CENTRO DE INVESTIGACIÓN CIENTÍFICA DE YUCATÁN A.C.

Jorge M. Santamaría,, Virginia Herrera-Valencia, Gabriela Fuentes,

Mariana Menéndez, Fabio Idrovo, Miguel Angel Vallejo-Reyna, Santy

Peraza-Echeverría .

CIBIOGEM, 2 Agosto 2012

1.

SOBREXPRESION CONTROLADA DEL GEN NPR1 EN PAPAYA

UTILIZANDO UN PROMOTOR INDUCIBLE POR ETANOL: UNA

ESTRATEGIA BIOTECNOLOGICA PARA EL CONTROL DE LA

ANTRACNOSIS

Porque papaya?

• Un alimento con un alto contenido nutricional (Jiménez, 2002; USDA, 2008). Vitamina C, Vitamina A, polifenoles, licopenos

Fuente: USDA, 2008

100gr de Papaya fresca contienen:

3

PORQUE PAPAYA ?

PAPAYA, PRODUCCION

En el 2010 Se sembraron a nivel mundial 438 mil has que produjeron 11 millones

de tons, con un valor de $3 mil millones de USD

En México, se sembraron 14 mil has produciéndose un total de 616 mil

tons, con un valor de la producción de $174 millones USD

México ocupó el quinto lugar mundial en producción después de India, Brasil, Nigeria

e Indonesiatons USD (millones)

1 India 4,7 millones 1.3 mil

2 Brazil 1,8 millones 531

3 Nigeria 7 millones 199

4 Indonesia 695 mil 197

5 Mexico 616 mil 174

4

• PAPAYA, EXPORTACION

•México, primer exportador a nivel mundial por arriba de Brasil y USA,

exportándose 100 mil tons anualmente,

con un valor de 55 millones de USD

País Cantidad (TM) Valor (10x103 USD)

México 101306 55327

Brasil 32267 34404

EUA 9604 17715

PORQUE ANTRACNOSIS?

•Producida por el hongo Colletotrichum gloeosporioides

Reduce la calidad del fruto en postcosecha

Pérdidas hasta del del 99% en épocas favorables al desarrollo de la

enfermedad.

• Papaya es un fruto climatérico, es decir madura fuera del árbol. Como parte

fundamental de este proceso de maduración poscosecha se libera etileno. Sin

embargo dicho etileno actúa también como señal, para estimular al hongo y

propagar la enfermedad ya que favorece la germinación de esporas, micelio y

apresorios.

Manners , (1993) . Principles of plant pathology. Prusky y Plumbley, (1992). Colletotrichum Dodd et al., (1992). Colletotrichum. (Flaishman yKolatukkudy,1994). Tatagiba et al., (2002). Fitopatologia BrasileiraLiberato y Zambolin (2002). Controle de doenças de plantas fruteiras. 5

Esta enfermedad postcosecha se presenta cuando eletileno dispara el proceso de maduración del fruto.Esto ocurre a los 4 días de ser removido del árbol.

De manera que se empacan frutos aparentementesanos y se exportan, pero en muchas ocasionespueden regresar el contenedor, ya que se recibelleno de antracnosis

6

7Guzmán et al.,(2009). Academia Journals 30:6

LA ENFERMEDAD SE CONTROLA CON

Fungicidas QUIMICOS

Sin embargo los fungicidas químicos causan

problemas ecológicos y su aplicación representa del

30 al 40 % del costo de producción (entre $20 y 40

mil pesos por ha al año) Guzmán et al., (2009).

Mas aún, los fungicidas se aplican además en postcosecha,

durante el empacado del fruto, 12 días antes de ser

consumidos¡

CLARAMENTE, SE REQUIERE UNA

ESTRATEGIA ALTERNATIVA

• Estrategia biotecnológica alterna para el control del patógeno

•SOBRE-EXPRESAR GENES QUE INCREMENTEN LA RESISTENCIA DE LA

PLANTA AL PATOGENO (NPR1, TGA)

•HACERLO EN FORMA CONTROLADA, SISTEMA ALC

•INDUCIR LA EXPRESION EN EL FRUTO COSECHADO POR LO QUE LA PLANTA

NO EXPRESA EL TRANSGEN EN LA PLANTACIÓN

8

El genoma completo de papaya está disponible Ming et al 2008, Nature

¿PORQUE NPR1?NPR1 (No expresivo de genes PR-1)

Es el regulador maestro de la resistencia sistémica adquirida (SAR)

Su sobre-expresión ha resultado en plantas de varias especies, con mayor resistencia a

patógenos

10

Patógeno

Activación de

una muerte

celular

programada

en el sitio de

ataque

Respuesta

Hipersensible

(HR)

Efectores

Ácido

Salicílico

(AS)

A

S

Metil

salicilato

Inducción de la expresión de

genes relacionados a la

patogénesis (PR) en tejidos

distantes a la zona de ataque

Señal que viaja

a través del

floema y activa

la

Zona de

ataque

Resistencia

Sistémica

Adquirida

(SAR)

Mo

dific

ad

o d

e P

iete

rse

an

d v

an

Lo

on

(2

00

4).

Clonación de ADNc completosde NPR1 reportados

Especie Referencia

Arabidopsis thaliana Cao et al. 1997

Nicotiana tabacum Liu et al. 2002

Helianthus annuus Ekergren et al. 2003

Lycopersicon esculentum Chern et al. 2005

Oryza sativa Radwan et al. 2005

Malus x domestica Malnoy et al. 2007

Vitis vinifera Henanff et al. 2009

Glycine max Sandhu et al. 2009

La familia génica de NPR1 en Arabidopsis thaliana

Liu et al. 2005

The Plant Journal,

Vol 41, 304–318

Desarrollo

Regulador

positivo

de la SAR

Reguladores

negativos

de la SAR

Hepworth et al, 2005.

The Plant Cell, Vol. 17,

1434–1448

Hepworth et al, 2005.

The Plant Cell, Vol. 17,

1434–1448

Zhang et al., 2006

The Plant Journal,

Vol.48, 647–656

Cao et al. 1997

Cell, Vol. 88

57–63

Sobre-expresión de NPR1 = mayor resistencia a patógenos

Especie Patógeno Fenotipo Referencia

Arabidopsis thaliana Psm ES4526Peronospora parasitica

Resistente Cao et al. 1998

Oriza sativa Xanthomonas oryzae pv oryzae Resistentepleitropía

Fitzgeald et al.2004

Lycopersicon esculentum Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici, Stemphylium solaniPhytophthora infestansX. campestris pv. Vesicatoria Ralstonia solanacearumCucumber Mosaic Virus (CMV)Tomato Mosaic Virus (ToMV)Tomato Yellow Leaf Curl Virus (TYLCV)

Resistente Lin et al. 2004

Oriza sativa X. oryzae pv oryzae Resistentepleitropía

Chern et al 2005

Triticum sp. F. graminearum Resistente Makandar et al.2006

Malus × domestica Venturia inaequalisErwinia amylovoraGymnosporangium juniperi-virginianae

Resistente Malnoy et al.2007

¿COMO LOGRAR UNA EXPRESION CONTROLADA?

• Sistema ALC

16

Actividad de GUS en tubérculos maduros

(100 mL de agua o disolución de etanol 0.7

M). Sweetman et al., (2002), Plant

Physiology

.

PROMOTOR INDUCIBLE POR ETANOL, GEN alc

Basado en Tomsett et al., (2004) TRENDS in Plant Science

Tubérculo

- +

17

Plant Physiology Volume 129(3):943-948, July 1, 2002

Potato tuber

SOBREXPRESION CONTROLADA DEL GEN NPR1 EN PAPAYA UTILIZANDO UN PROMOTOR INDUCIBLE POR ETANOL:

UNA ESTRATEGIA BIOTECNOLOGICA PARA EL CONTROL DE LA ANTRACNOSIS

Ciencia Básica del CONACYT

CB 83829

2009-2012

18

Objetivos• General

– Caracterizar la estructura, filogenia y expresión del juego completo de los genestipo NPR1 de Carica papaya L., var. Maradol. Sobreexpresar uno de los genesNPR1 mas prometedores en callos embriogénicos, regenerar plantas y evaluarsi frutos de platas que sobreexpresen dicho gen aumentan su resistencia aantracnosis

• Particulares– Caracterizar in silico la estructura de genes tipo NPR1 de Carica papaya L.

Caracterizar las relaciones filogenéticas de genes tipo NPR1 de Carica papaya L.

– Evaluar los patrones de expresión basal de genes tipo NPR1 de Carica papaya L.y en respuesta a SA (inductor de SAR).

– Transformar callos embriogénicos con uno de los genes NPR1 masprometedores, regenerar plantas y evaluar si frutos de las plantas quesobrexpresen dicho gen aumentan su resistencia a antracnosis

ESTRATEGIA EXPERIMENTAL

20

Resultados

21

Porcentajes de identidad de las secuencias homologas tipo NPR1 (4) encontradas en papaya

vs las 6 secuencias reportadas en A. thaliana

22

Características de NPR1

• Presenta dos dominios de interacción proteína-proteína.– un dominio BTB/POZ (Broad-Complex, Tramtrack, Bric-a-brac /

Poxvirus Zinc finger) .

– un dominio ankyrin-repeat formado de 4 dominios ANK (Ankyrin).

• Cisteínas (Cys) que permiten la oligomerizacion de la proteína.

Hepworth et al, 2005.

The Plant Cell, Vol. 17,

1434–1448

24

Motivo Fosfodegron Tipo IĸB DSxxxS

AtNPR1 1 ----MDTTIDGFADSYEISSTSF-VATDNTDS-SIVYLAAEQVLTGPDVSALQLLSNSFE

AtNPR2 1 MATTTTTTTARFSDSYEFSNTSG-NSFFAAES-SLDYP--TEFLTPPEVSALKLLSNCLE

CpNPR1 1 ----MDYRTG-TSDSNDISNNSS-TCCVATNTDTLSHP--LEPLTTPEISGLQLLSRNLL

AtNPR3 1 -------MATLTEPSSSLSFTSS-HFSYGSIGSNHFSSSS---ASNPEVVSLTKLSSNLE

AtNPR4 1 ------MAATAIEPSSSISFTSS-HLSNPSPVVTTYHS-----AAN-----LEELSSNLE

CpNPR3 1 -------MANSAEPSSSLSFTSSSHLSNCSASHNFSSSSCHETGPNLEVISLSRLSSNLE

CpNPR4 1 -------MENGSEMSSSLSFASS-NLSSSSSSLSHDPCTS---LEN---LSLNKLSCNLE

CpNPR5 1 -------------------------------------------MSS-LEESLRSLSLDYL

AtNPR5 1 -------------------------------------------MSN-LEESLRSLSLDFL

AtNPR6 1 -------------------------------------------MSNTFEESLKSMSLDYL

AtNPR1 55 SVFDSPD-DFYSDAKLVLSD-GREVSFHRCVLSARSSFFKSALAAAKKE-----------

AtNPR2 57 SVFDSPE-TFYSDAKLVLAG-GREVSFHRCILSARIPVFKSALATVKEQ-----------

CpNPR1 53 TIFDSSDFDFFSDARLMLGS-GREIPVHRCILSSRSPFFKAIFSGSAFK-----------

AtNPR3 50 QLLSNSD-CDYSDAEIIVDG--VPVGVHRCILAARSKFFQDLFKKEKKI-----------

AtNPR4 44 QLLTNPD-CDYTDAEIIIEEEANPVSVHRCVLAARSKFFLDLFKKDKDS-----------

CpNPR3 54 RLLIDST-CDYSDADIIVEG--ISVGVHRCILAARSKILN----KVKHS-----------

CpNPR4 47 NLLFHSE-YDYSDAEIVVED--KPVAVHRCILAARSQFFHQLFSKGVVK-----------

CpNPR5 17 NLLINGQ--AFSDVTFSVEG--RLVHAHRCILAARSLFFRKFFCGPDPP---PGLDPT-G

AtNPR5 17 NLLINGQ--AFSDVTFSVEG--RLVHAHRCILAARSLFFRKFFCGTDSPQPVTGIDPT-Q

AtNPR6 18 NLLINGQ--AFSDVTFSVEG--RLVHAHRCILAARSLFFRKFFCESDPSQ—PGAEPANQ

AtNPR1 102 --KDSNNTAAVKLELKEIAKDYEVGFDSVVTVLAYVYSSRVRPPPKGV---SECADENCC

AtNPR2 104 --KSS---TTVKLQLKEIARDYEVGFDSVVAVLAYVYSGRVRSPPKGA---SACVDDDCC

CpNPR1 101 --ERT-----AKFRLKELAGDYDVGFDALVAVLAYLYTGKVWPLPKGV---CVCVDEECS

AtNPR3 96 --SKTE---KPKYQLREMLPYGAVAHEAFLYFLSYIYTGRLKPFPLEV---STCVDPVCS

AtNPR4 92 --SEK----KPKYQMKDLLPYGNVGREAFLHFLSYIYTGRLKPFPIEV---STCVDSVCA

CpNPR3 96 --ANN-------------------------------------------------------

CpNPR4 93 --EGK-----PRYLMSELVPFGVVGYEAFSVFLNYLYTGKLRPSPPEV---STCVDLTCN

CpNPR5 69 SRMSPG-AARG----AGVIPVNSVGYEVFLLLLQFLYSGQVSIVPQKHEPRPNCGERGCW

AtNPR5 72 HGSVPASPTRGSTAPAGIIPVNSVGYEVFLLLLQFLYSGQVSIVPQKHEPRPNCGERGCW

AtNPR6 72 TGSGARAAAVG-----GVIPVNSVGYEVFLLLLQFLYSGQVSIVPHKHEPRSNCGDRGCW

AtNPR1 157 HVACRPAVDFMLEVLYLAFIFKIPELITLYQRHLLDVVDKVVIEDTLVILKLANICGKAC

AtNPR2 156 HVACRSKVDFMVEVLYLSFVFQIQELVTLYERQFLEIVDKVVVEDILVIFKLDTLCGTTY

CpNPR1 151 HVGCRPAVDFLVEVLYVAFTFQISELVALYQRHLLDIIDKVETDNILVILSVANICGKVC

AtNPR3 148 HDCCRPAIDFVVQLMYASSVLQVPELVSSFQRRLCNFVEKTLVENVLPILMVAFNC--KL

AtNPR4 143 HDSCKPAIDFAVELMYASFVFQIPDLVSSFQRKLRNYVEKSLVENVLPILLVAFHC--DL

CpNPR3 99 --------------------------TNSLGRRLLNFTGKAMVEHVLPILVVAFHC--QL

CpNPR4 143 HDACGPAITYALELMYASATFQVKELVLLLQRRLLDFVEKAFVEDVIPILVAAFHC--QL

CpNPR5 124 HTHCTSAVDLALDTLAAARYFGVEQLALLTQKQLASMVEKASIEDVMKVLIASRKQ--DM

AtNPR5 132 HTHCSAAVDLALDTLAASRYFGVEQLALLTQKQLASMVEKASIEDVMKVLIASRKQ--DM

AtNPR6 127 HTHCTAAVDLSLDILAAARYFGVEQLALLTQKHLTSMVEKASIEDVMKVLIASRKQ--DM

AtNPR1 217 MKLLDRCKEIIVKSNVDMVSLEKSLPEELVKEIIDRRKELGLE----VPK----------

AtNPR2 216 KKLLDRCIEIIVKSDIELVSLEKSLPQHIFKQIIDIREALCLE----PPK----------

CpNPR1 211 DRLLGRCMDIIVKSDVDAVTLDKSLPLSIVKQIMDLRAECDTQ----GPEG---------

AtNPR3 206 TQLLDQCIERVARSDLYRFCIEKEVPPEVAEKIKQLRLISPQDEETSPKIS---------

AtNPR4 201 TQLLDQCIERVARSDLDRFCIEKELPLEVLEKIKQLRVKSVN----IPEVE---------

CpNPR3 131 TQLIAQCVDRVARSDLDKVSIEKELPFEVAEDIRLVRDKSPPDENNNREIL---------

CpNPR4 201 NQLLSNCIQRVARSDIDCACLSKELPSEVFSKLKSVRLEIQQDHESSDLEV---------

CpNPR5 182 HQLWTTCSHLVAKSGLPPEVLAKHLPIDVVAKIEELRLKSSLARRSLMPHHHHHHHHHHH

AtNPR5 190 HQLWTTCSHLVAKSGLPPEILAKHLPIDVVTKIEELRLKSSIARRSLMPHN-------HH

AtNPR6 185 HQLWTTCSYLIAKSGLPQEILAKHLPIELVAKIEELRLKSSMPLRSLMPHH---------

1er ANTKYRIN

BTB

BTB

BTB

•El motivo fosfodegron tipo IĸB (Spoel et al., 2009) de seis

aminoácidos se encuentra en Asp10 - Ser15.

25

Motivo Fosfodegron Tipo IĸB DSxxxS

AtNPR1 1 ----MDTTIDGFADSYEISSTSF-VATDNTDS-SIVYLAAEQVLTGPDVSALQLLSNSFE

AtNPR2 1 MATTTTTTTARFSDSYEFSNTSG-NSFFAAES-SLDYP--TEFLTPPEVSALKLLSNCLE

CpNPR1 1 ----MDYRTG-TSDSNDISNNSS-TCCVATNTDTLSHP--LEPLTTPEISGLQLLSRNLL

AtNPR3 1 -------MATLTEPSSSLSFTSS-HFSYGSIGSNHFSSSS---ASNPEVVSLTKLSSNLE

AtNPR4 1 ------MAATAIEPSSSISFTSS-HLSNPSPVVTTYHS-----AAN-----LEELSSNLE

CpNPR3 1 -------MANSAEPSSSLSFTSSSHLSNCSASHNFSSSSCHETGPNLEVISLSRLSSNLE

CpNPR4 1 -------MENGSEMSSSLSFASS-NLSSSSSSLSHDPCTS---LEN---LSLNKLSCNLE

CpNPR5 1 -------------------------------------------MSS-LEESLRSLSLDYL

AtNPR5 1 -------------------------------------------MSN-LEESLRSLSLDFL

AtNPR6 1 -------------------------------------------MSNTFEESLKSMSLDYL

AtNPR1 55 SVFDSPD-DFYSDAKLVLSD-GREVSFHRCVLSARSSFFKSALAAAKKE-----------

AtNPR2 57 SVFDSPE-TFYSDAKLVLAG-GREVSFHRCILSARIPVFKSALATVKEQ-----------

CpNPR1 53 TIFDSSDFDFFSDARLMLGS-GREIPVHRCILSSRSPFFKAIFSGSAFK-----------

AtNPR3 50 QLLSNSD-CDYSDAEIIVDG--VPVGVHRCILAARSKFFQDLFKKEKKI-----------

AtNPR4 44 QLLTNPD-CDYTDAEIIIEEEANPVSVHRCVLAARSKFFLDLFKKDKDS-----------

CpNPR3 54 RLLIDST-CDYSDADIIVEG--ISVGVHRCILAARSKILN----KVKHS-----------

CpNPR4 47 NLLFHSE-YDYSDAEIVVED--KPVAVHRCILAARSQFFHQLFSKGVVK-----------

CpNPR5 17 NLLINGQ--AFSDVTFSVEG--RLVHAHRCILAARSLFFRKFFCGPDPP---PGLDPT-G

AtNPR5 17 NLLINGQ--AFSDVTFSVEG--RLVHAHRCILAARSLFFRKFFCGTDSPQPVTGIDPT-Q

AtNPR6 18 NLLINGQ--AFSDVTFSVEG--RLVHAHRCILAARSLFFRKFFCESDPSQ—PGAEPANQ

AtNPR1 102 --KDSNNTAAVKLELKEIAKDYEVGFDSVVTVLAYVYSSRVRPPPKGV---SECADENCC

AtNPR2 104 --KSS---TTVKLQLKEIARDYEVGFDSVVAVLAYVYSGRVRSPPKGA---SACVDDDCC

CpNPR1 101 --ERT-----AKFRLKELAGDYDVGFDALVAVLAYLYTGKVWPLPKGV---CVCVDEECS

AtNPR3 96 --SKTE---KPKYQLREMLPYGAVAHEAFLYFLSYIYTGRLKPFPLEV---STCVDPVCS

AtNPR4 92 --SEK----KPKYQMKDLLPYGNVGREAFLHFLSYIYTGRLKPFPIEV---STCVDSVCA

CpNPR3 96 --ANN-------------------------------------------------------

CpNPR4 93 --EGK-----PRYLMSELVPFGVVGYEAFSVFLNYLYTGKLRPSPPEV---STCVDLTCN

CpNPR5 69 SRMSPG-AARG----AGVIPVNSVGYEVFLLLLQFLYSGQVSIVPQKHEPRPNCGERGCW

AtNPR5 72 HGSVPASPTRGSTAPAGIIPVNSVGYEVFLLLLQFLYSGQVSIVPQKHEPRPNCGERGCW

AtNPR6 72 TGSGARAAAVG-----GVIPVNSVGYEVFLLLLQFLYSGQVSIVPHKHEPRSNCGDRGCW

AtNPR1 157 HVACRPAVDFMLEVLYLAFIFKIPELITLYQRHLLDVVDKVVIEDTLVILKLANICGKAC

AtNPR2 156 HVACRSKVDFMVEVLYLSFVFQIQELVTLYERQFLEIVDKVVVEDILVIFKLDTLCGTTY

CpNPR1 151 HVGCRPAVDFLVEVLYVAFTFQISELVALYQRHLLDIIDKVETDNILVILSVANICGKVC

AtNPR3 148 HDCCRPAIDFVVQLMYASSVLQVPELVSSFQRRLCNFVEKTLVENVLPILMVAFNC--KL

AtNPR4 143 HDSCKPAIDFAVELMYASFVFQIPDLVSSFQRKLRNYVEKSLVENVLPILLVAFHC--DL

CpNPR3 99 --------------------------TNSLGRRLLNFTGKAMVEHVLPILVVAFHC--QL

CpNPR4 143 HDACGPAITYALELMYASATFQVKELVLLLQRRLLDFVEKAFVEDVIPILVAAFHC--QL

CpNPR5 124 HTHCTSAVDLALDTLAAARYFGVEQLALLTQKQLASMVEKASIEDVMKVLIASRKQ--DM

AtNPR5 132 HTHCSAAVDLALDTLAASRYFGVEQLALLTQKQLASMVEKASIEDVMKVLIASRKQ--DM

AtNPR6 127 HTHCTAAVDLSLDILAAARYFGVEQLALLTQKHLTSMVEKASIEDVMKVLIASRKQ--DM

AtNPR1 217 MKLLDRCKEIIVKSNVDMVSLEKSLPEELVKEIIDRRKELGLE----VPK----------

AtNPR2 216 KKLLDRCIEIIVKSDIELVSLEKSLPQHIFKQIIDIREALCLE----PPK----------

CpNPR1 211 DRLLGRCMDIIVKSDVDAVTLDKSLPLSIVKQIMDLRAECDTQ----GPEG---------

AtNPR3 206 TQLLDQCIERVARSDLYRFCIEKEVPPEVAEKIKQLRLISPQDEETSPKIS---------

AtNPR4 201 TQLLDQCIERVARSDLDRFCIEKELPLEVLEKIKQLRVKSVN----IPEVE---------

CpNPR3 131 TQLIAQCVDRVARSDLDKVSIEKELPFEVAEDIRLVRDKSPPDENNNREIL---------

CpNPR4 201 NQLLSNCIQRVARSDIDCACLSKELPSEVFSKLKSVRLEIQQDHESSDLEV---------

CpNPR5 182 HQLWTTCSHLVAKSGLPPEVLAKHLPIDVVAKIEELRLKSSLARRSLMPHHHHHHHHHHH

AtNPR5 190 HQLWTTCSHLVAKSGLPPEILAKHLPIDVVTKIEELRLKSSIARRSLMPHN-------HH

AtNPR6 185 HQLWTTCSYLIAKSGLPQEILAKHLPIELVAKIEELRLKSSMPLRSLMPHH---------

1er ANTKYRIN

BTB

BTB

BTB

• El dominio BTB (Hepwort et al., 2005) en Ser65 - Val194,

26

AtNPR1 263 ---------VKKHVSNVHKALDSDDIELVKLLLKEDHTNLDDACALHFAVAYCNVKTATD

AtNPR2 262 ---------LERHVKNIYKALDSDDVELVKMLLLEGHTNLDEAYALHFAIAHCAVKTAYD

CpNPR1 258 ------RSFPDKHVKRIHRALDSDDVELVRMLLKEARTNLDDAHALHYAVAYCDAKTTIE

AtNPR3 257 ------EKLLER-IGKILKALDSDDVELVKLLLTESDITLDQANGLHYSVVYSDPKVVAE

AtNPR4 248 ------DKSIER-TGKVLKALDSDDVELVKLLLTESDITLDQANGLHYAVAYSDPKVVTQ

CpNPR3 182 ------DPFREKRVRRIHKALDSDDVELVKLLLTESNISLDDANALHYAVAYCDPKVVSE

CpNPR4 252 ------DAVDEKSIKKIHMALDSDDVELVNRLLSESNITLDKAYALHYAAAYCDPKVVKE

CpNPR5 242 HDLSAAADLEDQKIRRMRRALDSSDVELVKLMVMGEGLNLDEALALHYAVENCSREVVKA

AtNPR5 243 HDLSVAQDLEDQKIRRMRRALDSSDVELVKLMVMGEGLNLDESLALHYAVESCSREVVKA

AtNPR6 236 HDLTSTLDLEDQKIRRMRRALDSSDVELVKLMVMGEGLNLDESLALIYAVENCSREVVKA

AtNPR1 314 LLKLDLADVNHRN-PRGYTVLHVAAMRKEPQLILSLLEKGASASEATLEGRTALMIAKQA

AtNPR2 313 LLELELADVNLRN-PRGYTVLHVAAMRKEPKLIISLLMKGANILDTTLDGRTALVIVKRL

CpNPR1 312 LLDLGLADVNHRN-SRGYTVLHIAAMRKEPKLIVSLLTKGARPSDLTPDGRKALQISKRL

AtNPR3 310 ILALDMGDVNYRN-SRGYTVLHFAAMRREPSIIISLIDKGANASEFTSDGRSAVNILRRL

AtNPR4 301 VLDLDMADVNFRN-SRGYTVLHIAAMRREPTIIIPLIQKGANASDFTFDGRSAVNICRRL

CpNPR3 236 VLCLGLADVNLRN-SRGYTVLHIAAMRKEPSILVSLLTKGASASELTLDGQSSVNICRGL

CpNPR4 306 LLRLGLADLSLRN-PRGLTVLHVAARRKEPSLLMALLTEGASVSGTTLDGQTAVAICRRL

CpNPR5 302 LLELGAADVNFPAGPAGKTPLHIAAEMVSPDMVAVLLDHHADPNVRTVDGVTPLDILRTL

AtNPR5 303 LLELGAADVNYPAGPAGKTPLHIAAEMVSPDMVAVLLDHHADPNVRTVGGITPLDILRTL

AtNPR6 296 LLELGAADVNYPAGPTGKTALHIAAEMVSPDMVAVLLDHHADPNVQTVDGITPLDILRTL

4º ANTKYRIN 3er ANTKYRIN 2º ANTKYRIN

2º ANTKYRIN

1er ANTKYRIN

AtNPR1 373 TMAVECNNIPEQCKHSLKG--RLCVEILEQEDKREQI-PRDVPPSFAVAADELKMTLLDL

AtNPR2 372 TKADDYKTSTEDGTPSLKG--GLCIEVLEHEQKLEYLSPIEASLSLPVTPEELRMRLLYY

CpNPR1 371 TKAADYYNTTEEGKAAPKD--RLCVEILEQAERRDPL-LGEASLSLAKAGDDFRMKLLYL

AtNPR3 369 TNPKDYHTKTAKGRESSKA--RLCIDILEREIRKNPMVL-DTPMCSISMPEDLQMRLLYL

AtNPR4 360 TRPKDYHTKTSR-KEPSKY--RLCIDILEREIRRNPLVSGDTPTCSHSMPEDLQMRLLYL

CpNPR3 295 TRPKDYHAKMEQGQETNKD--RICIDILEREMRRNPMAG-DVSMNSHTVADDLHMKLLYL

CpNPR4 365 TRLKDYNKNIEQGQVSHKD--RICIGILEREMG-NSVSG-NVPISSPMNTDDLQRTLDYL

CpNPR5 362 TSDFLFKGAVPGLTHIEPNKLRLCLELVQSAALVISREE---AGSVNAPTSTAIYPPMSE

AtNPR5 363 TSDFLFKGAVPGLTHIEPNKLRLCLELVQSAAMVISREEGNNSNNQNNDNNTGIYPHMNE

AtNPR6 356 TSDFLFKGAIPGLTHIEPNKLRLCLELVQSAALVISREE---GNNNSNDNNTMIYPRMKD

4º ANTKYRIN

los 4 dominios Ankyrin de la región N-terminal (Cao et al., 1997)

27

AtNPR1 489 EHQSRLKALSKTVELGKRFFPRCSAVLDQIM---NCEDLTQLACGEDDTAEKRLQKKQRY

AtNPR2 489 KHLSRLRALCKTVELGKRYFKRCS--LDHFM---DTEDLNHLASVEEDTPEKRLQKKQRY

CpNPR1 ------------------------------------------------------------

AtNPR3 484 RLLTRMVALMKTVETGRRFFPYGSEVLDKYMAEYIDDDILDDFHFEKGSTHERRLKRMRY

AtNPR4 477 RMLTRMKALMKTVETGRRYFPSCYEVLDKYMDQYMDEEIPDMSYPEKGTVKERRQKRMRY

CpNPR3 408 RLLSRVESLMKTVNMGRRFFPHCSEVLDR----FMEDDLPDLFYLEKGTPDEQRRKRTRF

CpNPR4 540 RLQLQLQKLHKTVETGRRYFPHCSDVLDN---FLEDAEMPDSLFLEKGTPEEQKLKKRRF

CpNPR5 470 TMYHHSHDF---------------------------------------------------

AtNPR5 481 TMYHHHHQHHF-------------------------------------------------

AtNPR6 458 TMYHHHHHHF--------------------------------------------------

AtNPR1 546 MEIQETLKKAFSEDNLELGNSSLTDSTSSTSKSTGGKRSNRKLSHRRR------------

AtNPR2 544 MELQETLMKTFSEDKEECGKS-------STPKPTSAVRSNRKLSHRRLKVDKRDFLKRPY

CpNPR1 ------------------------------------------------------------

AtNPR3 544 RELKDDVQKAYSKDKESKIARSCLSASSSPSSSSIRDDLHNTT-----------------

AtNPR4 537 NELKNDVKKAYSKDK---VARSCLSSSSP--ASSLREALENPT-----------------

CpNPR3 464 MELKDDVQKAFIKDK---ARSSCSGLSSSSSSSSLKDAVT--------------------

CpNPR4 597 MELKEDVQKAFNKDME--NKRS--------------------------------------

CpNPR5 ------------------------------------------------------------

AtNPR5 ------------------------------------------------------------

AtNPR6 ------------------------------------------------------------

NLS

la señal de localización nuclear (NLS por sus siglas en inglés)

(Kinkema et al., 2000) que va de Lys537- Lys554.

• la localización nuclear de la proteína NPR1 se señalan con una flecha ()

• y los relacionados con la interacción con TGA´s con un asterisco (),

•aquellos que intervienen en la transactivación con signo de mas ()

•aquellos que intervienen en la fosforilación con un punto negro ().

TGA

Estructura tridimensional de NPR1 en papaya y arabidopsis

BTB/POZ ANKYRIN REPEATS

AtNPR1

CpNPR1

Fig. 2 Predicted three-dimensional structure of BTB/POZ and ankyrin domains from papaya and Arabidopsis. The 3D models were

generated using the SWISS-model workspace (Bordoli et al. 2009).

Análisis filogenético

29

AAM62410 N.t.

ABG38308 C.a

AAT57637 L.e.

AAT57640 B.v.

XP 002281475 V.v.

CpNPR1C.p.

XP_002308281 P.t.

ABI93182 M.a.

ABL63913 M.a.

CAJ19095 H.v.

AP002537 O.s.

AtNPR1 A.t.

AtNPR2 A.t.

CpNPR4 C.p

XP_002300863 P.t

AtNPR3 A.t

AtNPR4 A.t.

AAT57642 H.a.

CpNPR3 C.p.

ABK62792 P.p.

ACJ45013 G.m.

ACJ45015 G.m.

XP_001757508 P.p.

XP_001759240 P.p.

ABE11621 O.s.

AtNPR6 A.t.

XP_002308905 P.t.

XP_002323261 P.t.

AtNPR5 A.t.

CpNPR5 C.p.

Fig. 5 Neighbor-joining phylogenetic tree of papayaNPR1 homologues (black circles). Numbers on thebranches indicate the percentage of 1000 bootstrapreplications supporting the particular nodes and onlythose with >50% support are shown.

AAM62410 N.t.

ABG38308 C.a

AAT57637 L.e.

AAT57640 B.v.

XP 002281475 V.v.

CpNPR1C.p.

XP_002308281 P.t.

ABI93182 M.a.

ABL63913 M.a.

CAJ19095 H.v.

AP002537 O.s.

AtNPR1 A.t.

AtNPR2 A.t.

CpNPR4 C.p

XP_002300863 P.t

AtNPR3 A.t

AtNPR4 A.t.

AAT57642 H.a.

CpNPR3 C.p.

ABK62792 P.p.

ACJ45013 G.m.

ACJ45015 G.m.

XP_001757508 P.p.

XP_001759240 P.p.

ABE11621 O.s.

AtNPR6 A.t.

XP_002308905 P.t.

XP_002323261 P.t.

AtNPR5 A.t.

CpNPR5 C.p.

Fig. 5 Neighbor-joining phylogenetic tree of papayaNPR1 homologues (black circles). Numbers on thebranches indicate the percentage of 1000 bootstrapreplications supporting the particular nodes and onlythose with >50% support are shown.

.

Cao et al. 1997

Cell, Vol. 88

57–63

Desarrollo

Regulador

positivo de la

SAR

Reguladores

negativos de la

SAR

Hepworth et al, 2005.

The Plant Cell, Vol. 17,

1434–1448

Zhang et al., 2006

The plant Journal, Vol.48

647–656

AtNPR3

AtNPR4

CpNPR3

CpNPR4

AtNPR2

AtNPR1

CpNPR1

AtNPR5

CpNPR5

AtNPR6

Clado1

Clado2

Clado3

MISMA FUNCION

EN PAPAYA?

Expresión basal de las 4 secuencias tipo NPR1 de papaya en diferentes tejidos

31

Cambios en la expresión de CpNPR1 en respuesta a SA

32

Sobre-expresión del gen candidato (NPR1) en callos embriogénicos de papaya

Avances

33

JH

A CB

E F

D

I

G

DESARROLLAMOS UN PROTOCOLO DE EMBRIOGENESIS SOMATICA EFICIENTE

35

INTEGRACIÓN DEL CASSETTE DE EXPRESIÓN

35S::AlcR::GUS EN Agrobacterium tumefaciens

Fragmentos esperados para los productos de

la doble digestión con HindIII y EcoRI de los

plásmidos pRB35SAlcRGUS y pB35SAlcR.

Gel de los productos de PCR para el cassette de

expresión 35S::AlcR::GUS y el control positivo el

gen uidA (GUSPlus) que presentaron una banda

única de 1200 pb

36

TRANSFORMACIÓN TRANSITORIA EN

hojas DE PAPAYA MARADOL

Expresión transitoria de uidA

(GUSPlus) en hojas (con

peciolo) de plántulas de

papaya Maradol de

aproximadamente 21 días de

edad provenientes de

invernadero

Controles negativos hojas y

tallos de plantas de papaya

Maradol no transformadas,

controles positivos hojas de

N. tabaccum transformadas

de forma estable con el gen

reportero uidA (GUSPlus)

I con infiltración al vacío,

N sin infiltración al vacío.

37

TRANSFORMACIÓN TRANSITORIA DE CALLOS

DE PAPAYA MARADOL

Expresión transitoria de

uidA en callos no

embriogénicos de

papaya Maradol.

I con infiltración al

vacío,

N sin infiltración al

vacío.

Controles negativos

callos de papaya

Maradol no

transformados,

Controles positivos

hojas de N. tabaccum

transformadas de

forma estable con el

gen reportero uidA

(GUSPlus)

39

a) callos embriogénicos de papaya

Maradol en suspensión en

medio líquido MS al 50% con 10

mg mL-1 de 2,4-D b) callos

embriogénicos transformados

con el plásmido

pRB35SAlcRGUS en medio MS

al 100% c) vista al

estereomicroscopio de callos

transformados con el plásmido

pRB35SAlcRGUS inducidos con

etanol

d) e) y f) controles positivos, callos

transformados con el plásmido

pCAMBIA 1305.1 f) vista al

estereomicroscopio control

positivo inducido con etanol,

g) y h) controles negativos, callos

transformados con el plásmido

pRB35SAlcR

i) y j) controles negativos, callos sin

transformar

E inducido con etanol,

S no inducidos con etanol.

EXPRESION DE pRB35SAlcRGUS REGULADA POR ETANOL

EN CELULAS EN SUSPENSIÖN DE PAPAYA MARADOL

┼

┼ ┼

┼ E

┼ E

40

EXPRESION DE pRB35SAlcRGUS REGULADA POR

ETANOL EN CALLOS TRANSFORMADOS DE

PAPAYA MARADOL

Callos no embriogénicos de papaya maradol transformados transitoriamente con el plásmido

pRB35SAlcRGUS. Callo no inducido (concentración de etanol 0.0 % v/v) y callos inducidos con

diferentes concentraciones de etanol

Conclusiones1. Se encontraron 4 secuencias tipo NPR1 en el

genoma de C papaya.

2. Tienen alta homología con las 6 secuencias reportadas en A thaliana

3. Filogenéticamente, al menos una secuencia de C papaya se agrupa en los mismos 3 clados en los que se agrupan las de A thaliana

4. Las 4 secuencias presentan expresión basal en diferentes tejidos de plantas comerciales de C papaya variedad maradol

5. NPR1 aumenta su expresión al ser retada con SA41

Trabajo en progreso

• Sobrexpresar NPR1, con el sistema inducible por etanol, en papaya y evaluar si los frutos de plantas que sobrexpresen el gen, al ser tratados con vapores de etanol, aumentan su resistencia a patógenos como Colletotrichum gloesporioides, disminuyendo las pérdidas por antrcnosis

• Nos interesa sobre-expresar el gen NPR1 para que active la respuesta sistémica adquirida (SAR) de manera temporal. Simulando lo que ocurre de manera natural en el momento mas vulnerable a antracnosis del fruto.

• Hay que tomar en cuenta que el gen NPR1 se expresa de manera basal en papaya, la hipótesis es que un aumento en su expresión, conducirá a la activación de SAR aumentando su resistencia a antracnosis

43

44

a) Embrión

cigótico original,

b y c) al 5 día d)

a los 15 días e) a

los 30 días,

b) f) 71 días

posteriores a la

siembra inicial

g) a los 86 días

h) estructuras

verdes y

elongadas a los

142 días

i) explantes con

raíz, hojas y tallo

visibles a los 145

días j) a los 157 días

k) a los 164 días.

Transformar embriones somáticos con

NPR1 y TGA (con el sitema Alc) y regenerar

plantas

DIA CERO DIA NUEVE

Escala: 30 cm

Los frutos de aquellas plantas que sobrexpresen NPR1, se

retarán con esporas del hongo Colletotrichum gloeosporoides

para definir si aumentó su resistencia a antracnosis

Transformados Sin transformar

Comentario FinalDe comprobarse que los frutos de papaya que sobre-expresen NPR1 confieren resistencia a antracnosis, el presente proyecto puede tener un gran impacto.

Loa anterior, debido a que el transgen no se expresará en el campo de cultivo, sino que sólo se expresará en la empacadora, cuando los frutos cosechados sean expuestos a vapores de etanol.

46

Parte de los resultados del presente proyecto fueron publicados recientemente en: Genes and Genomics, 2012

47

También publicamos este año la caracterización la familia de un factor de transcripción ligado a NPR1 (TGA de C. papaya) que puede ser buen candidato para transformar. PPB, Enero (2012).

• .

48

Productos del proyecto

• 1 tesis de doctorado

• 2 tesis de maestría en Ciencias

• 2 Publicaciones Internacionales

• 1 posible patente

49

Jorge M. Santamaría, Virginia Herrera-Valencia, Gabriela Fuentes, Mariana

Menéndez, Fabio Idrovo, Miguel Angel Vallejo-Reyna, Santy Peraza-Echeverría

El equipo…

51

MC. Anabel Solís. Lab. De Fisiología Molecular y

Personal del Lab.Fitopatología Molecular y Biotecnología de

Cultivos Tropicales, por apoyo técnico en el mantenimiento

de callos embriogénicos

AGRADECIMIENTOS

51

Sr. José Arjona, “Rancho Alegre” por donar material de

papaya para los trabajos de expresión

CONACYT por el financiamiento al presente proyecto

CB 83829

Becas por el financiamiento de las becas PNPC a

FI y MMC