SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE MONO-β-LACTAMAS…NTESIS Y... · pudiera alcanzar esta meta tan...
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CICATA-LEGARIA-IPN
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
ESCUELA SUPERIOR DE INGENIERÍA QUÍMICA E
INDUSTRIAS EXTRACTIVAS
SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE
MONO-β-LACTAMAS COMO PRECURSORES DE
β-AMINOACIDOS
T E S I S
QUE PARA OBTENER EL TITULO DE
ING. QUÍMICO INDUSTRIAL
P R E S E N T A :
JOSÉ ALBERTO MIRANDA GONZÁLEZ
DIRECTOR DE TESIS: DRA. DELIA QUINTANA ZAVALA
México, D.F. Noviembre de 2010.
En el Laboratorio de Química Orgánica del Centro de Investigación en Ciencia Aplicada y Tecnología Avanzada del Instituto Politécnico Nacional, unidad Legaría (CICATA-IPN, Legaria) es el lugar donde
se desarrolló la presente Tesis bajo la dirección de la Dra. Delia Quintana Zavala, con el apoyo de los proyectos SIP-20090322
y SIP-20100084
Los resultados de este trabajo se presentaron en el 44 Congreso Mexicano de Química y 28 Congreso Nacional de Educación
Química, que se celebró en la Ciudad de Puebla, Puebla, del 26 al 30 de septiembre del 2009.
AGRADECIMIENTOS
Mis mas grandes agradecimientos a el Instituto Politécnico Nacional (IPN) por haber sido el responsable de haberme formado como un
profesionista de calidad, permitiéndome así realizar una de mis mas grandes metas en la vida.
A mi Escuela Superior de Ingeniería Química e Industrias Extractivas (ESIQIE) por que en sus aulas y laboratorios, aprendí los
conocimientos y valores que son la herramienta principal para mi formación profesional convirtiéndome en una persona que busca
lograr la superación personal.
Al Dr. Hugo A. Jiménez Vázquez de la ENCB por la determinación de las estructuras de difracción de rayos X.
A mis padres, con todo el amor, admiración mi mas grandes agradecimientos por todo el apoyo incondicional que me brindaron a lo largo de la carrera. Por todos los sacrificios y esfuerzos que realizaron para que yo me superara. Por todos sus consejos, regaños, castigos, premios que me hicieron, cuando yo estaba en lo correcto o incorrecto. Gracias mami, gracias papi, ¡¡¡gracias por todo!!! Porque yo sé que soy el espejo de todos sus esfuerzos, y lo que me dieron es la mejor de las herencias.
A mi hermana Máyela porque siempre estuvo conmigo en las buenas y en las malas, por todo su cariño y admiración que hacen que fortalezca mi carácter. Por todas sus preguntas, por sus chistes, comentarios graciosos, que hacían olvidarme de todos mis problemas. Porque al igual que yo deseo que ella se desarrolle profesionalmente para poder realizar sus metas.
A mi directora de tesis la Dra. Delia Quintana Zavala por todos conocimientos que me brindo para poder realizar el desarrollo de mi tesis, así como los instrumentos y el uso de sus recursos para que pudiera alcanzar esta meta tan deseada. Por su comprensión en todas las veces que no podía llegar, y todo el tiempo que me tarde en terminar este trabajo. Muchas Gracias Doc.
A mis más grandes compañeros y amigos que siempre me ayudaron y me alentaron para poder salir adelante. Por todos esos momentos de alegría, tristeza, preocupación, risas, por compartir conmigo sus problemas, por permitirme entra en sus vidas dándome su más sincera amistad. Gracias Michelle, Armando, Daniel, Felipe, Leticia, Adriana, Jessica, Luis Héctor, Mireya y Adai.
A mi Jefa la Ing. Flor Arellano, Gerente de Control de Calidad de PEPSI-Iztacalco, por haberme permitido poder culminar esta última etapa de mi formación profesional.
i
INDICE GENERAL
CAPÍTULO PAG
Índice de figuras ii
Índice de compuestos sintetizados iii
RESUMEN
INTRODUCCIÓN 1
I ANTECEDENTES
I.1 Antibióticos 4
I.2 Aldehídos y Cetonas 8
I.3Aminas 11
I.4 Iminas 13
I.5 Lactamas 15
Capítulo II. PARTE EXPERIMENTAL
II.1 Material y equipo 20
II.2 Procedimientos y metodología 22
II.2.1Sintesis de Compuestos 22
II.2.2 Pruebas Microbiológicas 30
Capítulo III. DISCUSIÓN DE RESULTADOS
III.1 Síntesis de Benciliminas (iminas 1a-1c) 32
III.2 Síntesis de las N-aril-mono-β-lactamas 2a y 2c 38
III.3 Pruebas Microbiológicas. 48
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES 52
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 54
ANEXOS 57
ii
Índice de Figuras
Figura 1 Alexander Fleming.
Figura 2 Prototipo de una célula bacteriana.
Figura 3 Tipos de bacterias de acuerdo a su membrana celular.
Figura 4. Representación de la síntesis de una imina y b) concentración del producto
Figura 5. Reacción a -78°C, en condiciones anhidras.
Figura 6. Esquema de purificación por cromatografía en columna.
Figura 7. Disposición de las microplacas para estudiar la actividad antibiótica de la -
lactama 2a, con ampicilina trihidratada (AMP 3H2O).
Figura 8. Estructura obtenida por difracción de rayos X de la 3-cloro-1-(4-nitrofenil)-4-
fenilazetidin-2-ona (β-lactama 2a)
Figura 9. Celda unitaria de la estructura de 3-cloro-1-(4-nitrofenil)-4-fenilazetidin-2-ona
(β-lactama 2a)
Figura 10. Estructura obtenida por difracción de rayos X de la 3-metil-1-(4-fluorofenil)-4-
fenilazetidin-2-ona (β-lactama 2b)
Figura 11. Celda unitaria de la estructura de 3-metil-1-(4-fluorofenil)-4-fenilazetidin-2-ona
(β-lactama 2b)
iii
Índice de compuestos
N
NO2
N
F
4-nitro-N[(E)-fenilmetilideno]anilina 4-fluoro-N [(E)-fenilmetilideno] anilina
(Imina 1a) (Imina 1b)
CH3
N
O
N
Cl
O
O2N
4-metoxi-N [(E)-fenilmetilideno] anilina 3-cloro-1-(4-nitrofenil)-4-fenilazetidin-2-
(Imina 1c) ona (β-lactama 2a)
N
CH3
O
F
3-metil-1-(4-fluorofenil)-4-fenilazetidin-2-ona
(β-lactama 2b)
RESUMEN
Las monobactamas (nombre genérico de las β-lactamas) desarrolladas en los inicios de los años
ochenta, simultáneamente por Sykes1, Imada
2 y colaboradores son antibióticos estructuralmente
relacionados con los β-lactámicos pero con configuración monocíclica. El descubrimiento de la
nocardicina y otras monobactamas con actividad antibiótica demostró que no se requiere una
estructura bicíclica conformacionalmente forzada para tener propiedades antibacterianas, lo cual
sugiere que la actividad biológica esta estrictamente correlacionada a la presencia del anillo de la
2-azetidinona adecuadamente funcionalizado. En este trabajo de investigación se tiene la
finalidad de aportar conocimiento en este campo mediante la síntesis y caracterización de dos
nuevas mono-β-lactamas, las cuales pudieran tener actividad como antibióticos, por otro lado, la
hidrólisis de estas mono-β-lactamas nos proporcionaría -aminoácidos.
La síntesis de estas mono-β-lactamas es la que involucra la reacción de Staudinger3, que es una
reacción de ciclo adición [2+2] entre una cetena y una imina, la cual incluye la inserción de un
carbenoide. Esta reacción es reconocida como un método fundamental, y versátil para la síntesis
de derivados β-lactámicos, en un solo paso, además de que se obtuvieron rendimientos
favorables.
Para la formación de las iminas o bases de Schiff llamadas así en honor a Hugo Schiff, químico
alemán que describió su formación en 1864, consiste en la reacción de aldehídos y cetonas con
aminas primarias. Como aldehído se uso el benzaldehído y se hizo reaccionar con 3 diferentes
aminas; p-nitro anilina, p-metoxi anilina y p-fluoroanilina, usando como disolvente tolueno y a
reflujo constante durante doce horas. La adición nucleofílica de la amina al grupo carbonilo da
como resultado hemiaminales (o carbinolamina), los cuales se deshidratan fácilmente dando lugar
a las iminas. Su mecanismo de formación es un proceso que está en equilibrio, por lo que es
necesario eliminar el agua para desplazar la reacción hacia el producto, esta reacción es
catalizada por ácidos, en este caso particular se utilizó, ácido clorhídrico.
La obtención de nuevas mono-β-lactamas tiene gran importancia tanto en síntesis orgánica, por
su versatilidad estructural, como a nivel medicinal por sus propiedades farmacológicas como
agente antimicrobiano, en este trabajo se logra sintetizar dos de estos compuestos: la mono-β-
lactama [3-cloro-1-(4-nitrofenil)-4-fenilazetidin-2-ona] y la mono-β-lactama derivada [3-metil-
1-(4-fluorofenil)-4-fenilazetidin-2-ona], sintetizadas por el método de Staudinger usando las
iminas obtenidas anteriormente y una cetena que se formo in situ con cloruro de cloro acetilo y
cloruro de propionilo respectivamente, como base se utilizó trietilamina para extraer el hidrógeno
ácido, alfa al grupo carbonilo; se empleó un baño de acetona con hielo seco para alcanzar una
temperatura de -78°C. La reacción se mantuvo a esta temperatura por un tiempo de 2 horas y
posteriormente 48 horas con agitación a temperatura ambiente.
Las N-aril-mono-β-lactamas sintetizadas se purificaron por cromatografía flash y fueron
caracterizadas por métodos espectroscópicos de RMN de 1H y
13C, mediante un estudio de
Difracción de Rayos X, se confirmo su estructura, y se determinó la configuración relativa de los
hidrógenos de los carbonos 3 y 4 del anillo de la mono-β-lactama, los cuales se encuentran en
posición trans uno respecto del otro.
Se realizaron estudios microbiológicos preliminares para el compuesto p-NO2--lactama 2a, y se
trabajó con las siguientes cepas: Aeromona hidrophila ATCC 7966, Klebsiella pnuemoniae
ATCC 700603, Pseudomonas aeruginosas ATCC 27852, Escherichia coli ATCC25922,
Escherichia coli ATCC35218, Escherichia coli DH10b sensible (DH10bs) y Staphylococcus
aureus ATCC 29213. Las cuales pertenecen al cepario del grupo de investigación del Laboratorio
de Bacteriología Médica de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas del I.P.N.
En cuanto a los resultados microbiológicos para la β-lactama 2a se concluyo que la inhibición del
crecimiento bacteriano, fue muy poco a pesar de que esta prueba se repitió 6 veces, y en cuanto a
la sensibilización de las bacterias productoras de β-lactamasa (K.pneumoniae), también los
resultados obtenidos no fueron concluyentes.
MIRANDA GONZÁLEZ JOSÉ ALBERTO Página 1
INTRODUCCIÓN
Los compuestos con actividad biológica existentes en la naturaleza generalmente incluyen
heterociclos, y por este motivo se intenta reproducirlos en forma sintética con fines
farmacológicos, y en algunos casos, resulta de interés incorporar modificaciones
estructurales que posibiliten una mayor actividad biológica y biodisponibilidad. Uno de los
mayores desafíos para los químicos orgánicos es la síntesis de compuestos o fragmentos
moleculares (naturales o artificiales), con propiedades y características que puedan mejorar
a las de los compuestos ya existentes. La síntesis de compuestos nuevos utilizados en la
medicina ha logrado éxitos notables en los últimos 60 años y sobre todo en las últimas
cuatro décadas. La síntesis química también produce compuestos nuevos que se usan en
campos tan diversos como los cosméticos, la tecnología electrónica y los materiales de
construcción.
Las monobactamas desarrolladas en los inicios de los años ochenta, simultáneamente por
Sykes1 e Imada
2 y colaboradores son antibióticos estructuralmente relacionados con los -
lactámicos pero con configuración monocíclica. El descubrimiento de la Nocardicina A y
otras monobactamas con actividad antibiótica demostró que no se requiere una estructura
bicíclica conformacionalmente forzada para tener propiedades antibacterianas, lo cual
sugiere que la actividad biológica, de estos compuestos, está estrictamente correlacionada a
la presencia del anillo de la 2-azetidinona adecuadamente funcionalizado.
N
COOH
NH
N
O
OH
OHOOC
NH2
O
OH
H
Nocardicina A
SINTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE MONO- -LACTAMAS…
MIRANDA GONZÁLEZ JOSÉ ALBERTO Página 2
En esta dirección, la síntesis de nuevas mono-β-lactamas tiene gran importancia tanto en
síntesis orgánica, por su versatilidad estructural, como a nivel medicinal por sus
propiedades farmacológicas como agente antimicrobiano.
En este trabajo de investigación se tiene la finalidad de aportar conocimiento en este campo
mediante la síntesis de nuevas mono-β-lactamas, las cuales pudieran tener actividad como
antibióticos, o por otro lado, la hidrólisis de estas mono -lactamas nos proporcionaría -
aminoácidos libres, los cuales están también presentes en la naturaleza, como componentes
de péptidos activos biológicamente,4 estos péptidos son de interés farmacológico que
presentan ventajas en términos de actividad biológica y estabilidad metabólica.5 La
Bastatina y el Taxol son dos moléculas activas biológicamente que contienen una cadena de
-aminoácido en su estructura, el Taxol es un compuesto líder que se aplica en la
quimioterapia del cáncer y la Bastatina es un inhibidor enzimático.6 Para lograr el objetivo
de este proyecto será necesario llevar a cabo los siguientes objetivos particulares.
Sintetizar tres iminas, haciendo reaccionar un aldehído aromático, el benzaldehído, con tres
aminas primarias aromáticas p-sustituidas diferentes.
Sintetizar dos mono-β-lactamas, mediante la “Reacción de Staudinger” utilizando para ello,
los cloruros de ácido adecuados para la formación in situ de la correspondiente cetena.
Purificar, todos los productos obtenidos mediante diferentes métodos: por cromatografía en
placa, y tipo flash, por destilación, por sublimación, y por cristalización según se requiera.
Caracterizar las iminas, así como, las β-lactamas sintetizadas mediante diferentes técnicas
espectroscópicas como resonancia magnética nuclear de protón (1H) y carbono trece (
13C),
e infrarrojo.
SINTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE MONO- -LACTAMAS…
MIRANDA GONZÁLEZ JOSÉ ALBERTO Página 3
Mediante difracción de rayos X realizar un estudio cristalográfico de las dos mono β-
lactamas obtenidas para además de corroborar la estructura propuesta determinar la
configuración relativa de los sustituyentes en el anillo de la mono β-lactama.
Determinar (mediante la prueba de Cefinasa), si las cepas Aeromona hidrophila ATCC
7966, Klebsiella pnuemoniae ATCC 700603, Pseudomonas aeruginosas ATCC 27852,
Escherichia coli ATCC25922, Escherichia coli ATCC35218, Escherichia coli DH10b
sensible (DH10bs) y Staphylococcus aureus ATCC 29213 son productoras de β-lactamasas.
Realizar las pruebas de susceptibilidad antimicrobiana, para la p-NO2-β-lactama 2a, según
lo indica las normas internacionales, ”The Clinical and Laboratory Standards Institute”
mejor conocida como la CLSI.
La contribución de este trabajo radica principalmente en la aportación de la síntesis de 2
nuevos compuestos mono-β-lactámicos, caracterizados estructuralmente, así como un
estudio microbiológico preliminar.
Capítulo I
SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE MONO-β-LACTAMAS…
MIRANDA GONZÁLEZ JOSE ALBERTO Página 4
I. ANTECEDENTES
I.1.- Antibióticos
En la actualidad uno de los antibióticos más utilizados e importantes es la penicilina
obtenida del hongo “Penicillium notatum” este antibiótico fue descubierto de manera
fortuita por el bacteriólogo escocés Alexander Fleming7 en el año de 1928. Posteriormente,
en 1938, Howard Walter Florey (1908-1968), patólogo australiano estudió sus aspectos
químicos y farmacológicos, y junto con Ernest Boris Chain (1906-1979) realizaron la
elucidación de su estructura mediante difracción de Rayos X, así como su uso. A pesar de
que su uso terapéutico fué puesto en práctica durante la segunda guerra mundial, hasta 1945
fué cuando se galardonó con el premio Nobel de Medicina a estos tres investigadores.
Figura1. Alexander Fleming
El continúo interés y descubrimiento de nuevos antibióticos8 como se muestra en la Tabla
1, se debe principalmente a la evolución de los microorganismos, específicamente las
bacterias que presentan una mayor resistencia a los antibióticos tradicionales, debido al uso
indiscriminado de estos.
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Tabla1. Antibióticos descubiertos entre 1928-2003
Año de introducción Tipo de Droga
1928 Penicilinas
1935 Sulfonamidas
1945,1971,1984 Cefalosporinas
1944 Aminoglicósidos
1949 Cloranfenicol
1050 Tetraciclinas
1952 Macrolidos y lincosámidos
1956 Glicopéptidos
1957 Rifamicinas
1959 Nitromidazoles
1962 Quinolonas
1968 Trimpetoprim
1976 Nocardicinas
1981 Monobactamas
2000 Oxazolidinonas
2003 Lipopéptidos
Mecanismo de Acción. Algunos antibióticos actúan sobre la membrana de las
bacterias, unos a nivel de síntesis de proteínas como las tetraciclinas, otros sobre el
metabolismo como sulfamidas o en el proceso de réplica del ADN. En el caso de las β-
lactamas estas atacan principalmente la membrana o la pared celular de las bacterias. En la
Figura 2, se muestra la estructura de una célula bacteriana.
Figura 2. Prototipo de una célula bacteriana.
Inclusión Granular Ribosomas
Hilos Núcleo
Capsula Membrana
Citoplasmatica Mesosomas
Citoplasma
Flagelo
Membrana
Celular
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MIRANDA GONZÁLEZ JOSE ALBERTO Página 6
Se han descrito dos mecanismos que intervienen de una manera más o menos directa en la
acción antibiótica de los β-lactámicos. El primero, es la inhibición directa de las proteínas
fijadoras de penicilina (PBPs) de la membrana citoplásmica. El segundo mecanismo, que es
inductor de la lisis celular, está determinado por la acción concomitante de las autolisinas.
La pared celular de las bacterias, es la responsable de la forma y rigidez de la célula. Las
diferencias que existen en la estructura de la pared celular permiten distinguir a las
bacterias como Gram positivas (Gram+) o Gram negativas (Gram
-) mediante una tinción
diferencial denominada “tinción de Gram” que es una técnica desarrollada por el
bacteriólogo Christian Gram en 1884. La clasificación de estos dos tipos de bacterias se
debe a la complejidad de la estructura de las bacterias Gram negativas las cuales presentan
3 capas principales a) la membrana citoplasmática (20-30Å), la cual contiene proteínas y
fosfolipidos, b) el peptidoglicano, que es un polímero compuesto de ácido N-acetil
murámico y N-acetil glucosamida entrelazados, y c) la capa externa o capa L,
lipopolisacarido (60-180Å) la cual contiene además de fosfolípidos, polisacáridos y
proteínas.
Por otro lado las bacterias Gram positivas son menos complejas debido a que contienen
solo dos capas: la membrana citoplasmática y la capa de peptidoglicano, esta capa es
mucho más gruesa que la de las bacterias Gram negativas Figura 3.
Figura 3. Tipos de bacterias de acuerdo a su membrana celular.
Membrana externa
PEPTIDOGLICANO
Membrana
celular
GRAM-NEGATIVA GRAM-POSITIVA
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MIRANDA GONZÁLEZ JOSE ALBERTO Página 7
Tipos de antibióticos. Los antibióticos tradicionalmente se definen como compuestos
de bajo peso molecular, producidos por microorganismos que matan o inhiben el desarrollo
de otros microorganismos y pueden ser ingeridos o inyectados dentro del cuerpo humano.
Se han descubierto un gran número de antibióticos; sin embargo algunos han sufrido
modificaciones químicas para ser más efectivos en los tratamientos estos son llamados
antibióticos semisintéticos, y cuando se sintetizan completamente se les llama antibióticos
sintéticos. En términos generales y de acuerdo a su forma de actuar sobre los micro-
organismos los antibióticos se dividen en dos grandes grupos:
a) Los antibióticos Bactericidas: Inhiben el crecimiento bacteriano sino que además
desencadenan mecanismos dentro de la célula que conducen a la muerte celular, su
acción, por lo tanto es letal e irreversible sobre las bacterias (ejemplo: vancomicina,
β-lactámicos, aminoglucosidos, etc).
b) Los antibióticos Bacteriostáticos: Inhiben el crecimiento y multiplicación de las
bacterias, pero no matan al microorganismo, sin embargo si el agente es retirado, las
células vuelven a multiplicarse (ejemplo, tetraciclina, cloranfenicol, sulfonamidas,
clindamicida, macrolidos, etc).9
Para la síntesis de los compuestos β-lactámicos obtenidos en este trabajo, se utilizaron
como materias primas aldehídos, y aminas con los cuales se obtuvieron iminas, además de
las β-lactamas; por lo que a continuación se presenta un resumen de las propiedades más
importantes de cada uno de estos grupos funcionales.
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MIRANDA GONZÁLEZ JOSE ALBERTO Página 8
I.2 Aldehídos y Cetonas
El grupo carbonilo (C=O), es un grupo funcional muy importante en la química orgánica
sintética, una característica muy especial es el hecho de que este grupo activa a grupos que
están sobre carbonos adyacentes. El grupo carbonilo determina la mayoría de las
propiedades físicas y químicas de los aldehídos y las cetonas. En los aldehídos, el grupo
carbonilo está unido a un sustituyente orgánico por un lado y a un átomo de hidrógeno por
el otro. En las cetonas dicho grupo siempre está unido a dos sustituyentes orgánicos. El
átomo del carbono del grupo carbonilo presenta hibridación sp2 y en consecuencia, este
grupo y los dos átomos unidos al mismo quedan en un mismo plano.
Reacciones de aldehídos y cetonas. La reactividad del enlace carbonílico se debe
fundamentalmente a la diferencia en electronegatividad entre el carbono y el oxigeno, lo
cual conduce a una considerable contribución de la forma resonante dipolar con el oxígeno
negativo y el carbono positivo como se muestra a continuación.
R1
R
C O
R1
R
C O:+ ..
..
La mayoría de las reacciones de los aldehídos y cetonas sobre el grupo carbonílico implican
procesos de adición. Estos, generalmente, se efectúan más fácilmente con los aldehídos o
cetonas cíclicas que con las cetonas de cadena abierta, especialmente con aquellas que
contienen grupos voluminosos.
Caracterización química de aldehídos y cetonas. Los aldehídos y las cetonas,
tienen espectros característicos de infrarrojos, ultravioleta y de resonancia magnética
nuclear. La fuerte absorción en el infrarrojo justamente por encima de los 1700 cm-1
se
debe al alargamiento C=O. La absorción más débil en el ultravioleta cercana a 270 nm se
debe a una transición electrónica n* en los aldehídos o cetonas saturados. La difracción
SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE MONO-β-LACTAMAS…
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de rayos X proporciona información relativa a las distancias y a los ángulos de enlace. Para
los químicos orgánicos, la espectroscopia es sin duda la técnica física de mayor utilidad
Espectroscopía de resonancia magnética nuclear: Los núcleos de algunos
átomos, tales como los del hidrógeno (1H) y del carbono trece (
13C) se comportan como
pequeños imanes. Si una muestra de un compuesto que contenga estos elementos se coloca
en un campo magnético intenso, algo más de la mitad de los núcleos se alinean con el
campo. Los núcleos en este estado absorben radiación en la zona de las radiofrecuencias del
espectro y pasan a un estado de mayor energía, en el que se alinean contra el campo
magnético externo. El registro de estas transiciones es un espectro de resonancia magnética
nuclear.
Un espectro de resonancia magnética nuclear de protón (RMN 1H) tiene un número de
señales equivalente a los diferentes tipos de átomos de hidrógeno de la molécula. El
desplazamiento para el hidrógeno del grupo aldehído (HC=O) aparece entre 9 y 10 ppm,
mientras que, los hidrógenos que están sobre el carbono alfa al grupo carbonilo aparecen
entre 2.0 y 2.5 ppm.
Por otro lado, un espectro de resonancia magnética nuclear de carbono (RMN 13
C) nos
proporciona información también sobre los diferentes tipos de átomos de carbono de la
molécula. En el espectro de RMN 13
C, la señal del carbono (C=O) en aldehídos y cetonas
aparece a campo muy bajo, es decir tiene desplazamientos entre 190 a 220 ppm, y para los
átomos del carbono en posición alfa al grupo carbonilo estos aparecen entre 20 y 40 ppm.
Aldehídos y cetonas de uso común: En la naturaleza existen muchos compuestos de
importancia biológica que tienen en su estructura aldehídos o cetonas, en las plantas y en
los animales se han encontrado también una gran variedad de compuestos con estos grupos
funcionales, algunas veces con azúcares, pero más comúnmente como el compuesto
carbonílico libre. Muchas de estas sustancias naturales son importantes como saborizantes e
ingredientes de perfumes. A continuación se muestra una tabla con algunas cetonas y
aldehídos con olores y sabores bien conocidos10
.
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MIRANDA GONZÁLEZ JOSE ALBERTO Página 10
Tabla 2 Nombres comunes y usos de algunos aldehídos y cetonas.
Compuesto
HCH3
O
OH
CH3
OH
O
O
CH3
H
O
Nombre Butiraldehído Vainillina Acetofenona trans-
cinamaldehido
Olor Mantequilla Vainilla Pistacho Canela
Uso
Margarina,
alimentos
Alimentos,
perfumes.
Helados Dulces,
alimentos,
medicamentos.
Compuesto
CH3
CH3
O
CH3
O
CH3
CH3
O
O
CH3
CH2
H
H
H
CH3
CH3
O
CH3
CH2 CH3
O CH3
Nombre Alcanfor Piretrina Carvona Muscona
Olor
Alcanforado
Floral
Enantiómero
(S)-(-): menta
verde
Enantiómero
(R)-(+):
semilla de
alcaravea.
Aroma
almizclado
Uso Linimentos,
inhalante.
En jardinería como
insecticida.
Dulces, pastas
de dientes.
Perfumes
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MIRANDA GONZÁLEZ JOSE ALBERTO Página 11
I.3 Aminas
Este tipo de compuestos son derivados orgánicos del amoniaco (NH3), mejor conocidos
como compuestos orgánicos nitrogenados. Las alquilaminas tienen su nitrógeno unido a un
carbono con hibridación sp3; mientras que las arilaminas tienen su nitrógeno unido a un
carbono con hibridación sp2, de un anillo bencénico o bencenoide como se muestra en las
siguientes estructuras:
alquilamina
R = grupo alquilo
arilamina
Ar = grupo arilo
CH3
R
NCH3 CH3
Ar N
CH3
Las alquilaminas al igual que el amoniaco tienen un arreglo piramidal de los enlaces con el
nitrógeno, en la metilamina el nitrógeno y el carbono tiene hibridación sp3 y están unidas
por un enlace sigma (). El par electrónico del nitrógeno ocupa un orbital hibrido sp3. Ese
par no compartido interviene en las reacciones en las que las aminas se comportan como
bases o nucleófilos. En la anilina, la arilamina más sencilla, al igual que las alquilaminas,
se tiene un arreglo piramidal de enlaces en torno al nitrógeno, pero esa pirámide es algo
más plana, a pesar de tener un enlace con un carbono de hibridación sp2.
Las aminas que tienen menos de seis o siete átomos de carbono son solubles en agua. Todas
las aminas, hasta las terciarias, pueden comportarse como receptoras de un protón en
puentes de hidrógeno con moléculas de agua.
Las aminas al igual que el amoniaco, son bases débiles. Sin embargo, son las bases sin
carga más fuertes que se encuentran en cantidades importantes bajo condiciones
fisiológicas. Las aminas ocupan un lugar fundamental en los procesos biológicos, en
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MIRANDA GONZÁLEZ JOSE ALBERTO Página 12
general, las aminas son las bases que participan en las reacciones biológicas ácido-base;
con frecuencia son los nucleófilos en las sustituciones nucleofílicas biológicas.
La facilidad con que las aminas se extraen con los ácidos acuosos aunado a su regeneración
al tratarlas con bases, simplifica la tarea de separar las aminas de otros materiales vegetales.
Por sus propiedades básicas (alcalinas) a las aminas vegetales se le llamo alcaloides11
. Los
alcaloides son compuestos biológicamente activos usados y sintetizados por las plantas para
protegerse de los insectos, la mayoría de estos alcaloides se usan en medicina, ya que se
caracterizan por un alto grado de actividad biológica, principalmente como sedantes,
aunque también la mayoría de estos son tóxicos y letales en grandes cantidades, un ejemplo
de ellos son la morfina, la nicotina o la cocaína, sus estructuras se presentan a continuación.
CH3N
N
Nicotina
Presente en el tabaco; muy tóxico a veces se usa como insecticida.
NCH3
O OCH3
O C6H5
O
Cocaína
Estimulante del sistema nervioso central
O
OH
H O
H
N CH3
Morfina
Excelente analgésico, genera adicción
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I.4 Iminas
Las aminas primarias y otros compuestos relacionados con el amoniaco, son una clase de
reactivos importantes que se comportan como nucleófilos frente a los grupos carbonilos. La
reacción de estos compuestos con aldehídos y cetonas da productos con un doble enlace
entre el átomo de carbono del grupo carbonilo y el átomo de nitrógeno, estos compuestos
son llamados iminas12
, también conocida como bases de Schiff en honor a Hugo Schiff,
químico alemán que describió su formación en 1864. En esta reacción se forma una especie
neutra llamada hemiaminal o carbinolamina, algunas de estas especies se han observado
espectroscópicamente13
, la cual después de una protonación se deshidrata y forma el doble
enlace C=N. De forma parecida a los alquenos, la iminas presentan isomería cis/trans
(Z/E), en la cual la estabilidad de las moléculas esta regida por el impedimento estérico que
presenten los sustituyentes.
Por otro lado, la adición de aminas secundarias (R2NH) sobre compuestos carbonílicos,
proporciona enaminas, R2N-CR=CR2, en (de alqueno) + amina, el cual significa una
amina insaturada, ya que en este tipo de aminas el nitrógeno carece de otro hidrógeno que
se pueda perder para dar lugar al producto neutro la imina. En cambio se pierde el protón
del carbono α, obteniéndose así un doble enlace carbono-carbono (C=C), dando lugar a la
enamina, como se muestra a continuación.
H
H
O
CC
R
H
H
N
C
C
R R1
N
C
C
+ OH2OH2 +
RNH2 RR1NH
Enamina
Aldehido
o
Cetona
Imina
SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE MONO-β-LACTAMAS…
MIRANDA GONZÁLEZ JOSE ALBERTO Página 14
Mecanismo de formación de una imina. Esta reacción requiere catálisis ácida. En
términos generales, esta reacción se puede visualizar primero como una adición al doble
enlace carbono-oxigeno seguida de una reacción de eliminación de una molécula de agua,
en la que se forma un doble enlace (N=C), mediante una etapa de adición y una de
eliminación las cuales se muestran a continuación.
OC + RNH2
H
OHCNR
Etapa de adición
H
OHCNR CNR + OH2
Etapa de eliminación
Debido a que el proceso es reversible es necesaria la eliminación de agua para desplazar el
equilibrio hacia la formación de la imina. Las iminas derivadas de aminas y compuestos
carbonilicos aromáticos son más estables que las derivadas de precursores no aromáticos.
Algunas iminas son importantes biológicamente. Así por ejemplo una imina derivada de un
aldehído relacionado con la vitamina A (o retinol) y una proteína de la retina del ojo, (H2N-
Lisina-proteina) la opsina, juega un papel importante en la química de la visión, ya que la
molécula compleja que resulta llamada rodopsina, absorbe luz en la región visible del
espectro, a continuación se presenta su estructura.
proteínal isinaH N
Rodopsina
SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE MONO-β-LACTAMAS…
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Hay otra vitamina importante la B6, que actúa como una coenzima (cofactor) formando una
imina con el grupo amino de la enzima, este cofactor está relacionado con las reacciones de
transaminación, es decir la transferencia de grupos amino de un aminoácido a otro,
mediante una serie de reacciones que involucran la formación de distintas iminas, que son
importantes en el metabolismo y la biosíntesis de aminoácidos. Las vitaminas también se
denominan coenzimas, que son las grandes proteínas que catalizan los cambios químicos
que tienen lugar en el interior de la célula, a continuación se muestran su estructura.
Enzima
O
O
PO
N+
CH3
H
OH
N
CH
O
Cofactor (B6-enzima) unido
mediante un enlace imina.
_
I.5 Lactamas
Las lactamas son amidas cíclicas y son análogas de las lactonas que son ésteres cíclicos.
Así como las amidas son más estables que los ésteres las lactamas son más estables que las
lactonas. En la naturaleza existen muchas lactonas, casi todas son o lactonas, es
decir, casi todas contienen anillos de cinco y seis miembros, que son anillos estables.
O
O
CH3
OO
NO
H
- lactona - lactoma - lactama
SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE MONO-β-LACTAMAS…
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En algunas reacciones se han detectados –lactonas o sea, lactonas con anillos de cuatro
miembros, como productos intermediarios. Sin embargo, estas son muy reactivas. Por otro
lado, las –lactamas son inesperadamente estables.
βlactamas: Las βlactamas se encuentran entre los productos mejor conocidos de la
industria farmacéutica. Como ya se mencionó al principio, los antibióticos del tipo de las
penicilinas y las cefalosporinas que son tan útiles para tratar las infecciones bacterianas, son
βlactamas unidos a otro anillo; a los cuales se les llama antibióticos β-lactámicos, su
estructura es la siguiente:
CO2H
CH3
CH3
O
N
ON
H5C6
S
H
X
N
ON
S
CO2H
H
O
R
Penicilina G Cefalosporinas
Los compuestos heterocíclicos juegan un papel farmacológico y bioquímico importante, las
bases púricas y pirimidínicas, que son las unidades estructurales de los ácidos nucleicos;
desoxirribonucleico (ADN), y ribonucleico (ARN), son compuestos heterocíclicos, al igual
que muchas drogas como la morfina, la heroína y la cocaína. Las β-lactamas son
heterociclos de cuatro miembros, mejor conocidos como 2-azetidinonas; azetidin debido al
nombre genérico que corresponde a un anillo de cuatro miembros con nitrógeno como
heteroátomo, 2- y la terminación ona corresponden a la posición de la cetona.
La reactividad del grupo carbonilo de la 2-azetidinona, que es una amida cíclica de cuatro
miembros, tensionada, es la responsable de la actividad biológica de estos antibióticos.
Estos compuestos actúan como agentes acilantes e impiden la síntesis de la pared celular de
las bacterias.
SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE MONO-β-LACTAMAS…
MIRANDA GONZÁLEZ JOSE ALBERTO Página 17
La comprensión del mecanismo de acción de los antibióticos β-lactámicos en las bacterias
por inhibición específica de la enzima transpeptidasa, ha promovido el desarrollo de nuevos
inhibidores β-lactámicos que tienen como blanco a las enzimas serina-proteasa, las β-
lactamasas y las elastasas14
. Como consecuencia se han desarrollado, un gran número de
métodos químicos para la producción de compuestos β-lactámicos los cuales han sido
ampliamente documentados y revisados en más de una ocasión15
: 1.- La ciclación de
hydroxamato16
, 2.- La condensación de metaloester con enolatos de iminas17
, 3.- La
reacción entre complejos de cromo con carbeno-iminas18
, 4.- La cicloadición entre
isocianatos y alquenos19
y 5.- La cicloadición cetena-imina3, también conocida como la
reacción de Staudinger son los métodos más frecuentemente utilizados para la construcción
del anillo de la 2-azetidinona. En particular, este último método ha proporcionado una
opción muy útil y económica para la síntesis de los compuestos β-lactámicos,
principalmente debido a la fácil disponibilidad para obtener tanto las bases de Schiff, así
como de las cetenas.
Se ha reportado la síntesis de -lactamas quirales; como por ejemplo la obtención
enantioselectiva de la -lactama D con un exceso enantiomerico del 82% y con un
rendimiento aislado del 75%, mediante una condensación utilizando el enolato A, la imina
B, y en donde el agente auxiliar quiral C es recuperado de manera cuantitativa17
.
CH3
OLiO
CH3 CH3
CH3
+ LDA +
R
Ph
N
OMe
PhPh
MeO
Tolueno O R
CH3
CH3
CH3
N
A B D
ee = 82%
C
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La obtención de -lactamas , -disustituidas como la estructura E, se obtienen mediante
una cicloadición [2+2] de isocianatos sustituidos y alquenos19
.
RO C N
+ [2+2]
CH3
CH3
CH2
CH3
OR
N
CH3
Isocianato Olefina E
La cicloadición de cetenas e iminas, (reacción de Staudinger) es probablemente la más
general y útil de las aproximaciones al núcleo de 2-azetidinona, si se tienen en cuenta
factores tales como versatilidad y control estereoquímico. Por ejemplo se ha reportado20
,
que la reacción del cloruro de ácido F, con la imina G, y la trietilamina producen la -
lactama H, como un solo producto diastereoisomérico.
O Cl
SO2
CH3 CH3
N+
R
N
Ar Et3N,CH2Cl2,
-23°C, t.a, 15h.
RO
H H
SO2
CH3 CH3
N
N
Ar
F G H
Como consecuencia de la amplia investigación de compuestos β-lactámicos, se ha
descubierto que estos compuestos pueden ser precursores no solo de penicilinas y
cefalosporinas, sino que también son precursores de β-aminoácidos y péptidos, entre otras
sustancias21
.
Por otro lado, los recientes descubrimientos de compuestos -lactámicos con nueva y
diferente actividad biológica; tales como el inhibidor trombina22
, el inhibidor del
antígeno prostático especifico23
, el inhibidor de la enzima proteasa del citomegalovirus
humano24
, o los inhibidores de absorción de colesterol25
, garantizan un interés renovado en
la síntesis de azetidinonas y por lo tanto, en la reacción de Staudinger. Las estructuras de
dichos inhibidores son:
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O
O
H O
H
CONMe2
O
H
NN
N
H
NO
OMe
OMe
O
H H
N
OH
F
F
OH
O
H H
N
NH
CO2Me
O
H H
N
O
OS
NNH2
H
Me
Inhibidor Trombina BnO2C
OH
H
OHO
O
N
O
CO2H
Inhibidor antígeno prostático especifico
Inhibidor de la proteasa del citomegalovirus humano
Inhibidores de absorción del colesterol
Finalmente, tomando en cuenta el hecho de que –lactamas derivadas estratégicamente
funcionalizadas son también excelentes bloques de construcción para la síntesis de y -
aminoácidos derivados26 y 27
. Se debe esperar que mejoras en la reacción de Staudinger
contribuyan a ser los intermediarios sintéticos de elección para muchos químicos que
trabajan en el campo de la química heterocíclica y en la síntesis de péptidos.
Capítulo II
SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE MONO-β-LACTAMAS…
MIRANDA GONZÁLEZ JOSÉ ALBERTO Página 20
II PARTE EXPERIMENTAL
II.1 Material y equipo
En la síntesis de los compuestos reportados en este trabajo, el material e instrumentación
utilizado es de fácil acceso y se puede encontrar en un laboratorio de química orgánica, los
materiales empleados fueron los siguientes; tubos de ensayo, vasos de precipitado,
embudos de separación, embudos, matraces aforados, pipetas, probetas, pizetas, balanza
analítica, soportes, cánulas, cristalizadores, capilares, sistemas de destilación, barras
magnéticas de agitación, parrillas de agitación y calentamiento, mantas de calentamiento,
refrigerantes, termómetros, jeringas desechables, algodón, estufa, parafilm, guantes de
látex, guantes de asbesto, bomba de recirculación de agua, bomba de vacío, variador de
corriente, gafas de protección, pinzas, papel filtro, papel aluminio, entre otros. Todo el
material de vidrio se lava y se seca en una estufa a una temperatura de 150 °C durante 24
horas antes de utilizarse. Para concentrar los productos obtenidos se empleó un evaporador
rotatorio Büchi RE50 unido a una bomba de vacío.
Los puntos de fusión de los productos sintetizados fueron determinados en un aparato de
punto de fusión Electrothermal 9300 usando láminas de vidrio, y no están corregidos. Los
espectros de infrarrojo (IR) se determinaron en pastillas de KBr y fueron obtenidos en un
espectrofotómetro “Spectrum One FT-IR” de Perkin Elmer. Las frecuencias de absorción se
reportan en cm-1
.
Los espectros de resonancia magnética nuclear (RMN) se determinaron en dos
espectrómetros; JEOL modelo FX-270Q (a 270 MHz para 1H y a 67.89 MHz para
13C), y
otro de Varian modelo VNMRS-500 (a 500 MHz para 1H y 125.787 MHz para
13C).
Las estructuras de rayos X de un monocristal se obtuvieron en un difractómetro Xcalibur-S
de la compañía Oxford Diffraction, empleando radiación de molibdeno y un detector de
área.
SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE MONO-β-LACTAMAS…
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Disolventes y reactivos: El cloruro de metileno (CH2Cl2) se destilo y se secó
usando como indicador sulfato de calcio, mejor conocido como dierita, el cual se agitó
durante 8 hrs a reflujo, en un medio libre de oxígeno, para lo cual se burbujea un gas inerte
nitrógeno (N2). Los disolventes utilizados en las purificaciones de los compuestos; el
hexano y el acetato de etilo son grado reactivo, por lo que fueron destilados antes de
utilizarse. Los reactivos se compraron de Sigma-Aldrich y a continuación se tabulan
algunas de sus propiedades químicas:
Tabla 3.- Propiedades químicas de disolventes y reactivos utilizados.
Reactivo Formula P.M.(g/gmol) (g/ml) p.f. (°C ) p.eb. (°C )
Benzaldehído C6H5CHO 106.12 1.045 -26 178-179
4-Nitroanilina C6H6N2O2 138.12 1.402 146-149 360
4-Fluoroanilina C6H6FN 111.12 1.173 56 74
4-Metoxianilina C7H9NO 123.16 1.071 56 122
Trietilamina (C2H5) 3N 101.19 0.726 -115 89
Cloruro de
Cloroacetilo
C2H2Cl2O 112.94 1.418 -22°C 105-106
Cloruro de
propionilo
C3H5ClO 92.52 1.065 -94°C 77-79
Cloruro de
metileno
CH2Cl2 84.93 1.325 -97°C 39-40
Tolueno C7H8 92.14 0.865 -93 110-111
Acetato de etilo CH3COOC2H5 88.11 0.902 -84 77-78
Hexano C6H14 86.18 0.659 -95 69
Reactivos Microbiológicos. Para las pruebas de sensibilidad, se usaron los siguientes
reactivos: medio de culivo BBLTM
Mueller Hinton Broth (Becton Dickinson and
Company), medio de cultivo LB Miller broth (Sigma), sensidiscos con cefinasa BBL
Cefinace (Becton Dickinson and company), medio de cultivo BD Broxon Muller hinton
agar (Becton Dickinson and company), sensidiscos con cefotaxima BD BBL™ (CTX) 30
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N
H
NO2
µg (Becton Dickinson and company), sensidiscos con ceftazidima BD BBL™. (CAZ) 30
µg (Becton Dickinson and company), antibacteriano antibenzil concetrado rojo
(Farmacéuticas Altamirano), DMSO (Sigma). Los antibióticos de referencia: ampicilina
trihidratada y amoxicilina trihidratada, fueron amablemente otorgados por los Laboratorios
Sinbiotik International S.A. de C.V., y el inhibidor de referencia: clavulanato de potasio fue
amablemente otorgado por los Laboratorios Fermic. S.A. de C.V.
En relación al ajuste del inóculo se realizó en un espectrofotómetro de UV-VIS Varian
Cary–win conc. 50%
II.2 Procedimiento y metodología
II.2.1.- Síntesis de compuestos
Síntesis de la 4-nitro-[(E)- fenilmetilideno]-anilina (Imina 1a)
En un matraz balón de 100 mL, se agregaron 9.56 ml (0.0942mol) de benzaldehído, 13.15
gr (0.09423mol) de p-nitroanilina, y 0.5 mL ácido clorhídrico como catalizador, en 75 mL
de tolueno como medio de reacción, se utilizo una trampa de Dean-Stark para separar el
agua producida en la reacción y esta se mantuvo a reflujo y con agitación magnética, por un
tiempo de 12 horas (Figura 4), la solución resultante se filtró a vacío y el precipitado se
lavó con hexano. Al líquido obtenido se le evapora el disolvente hasta la mitad en el
rotavapor y se deja cristalizar, obteniéndose 17.907g de cristales anaranjados de punto de
fusión 110oC, que corresponde a un rendimiento del 84%. Su estructura es la siguiente:
Peso molecular: 226.23 g/mol.
Punto de Fusión: 110 °C.
SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE MONO-β-LACTAMAS…
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a) b)
Figura 4. Representación; a) de la síntesis de una imina y b) concentración del producto
Caracterización: En la purificación de los productos sintetizados, primero se realiza
una prueba preliminar en cromatografía de placa fina sobre placas de Merck-DC-F254, la
cual se revela usando una lámpara de luz ultravioleta (UV) a 254nm, modelo UVS-18, con
luz de onda corta y luz blanca, para determinar cuál es el producto principal de la mezcla de
productos obtenidos en la reacción, así como las proporciones adecuadas de los disolventes,
para obtener una buena separación de ellos, una vez obtenidas estas condiciones, la
separación del compuesto principal se hace por medio una cromatografía en columna tipo
flash28
, la cual se realiza con aire y la sílica utilizada es sílica gel Merck de 230-240 mallas
(0.040-0.063mm). Para la purificación de los disolventes se utilizó destilación fraccionada,
y los productos sólidos obtenidos se purifican por recristalización.
Para la caracterización por RMN de 1H y
13C las determinaciones se llevaron a cabo
utilizando en todos los casos como disolvente cloroformo deuterado (CDCl3) y
tetrametilsilano (TMS) como referencia interna. Para indicar la multiplicidad de las señales
en 1H se utilizaron las siguientes abreviaturas: (s) simple, (d) doble, (t) triple, (c) cuarteto
(m) múltiple. Los valores de los desplazamientos químicos (δ) se presentan en partes por
millón (ppm) y las constantes de acoplamiento (J) se describen en Hertz (Hz). En los casos
en que no se pudo determinar la multiplicidad de una señal, se reporta el intervalo de
desplazamiento químico en el que aparecen.
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N
H
F
Bandas de absorción de IR (pastilla de KBr, v; cm-1
); 2893.70 (C-H aromático), 1627.85
(C=N), 1510.97 (Caromático-NO2), 1478.42 y 1333.15 (-NO2),1107.01 (C-Haromático), 857.83 y
527.58 (C-NO2), 842.42 (C=Caromático), y 444.97 (C-N-C).
Señales de 1H-RMN (500 MHz; CDCl3), (ppm); 7.22 (2H, d, J=8.54, =C-H aromático), 7.50
(2H, d, J=7.58, =C-H aromático), 7.53 (1H, d, J=8.07, =C-H aromático), 7.91 (2H, d, J=7.09, =C-
H aromático), 8.22 (2H, d, J=7.09, =C-H aromático), y 8.41 (1H, s, CH=N-C=).
Señales de 13
C-RMN (125 MHz; CDCl3), (ppm); 121.2 (=CHorto), 125.0 (=CHmeta), 128.8
(=CHmeta), 129.2 (=CHorto), 132.4 (=CHpara), 135.3 (=CHipso), 145.4 (=CHpara), 157.8
(=CHipso), y 162.6 (CH=N),
Síntesis de la 4-fluoro-[(E)-fenilmetilideno]-anilina (Imina 1b)
En un matraz balón de 100 mL, se agregaron 9.56 mL (0.0942mol) de benzaldehído,
10.470 gr (0.09423mol) de p-Fluoroanilina, y 0.5 ml ácido clorhídrico como catalizador, en
50 mL de tolueno como medio de reacción, se utilizo una trampa de Dean-Stark para
separar el agua producida en la reacción y esta se mantuvo a reflujo y con agitación
magnética, por un tiempo de 12 horas, la solución resultante se filtro a vacío y el
precipitado se lavó con hexano. Al líquido obtenido se le evapora el disolvente hasta la
mitad en el rotavapor y se deja cristalizar, obteniéndose 15.956g de cristales blancos muy
ligeros de punto de fusión 51oC, que corresponde a un rendimiento del 85%.
Peso molecular: 199.22 g/mol.
Punto de Fusión: 51 °C.
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N
H
OMe
Bandas de absorción de IR (pastilla de KBr, v; cm-1
); 2875.73 y 2855.16 (C-H
aromático), 1627.88 (-C=N-), 1499.60 (Caromát), 1237.53 (C=C-F), 1217.43 y 1188.43 (F-CH),
832.34 y 771.04 (C-Catomaticodi-sustituido), y 690.08 (C-N-C).
Señales de 1H-RMN (500 MHz; CDCl3), (ppm); 7.04 –7.1 (2H, m, =C-H aromático), 7.16-
7.20 (2H, m, =C-H aromático), 7.44-7.48 (3H, m, =C-H aromático), 7.85-7.90 (2H, m, =C-H
aromático), y 8.41 (1H, s, CH=N-C=).
Señales de 13
C-RMN (125 MHz; CDCl3), (ppm); 115.81 (d J2C-F=22.37Hz, =CHmeta),
122.27 (d J3C-F=8.42Hz, =CHorto), 128.73 (=CHorto), 128.76 (=CHmeta), 131.40 (=CHpara),
136.05 (=CHipso), 148.02(d J4C-F=3.27Hz, =CHipso), 160.09 (CH=N), 161.21 (d, J
1=
244.21Hz, =C-Fpara).
Síntesis de la 4-metoxi-[(E)fenilmetilideno]-anilina (1c) En un matraz balón de 100 mL, se agregaron 9.56 mL (0.0942 mol) de benzaldehído,
11.605gr (0.0942 mol) de p-metoxianilina y 0.5 mL ácido clorhídrico como catalizador, en
50 mL de tolueno como medio de reacción, se utilizo una trampa de Dean-Stark para
separar el agua producida en la reacción y esta se mantuvo a reflujo y con agitación
magnética, por un tiempo de 12 horas, la solución resultante fue filtrada con vacío y el
precipitado se lavó con hexano. Al líquido obtenido se le evapora el disolvente hasta la
mitad en el rotavapor y se deja cristalizar, obteniéndose 13.930g de cristales blancos muy
ligeros de punto de fusión 64-66oC, que corresponde a un rendimiento del 70%.
Peso molecular: 211.25 g/mol.
Punto de Fusión: 64- 66°C.
SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE MONO-β-LACTAMAS…
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Banda de absorción de IR (pastilla de KBr, v; cm-1
); 2975.61 (C-H aromático), 1623.10 (-
C=N-), 1510.97 (Caromát), 1248.52 (O-CH3), 1030.23 (O-Caromático), 834.64 y 761.56 (C-
Catomaticodi-sustituido), y 688.48 (C-N-C).
Señales de 1H-RMN (500 MHz; CDCl3), (ppm); 3.84 (-OCH3), 6.97 (2H, d, J=8.8 Hz,
=C-H aromático), 7.28 (2H, d, J=8.88 Hz, =C-H aromático), 7.49 (3H, =C-H aromático), 7.94 (2H,
=C-H aromático), y 8.50 (1H, s, CH=N-C=).
Señales de 13
C-RMN (125 MHz; CDCl3), (ppm); 55.74 (-OCH3), 114.66 (=CHmeta),
122.52 (=CHorto), 128.86 (=CHmeta), 129.00 (=CHorto), 131.32 (=CHpara), 136.73 (=CHipso),
145.15(=CHipso), 158.57 ( =C-Fpara), 158.64 (CH=N).
Síntesis de la 3-cloro-1-(4-nitrofenil)-4-fenilazetidin-2-ona (β-lactama 2a)
En un matraz balón de fondo plano de 100mL, que contenía 1.5 g (0.0066 mol) de la imina
1a se agregaron 30 mL de cloruro de metileno anhidro, esta solución se mantuvo en
agitación magnética en atmosfera de nitrógeno y en un baño de hielo seco/acetona, para
alcanzar una temperatura de -78°C. A esta mezcla se le adicionó vía cánula en condiciones
inertes (N2) y gota a gota una la solución de 1.32mL de cloruro de cloroacetilo
(0.01657 mol) en 30 mL de cloruro de metileno. Después se agregó, también, vía cánula en
condiciones inertes y gota a gota una solución que contenía 2.39mL (0.01657 mol) de
trietilamina en 25mL de cloruro de metileno. Terminada la adición se mantuvo por dos
horas a esta temperatura (-78°C) y posteriormente se mantuvo en agitación a temperatura
ambiente durante 48 horas (Figura 5).
SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE MONO-β-LACTAMAS…
MIRANDA GONZÁLEZ JOSÉ ALBERTO Página 27
Figura 5. Reacción a -78°C, en condiciones anhidras.
Finalizado este tiempo de reacción la solución resultante se filtró a vacio, para quitar el
clorhidrato de la trietilamina formado, el cual se lavó con diclorometano; el líquido
obtenido del filtrado se trató con una solución de bicarbonato de sodio (NaHCO3) al 10%.
Después se hicieron 3 extracciones con esta solución y 3 más con agua destilada. La fase
orgánica se secó con sulfato de sodio anhidro (Na2SO4), se filtró y se concentró en el
rotavapor para eliminar todo el disolvente. El producto obtenido se purificó por
cromatografía en columna tipo flash (Figura 6), empleando una mezcla de disolventes 9:1
de hexano-acetato de etilo. Se obtuvo un sólido transparente con punto de fusión 139°C, y
con un rendimiento de 56%.
Figura 6. Esquema de purificación por cromatografía en columna.
SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE MONO-β-LACTAMAS…
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N
Cl
O
O2N
Peso molecular: 302.72 g/mol.
Punto de Fusión: 139° - 140°C.
Bandas de absorción de IR (pastilla de KBr, v; cm-1
); 3050.18(C-H), 2991.12 (C-H
aromático), 1765.13 (O=C-N-), 1518.01 (Caromático-NO2), 1498.62 y 1339.33 (-NO2), 1372.00
(C-N) 1109.79 (C-Haromático), 1061.29, 834.75 y 748.26 (C-Cl) 858.07 y 703.93 (C-NO2),
846.41 y 788.66 (C-Catomaticodi-sustituido), y 471.12(C-N-C).
Señales de 1H-RMN (500 MHz; CDCl3), (ppm); 4.78 (H, d, J=2.2 Hz, Ph-CH-CH-Cl),
5.17 (H, d, J=2.20 Hz, Ph-CH-CH-Cl), 7.33-7.46 (2H, m, =C-H aromático), 7.48 (2H, d, J
=9.04Hz, =C-H aromático), 7.49-7.53 (3H, m, =C-H), 8.23 (2H, d, J =9.07Hz, =C-H aromático)
Señales de 13
C-RMN (125 MHz; CDCl3), (ppm); 63.78 (COCHCl-), 66.96 (Ph-CH-CH),
117.84 (=CHorto), 125.52 (=CHmeta), 126.38 (=CHorto), 130.13 (=CHmeta), 130.39 (=CHpara),
134.24 (=CHipso), 142.08 (=Cipso), 144.33 (=C-NO2) y 161.58 (Cl-CH-C=O).
Síntesis de la 3-metil-1-(4-fluorofenil)-4-fenilazetidin-2-ona (β-lactama 2b)
En un matraz balón de fondo plano de 100mL, que contenía 2g (0.0101 mol) de la imina
1b, se agregaron 30 mL de cloruro de metileno anhidro, esta solución se mantuvo en
agitación magnética en atmosfera de nitrógeno y en un baño de hielo seco/acetona, para
alcanzar una temperatura de -78°C. A esta mezcla se le adicionó vía cánula en condiciones
inertes y gota a gota una la solución que contenía 2.19 mL (0.0251 mol) de cloruro de
SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE MONO-β-LACTAMAS…
MIRANDA GONZÁLEZ JOSÉ ALBERTO Página 29
N
CH3
O
F
propionilo en 30 mL de cloruro de metileno. Después se agregó, también, vía cánula, es
decir, en condiciones inertes y gota a gota una solución que contenía 3.48 mL (0.0251 mol)
de trietilamina en 25mL de cloruro de metileno. Terminada la adición se mantuvo por dos
horas a esta temperatura (-78°C) y posteriormente se mantuvo en agitación a temperatura
ambiente durante 48 horas. Finalizado este tiempo de reacción la solución resultante se
filtro a vacio, para quitar el clorhidrato de la trietilamina formado, el cual se lavó con
diclorometano; el líquido obtenido del filtrado se trato con una solución de bicarbonato de
sodio (NaHCO3) al 10%. Después se hicieron 3 extracciones con esta solución y 3 más con
agua destilada, la fase orgánica se secó con sulfato de sodio anhidro (Na2SO4), se filtró y se
concentró en el rotavapor para quitar todo el disolvente. El producto obtenido se purificó
por cromatografía en columna tipo flash, empleando una mezcla de disolventes 9:1 de
hexano-acetato de etilo. Se obtuvo un sólido blanco con punto de fusión 90°C, y con un
rendimiento de 50%.
Peso molecular: 255.28 g/mol.
Punto de Fusión: 90°C.
Señales de 1H-RMN (500 MHz; CDCl3), (ppm); 1.49 (3H, d, J=8.58 Hz, CH3-CH-), 3.15
(H, c, Ph-CH-CH-CH3), 4.58 (H, d, J=2.20 Hz, Ph-CH-CH-CH3), 6.93 (2H, t, J3
H-H=9.0
Hz, J3
H-F=8.31 Hz, =C-Haromático), 7.28(2H, dd, J3
H-H=9.07 Hz y J4
H-F=5.1 Hz, =C-Haromático),
7.34-7.40 (5H, m, =C-H aromático).
Señales de 13
C-RMN (125 MHz; CDCl3), (ppm); 13.29 (CH3-CH-), 55.79(CO-CHCH3-),
63.17 (Ph-CH-CH-), 116.0 (d J2
C-F=22.10Hz, =CHmeta), 118.58 (d J3C-F=8.14Hz, =CHorto),
126.08 (=CHorto), 128.94 (=CHpara), 129.45 (=CHmeta), 134.34(d J4
C-F=2.78Hz, =CHipso),
137.89 (=CHipso), 159.37 (d, J1= 245.58 Hz, =C-Fpara), 168.28 (CH3-CH-C=O).
SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE MONO-β-LACTAMAS…
MIRANDA GONZÁLEZ JOSÉ ALBERTO Página 30
II.2.2.-Pruebas Microbiológicas
Obtención y recuperación de cepas. Se recuperaron 7 cepas, Aeromona hidrophila
ATCC 7966, Klebsiella pnuemoniae ATCC 700603, Pseudomonas aeruginosas ATCC 27852,
Escherichia coli ATCC 25922, Escherichia coli ATCC 35218, Escherichia coli DH10 sensible
(DH10s) y Staphylococcus aureus ATCC 29213; las cuales pertenecen al cepario del grupo de
investigación del laboratorio de Bacteriología médica de la Escuela Nacional de Ciencias
Biológicas del I.P.N.
Manejo y conservación de cepas. Estas cepas se conservaron por congelación a
-80ºC en caldo Mueller-Hinton con glicerol al 40 % como crioprotector y fueron
resembradas en agar Mueller-Hinton. Después de la incubación se comprobó su pureza por
tinción de Gram. Se tomó un inóculo y se sembró en una caja de agar Mueller-Hinton por
estría cruzada. El vial empleado se regresó al congelador inmediatamente después de
utilizarlo. Las cajas se incubaron a 28ºC durante 24 horas. Las cepas recuperadas se
conservaron a corto plazo en microtubos conteniendo medio de mantenimiento.
Evaluación de la producción de β-lactamasas. Fundamento de la prueba. La
prueba de Cefinasa, consta de varios discos impregnados con nitrocefina (estos discos se
impregnan con 0.5 mL de Nitrocefina previamente disuelta en un buffer de fosfatos y
dimetil sulfóxido). Procedimiento de la prueba. La prueba de cefinasa se realizó usando el
kit BD BBL, bajo los estándares del fabricante. (Beckton Dickinson). Se tomó de 2 a 3
colonias de cada cepa y se depositaron en los discos previamente rehidratados con agua
estéril. El desarrollo de una coloración roja al cabo de 1 a 5 minutos indica la producción de
β-lactamasas.
Determinación de la potencial actividad antibiótica de la β-lactama 2a:
Prueba de susceptibilidad antimicrobiana. Procedimiento de la prueba. Se
trabajó de acuerdo a los lineamientos de la Clinical and Laboaratory Standadrs (CLSI),
utilizando la técnica de dilución en medio líquido (microplaca). Se utilizó Ampicilina
trihidratada como antibiótico de referencia; así mismo, las cepas con las que se trabajó
fueron: Klebsiella pneumoniae ATCC 700603, Escherichia coli ATCC 25922, Escherichia
SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE MONO-β-LACTAMAS…
MIRANDA GONZÁLEZ JOSÉ ALBERTO Página 31
coli ATCC 35218, y Escherichia coli DH10s. El intervalo de concentración usado fue de
0.5-256 µg/mL (4.9x10-6
- 2.5x10
-5 M) para la ampicilina trihidratada (AMP
.3H2O), y para
las β-lactamas, se tomó en cuenta la relación molar de la AMP.3H2O, trabajando en el
mismo intervalo de concentraciones. Se adicionaron 100 µL del posillo No 1 al 10 de cada
una de las concentraciones, empezando de mayor a menor concentración, en el posillo No.
11 se adicionó 50 µL del disolvente y 50 µL de medio Mueller Hinton Caldo (MHB*),
como control positivo del crecimiento bacteriano, y en el posillo No. 12 se adicionaron 200
µL de MHB, como control negativo del crecimiento bacteriano. Véase Figura 7.
Figura 7. Disposición de las microplacas para estudiar la actividad antibiótica de la β-
lactama 2a, con ampicilina trihidratada (AMP.3H2O).
Una vez que a las microplacas se les colocó la β-lactama 2a y la ampicilina, se dejaron a
prueba de esterilidad por 24 h. Posteriormente, cada una de las cepas bacterianas se
ajustaron partir de un cultivo de 18 horas en solución salina fisiológica (ssf) hasta 0.5
unidades Mc Farland**
. Del inóculo estandarizado se realizó una dilución 1:10000 con
caldo Mueller-Hinton, y del cual se adicionaron 100 µL a cada posillo, exceptuando el
posillo No. 12. Finalmente se incubaron las microplacas a 28 ºC por 18 h. Esta técnica se
realizó por triplicado.
* Del inglés Muelle Hinton Broth
** Lo que equivale a 1.5x10
4 células/mL
Capítulo III
SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE MONO-β-LACTAMAS…
MIRANDA GONZÁLEZ JOSÉ ALBERTO Página 32
III. DISCUSIÓN DE RESULTADOS
Como resultado del gran interés de los compuestos β-lactámicos, tanto en medicina y en
biología, como en química orgánica existe una gran variedad de métodos químicos
reportados para la obtención de estos compuestos, la metodología que se estableció, en este
trabajo, para la síntesis de estas mono β-lactamas es la que involucra la reacción de
Staudinger, que es una reacción de cicloadición [2+2] entre una cetena y una imina, la cual
incluye la inserción de un carbenoide. Esta reacción es un método fundamental que se lleva
a cabo en un solo paso. Para lo cual primeramente se obtienen y se caracterizan tres iminas
(o benziliminas) derivadas del benzaldehído con tres aminas aromáticas para sustituidas y
posteriormente la obtención de las β-lactamas monocíclicas. La síntesis general de las mono
β-lactamas podemos representarla como sigue:
N
R2
O
R1
NH2 R1
O
H
R1 = -NO2 , -F, y -OMe R1 = -NO2 , R
2 = Cl 2a
R1 = -F , R2 = CH3 2b
+
III.1 Síntesis de benciliminas (Iminas 1a-1c)
Las benciliminas son iminas o bases de Schiff, obtenidas específicamente de benzaldehido
y como amina primaria tres anilinas para-sustituidas. La adición nucleofílica de la amina
aromática al grupo carbonilo da como resultado hemiaminales, los cuales se deshidratan
fácilmente dando lugar a las iminas correspondientes. Su mecanismo de formación es un
proceso que está en equilibrio, por lo que es necesario eliminar el agua para desplazar la
reacción hacia el producto; esta reacción generalmente es catalizada por ácidos.
SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE MONO-β-LACTAMAS…
MIRANDA GONZÁLEZ JOSÉ ALBERTO Página 33
Síntesis de la 4-nitro-[(E)- fenilmetilideno]-anilina (Imina 1a): Se hizo
reaccionar al benzaldehído con un equivalente de la p-nitro-anilina utilizando tolueno como
disolvente y ácido clorhídrico como catalizador. La mezcla se mantuvo a reflujo durante
doce horas, usando una trampa de Dean-Stark, para separar el agua producida en la
reacción, obteniéndose la 4-nitro-[(E)- fenilmetilideno]-anilina, referida como la Imina 1a,
que es un sólido anaranjado el cual se caracterizó espectroscópicamente por RMN de 1H,
RMN de 13
C y espectroscopia de infrarrojo. A continuación se representa la síntesis de la
Imina 1a:
NH2
NO2
+Tolueno
N
NO2O
H
+ H
2O
1 aBenzaldehido p-NO2-anilina
En la asignación de los desplazamientos químicos para las señales de hidrógeno de este
compuesto, se observa que en el espectro de RMN de 1H, el desplazamiento del hidrógeno
que esta sobre el carbono de la imina (CH=N-) aparece en campos bajos, es este caso a 8.41
ppm, y que el desplazamiento químico para los dos hidrógenos alfa al grupo nitro esta en
8.22 ppm, es decir, son los hidrógenos aromáticos que se desplazan más a campos bajos. En
la estructura siguiente se muestran la asignación de las señales de 1H en ppm para el
compuesto 1a:
N
NO2
H
H
H
H
H
H
8.41
8.22
7.91
7.22
7.50
7.53
SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE MONO-β-LACTAMAS…
MIRANDA GONZÁLEZ JOSÉ ALBERTO Página 34
Como puede observarse en la estructura de este compuesto, todos los carbonos tienen
hibridación sp2, por lo que en la caracterización por RMN
13C, todas las señales de los
carbonos salen en la región de 120 a 165 ppm, observándose que las señales mas
desplazados aparecen en 157.8 y 162.6 las cuales corresponden al carbono ipso con el
nitrógeno de la imina (C=N-C-) y al carbono de la propia imina (CH=N-) respectivamente.
Se muestra la asignación de las señales de RMN13
C, en ppm para el compuesto 1a.
N
NO2
157.8132.4
135.3
145.4128.8
125.0
129.2
162.6
121.2
Síntesis de la 4-fluor-[(E)-fenilmetilideno]-anilina (Imina 1b): Para la síntesis
de esta benzilimina se hizo reaccionar al benzaldehído con un equivalente en este caso de
la p-fluoro-anilina, bajo las mismas condiciones de reacción, y usando una trampa de Dean-
Stark, para separar el agua producida en la reacción, obteniéndose la 4-fluor-[(E)-
fenilmetilideno]-anilina, representada como la Imina 1b, que es un sólido blanco muy
ligero, tipo escamas, con un punto de fusión muy bajo de 51oC. La síntesis de la esta Imina
se representa a continuación:
NH2
F
+Tolueno
N
FO
H
+ H
2O
1 bBenzaldehido p-fluor-anilina
SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE MONO-β-LACTAMAS…
MIRANDA GONZÁLEZ JOSÉ ALBERTO Página 35
La caracterización espectroscópicamente de este compuesto se realizó usando RMN de 1H,
RMN de 13
C y espectroscopia de infrarrojo. En relación a la asignación de los
desplazamientos químicos para las señales de hidrógeno del compuesto 1b, se observa que
en el espectro de RMN de 1H, el desplazamiento del hidrógeno que esta sobre el carbono de
la imina (CH=N-) aparece, es este caso también a 8.41 ppm, y debido a que el átomo de
flúor presenta una frecuencia de resonancia característica (470.47 MHz) y diferente a la del
hidrógeno (500 MHz) es decir, es magnéticamente activo y además como tiene un spin de
½ (I=1/2), se observa el acoplamiento heteronuclear (F-H) de este con los hidrógenos
aromáticos vecinos, generando una señal múltiple con un desplazamiento químico para los
dos hidrógenos α a este halógeno entre 7.04 y 7.1 ppm, e incluso para los hidrógenos que se
encuentran a cuatro enlaces con el átomo de flúor también se acopla y aparece como una
señal múltiple entre 7.16 y 7.20 ppm. La asignación de las señales de RMN1H, en ppm de
la Imina 1b se muestra en la estructura siguiente:
N
F
H
H
H
H
H
H
8.41
7.04 - 7.1
7.16 - 7.20
7.86 - 7.9
7.44 - 7.48
En la asignación de los desplazamientos químicos para las señales de los carbonos de este
compuesto, en el espectro de RMN de 13
C se observa también que el átomo de flúor es
magnéticamente activo, y como una consecuencia de la presencia de este átomo sobre los
átomos de carbono del anillo aromático, se genera un acoplamiento heteronuclear (C-F) con
estos, y los valores de las constantes de acoplamiento son muy grandes e inusuales; para el
carbono que está unido directamente al átomo de flúor se tiene un desplazamiento químico
de 161.21 ppm y una constante de acoplamiento carbono-flúor de J1
C-F = 244.21Hz, para el
carbono α al carbono que soporta al átomo de flúor este aparece en 115.81 ppm y su
SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE MONO-β-LACTAMAS…
MIRANDA GONZÁLEZ JOSÉ ALBERTO Página 36
constante de acoplamiento carbono-flúor es ahora a dos enlaces J2C-F=22.37Hz, para el
carbono que se encuentra unido a tres enlaces con el átomo de flúor su desplazamiento es
de 122.27 ppm y su constante de acoplamiento es menor J3
C-F=8.42Hz, y finalmente la
constante de acoplamiento a cuatro enlaces también se observa, aunque su magnitud es muy
pequeña J4
C-F=3.27Hz. La asignación de las señales de RMN13
C, en ppm de la Imina 1b es
la siguiente:
N
F
148.019
131.41
136.05
161.21128.76
115.81
128.73
160.09
122.27
J2
C-F
= 22.37Hz
J3
C-F
= 8.42HzJ4
C-F
= 3.27Hz
J1
C-F
= 244.21
Síntesis de la 4-metoxi-[(E)-fenilmetilideno]-anilina (Imina 1c): Las mismas
condiciones fueron utilizadas para la obtención de la 4-metoxi-[(E)- fenilmetilideno]-
anilina, citada como la Imina 1c. En este caso se utilizó como amina primaria a la p-metoxi-
anilina.
NH2
OMe
+Tolueno
N
OMeO
H
+ H
2O
1 cBenzaldehido p-metoxi-anilina
En el espectro de RMN de 1H, de este compuesto, se observa el desplazamiento de los
hidrógenos del grupo metoxi (CH3O-) como una señal simple que aparece en 3.84 ppm, el
SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE MONO-β-LACTAMAS…
MIRANDA GONZÁLEZ JOSÉ ALBERTO Página 37
hidrógeno característico de la imina (CH=N-) aparece a campos bajos, es este caso a 8.50
ppm, y el desplazamiento químico para los dos hidrógenos α al carbono que tiene el grupo
metoxi aparece como una señal doble en 7.28 ppm, y con un a constante de acoplamiento
hidrógeno-hidrógeno a tres enlaces de J3
H-H=8.8 Hz; mientras que los hidrógenos α al
carbono que tiene el nitrógeno de la imina aparecen en 6.97 ppm y con la misma constante
de acoplamiento aromática de 8.8 Hz. La asignación de las señales de RMN1H, en ppm de
1c son las siguientes:
N
OCH3
H
H
H
H
H
H
8.50
7.28
6.97
7.49
7.49
7.94
3.84
J3
H-H= 8.88Hz
J3
H-H= 8.88Hz
En la caracterización del compuesto 1c por RMN13
C, aparecen las diez señales
correspondientes a los diez átomos de Carbono magnéticamente diferentes que conforman
la estructura de este compuesto. En 55.57 ppm aparece la señal del carbono del metilo del
grupo metoxi (CH3O-), y las dos señales mas desplazadas aparecen en 158.64 y 158.57 que
corresponden al carbono de la imina (CH=N-) y el carbono aromático que soporta al grupo
metoxi (=C-OCH3) respectivamente. La Asignación de las señales de RMN13
C, en ppm de
1c son las siguientes:
N
OCH3
145.15131.32
136.73
158.57128.86
114.66
129.00
158.64
122.52
55.57
SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE MONO-β-LACTAMAS…
MIRANDA GONZÁLEZ JOSÉ ALBERTO Página 38
III.2 Síntesis de las N-aril-mono--lactamas 2a y 2b
La síntesis de las dos N-aril-mono-β-lactamas se llevó a cabo mediante una reacción de
cicloadición [2 + 2] entre una cetena y las benziliminas 1a y 1b. Para la formación in situ,
de la cetena se utilizo el cloruro de ácido correspondiente, una base que nos permitió
extraer el hidrógeno ácido alfa al grupo carbonilo del cloruro de ácido, para formar el doble
enlace sobre el carbono carbonílico, y esta reacción tiene muy buenos resultados si se
realiza la formación de la cetena a bajas temperaturas.
Síntesis de la 3-cloro-1-(4-nitrofenil)-4-fenilazetidin-2-ona (β-lactama 2a)
Se hizo reaccionar la imina 1a, con 2.5 equivalentes de cloruro de cloroacetilo, utilizando la
trietilamnia como base, para obtener la cetena y usando cloruro de metileno anhidro como
disolvente, la reacción se mantuvo en agitación magnética, con atmósfera de nitrógeno y a
una temperatura de -78°C durante dos horas y posteriormente se mantuvo en agitación a
temperatura ambiente durante 48 horas. Se muestra a continuación la síntesis de la
β-lactama 2a:
N
Cl
O
O2N
N
NO2
CH2Cl2, NEt3Cl
Cl
O
+
-78 º C
Cloruro de cloroacetilo1 a2 a
En esta reacción se obtuvieron varios subproductos, además de la N-aril-mono--lactama
deseada, por lo que, después de purificar el crudo de la reacción por cromatografía en
columna tipo flash, empleando una mezcla de disolventes hexano-acetato de etilo, se
obtuvo un sólido cristalino amarillo claro, con un punto de fusión de 139 a 140 oC, con un
rendimiento del 56%. El cual además de ser caracterizado por las técnicas espectroscópicas
convencionales, se le realizó un estudio de difracción de rayos X.
SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE MONO-β-LACTAMAS…
MIRANDA GONZÁLEZ JOSÉ ALBERTO Página 39
La asignación de las señales en el espectro de RMN de 1H para la N-aril-mono--lactama
2a se presenta en la estructura siguiente. En donde a 4.78 ppm aparece una señal doble con
una constante de acoplamiento homonuclear Hidrógeno-Hidrógeno de 2.2 Hertz (J2
H-H=2.2
Hz), que corresponde al desplazamiento químico del hidrógeno del metino al grupo
carbonilo de la -lactama (CH-CH(Cl)C=O), y a campos más bajos (5.17 ppm) aparece
también una señal doble con una constante de acoplamiento homonuclear a tres enlaces con
una magnitud de 2.2 Hertz, que corresponde al desplazamiento químico del hidrogeno del
carbono que tiene unido un átomo de cloro y está en posición al grupo carbonilo de la
-lactama (CH-CH(Cl)C=O), mientras que las demás señales corresponden al resto de los
hidrógenos y todos son aromáticos.
8.23
7.48
5.17
4.78
7.53 - 7.49
H
N
Cl
O
O2N
H
H
H
H
H
H
J3
H-H = 2.2 Hz
J3
H-H = 2.2 Hz
J3
H-H = 9.07 Hz
J3
H-H = 9-07 Hz
Como puede observarse en la estructura de este compuesto, solo dos de los once carbonos
magnéticamente diferentes tienen hibridación sp3, y estos corresponden a los carbonos que
se encuentran en la posición α y del grupo carbonilo de la 2-azetidinona y aparecen en el
espectro de RMN13
C, en 63.78 y 66.96 ppm respectivamente. De los nueve carbonos
restantes, ocho de ellos son aromáticos y todos las señales de estos carbonos salen en la
región correspondiente a carbonos con hibridación sp2, específicamente aquí aparecen de
118 a 145 ppm, mientras que la señal del carbono carbonilo de la -lactama aparece en
SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE MONO-β-LACTAMAS…
MIRANDA GONZÁLEZ JOSÉ ALBERTO Página 40
164.58 ppm. En la estructura siguiente se muestra Asignación de las señales de RMN13
C,
en ppm de 2a:
N
Cl
O
O2N
144.33126.38
134.24
161.58
63.78
66.96
142.08130.13
130.39
117.84
125.52
Estudio de difracción de rayos X, 3-cloro-1-(4-nitrofenil)-4-fenilazetidin-
2-ona (β-lactama 2a). La caracterización de este compuesto se corroboró mediante la
obtención de su estructura por un estudio de difracción de rayos X, obteniéndose de esta
forma la estructura en estado sólido del compuesto 2a. En la siguiente figura se muestra la
estructura obtenida de la molécula en la cual podemos observar; primeramente que se
formó el anillo de cuatro miembros de la -lactama, así mismo, que los dos anillos
aromáticos que contiene la molécula se encuentran perpendiculares uno respecto del otro, y
finalmente que los hidrógenos de los carbonos α y β, respecto al grupo carbonilo del anillo
de la -lactama, se encuentran en posición trans y estos poseen un ángulo dihedro de
123.90°. Figura 8.
SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE MONO-β-LACTAMAS…
MIRANDA GONZÁLEZ JOSÉ ALBERTO Página 41
Figura 8. Estructura obtenida por difracción de rayos X de la 3-cloro-1-(4-nitrofenil)-4-
fenilazetidin-2-ona (β-lactama 2a)
La estructura del cristal comprende una celda unitaria monoclínica con un grupo espacial
(P1 21/n1), con las siguientes dimensiones: a = 8.6785(2) Å, b = 16.1155(4) Å, c =
10.2348(2) Å; α = 90°, β = 93.6526(19)°, γ = 90°. El volumen de la celda unitaria es de
1428 (6) Å3 y se encuentran 4 moléculas con un peso molecular de 302.71g /gmol, cada
una, en cada celda unitaria. Figura 9.
SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE MONO-β-LACTAMAS…
MIRANDA GONZÁLEZ JOSÉ ALBERTO Página 42
Figura 9. Celda unitaria de la estructura de 3-cloro-1-(4-nitrofenil)-4-fenilazetidin-2-ona
(β-lactama 2a)
En la figura de la celda unitaria de este compuesto se observa que en la estructura cristalina
se forman enlaces por puente de hidrógeno de manera intramolecular, es decir, dentro de la
misma molécula entre el oxígeno del carbonilo de la 2-azetidinona (H…O=C) y el
hidrógeno orto del anillo aromático del sustituyente 4-nitrofenil.
SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE MONO-β-LACTAMAS…
MIRANDA GONZÁLEZ JOSÉ ALBERTO Página 43
Síntesis de la 3-metil-1-(4-fluorofenil)-4-fenilazetidin-2-ona (β-lactama 2b)
Para la obtención de esta N-Aril-mono--lactama, se hizo reaccionar la imina 1b, pero
ahora con cloruro de propionilo (2.5 equivalentes). Para obtener la cetena de este cloruro de
ácido, se uso como base la trietilamnia, en cloruro de metileno anhidro como disolvente, y
bajo las mismas condiciones descritas para la obtención de la -lactama derivada 2a.
Como se muestra en la siguiente estructura:
N
CH3
O
F
N
F
CH2Cl2, NEt3CH3
Cl
O
+
-78 º C
Cloruro de propionilo1 b 2 b
La mezcla de productos obtenidos de esta reacción también se purificó, por cromatografía
en columna tipo flash. Se obtuvo un sólido cristalino blanco, con un punto de fusión de 90 a
91oC, y con un rendimiento del 50%, el cual además de ser caracterizado por las técnicas
espectroscópicas convencionales, se recristalizó hasta obtener cristales adecuados para
realizar un estudio de difracción de rayos X.
Para este compuesto podemos observar en el espectro de RMN de 1H; que a 1.49 ppm
aparece una señal doble con una constante de acoplamiento Hidrógeno-Hidrógeno de 8.58
Hertz (J3
H-H=8.58 Hz), que corresponde al desplazamiento químico de los hidrógenos del
metilo al grupo carbonilo de la -lactama (-CH(CH3)-C=O), y el valor de la constante
de acoplamiento se debe al acoplamiento del metilo con el hidrógeno de ese mismo carbono
a tres enlaces.
SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE MONO-β-LACTAMAS…
MIRANDA GONZÁLEZ JOSÉ ALBERTO Página 44
A campos más bajos (4.58 ppm) aparece una señal doble con una constante de
acoplamiento a tres enlaces con una magnitud de 2.2 Hertz, que corresponde al
desplazamiento químico del hidrogeno del carbono en posición al grupo carbonilo de la
-lactama [-CH(N)CH(CH3)-], y la constante de acoplamiento entre los hidrógenos de los
carbonos y y finalmente para los hidrógenos aromáticos unidos a tres y cuatro enlaces
con el átomo de flúor aparecen señales múltiples centradas en 6.93 y 7.28 ppm
respectivamente. En la siguiente estructura se muestra la asignación de las señales de
RMN1H, en ppm, para la β -lactama 2b:
6.93
7.28
3.15
4.58
7.34 - 7.4
H
N
CH3
O
F
H
H
H
H
H
H
1.49
J3
H-H =2.2 Hz
J3
H-H = 8.58 Hz
La asignación de las señales en el espectro de RMN de 13
C para la 3-metil-1-(4-fluoro-
fenil)-4-fenilazetidin-2-ona (β-lactama 2b) se presenta en la siguiente estructura. En donde
puede observarse que el desplazamiento a 55.79 ppm corresponde al carbono que se
encuentran en la posición α del grupo carbonilo de la 2-azetidinona. La presencia del átomo
de flúor aquí también genera un acoplamiento con los carbonos que se encuentran unidos a
uno, dos, tres y cuatro enlaces con él, dando lugar a señales dobles con constantes de
acoplamiento grandes las cuales van disminuyendo conforme a la distancia; a un enlace
SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE MONO-β-LACTAMAS…
MIRANDA GONZÁLEZ JOSÉ ALBERTO Página 45
J1
C-F = 245.48Hz, a dos enlaces J2C-F = 22.10Hz, a tres enlaces J
3C-F = 8.14Hz, y la más
pequeña es a cuatro enlaces J4
C-F = 2.78Hz, mientras que la señal del carbono carbonilo de
la -lactama aparece en 168.28 ppm.
N
CH3
O
F
159.37118.58
134.34
168.28
55.79
63.17
137.89129.45
128.84
126.08
116.0
13.29
J2
C-F = 22.10Hz
J3
C-F = 8.14 HzJ1
C-F = 245.48 Hz
J4
C-F = 2.78 Hz
Estudio de difracción de rayos X para la 3-metil-1-(4-fluorofenil)-4-fenil-
azetidin-2-ona (β-lactama 2b). La estructura propuesta para esta β-lactama se
corroboró por medio de la difracción del en rayos X, obtenida a partir de un mono cristal de
este compuesto, ver Figura 10. En la estructura se observa claramente la posición trans que
guardan los hidrógenos de los carbonos α y β, respecto al grupo carbonilo del anillo de la
-lactama, y estos poseen un ángulo diedro de 118.9°
SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE MONO-β-LACTAMAS…
MIRANDA GONZÁLEZ JOSÉ ALBERTO Página 46
Figura 10. Estructura obtenida por difracción de rayos X de la 3-metil-1-(4-fluorofenil)-4-
fenilazetidin-2-ona (β-lactama 2b)
La estructura del cristal comprende una celda unitaria monoclínica con un grupo espacial
(P1 21/c1), con las siguientes dimensiones: a = 20.4231(7) Å, b = 8.6399(3) Å, c =
16.9215(5) Å; α = 90°, β = 114.097(4)°, γ = 90°. El volumen de la celda unitaria es de
2725.661(18) Å3 y se encuentran 8 moléculas con un peso molecular de 255.28 g /gmol,
cada una, en cada celda unitaria. Figura 11.
SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE MONO-β-LACTAMAS…
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Figura 11. Celda unitaria de la estructura de 3-metil-1-(4-fluorofenil)-4-fenilazetidin-2-ona
(β-lactama 2b)
Por otro lado en la estructura cristalina de este compuesto se observa que se forman enlaces
por puente de hidrógeno; tanto con el oxígeno del carbonilo (H…O=C), como con el átomo
de flúor del anillo aromático (H…F-C=). En la figura de la celda unitaria se puede
distinguir que estos enlaces por puente de hidrogeno se forman tanto dentro de la misma
molécula como entre otra molécula. En la Tabla 4 se presentan los valores de las longitudes
de enlace.
SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE MONO-β-LACTAMAS…
MIRANDA GONZÁLEZ JOSÉ ALBERTO Página 48
Tabla 4. Longitud de enlaces por puente de hidrógeno en Amstrons(Å)
D-H…A d(D-H) d(D…A)
C(6)-H(6)…O(12) 0.93 2.47
C(6A)-H(6A)…O(12A) 0.93 2.49
C(4a)-H(4A)…O(12A)#1 0.98 2.55
C(7)-H(7)…F(11A)#2 0.93 2.47
C(7A)-H(7A)…F(11)#3 0.93 2.42
C(9)-H(9)…O(12)#4 0.93 2.47
C(9A)-H(9A)…O(12A)#4 0.93 2.48
Transformaciones de simetría usadas para generar átomos equivalentes.
#1 –x+1,y-1/2,-z+3/2 #2 x+1,-y+1/2,z+1/2 #3 x-1,y,z-1 #4 x,-y+1/2,z+1/2
III.3 Pruebas Microbiológicas
Evaluación de la producción de β-lactamasas. Se han desarrollado diversas
pruebas clínicas para la detección de β-lactamasas. La Nitrocefina; es la cefalosporina
utilizada en la metodología para la detección de las β-lactamasas conocidas, incluidas las
penicilinasas estafilococócicas29
. Una reacción positiva de la prueba de sefinasa da un
cambio de color amarillo a rojo en el área en la que se aplicó el cultivo. Un resultado
negativo de esta prueba, se observa cuando no hay cambio de color en el disco. En la
mayoría de las cepas, el resultado positivo apareció en menos de 5 min. A continuación en la
Tabla 5 se muestran los resultados.
SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE MONO-β-LACTAMAS…
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Tabla 5. Prueba Cefinasa: identificación de microorganismos productores de
β-lactamasa.
Microorganismo Bacteria
Gram
Desarrollo de
color
Staphylococcus aureus
(ATCC 25923) Positiva -
Escherichia coli
(ATCC 25923) Negativa -
Escherichia coli
(DH10S) Negativa -
Escherichia coli
(ATCC 25923) Negativa -
Aeromonas hydrophila
(ATCC 25923) Negativa +
Pseudomonas aeruginosa
(ATCC 25923) Negativa +
Klebsiella pneumoniae
(ATCC 25923) Negativa +
El resultado de la reacción de esta prueba se obtuvo dentro de los primeros 10 minutos, lo
cual está de acuerdo con la norma, ya que puede dar falsos positivos si la respuesta se
obtiene después de ese tiempo. Se observó el desarrollo del color en el disco para K.
pneumoniae, P. aeruginosa y A. hydrophila indicando su resistencia a penicilinas y
cefalosporinas principalmente. En cuanto a las cepas de E. coli y S. aureus desarrollaron un
color rojizo muy claro por lo que la prueba para estas cepas no es confiable; sin embargo,
debido a que las cepas que se usaron en este trabajo son de control de calidad, se sabe que
no son productoras de β-lactamasas.
Cabe mencionar que las cepas que se utilizaron para la siguiente prueba microbiológica
fueron K. pneumoniae ATTCC700603, E.coli ATCC25922, ATCC35218, y DH10sensible
(DH10s) y S. aureus ATCC25923, ya que son las que recomienda la CLSI con el
conocimiento de que estas cepas su principal mecanismo de resistencia es la producción de
β-lactamasas.
SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE MONO-β-LACTAMAS…
MIRANDA GONZÁLEZ JOSÉ ALBERTO Página 50
Evaluación de la potencial actividad antibiótica de la β-lactama 2a. Dentro
del área de investigación se requiere evaluar la actividad antimicrobiana de nuevas
moléculas o de las ya existentes frente a patógenos y determinar su capacidad bactericida.
Es necesario utilizar el inóculo en la fase logarítmica de crecimiento ya que los antibióticos
β-lactámicos, sólo son bactericidas durante este periodo, y el valor de la prueba se determina
por el éxito de su aplicación en el laboratorio30
.
Las condiciones que se usaron para evaluar la actividad antimicrobiana de las espiro
β-lactamas sintetizadas se tomaron de la CLSI; así mismo, el antibiótico de referencia usado
(ampicilina trihidratada) se trabajó bajo estas mismas condiciones y la técnica empleada fue
la de difusión en medio líquido.
Debido a la naturaleza química de la β-lactama 2a sintetizada, esta no es solubles en
soluciones acuosas, por lo que las soluciones stock se disolvieron en DMSO puro, y
conforme se hicieron las diluciones necesarias con el medio de cultivo Mueller Hinton caldo
(MHB), quedando el DMSO a una concentración final del 1%. Por otro lado, la solución
stock de la ampicilina trihidritada se realizó con un buffer de fosfatos 0.1M a pH= 7.5 y
posteriormente las diluciones se realizaron con el medio de cultivo MHB. El uso del
disolvente DMSO, lo cual está permitido por los estándares clínicos internacionales CLSI.
Tomando como referencia a la ampicilina, el intervalo de concentración que se trabajó fue
de 0.1-258 µg/mL (5.73x10-2
M), y su relación molar se tomó como base para trabajar con
las respectivas β-lactamas. Para establecer la actividad de los compuestos sobre las cepas
bacterianas, se consideró la concentración mínima inhibitoria (CMI) establecida por los
estándares clínicos internacional CLSI lo que se muestra, en la Tabla 6.
SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE MONO-β-LACTAMAS…
MIRANDA GONZÁLEZ JOSÉ ALBERTO Página 51
Tabla 6. Criterios establecidos por la CLSI para las pruebas de
susceptibilidad en medio líquido.
CMI*
(µg/mL) Interpretación de la prueba
≥32 Cepa resistente
16 Intermedio (se repite la prueba)
≤8 Cepa sensible
*CMI= Concentración mínima inhibitoria para pruebas de susceptibilidad antimicrobiana realizadas en
caldo Mueller Hinton.
La CMI de la ampicilina observada en las microplacas, para las tres cepas de E. coli, fue de
4 µg/mL y para la cepa de K. pneumoniae fue de 32 µg/mL. Con estos resultados se
concluyen dos aspectos importantes, el primero es que la ampicilina inhibe a las PBP´s en
las cepas de E. coli y por otro lado las cepas de K. pneumoniae producen β-lactamasa, las
cuales abren al anillo β-lactámico de la ampicilina impidiendo su acción sobre las PBP´s,
por lo que se requiere mayor concentración del antibiótico para inhibir el crecimiento
bacteriano.
En cuanto al β-lactama 2a sintetizada la inhibición del crecimiento bacteriano, fue muy
poco a pesar de que esta prueba se repitió 6 veces y se reprodujo 3 veces, y en cuanto a la
sensibilización de las bacterias productoras de β-lactamasa (K.pneumoniae), también los
resultados no fueron concluyentes.
SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE MONO-β-LACTAMAS…
MIRANDA GONZÁLEZ JOSÉ ALBERTO Página 52
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
Se sintetizaron y caracterizaron espectroscópicamente tres benziliminas; la 4-nitro-
N[(E)-fenilmetilideno] anilina (1a), la 4-fluoro-N[(E)-fenilmetilideno] anilina (1b),
y la 4-metoxi-N[(E)-fenilmetilideno] anilina (1c), mediante la reacción de benzal-
dehído con la correspondiente anilina aromática.
Los rendimientos obtenidos en la síntesis de las tres benziliminas fueron buenos;
para la ( p-NO2 Imina 1a) fue del 84%, la ( p-F Imina 1b) se obtuvo con un 85% y
para la ( p-OMe Imina 1c), fue del 70%.
Se sintetizaron dos nuevos compuestos mono--lactámicos; la 3-cloro-1-(4-nitro-
fenil)-4-fenilazetidin-2-ona (-lactama 2a), y la 3-metil-1-(4-fluorofenil)-4-fenil-
azetidin-2-ona (-lactama 2b) mediante la reacción de Staudinger, utilizando
cloruro de cloroacetilo en la síntesis de la -lactama 2a y cloruro de propionilo para
la síntesis de la -lactama 2b, obteniéndose rendimientos moderados: para la p-
NO2--lactama 2a fue del 56%, y para la p-F--lactama 2b del 50%.
La caracterización por espectroscopia de resonancia magnética nuclear de protón y
carbono trece (RMN 1H y
13C), así como la espectroscopia de infrarrojo, de todos
los compuestos sintetizados estuvo de acuerdo con las estructuras propuestas.
Mediante un estudio de difracción de rayos X se determino la estructura cristalina
de las dos nuevas -lactamas obtenidas; y se precisó que la configuración relativa
que guardan los hidrógenos y en el anillo de la 2-azetidinona es trans, como se
había predicho.
SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE MONO-β-LACTAMAS…
MIRANDA GONZÁLEZ JOSÉ ALBERTO Página 53
En la figura de la celda unitaria del compuesto ((-lactama 2a), se observa que se
forman enlaces por puente de hidrógeno de manera intramolecular, entre el oxígeno
del carbonilo de la 2-azetidinona (H…O=C) y el hidrógeno orto del anillo
aromático del sustituyente 4-nitrofenil.
En la celda unitaria de la estructura cristalina de la (-lactama 2b), se observa la
formación de enlaces por puente de hidrógeno, de forma tanto intramolecular con el
oxígeno del carbonilo (H…O=C), es decir dentro de la misma molécula, como de
manera intermolecular entre el átomo de flúor del anillo aromático de una molécula
(H…F-C=) con un hidrógeno aromático de otra molécula.
Se hicieron estudios microbiológicos preliminares para el compuesto p-NO2--
lactama 2a, se trabajó con las siguientes cepas: Klebsiella pneumoniae ATCC
700603, Escherichia coli ATCC 25922, Escherichia coli ATCC 35218, y
Escherichia coli DH10s las cuales son productoras de -lactamasas.
Se recomienda realizar una prueba de sinergismo adicional para poder concluir
sobre la actividad biológica de este compuesto.
SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE MONO-β-LACTAMAS…
MIRANDA GONZÁLEZ JOSÉ ALBERTO Página 54
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Anexos
SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE MONO-β-LACTAMAS COMO PRECURSORES DE β-AMINOACIDOS
MIRANDA GONZÁLEZ JOSÉ ALBERTO Página 57
ANEXOS
1.- Espectro de IR del compuesto 1a.
2.-Espectro de IR del compuesto 1b.
3.-Espectro de RMN1H a 500 MHz del compuesto 1b
4.-Espectro de RMN13
C a 500 MHz del compuesto 1b
5.- Espectro de IR del compuesto 1c
6.-Espectro de RMN1H a 500 MHz del compuesto 1c
7.-Espectro de RMN13
C a 500 MHz del compuesto 1c
8.-Espectro de IR del compuesto 2a
9.-Espectro de RMN1H a 500 MHz del compuesto 2a
10.-Espectro de RMN13
C a 500 MHz del compuesto 2a
11.-Espectro de RMN1H a 500 MHz del compuesto 2b
12.-Espectro de RMN13
C a 500 MHz del compuesto 2b
13.- Coordenadas de la β-lactama 2b, (x104).
14.- Coordenadas de la β-lactama 2a, (x104).
15.-Pruebas de Sensibilidad Antimicrobiana: Evaluación de la potencial actividad
antibiótica de la mono-β-lactama 2a
SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE MONO-β-LACTAMAS COMO PRECURSORES DE β-AMINOACIDOS
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NO2
N
1.- Espectro de IR del compuesto 1a
SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE MONO-β-LACTAMAS COMO PRECURSORES DE β-AMINOACIDOS
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N
F
2.-Espectro de IR del compuesto 1b.
SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE MONO-β-LACTAMAS COMO PRECURSORES DE β-AMINOACIDOS
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N
F
H
H
H
H
H
HC
A
B
E
D
C
3.-Espectro de RMN1H a 500 MHz del compuesto 1b
A
B
C
D
E
SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE MONO-β-LACTAMAS COMO PRECURSORES DE β-AMINOACIDOS
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N
F
H
A
C
E
I
G
B
DF
4.-Espectro de RMN13
C a 500 MHz del compuesto 1b
A
B C
D
E
F
G
H
I
SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE MONO-β-LACTAMAS COMO PRECURSORES DE β-AMINOACIDOS
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CH3
N
O
5.- Espectro de IR del compuesto 1c
SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE MONO-β-LACTAMAS COMO PRECURSORES DE β-AMINOACIDOS
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N
OCH3
H
H
H
H
H
H
A
CE
GBD
F
6.-Espectro de RMN1H a 500 MHz del compuesto 1c
B
C
D E
F
A
G
SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE MONO-β-LACTAMAS COMO PRECURSORES DE β-AMINOACIDOS
MIRANDA GONZÁLEZ JOSÉ ALBERTO Página 64
N
OCH3
A
C
EG
B
D
F
H
I
J
7.-Espectro de RMN13
C a 500 MHz del compuesto 1c
A
B
C
D
E
F
G
H
J
I
SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE MONO-β-LACTAMAS COMO PRECURSORES DE β-AMINOACIDOS
MIRANDA GONZÁLEZ JOSÉ ALBERTO Página 65
NO
Cl
O2N
8.-Espectro de IR del compuesto 2a
1765.13
846.21
SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE MONO-β-LACTAMAS COMO PRECURSORES DE β-AMINOACIDOS
MIRANDA GONZÁLEZ JOSÉ ALBERTO Página 66
NO
Cl
O2N
H
H
H
H
H
H
HA
B
C
D
E
F
G
9.-Espectro de RMN1H a 500 MHz del compuesto 2a
A
B
C D
E
F
G
SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE MONO-β-LACTAMAS COMO PRECURSORES DE β-AMINOACIDOS
MIRANDA GONZÁLEZ JOSÉ ALBERTO Página 67
NO
Cl
O2N B
A
C
D
E
F
G
H
I
J
K
10.-Espectro de RMN13
C a 500 MHz del compuesto 2a
B
A
C
D E
F G
H
I J
K
SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE MONO-β-LACTAMAS COMO PRECURSORES DE β-AMINOACIDOS
MIRANDA GONZÁLEZ JOSÉ ALBERTO Página 68
N
CH3
O
F
H
H
H
H
H
H
HA
B
C
DE
F
G
H
11.-Espectro de RMN1H a 500 MHz del compuesto 2b
A
B
C
D
E
F
G
G
SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE MONO-β-LACTAMAS COMO PRECURSORES DE β-AMINOACIDOS
MIRANDA GONZÁLEZ JOSÉ ALBERTO Página 69
N
CH3
O
FA
DC
B
E
F
G
H
I
J
L
K
12.-Espectro de RMN13
C a 500 MHz del compuesto 2b
A
B
C
D
E
F G H
I
J
K
L
SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE MONO-β-LACTAMAS COMO PRECURSORES DE β-AMINOACIDOS
MIRANDA GONZÁLEZ JOSÉ ALBERTO Página 73
13.- Coordenadas de la β-lactama 2b, (x104).
x y z U(eq)
C(2) 10074(2) 2921(3) 11914(2) 48(1)
C(2A) 4902(2) 2837(3) 6881(2) 48(1)
C(3) 9287(2) 2603(4) 11372(2) 55(1)
C(3A) 5697(2) 2551(4) 7115(2) 55(1)
C(4) 9263(1) 1944(3) 12217(2) 48(1)
C(4A) 5723(1) 1891(3) 7991(2) 47(1)
C(5) 10536(1) 2175(3) 13504(2) 41(1)
C(5A) 4440(1) 2043(3) 8008(1) 40(1)
C(6) 11253(1) 2494(4) 13727(2) 54(1)
C(6A) 3716(1) 2245(4) 7502(2) 53(1)
C(7) 11745(2) 2306(5) 14571(2) 64(1)
C(7A) 3220(2) 1994(4) 7845(2) 64(1)
C(8) 11510(2) 1776(4) 15174(2) 61(1)
C(8A) 3457(2) 1552(4) 8693(2) 58(1)
C(9) 10811(2) 1435(4) 14978(2) 60(1)
C(9A) 4166(2) 1349(4) 9215(2) 57(1)
C(10) 10311(1) 1639(3) 14132(2) 48(1)
C(10A) 4662(1) 1596(3) 8865(2) 50(1)
C(13) 9127(2) 1528(5) 10607(2) 83(1)
C(13A) 5860(2) 1463(5) 6515(2) 81(1)
C(14) 8780(1) 2683(3) 12578(2) 49(1)
C(14A) 6202(1) 2638(4) 8824(2) 49(1)
C(15) 8829(2) 4242(4) 12771(2) 61(1)
C(15A) 6154(2) 4205(4) 8962(2) 64(1)
C(16) 8394(2) 4949(5) 13110(3) 76(1)
C(16A) 6585(2) 4879(5) 9736(2) 81(1)
C(17) 7899(2) 4057(6) 13270(3) 82(1)
C(17A) 7076(2) 3992(6) 10389(2) 85(1)
C(18) 7846(2) 2501(6) 13090(3) 86(1)
C(18A) 7124(2) 2437(6) 10259(2) 81(1)
C(19) 8279(2) 1808(4) 12746(2) 63(1)
C(19A) 6693(2) 1750(4) 9487(2) 62(1)
N(1) 10029(1) 2351(3) 12651(1) 45(1)
N(1A) 4953(1) 2290(3) 7665(1) 46(1)
O(12) 10583(1) 3401(3) 11794(1) 62(1)
O(12A) 4396(1) 3312(3) 6258(1) 60(1)
F(11) 12000(1) 1581(3) 15999(1) 99(1)
F(11A) 2964(1) 1306(3) 9034(1) 90(1)
SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE MONO-β-LACTAMAS COMO PRECURSORES DE β-AMINOACIDOS
MIRANDA GONZÁLEZ JOSÉ ALBERTO Página 74
14.- Coordenadas de la β-lactama 2a, (x104).
x y z U(eq)
C(2) 6913(2) 2575(1) 9921(1) 56(1)
C(3) 7924(2) 2039(1) 8891(1) 56(1)
C(4) 6367(1) 2391(1) 7897(1) 47(1)
C(5) 4771(1) 3532(1) 9048(1) 45(1)
C(6) 4412(2) 3875(1) 10247(1) 49(1)
C(7) 3290(2) 4470(1) 10283(1) 51(1)
C(8) 2522(1) 4722(1) 9125(1) 48(1)
C(9) 2846(2) 4383(1) 7937(1) 58(1)
C(10) 3969(2) 3788(1) 7900(1) 55(1)
C(16)
C(17)
6914(2)
6414(2)
2822(1)
2534(1)
6714(1)
5485(1)
47(1)
58(1)
C(18)
C(19)
C(20)
C(21)
6495(2)
7960(2)
8467(2)
7939(2)
2906(1)
3556(1)
3842(1)
3480(1)
4380(1)
45008(2)
5718(2)
6821(2)
85(1)
96(1)
93(1)
71(1)
N(1) 5909(1) 2926(1) 8995(2) 47(1)
N(11) 1352(1) 5372(1) 9147(2) 59(1)
O(12) 1185(1) 5732(1) 10186(2) 75(1)
O(13) 574(1) 5526(1) 8133(2) 79(1)
O(14)
O(15)
7126(1)
7629(1)
2672(1)
963(1)
11078(2)
9172(2)
80(1)
87(1)
SÍNTESIS Y CARACTERIZACIÓN DE MONO-β-LACTAMAS COMO PRECURSORES DE β-AMINOACIDOS
MIRANDA GONZÁLEZ JOSÉ ALBERTO Página 75
A. Microplaca con el antibiótico testigo (AMP)
B. Microplaca con DMSO al 1%
C. Microplaca con la mono-β-lactama 2a
15.-Pruebas de Sensibilidad Antimicrobiana: Evaluación de la potencial actividad
antibiótica de la mono-β-lactama 2a.