Solfrid Hegstad...R‐Amfetamin‐d3 Utfordringer • Høyt trykk/lekkasje i CO2‐pumpa • Renhet...

25.05.2018

1

UPC2‐MSMSTeori og anvendelsesområder

Solfrid Hegstad

• Ultra Performance (UP) ConvergenceChromatography (CC)=UPC2

Hva er UPC2?

25.05.2018

2

• Ultra Performance (UP) ConvergenceChromatography (CC)=UPC2

• GC: Mobil fase ‐ gass• LC: Mobil fase ‐ væske• UPC2: Mobil fase ‐ gass og

væske

UPC2: Kombinasjon av superkritisk fluid kromatografi (SFC) og LC

Hva er UPC2?

Historisk perspektiv Superkritisk Fluid Kromatografi (SFC)

• Teknikk først beskrevet i 1962• Dårlig reproduserbarhet, lite

robust, lav sensitivitet • Ikke egnet for kvantitative

analyser

• Vanskeligheter med å koble til massespektrometer

• Preparativ kromatografi i legemiddelindustrien

25.05.2018

3

SFC

SFCMiddels polare til upolare

Termolabile

Isomere

Kirale

25.05.2018

4

SFC

Superkritisk fluid: En substans over sin kritiske temperatur og trykk

SFC – mobil faser

Substans Kritisk temp (oC)

Kritisk trykk(bar)

Kommentar

CO2 31 73 Fysisk tilstand kan lett endres

H2O 374 221 Ekstreme forhold er nødvendig

Metanol 240 80 Ekstreme forhold er nødvendig

Ammonia 132 111 Sterk etsende

Freon 96 49 Miljøuvennlig

N2O 37 73 Oksideringsmiddel

25.05.2018

5

SFC – mobil faser

Substans Kritisk temp (oC)

Kritisk trykk(bar)

Kommentar

CO2 31 73 Fysisk tilstand kan lett endres

H2O 374 221 Ekstreme forhold er nødvendig

Metanol 240 80 Ekstreme forhold er nødvendig

Ammonia 132 111 Sterk etsende

Freon 96 49 Miljøuvennlig

N2O 37 73 Oksideringsmiddel

Superkritisk CO2

73 bar

31,3 °C ~ 304 K

25.05.2018

6

Fysikalske egenskaper

Hvorfor er superkritisk fluid en god mobil fase for kromatografiske analyser?

Diffusivitet: Beskriver hastigheten som en substans kan gå gjennom en annen

Tetthet påvirker løseligheten av analytt i mobilfasen

Diffusivitet(cm2/s)

Viskositet (g/cm x s)

Tetthet (g/cm3)

Gass 10‐1 10‐4 10‐3

Superkritiskfluid

10‐4 – 10‐3

(væskelignende)10‐4 – 10‐3

(gasslignende)0,2 ‐ 1

Væske < 10‐5 10‐2 1,0

Fysikalske egenskaperHvorfor er superkritisk fluid en god mobil fase for kromatografiske analyser?

Diffusivitet: Beskriver hastigheten som en substans kan gå gjennom en annen

Tetthet påvirker løseligheten av analytt i mobilfasen

Høy diffusivitet og lav viskositet som kombineres i SFC gir rask og effektiv kromatografi.

Diffusivitet*

(cm2/s)Viskositet (g/cm x s)

Tetthet (g/cm3)

Gass 10‐1 10‐4 10‐3

Superkritiskfluid

10‐4 – 10‐3

(væskelignende)10‐4 – 10‐3

(gasslignende)0,2 ‐ 1

Væske < 10‐5 10‐2 1,0

25.05.2018

7

CO2‐tetthet, trykk og temperatur

73 bar ~ 7,3 MPa ~ 1058 psi

0,47 g/ml

Red

user

t tet

thet

Tem

pera

turø

knin

g

Redusert tetthet‐ nedsatt løselighet ‐ økt retensjon

Økende trykk

SFC nyere tid• UPC2 Waters, 2012

• Stabil trykkregulator

– God kontroll på trykk tetthet

• Lavt systemvolum

– Smalere kromatografiske topper

• LC lignende kolonner

– Større fleksibilitet ved valg av stasjonær fase

• Utviklet for å kobles til MS

UPC2 robust og egnet for kvantitativ analyse

25.05.2018

8

UPC2 – Mobil faser

Mobil fase = Superkritisk fluid


Mobil fase = Superkritisk fluid + co‐solvent

+

25.05.2018

9



Co‐solvent (mobil fase B) kan påvirke:

‐ Løselighet i mobil fasen

‐ Elueringsstyrke i mobil fasen

‐ Overflateaktivitet i kolonnen

+

Co‐Solvent ElueringsstyrkePentan, heksan, heptan Svakest

Xylen

Toluen

Dietyl eter

Diklormetan

Kloroform

Aceton

Dioxan

THF

MTBE

Etylacetat

DMSO

Acetonitril

2‐Propanol

Etanol

Metanol Sterkest

CO2 styrke

25.05.2018

10



Metanol

2‐propanol

Etanol

ACN

+

m. fl.



Metanol

2‐propanol

Etanol

ACN

+

Co-solvent konsentrasjon

Polaritet

m. fl.

25.05.2018

11


Additiv =

+


Additiv = Salt eller væske tilsatt co‐solventen

+

25.05.2018

12



Formål:

‐ Forbedre toppfasong

‐ Forbedre analytt‐løselighet

‐ Kan påvirke selektivitet

+



+

Ammoniumhydroksyd

Dietylamin

Maursyre Trifluoreddiksyre

Ammoniumformat

m. fl.

25.05.2018

13



+

Ammoniumhydroksyd

Dietylamin

Maursyre Trifluoreddiksyre m. fl.

Ammoniumformat



+

Ammoniumhydroksyd

Dietylamin

Maursyre Trifluoreddiksyre m. fl.

Ammoniumformat

25.05.2018

14

ACQUITY UPC2 kolonner

ACQUITY UPC2 Trefoil AMY1amylose tris-(3,5-dimethylphenylcarbamate)

ACQUITY UPC2 Trefoil CEL1cellulose tris-(3,5-dimethylphenylcarbamate)

ACQUITY UPC2 Trefoil CEL2cellulose tris-(3-chloro-4-methylphenylcarbamate)

• ACQUITY UPC2 CSH Fluoro-Phenyl– Charged surface hybrid fluoro-phenyl

• ACQUITY UPC2 HSS C18 SB– High strength silica C18

• ACQUITY UPC2 BEH 2-EP– 2-Ethylpyridine

• ACQUITY UPC2 BEH– Unbonded BEH particle

BEH, CSH & HSS Technology

Optimalisering av separasjonen med UPC2

Stasjonær fase

Co‐Solvent

Additiv

Trykk*

Temperatur*

Flow hastighet*

Toppform Retensjon Selektivitet

Injeksjon løsning 2

(*) – Påvirker tetthet

4

1

3 1

2

4

1

2

3

3

4

4

3

3

3

1 – Størst effekt4 – Minst effekt

25.05.2018

15

UPC2‐MSMS

Hvordan virker UPC2‐systemet?

25.05.2018

16



25.05.2018

17



25.05.2018

18


Anvendelsesområder

• Kiral amfetamin

• Isomere amfetaminer

• Syntetisk cannabis

• Anabole steroider

• Fettsyrer

• Vitaminer

25.05.2018

19

Metodeutvikling‐våre erfaringer

• Fettsyrer i fullblod

• R/S‐ Citalopram i serum

• R/S‐Amfetamin i urin

– Legalt S‐amfetamin

– Illegalt R/S‐amfetamin

Strategier for å forbedre selektivitet og kromatografisk separasjon

• Analytisk kolonne/stasjonær fase

• Endre co‐solvent og/eller blandinger av co‐solventer

• Additiver

• Endre tetthet på mobil fasen ved å endre trykket eller kolonnetemperatur

• Injeksjonsvolum

25.05.2018

20

Effekt av stasjonær faseR/S‐ Citalopram

To ulike kirale kolonner

• UPC2 Trefoil CEL2

• UPC2 Trefoil AMY1

3 mm X 150 mm, 2,5 µm

Effekt av stasjonær faseR/S‐ Citalopram

Trefoil CEL2Trefoil AMY1

A:CO2, B: Metanol/acetonitril (70/30) 10 mM ammonium acetatGradient: 0‐4 min; 25 % B til 40 % B

R/S‐Citalopram R‐Citalopram S‐Citalopram

25.05.2018

21

Effekt av co‐solventR/S‐ Amfetamin

Chiralpak AD‐3 2,1 mm X 150 mm, 3 µm

• Metanol

• Metanol/2‐propanol, 50/50

Effekt av co‐solventR/S‐ Amfetamin

Co‐solvent: Metanol Additiv: 0,25 % NH4OH

Co‐solvent: Metanol/2‐propanol, 50/50Additiv: 0,25 % NH4OH

Time2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40

%

0

100

20150318 test 043 MRM of 4 Channels ES+ 136.1 > 119 (Amfetamin)

1.86e72.72

2.64

Time2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40

%

0

100

20150318 test 032 MRM of 4 Channels ES+ 136.1 > 119 (Amfetamin)

1.83e72.61

R/S‐AmfetaminR‐Amfetamin

S‐Amfetamin

25.05.2018

22

Effekt av additivR/S‐Amfetamin

Additiv: 0,3 % syklohexylaminCo‐solvent: Metanol/2‐propanol, 50/50

Additiv: 0,25 % NH4OHCo‐solvent: Metanol/2‐propanol, 50/50

R‐AmfS‐AmfR‐AmfS‐Amf

Effekt av trykkLinolensyre

Kolonne HSS C18 SB2,1X100mm, 1,8 µm

25.05.2018

23

Effekt av kolonnetemperaturLinolensyre

50 °C

60 °C

70 °C

Effekt av kolonnetemperaturR/S‐Citalopram

60 °C

50 °C

35 °CS‐CitalopramR‐Citalopram

? X

25.05.2018

24

Effekt av injeksjonsvolumR/S‐Citalopram

3 µl

4 µl

6 µl

1 µl

100 µl serum375 µl ACN m/ 1 % maursyre

UPC2 gradientR/S‐Citalopram

Tid(min)

Flow(ml/min)

CO2

(%)B(%)

Kurve

Initial 2,0 75 25

0,3 2,0 75 25 6

2,0 2,0 70 30 6

2,8 2,0 60 40 6

3,5 2,0 60 40 6

3,6 2,0 75 25 6

4,0 2,0 75 25 6

B: Metanol/acetonitril (70/30) 10 mM ammonium acetatAnalysekolonne: Trefoil CEL2 Kolonne temperatur: 35 °C

25.05.2018

25

R/S‐ Citalopram i serum

min1.400 1.600 1.800 2.000

%

0

100

F2:MRM of 1 channel,ES+329.4 > 2666.458e+005

IS R-Citalopram-d41.66

1.86

min

%

0

100


R-Citalopram_S1.68 1.88

min5.50 6.00 6.50 7.00 7.50

%

0

100


IS R-Citalopram-d46.55 7.10

min

%

0

100

F1:MRM of 2 channels,ES+325 > 109

2.350e+005R_Citalopram_S

6.58

5.53

7.13

UPC2‐MSMS UPLC‐MSMS

4 min, flow 2 ml/min 12 min flow 1 ml/min

R/S‐Citalopram i serum

2000 prøver per år

R‐Citalopram 5‐500 nM

Std 5 nM

min1.400 1.600 1.800 2.000

%

0

100

F2:MRM of 1 channel,ES+329.4 > 266

Std1

2.136e+005IS R-Citalopram-d4

1.65 1.84

min

%

0

100

F1:MRM of 1 channel,ES+325.1 > 262

Std1

1.640e+004R_Citalopram_S

1.66 1.86

nM-0 100 200 300 400 500

Re

spo

nse

-0.00

2.00

4.00

6.00

25.05.2018

26

R/S‐Amfetamin i urin

2500 prøver per år

S‐Amfetamin50‐10000 ng/ml

Std 50 ng/ml

µg/l-0 2000 4000 6000 8000 10000

Re

spo

nse

-0.0

10.0

20.0

30.0

40.0

50.0

60.0

min2.000 2.200 2.400 2.600

%

0

100

F2:MRM of 1 channel,ES+139 > 92

0201AKIRAMF_06 Smooth(Mn,3x3) Std1

2.317e+0052.43IS S-amfetamin-d3

2.26

min

%

0

100

F1:MRM of 2 channels,ES+136.1 > 119

0201AKIRAMF_06 Smooth(Mn,3x3) Std1

7.918e+004S-Amfetamin

2.26 2.44

25.05.2018

27

Prøve 1

Konklusjon: Legaltamfetamin

R‐Amfetamin‐d3

min2.000 2.100 2.200 2.300 2.400 2.500

%

0

100


0811ASOH3_31

5.707e+0042.37

2.21

min

%

0

100


0811ASOH3_31

1.091e+0062.21

S‐Amfetamin

S‐Amfetamin‐d3

Prøve 2

Konklusjon: Illegalt amfetamin

min2.000 2.200 2.400 2.600

%

0

100


0811ASOH3_20

5.464e+0042.21 2.38

min

%

0

100


0811ASOH3_20

1.235e+0052.38

2.22

S‐Amfetamin

R‐Amfetamin

S‐Amfetamin‐d3

R‐Amfetamin‐d3

25.05.2018

28

Prøve 3

Konklusjon: Legalt og illegaltamfetamin

min2.000 2.100 2.200 2.300 2.400 2.500

%

0

100


0901AHH1_55

5.217e+0042.36

2.19

min

%

0

100


0901AHH1_55

1.168e+0062.20

2.36

S‐Amfetamin

R‐Amfetamin

S‐Amfetamin‐d3

R‐Amfetamin‐d3

Utfordringer

• Høyt trykk/lekkasje i CO2‐pumpa

• Renhet CO2 er viktig

• Ingen ventil på MS‐viktig med rene prøver

• Splitter ca 80 % av prøven i waste‐mindre prøve inn i MS’en

• Begrenset injeksjonsvolum i forhold til LC

• Gassflaske i rommet

• Flere organiske løsninger enn vanlig LC, make up solvent og to vaske‐løsninger

25.05.2018

29

Konklusjon

• Relativt kort analysetid for kirale metoder

• Stabile retensjonstider og trykk

• Enkel i bruk

• Samme programvare som våre UPLC‐system

• Valideringen av metodene viser gode resultater mhp reproduserbarhet mm

• To metoder i rutinedrift

• Robust

Solfrid Hegstad...R‐Amfetamin‐d3 Utfordringer • Høyt trykk/lekkasje i CO2‐pumpa • Renhet...

Documents

Transcript of Solfrid Hegstad...R‐Amfetamin‐d3 Utfordringer • Høyt trykk/lekkasje i CO2‐pumpa • Renhet...