tid vs.Kontinuerlig monitorering
Hastighet
Substrat-konsentrasjon
Tid
Måle i lineært område, hastighet da avhengig av enzymkonsentrasjon
20
LD
Eksempel: LD
Laktat Pyruvat
+ NADH+H+NAD+ +
NADH
NAD+
pH 8,8-9,8
pH 7,4-7,8
P→Log
L→P
IFCC
21
Fargebinding, total-Ca
o-kresolftalein complexon CPC+ Ca2+
Ca2+-CPC+ rødfarge, 570-580 nm
22
Kromogent assay
Substrat, fargeløst
Enzym
Produkt
23
Kromogent substrat
Spesifikkgjenkjennelsessekvens
Kuttesete
p-nitroaniline
24
Kromogent assay
• Eksempel: AntitrombinAT
Heparin TrombinFXaPas-plasma (AT)
Trombin (kjent mengde)Heparin
Inkuberes, 60 sek Kromogent substrat
Farget produkt(p-nitroaniline, pNA)
AT pNA
25
Feilkilder
• MANGE ! • I prøve - Optisk interferens
– lysspredende substanser (lipemi, klotting...)– fargede substanser -bilirubin -hemolyse
• I instrument– Monokromator - endret bølgelengde