SPECIATION CHIMIQUE DU FER DANS L’OCEAN : Les complexes ... · SOD active pH eau de mer O2 °-pH...
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Diapositive 1
SPECIATION CHIMIQUE DU FER DANS L’OCEAN :
Les complexes fer-porphyrines,méthode de détection et mécanismes de production
Au : Laboratoire d’Océanographie et de Biogéochimie (UMR CNRS 6535)Directeur de thèse : Stéphane BLAIN (Pr.)
Soutenance de thèse présentée par Lilita VONG
14 janvier 2008
Diapositive 2
(ECHANGEURS D’ELECTRONS)Rôle dans les réactions biochimiques
Qu’est-ce qu’un complexe fer-porphyrine ?
pont méthénique
noyau pyrrolique
STRUCTURE COMMUNE DES PORPHYRINES
+ ou – SOLUBLEdans les solutions aqueuses
(AGGREGATION, ADSORPTION)
FER-PORPHYRINES
METALLO-PORPHYRINES
cuivre
cobaltmanganèse
magnésium
Diapositive 3
partie protéique
fer-porphyrine
ENZYME contenant une fer-porphyrine : Catalases
PeroxydasesCytochromes (a, a3, b, b6, c, c1,d1, f, P450)Hémoglobine, myoglobine
Exemples de complexes fer-porphyrines
Élimination des radicaux libresStockage et transport d’oxygène… etc.
Rôles clés dans les fonctions physiologiques
Chaînes de transfert d’électrons (respiratoires et photosynthétiques)
Complexe IComplexe IV
Complexe III
Complexe IICytochrome c
Cytochrome c oxydase
Cytochrome bc1
MATRICE MITOCHONDRIALE
ESPACE INTERMEMBRANAIRE
électron
ATP Synthase
H+
ATP
H+ H+ H+
Rôles dans les fonctions physiologiques
Diapositive 4
Les fer-porphyrines : des molécules ubiquistes
Lorsque ces organismes meurent, le contenu de leur(s) cellule(s) est libéré dans le milieu extérieur…
Libération possible de ces complexes fer-porphyrines intracellulairesdans l’eau de mer, Dissolution possible des fer-porphyrines dans la phase dissoute (<0,2 µm)
Diapositive 5
Les fer-porphyrines : sources de fer dans l’océan ?
LE PROBLEME :
La biodisponibilité en ferest TRES PEU CONNUE
40 % de la surface océanique mondiale
Limitation en FER
La croissance du phytoplancton peut être limitée par le fer
RESOUDRE LASPECIATION CHIMIQUE du fer
Diapositive 6
La spéciation chimique du fer dans l’océan …
Fer intracellulaire
Fer extracellulaire(débris détritiques)
Fer colloïdalFer humique
Fer inorganique (1%) Fer organique (99%)Fe(OH)3Fe(OH)2+Fe(H2O)62+FeCO3…
FRACTIONS DE TAILLE
PARTICULAIRE
COLLOIDAL
DISSOUS
Aluminosilicates
Ordre du NANOMOLAIRE
NO
O
C
OH
COOH
NO O
OH
O
N NO
O
COOH
sidérophore
?PORPHYRINE
Le fer dissous est utilisé par les micro-organismes,et il est majoritairement sous forme organique.
Diapositive 7
Objectif 2:Étudier un mécanisme de production des
fer-porphyrines.
Objectif 1:Mettre au point une méthode capable de
mesurer les fer-porphyrines dans l’eau de mer.
Objectifs :
Pourrait-on retrouver les fer-porphyrines dans l’eau de mer, en phase dissoute (<0,2 µm) ?
Diapositive 8
PARTIE 1Comment doser les FePy dans l’eau de mer ?
Diapositive 9
Luminol
O2
METALLOPORHYRINES (fer-porphyrines)
pH 13
Le luminol
Le point de départ …
Réaction de chimiluminescence avec l’hémoglobine
Pour des tests d’immuno-essais: (Motsenbocker et al., 1993)
HHP
PHOTONS
Aminophthalate
Diapositive 10
transférable en analyse par injection en flux (FIA)
Quelles sont les principales exigences de ce développement analytique ?
Pour être utilisée en océanographie, la réaction doit être :
adaptée pour l’analyse d’eau de mer
spécifique aux fer-porphyrines
assez sensible pour mesurer des concentrations naturelles
Diapositive 11
Poubelle
Fluide porteur
Réactif (luminol)
Echantillon
étape 1Peut-on appliquer la réaction de chimiluminescence en FIA ?
FIA = Analyse par injection en flux
Avantages :Peu de manipulation sur l’échantillonConsomme peu de réactifsApplicable à bord de naviresPeu coûteuse
nM d’équivalent hémine
CALIBRATION avec l’HEMINECommercialiséeSoluble
HEMINE (FePy modèle)
Diapositive 12
Peut-on appliquer la réaction à des analyses d’eau de mer ? étape 2
pH 13 Formation de précipités:Incompatibles avec la FIARisque d’adsorption des fer-porphyrines
… NONSANS TRAITEMENT
AVEC TRAITEMENT … OUI
Utilisation de l’EDTA qui empêche la précipitationHors ligne
En ligne
Poubelle
NaOH 0.1M
Luminol 1.5 mMdans NaOH 0.1M
� Automatisation maximale de l’analyse
Poubellechimique
(a)(b)
(c)
(d)
(e)
(f)(g)
NaCl 0.5MEDTA 0.25MLuminol 1.5 mMdans NaOH 0.5M
� Amélioration de la sensibilité et de la reproductibilité
0,38 nM (n=10) 0,11 nM (n=10)
Diapositive 13
La FIA est-elle spécifique aux fer-porphyrines? étape 3
PAS D’INTERFERENCES !
Autres métallo-porphyrineset porphyrines libres(12 molécules)
Tests de spécificité :Luminol
PHOTONS
FePy
Interférents (dans d’autres conditions de pH…) :Fe2+, Fe3+, Cu2+, Co2+, H2O2
Ligands (en compétition avec FePy) :DFOB, Fe-DFOB, acides humiques et phytiques
ligands
Diapositive 14
Dunaliella tertiolectaPHYTOPLANCTON
QUOTA INTRACELLULAIRE (FePy)1 à 5
(x 10-18 moles d’équivalent hémine.cellule-1)
Application de la FIA ? étape 4
!! PREMIERES CONCENTRATIONS EN MILIEU NATUREL !!
~ 11 nM (Etang de Berre)
~ 9 nM (Rhône)
~ 1 à 2 nM (Baie de Marseille, Guyane)
Spectrophotométrie (Gledhill, 2007)
Calcul théorique (Ewetz et Thore, 1978)(Miller et Vogelhut, 1978)
(Océan austral)< LD
(En phase dissoute)
Diapositive 15
Conclusions :
transférable en FIA
Pour être utilisée en océanographie, la réaction doit être :
adaptée pour l’analyse d’eau de mer
spécifique aux fer-porphyrines
assez sensible pour mesurer des concentrations naturelles
� Avec un traitement spécifique
� 0,11 nM équivalent hémine
… a-t-on répondu à nos objectifs ?
Diapositive 16
La suite de ce travail
2ème possibilité:ETUDE DES MECANISMES DE PRODUCTION de FePy (cultures)
1ère possibilité:POURSUIVRE LE DEVELOPPEMENT ANALYTIQUE(Diminution de LD) (phase de pré-concentration)
Limite de détection : 0,11 nM équivalent hémine
BILAN POSITIF :
CETTE FIA EST LA PREMIERE METHODE DE DOSAGE DES FePyDANS L’EAU DE MER :
Diapositive 17
PARTIE 2Étude de mécanismes
de production des fer-porphyrines
Diapositive 18
CULTURES NON AXENIQUES
Phytoplancton
Dunaliella salinaCHLOROPHYCEE
Quel mécanisme choisit-on d’étudier ?
LA PREDATION (=LE BROUTAGE)
Cause de mortalitésouvent dominantedans le domaine pélagique
Phytoplancton Microzooplancton
MODELE SIMPLE : Phytoplancton – Microzooplancton
Phagotrophie
Oxyrrhis marinaDINOPHYCEE
Microzooplancton
Prédateur associé
(5 fois plus gros)
Diapositive 19
Etape 1
Proies+
Prédateurs
BROUTAGE (OBSCURITE) (24h)
Principe :
Proiestémoin
La consommation du phytoplancton par le microzooplancton induit une libération de fer-porphyrines dans l’eau de mer (phase dissoute).
HYPOTHESE
broutage
DISCONTINUEBrest (cellules)
Marseille (FePy)
Diapositive 20
Le broutage n’apparaît pas comme un mécanisme de production de FePy
Libération de fer-porphyrines dans les cultures de phytoplancton
CONSOMMATION du phytoplancton par le microzooplancton
Résultats et discussion : Etape 1
Dunaliella salina
Temps (heure)
0 10 20 30
LN
(ce
llule
/L)
131415161718192021
Oxyrrhis marina
Temps (heure)
0 10 20 30
LN
(ce
llule
/L)
14,214,414,614,815,015,215,415,6
n =3
n =3
Temps (jours)
0 5 10 15 20 25 30
Con
cent
ratio
ns e
n F
ePy
(
nM)
0
1
2
3
4
5
6Lot Témoin Lot Broutage
Temps (heures)
n =3
Diapositive 21
Principe et résultats: Etape 2
Production de fer-porphyrines lors de la phase exponentielle
Témoin(stérile)
phytoplancton
SUIVI DE CULTURES DE PHYTOPLANCTON(2 semaines) n = 6
n = 3
Temps (jours)
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
[phy
topl
anct
on]
(1
09 cel
lule
/L)
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
fer
Temps (jours)
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
Con
cent
ratio
ns e
n F
ePy
(
nM e
q. H
em)
-2
0
2
4
6
8
10
12(n = 3)
(n = 3)
Diapositive 22
CAPACITE de PRODUCTIONKp = 1,8 x 10-18moles FePy/L/cellule/jour
QUOTA INTRACELLULAIRE1 à 5 x 10-18moles FePy/cellule
PEU REALISTE qu’une cellule soit capable de produire l’équivalent de son contenu intracellulaire en fer-porphyrines pour le libérer dans l’eau de mer
Discussion : Etape 2
Temps (jours)
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
Con
cent
ratio
ns e
n F
ePy
(
nM e
q. H
em)
-2
0
2
4
6
8
10
12
���� HYPOTHESE 1 : Une production de fer-porphyrines par les bactéries ?
���� HYPOTHESE 2 : Une interférence chimique (chimiluminescence)?
0,3 à 1,4FePy extracellulaireFePy intracellulaire
RAPPORT =
(n = 3)
Diapositive 23
Hypothèse 1 : production par les bactéries ? Etape 3?
HYPOTHESE 1:Une production par les bactéries ?
Temps (jours)
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
Con
cent
ratio
ns e
n F
ePy
(
nM e
q. H
em)
-2
0
2
4
6
8
10
12
n = 6 n = 3
Bactéries
Temps (jours)0 2 4 6 8
LN c
once
ntra
tion
bact
érie
nne
LN
(C
ellu
le/L
)
1416182022242628
0 2 4 6 8
Con
cent
ratio
n en
FeP
y
(nM
)
-20
-10
0
10
20
Temps (jours)
fer
NON
Diapositive 24
Etape 3?Hypothèse 2 : existence d’un interférent ?
… si oui, quel est-il ?
Temps (jours)
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
Con
cent
ratio
ns e
n F
ePy
(
nM e
q. H
em)
-2
0
2
4
6
8
10
12
n = 6 n = 3
2ème INDICE:
produit pendant la phase exponentielle…
3èmeINDICE:
Production par le phytoplancton de superoxyde(phase exponentielle)(Marshall et al., 2005)
intervient dans l’oxydation du luminol…1er INDICE:
Luminol
PHOTONS
FePy
Le radicalsuperoxyde
O2°-
Diapositive 25
Comment éliminer les radicaux superoxydes ? Etape 3?
MISE AU POINT: PROTOCOLE D’ELIMINATION DES SUPEROXYDES
Quelle méthode choisir ?
gluthatione
acide fulviqueacide ascorbique alpha-tocophérol
…SUPEROXYDE DISMUTASE
SOD(Méthode enzymatique)
Superoxyde (O2°-) H2O2
O22 H+
SOD active
pH eau de mer
O2°-
pH 13
SOD inactive
La SOD n’empêchera pas la chimiluminescenceprovoquée par les fer-porphyrines
Diapositive 26
Vérification : Etape 3?
Temps (jours)
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18Con
cent
ratio
ns e
n F
ePy
(
nM e
q. H
em)
-2
0
2
4
6
8
10
12
SANS SOD(résultat précédent)
DONC :
INTERFERENCE AVEC LES SUPEROXYDES (ARTEFACT)
Temps (jours)
0 2 4 6 8 10 12 14
Con
cent
ratio
n en
FeP
y (n
M)
-202468
1012
AVEC SOD
Diapositive 27
Etape 4Principe :
La consommation du phytoplancton par le microzooplancton induit une libération de fer-porphyrines dans l’eau de mer (phase dissoute).
HYPOTHESE
Ajout de prédateurs :-en phase exponentielle-en phase stationnaire… du phytoplancton
+ SOD
EXPERIENCE DE BROUTAGE
Proies
Proies+
Prédateursbroutage
témoin
CONTINUE: Marseille (cellules + FePy)
Diapositive 28
Résultats : Etape 4
BroutageTémoin
0 2 4 6 8 10 12
LN (
cellu
le/L
)
6
8
10
12
14
16
18
20
ajout du prédateur
En phase exponentielle En phase stationnaire
Temps (jours)
0 5 10 15 20
LN (
cellu
le/L
)
1012141618202224
ajout du prédateur
Temps (jours)
Phy
topl
anct
on
Phy
topl
anct
onTemps (jours)
0 2 4 6 8 10 12
LN (
nM)
-1,5
-1,0
-0,5
0,0
0,5
1,0
fer
Temps (jours)
0 5 10 15 20
LN (
nM)
-2
-1
0
1
2
3
[FePy]
[FePy]
Diapositive 29
Discussion : Etape 4
QUOTA INTRACELLULAIRE1 à 5 x 10-18moles FePy/cellule/
k � 2,2 (± 0,5) x 10-18 moles de fer-porphyrines par cellule broutéeCAPACITE DE RELARGUAGE :
0,03 à 1,43FePy extracellulaireFePy intracellulaire
RAPPORT =
Il est PLAUSIBLE :que la quantité de FePy libérée par une cellule broutée soit du même ordre de grandeur que son contenu intracellulaire.
Le broutage est un mécanisme de production des fer-porphyrines
Diapositive 30
CONCLUSIONS GENERALESet
PERSPECTIVES
Diapositive 31
Conclusions:
Pourrait-on retrouver les fer-porphyrines dans l’eau de mer, en phase dissoute (<0,2 µm) ?
Partie 1 : DEVELOPPEMENT ANALYTIQUE:Mise au point d’une méthode de détection des complexes fer-porphyrinesEt détermination de concentrations naturelles
Partie 2 : ETUDE DE MECANISME DE PRODUCTION : Le broutage peut générer une libération de complexes fer-porphyrines dans le milieu (Cultures).
On peut retrouver les fer-porphyrines dans l’eau de mer
(rôle possible dans la complexation organique et la biodisponibilité du fer dans l’océan)
Diapositive 32
Perspectives :
Sur la méthodologie :
Méthode de pré-concentrationEfforts sur la diminution de la limite de détection
Méthode de dissolution/désorption Possibilité de travailler sur la phase particulaire
Développer un protocole pour mesurer les porphyrines libresIndirectement avec une ferrochélatase
Porphyrine libre + Fer Fer-porphyrineferrochélatase
Diapositive 33
Sur la biogéochimie des complexes fer-porphyrines :
Perspectives :
Processus de production de fer-porphyrines
Lyse virale
Processus de « dégradation » de fer-porphyrines
Éclairement … (les fer-porphyrines sont photosensibles)
Faible solubilité qui entraîne :
AUTO-AGGREGATIONADSORPTION
Rôle des fer-porphyrines dans la biodisponibilité du fer dans l’océan
Les fer-porphyrines sont-elles biodisponibles ?
Les porphyrines libres sont-elles capables de chélater le fer dissous ?
Broutage (autre mode)
Diapositive 34
Merci de votre attention …
…et…
Diapositive 35
Équipe Monitorat
MERCI POUR VOTRE SOUTIEN ET VOTRE BIENVEILLANCE !Badr Al-Ali + Dominique Estival + Lionel Einsenhauer + Marc Garel+ Zi Huan Hu + Antoine Nowaczyk + Cathy Perrot + J-L Fuda + Julien Touboul + Les POTES du GIS …