Some paradigmatic examples

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Some paradigmatic examples. Absorbance. Typical 1 H NMR Spectrum. Valore medio: 2 MUSD/anno. 500 MHz 1 H NMR. K1  T2  L3  T4  L5  E6  A7  A8  L9  R10  N11  A12  W13  L14  R15  E16  V17  G18  L19  K20. Ubiquitin. 76 amino acids, 8,5 kDa. Protein 1 H NMR spectrum: a “real spectrum”. - PowerPoint PPT Presentation

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  • Some paradigmatic examples

  • Typical 1H NMR Spectrum

  • Valore medio: 2 MUSD/anno

  • K1 T2 L3 T4 L5 E6 A7 A8 L9 R10 N11 A12 W13 L14 R15 E16 V17 G18 L19 K20 500 MHz 1H NMR

  • Ubiquitin76 amino acids, 8,5 kDa

  • Protein 1H NMR spectrum: a real spectrumFourier TransformationThe NMR signal in the time domainFree Induction DecayA short pulse will excite all spinsAll spins will relax (all together) during time AQThe FT of FID gives the NMR spectrum

  • 1D experimentCould be nice but.....Too crowded..What do we learn?Chemical shifts relaxation ratesNot enough to get a structure

  • STRUTTURE IN SOLUZIONE VIA NMR

  • The need for multidimensional NMR

  • Cosa un esperimento bidimensionale ?Dopo un impulso a 90 il segnale pronto per essere acquisito Facciamo lacquisizione ma NON terminiamo lesperimento ed applichiamo ancora uno o piu impulsi in modo da perturbare ulterioremente il sistemaAttraverso una combinazione di impulsi e delays noi facciamo in modo che ci sia uno scambio di magnetizzazione tra spin accoppiatiSUCCESSIVAMENTE, acquisiamo il segnale una seconda volta,Registrando il segnale NMR che rimane sul piano xy dopo la perturbazione

  • Eccito (impulso a 90)-Acquisisco (t1)- Perturbo (trasferisco)- Acquisisco (t2)Se la perturbazione non ha effetto e se non c trasferimento di alcun tipo,Ottengo lo stesso spettro in ciascuna delle 2 dimensioni tempo (t1 e t2)Dopo la trasformate di Fourier io otterro uno spettro dove i segnali appaiono su una diagonale di una matrice quadrata

  • Acquisisco (t1)- Perturbo (trasferisco)- Acquisisco (t2)Se durante la perturbazione una parte della magnetizzazione si traferisce da un nucleo ad un altro, per esempio per effetto di accoppiamento scalare, allora lo spettro della dimensione t2 sar diverso da quello della dimensione t1.

    Il risultato che avro dei segnali fuori dalla diagonale. Ciascun segnale fuori dalla diagonale dar linformazione sugli accoppiamenti scalari attivi nel sistema

    M (wI t1) (wSt2)

  • EXAMPLENHHCCOWe make a 1H experiment and we acquire. Then all signals transfer the information because of scalar couplingNHHCThen I observe Hc I observe HnI consider the first and the second acquisition as two indpendent dimensionsSpectrum afterThe J couplingSpectrum beforeThe J coupling

  • EXAMPLENHHCCONHHCSpectrum afterThe J couplingSpectrum beforeThe J coupling4 ppm9 ppmSignal!This indicates that there is a scalar coupling between Hn and Hc

  • EXAMPLENHHCCONHHCSpectrum afterThe J couplingSpectrum beforeThe J coupling4 ppm9 ppmSignal!This indicates that there is a scalar coupling between Hn and Hc HnHnHcJ-coupling

  • EXAMPLENHHCCOSpectrum afterThe J couplingSpectrum beforeThe J couplingHcHcHnJ-couplingIf you begin from Hc , the situation is the same !

  • EXAMPLENHHCCOSpectrum afterThe J couplingSpectrum beforeThe J couplingHcHcHnJ-couplingTherefore, if I consider only this systemHnHnHcJ-coupling

  • The first dimension = t1The second dimension = t2the series of pulses that I have to apply to my system = PULSE SEQUENCEexamplet1t2t1 dimensionOr F1 t2 dimensionOr F2

  • Usually t1 is also defined as indirect dimensiont2 is also defined as direct dimensionthe series of pulses that I have to apply to my system = PULSE SEQUENCEexamplet1t2t1 dimensionOr F1 t2 dimensionOr F2

  • DefinitionsF1 F2 Cross peak Two different frequencies are observed in the two dimensionsDiagonal peakThe same frequency is observed in both dimensionsCROSS PEAK= Yes, There is a COUPLING between the two frequencies

  • Accoppiamento scalareLaccoppiamento scalare puo comunque essere osservato attraverso esperimenti NMR bidimensionali, quali il COSY

  • Example: COSYThrough-bond connectivitiesCOSY= COrrelation SpectroscopYH4-H5H4-H5

  • Example: COSYThrough-bond connectivitiesCOSY= COrrelation SpectroscopYH4-H5H4-H5123456

  • Beyond COSYCOSY is not the only 2D experimentIt is possible to transfer the information from spin A to spin B via several possible mechanismsThe most important routes, which is COMPLEMENTARY TO J-couplingIs THROUGH SPACE COUPLING

  • Accoppiamento dipolareLaccoppiamento dipolare si ha tra due spin che sono vicini nello spazioSi tratta della interazione tra due dipoli magnetici, tra i quali, quando essi sono vicini nello spazio, si ha uno scambio di energiaLentit delleffetto dipende dal campo magnetico e dalle dimensioni della molecola. Nel caso di spin 1H, laccoppiamento dipolare si trasferisce per spin che si trovano a distanze inferiori ai 5 A. NON si osservano doppiettiLaccoppiamento dipolare da luogo ad un trasferimento di magnetizzazione da uno spin allaltro. Questo effetto va sotto il nome di effetto NOE

    Nuclear Overhauser EffectPerturbo AAumenta la intensit di B

  • Accoppiamento dipolareLaccoppiamento dipolare indipendente dallaccoppiamento scalare2 spin possono essere accoppiati :-Scalarmente E dipolarmente se sono vicini nello spazio e legati da legami chimici-scalarmente ma non dipolarmente se sono legati da legami chimici ma non vicini nello spazio-dipolarmente ma non scalarmente se sono spazialmente vicini ma non legati da legamei chimiciPensate a degli esempi, per favoreLeffetto NOE osservabile in un esperimento NMR bidimensionale , detto NOESY(in realt si puo anche osservare in esperimenti monodimensionle (1D NOE) di cui pero non parleremo

  • Through space AND throuhg bondsThrough spaceThrough bond

  • Example:Nuclear Overhauser Effect SpectroscopYNOESYNOE Effect:If two spins that are close in space are excited out of equilibrium, they will mutually transfer their magnetizationAAAB

  • Example:Cross peaks: A and B are closeDiagonal peakThe real case:Some 1500 peaks are observed for a protein of 75 aminoacidsAAABNOESY experiment

  • 2D NOESY Spectrum

  • Distance constraintsNOESY volumes are proportional to the sixth power of the interproton distance and to the correlation time for the dipolar couplingB0qmImJr

  • The old times approachNOESYCOSYIdentify through space connectivitiesHN(i)-Ha(i) and HN(i)Ha(i-1)Identify through bond connectivitiesHN(i)-Ha(i)NOESY conn.COSY conn

  • 1J couplings for backbone resonances

  • 1J couplings for backbone resonances

  • The 2D Hetcor experimentTwo dimensional Heteronuclear correlation Experiment

  • The 2D Hetcor experimentTwo dimensional Heteronuclear correlation Experiment

  • E possibile, in uno stesso esperimento mandare impulsi su nuclidi diversi (Es: 1H, 13C) possibile, combinare questa possibilit con ci che sappiamo a proposito degli accoppiamenti scalari e quindi UTILIZZARE gli accoppiamenti scalari per trasferire la magnetizzazione dauno spin 1H ad uno spin 13C ad esso scalarmente accoppiato

  • E possibile, in uno stesso esperimento mandare impulsi su nuclidi diversi (Es: 1H, 13C)Inoltre possiamo combinare tutto cio con quello che sappiamo sugli esperimenti bidimensionali

  • Eccito (impulso a 90) 1H Acquisisco (t1) 1H Perturbo (Trasferisco la magnetizzazione da 1H a 13C utilizzando laccoppiamento scalare 1JHC Acquisisco (t2) 13C2D HETCOR Expriment

  • 2D HETCOR Expriment

  • 2D HETCOR ExprimentPrima dimensione

  • 2D HETCOR ExprimentPrima dimensione

  • 2D HETCOR ExprimentPrima dimensioneSeconda dimensione

  • 2D HETCOR ExprimentPrima dimensioneSeconda dimensione

  • EsempioCOSY

  • EsempioCOSYN.B. In questo caso non si osserva solo laccoppiamento 3J ma si osserva una propagazione dellinformazione attraverso gli accoppiamenti scalari

  • EsempioHETCOR51432

  • 2D HSQC ExperimentHeteronuclear Single Quantum coherence

  • 2D HSQC ExprimentHeteronuclear Single Quantum coherence

  • 2D HSQC ExperimentPrima dimensioneSeconda dimensioneHeteronuclear Single Quantum coherence

  • 2D HSQC ExprimentPrima dimensioneHeteronuclear Single Quantum coherence

  • 2D HSQC ExperimentSeconda dimensionePrima dimensioneHeteronuclear Single Quantum coherence

  • 2D HSQC ExperimentHeteronuclear Single Quantum coherenceE possibile progettare esperimenti per trasferire la magnetizzazione da un nucleo allaltro anche indipendentemente dallacquisizioneIn questo esperimento il primo spin che viene eccitato 1H, la magnetizzazione viene trasferita da 1H a 13C PRIMA della acquisizione della prima dimensione, che quindi 13C. SOLO i 13C che sono accoppiati ad 1H possono essere osservati!

    Successivamente la magnetizzazione e di nuovo trasferita 1H utilizzando sempre laccoppiamento scalare ed alla fine osservo 1H

  • Eccito (impulso a 90) 1H Trasferisco la magnetizzazione da 1H a 13C utilizzando laccoppiamento scalare 1JHC Acquisisco (t1) 13C

    Perturbo -Trasferisco la magnetizzazione da 13C a 1H utilizzando laccoppiamento scalare 1JHC

    Acquisisco (t2) 1H2D HSQC Experiment

  • Questo tipo di esperimento si chiama anche Out and backSignifica che parto da 1H, trasferisco da 1H a 13C (out), acquisisco 13C nella prima dimensione e poi torno (back) sullo stesso nucleo da cui sono partito2D HSQC ExperimentIl doppio trasferimento fa si che lesperimento sia molto piu selettivo

    Osservo solo 1H e 13C che sono accoppiati tra di se per effetto di 1J

  • The HSQC experiment

  • Caratteristiche dellesperimento HSQC Non esiste la diagonaleLa magnetizzazione viene trasferita da 1H al 13C ad esso accoppiato

    Successivamente si acquisisce, nella dimensione indiretta, 13C

    Infine si ri-trasferisce su 1H e si osserva 1HTutti gli 1H che non sono accoppiati a 13C NON si o