skrypt harpera.pdf

158
BIOCHEMIA Skrypt dla studentów medycyny opracowany na podstawie „Biochemii Harpera” Michu ® Wrocław 2008 Wersja 1.0

Transcript of skrypt harpera.pdf

  • BIOCHEMIA

    Skrypt dla studentw medycyny opracowany na podstawie

    Biochemii Harpera

    Michu Wrocaw 2008 Wersja 1.0

  • - - 2

  • - - 3

    SPIS TRECI

    Rozdzia I Aminokwasy, peptydy, biaka

    1. Aminokwasy a) budowa, b) nazewnictwo i wzory, c) klasyfikacja, d) funkcje, e) waciwoci fizyczne, f) waciwoci chemiczne reakcje aa, g) techniki rozdziau

    2. Peptydy a) synteza i waciwoci wizania peptydowego, b) nazewnictwo, podzia i funkcje peptydw, c) przykady peptydw aktywnych biologicznie

    3. Biaka a) klasyfikacja, b) identyfikacja, c) poziomy organizacji i fadowanie, d) rozdzia i okrelanie struktury biaek, e) zwizek budowy i funkcji biaek fibrylarnych i globularnych

    Rozdzia II Struktura i funkcje enzymw

    1. Ogle waciwoci enzymw a) klasyfikacja i nazewnictwo, b) centrum katalityczne, c) koenzymy i witaminy bdce ich prekursorami, d) swoisto dziaania enzymw, e) aktywno enzymw, jednostki aktywnoci, f) kompartmentacja komrkowa enzymw, g) izoenzymy, h) izolacja enzymw

    2. Mechanizmy dziaania enzymw a) typy reakcji enzymatycznych przy dwch substratach, b) mechanizm dziaania chymotrypsyny, c) mechanizm dziaania fruktozo-2,6-bisfosfatazy, d) mechanizm dziaania transaminaz, e) kataliza kwasowo zasadowa (k-z), f) enzymy wymagajce atomw metali

    3. Kinetyka reakcji enzymatycznych a) oglne zasady kinetyki reakcji chemicznych, b) kinetyka katalizy enzymatycznej; czynniki wpywajce na szybko reakcji enzymatycznej, c) wpyw stenia substratu na szybko reakcji, d) zjawisko kooperatywnoci, e) inhibicja odwracalna i nieodwracalna

    4. Regulacja aktywnoci enzymw a) regulacja iloci enzymu, b) regulacja aktywnoci katalitycznej enzymu

    5. Znaczenie diagnostyczne pomiarw aktywnoci enzymw a) enzymy indykatorowe, ekskrecyjne i sekrecyjne, b) enzymy najczciej oznaczane w praktyce klinicznej, c) panele enzymatyczne, d) diagnostyka enzymatyczna w onkologii

    Rozdzia III Transport przez bony i utleniania biologiczne

    1. Budowa i funkcje bon biologicznych a) skad bon, b) funkcje bon

    2. Transport przez bony biologiczne klasy biaek transportujcych a) kanay jonowe, b) przenoniki transbonowe translokazy, c) pompy jonowe, d) wymienniki

    3. Oksydoreduktazy, ich kofaktory i grupy prostetyczne a) klasyfikacja oksydoreduktaz, b) kofaktory i grupy prostetyczne przenoszce protony i elektrony

    4. Transport atomw wodoru przez bon mitochondrialn 5. acuch oddechowy 6. Fosforylacja oksydacyjna 7. Reaktywne formy tlenu (RFT) 8. Utlenianie mikrosomalne 9. Cykl kwasw trjkarboksylowych (TCA)

    a) reakcje cyklu, b) bilans energetyczny cyklu, c) powizania z innymi szlakami amfiboliczno cyklu, d) regulacja cyklu

    10. Kompleks oksydazy -ketokwasw Rozdzia IV Wglowodany

    1. Budowa chemiczna, waciwoci i funkcje cukrw prostych i zoonych a) monosacharydy, b) disacharydy, c) polisacharydy

    2. Trawienie wglowodanw i jego zaburzenia 3. Wchanianie i transport wglowodanw

    a) transport aktywny i bierny, biaka transportujce, b) zrnicowanie tkankowe transportu, c) rola insuliny, d) rola fosforylacji monosacharydw

    4. Metabolizm glukozy

  • - - 4

    a) glikoliza (szlak EMP), b) glukoneogeneza, c) szlak pentozofosforanowy (szlak WDH, PPP), d) niektre zaburzenie przemian glukozy

    5. Metabolizm glikogenu a) glikogenogeneza, b) glikogenoliza, c) regulacja glikogenogenezy i glikogenolizy, d) glikogenozy

    6. Inne szlaki metabolizmu monosacharydw a) szlak kwasu uronowego, b) metabolizm fruktozy, c) metabolizm galaktozy

    7. Metabolizm heteroglikanw a) aminocukry heksozoaminy, b) glikoproteiny, c) proteoglikany, d) mukopolisacharydozy

    8. Regulacja przemiany wglowodanw a) zrnicowanie tkankowe przemiany wglowodanowej i integracyjna rola wtroby, b) kontrola stenie glukozy we krwi i hormonalna regulacja metabolizmu wglowodanw

    Rozdzia IV Lipidy

    1. Budowa chemiczna, podzia i rola tuszczw prostych i zoonych a) funkcje tuszczw, b) podzia lipidw, c) kwasy tuszczowe, d) triglicerydy (TG), e) fosfolipidy, f) glikolipidy, g) steroidy, h) poliprenoidy

    2. Trawienie i wchanianie lipidw 3. Transport lipidw w chonce i w osoczu

    a) budowa lipoprotein, b) transport lipidw w lipoproteinach osocza, c) zaburzenia transportu lipoproteinowego, d) rola wtroby w metabolizmie lipidw

    4. Tkanka tuszczowa rola w metabolizmie lipidw a) metabolizm adipocytw, b) regulacja, c) brunatna tkanka tuszczowa

    5. Utlenianie kwasw tuszczowych a) lokalizacja komrkowa i tkankowa, b) aktywacja i transport KT do mitochondrium, c) -oksydacja nasyconych KT, d) oksydacja nienasyconych KT, e) ketogeneza, f) zaburzenia oksydacji KT

    6. Lipogeneza synteza kwasw tuszczowych a) lokalizacja i transport substratw, b) przebieg lipogenezy, c) synteza nienasyconych KT, d) metabolizm eikozanoidw

    7. Synteza trjglicerydw a) lokalizacja tkankowa i komrkowa, b) przebieg syntezy

    8. Cholesterol a) biosynteza cholesterolu, b) trawienie i wchanianie cholesterolu, c) rwnowaga cholesterolu i endocytoza LDL, d) wydalanie cholesterolu, e) miadyca

    9. Kwasy ciowe 10. Kalcyferole 11. Hormony sterydowe

    Rozdzia VI Przemiana azotowa: aminokwasy, nukleotydy, porfiryny

    1. Trawienie biaek w przewodzie pokarmowym a) enzymy i ich specyficzno, b) transport azotu pomidzy tkankami

    2. Oglna przemiana aminokwasw i metabolizm grupy aminowej a) transaminacja, b) dezaminacja, c) transport, d) eliminacja

    3. Metabolizm poszczeglnych aminokwasw a) Asp, b) Asn, c) Glu, d) Gln, e) Ala, f) Gly, g) Ser, h) Pro, i) Hyp, j) Arg, k) Orn, l) Cys, m) Phe, n) Tyr, o) Lys, p) Hyl, q) His, r) Thr, s) Met, t) Trp, u) Val, Leu i Ile

    4. Przemiana nukleotydw a) trawienie kwasw nukleinowych w przewodzie pokarmowym, b) budowa nukleotydw, c) biosynteza nukleotydw purynowych, d) degradacja puryn, e) odzysk puryn, f) synteza nukleotydw pirymidynowych, g) degradacja pirymidyn, h) kwas foliowy; zaburzenia przemiany nukleotydw

    5. Metabolizm porfiryn a) synteza hemu, b) rozkad hemu, c) zaburzenia metabolizmu porfiryn

    Rozdzia VII Biochemia funkcjonalna tkanek

    1. Endogenne regulatory procesw metabolicznych a) regulacja metabolizmu przez hormony, mechanizmy regulacji, receptory, przekaniki wtrne, b) eikozanoidy budowa, powstawanie i funkcje metaboliczne

    2. Gospodarka wapniowo fosforanowa w organizmie i jej regulacja a) rola wapnia oraz biaek wicych wap, b) regulacja przemiany wapniowej, c) rola fosforanu nieorganicznego, regulacja przemiany fosforanowej, powizania z gospodark wapniow

    3. Gospodarka elazem w organizmie wchanianie, regulacja, zaburzenia przemiany

  • - - 5

    4. Biochemia krwi a) biaka osocza i ich rola, b) struktura i funkcja erytrocytw, c) budowa i metabolizm leukocytw na przykadzie neutrofili, d) budowa i metabolizm trombocytw, e) hemostaza osoczowa

    5. Biochemia wtroby a) rola tkanki wtrobowej, b) przemiana wglowodanowa, lipidowa i azotowa w wtrobie, c) wtroba jako gruczo zewntrzwydzielniczy, d) procesy biotransformacji i detoksykacji

    6. Biochemia nerek a) funkcje i regulacja, b) skad i waciwoci moczu w normie i w patologii

    7. Biochemia mini a) budowa i charakterystyka biaek mini, b) mechanizm skurczu minia

    8. Biochemia tkanki cznej a) skadniki tkanki cznej, ich budowa i funkcja, b) synteza kolagenu reakcje i regulacja procesu, c) biochemia koci

    9. Biochemia zmysu wzroku a) rola i przemiany karotenoidw w organizmie czowieka, b) reakcje zachodzce w procesie fotorecepcji

    Rozdzia VIII Kwasy nukleinowe i biosynteza biaek

    1. Budowa i waciwoci kwasw nukleinowych; struktura i organizacja chromatyny a) elementy skadowe kwasw nukleinowych zasady azotowe, nukleozydy i nukleotydy, b) budowa przestrzenna i waciwoci DNA, c) budowa, waciwoci i klasyfikacja RNA, d) budowa chromatyny, e) chromatyna aktywna i nieaktywna, f) sekwencje powtarzajce; mutacje dynamiczne; konwersja genu, g) rekombinacja (crossing-over); wymiana chromatyd siostrzanych, h) gen i jego ekspresja; genom, i) transpozony; geny przeksztacone, j) motywy funkcjonalne biaek wicych si z DNA

    2. Replikacja i naprawa DNA; cykl komrkowy i jego regulacja a) inicjacja, b) elongacja, c) terminacja, d) regulacja replikacji i cykl komrkowy, e) naprawa DNA

    3. Synteza RNA (transkrypcja) i jego modyfikacje a) transkrypcja u Procariota, b) rnice w transkrypcji u Eucariota, c) geny podzielone; snRNA; skadanie mRNA, d) modyfikacje potranskrypcyjne mRNA; redagowanie RNA, e) transkrypcja genw tRNA i rRNA

    4. Translacja biosynteza biaek a) kod genetyczny, b) budowa tRNA i aktywacja aa, c) budowa i funkcje rybosomw, d) etapy translacji, e) regulacja i inhibitory translacji, f) potranslacyjne modyfikacje biaek

    5. Mitochondrialne DNA (mtDNA)

  • - - 6

  • - - 7

    ROZDZIA I AMINOKWASY, PEPTYDY I BIAKA

    1. Aminokwasy

    a) budowa

    Aminokwasy (ang. aminoacids = aa), jak sama nazwa wskazuje, nale do dwufunkcyjnych pochodnych wglowodorw, zawierajcych w czsteczce grup karboksylow oraz aminow. Oglnie rzecz biorc, wzgldne pooenie obu tych grup moe by dowolne, jednak zdecydowanie najwiksze znaczenie posiadaj -L-aminokwasy, ze wzgldu na to, i wchodz w skad peptydw i biaek. Okrelenie -aminokwasy oznacza, i obie gwne grupy funkcyjne przyczone s do tego samego, I-rzdowego atomu wgla; wynika std ich wzr oglny postaci: H2N-CH(R)-COOH, gdzie R jest fragmentem zmiennym, charakterystycznym dla kadego aa i decydujcym o jego waciwociach. Aa mog rwnie ulega w organizmie rozmaitym modyfikacjom, np. hydroksylacji (4-hydroksy-Pro, 5-hydroksy-Lys), karboksylacji (-karboksy-Glu), metylacji, formylacji, acetylacji (N-Ac-Glu), prenylacji, fosforylacji i innym.

    b) nazewnictwo i wzory

    Kady aa biakowy posiada nazw systematyczn, wynikajc z jego budowy chemicznej, jak rwnie zwyczajow. W praktyce posuguje si wycznie tymi drugimi, jak rwnie ich skrtami trj- oraz jednoliterowymi. Nazwy zwyczajowe aa biakowych, ich skrty oraz wzory strukturalne przedstawia ponisza tabela.

    Lp. Nazwa zwyczajowa i skrty Wzr strukturalny

    1. glicyna, Gly, G

    2. alanina, Ala, A

    3. walina, Val, V

    4. leucyna, Leu, L

    5. izoleucyna, Ile, I

    6. seryna, Ser, S

    7. treonina, Thr, T

    8. cysteina, Cys, C

  • - - 8

    9. metionina, Met, M

    10. kwas asparaginowy, Asp, D

    11. asparagina, Asn, N

    12. kwas glutaminowy, Glu, E

    13. glutamina, Gln, Q

    14. arginina, Arg, R

    15. lizyna, Lys, K

    16. histydyna, His, H

    17. fenyloalanina, Phe, F

    18. tyrozyna, Tyr, Y

    19. tryptofan, Trp, W

    20. prolina, Pro,

    c) klasyfikacja

    Aa klasyfikuje si ze wzgldu na rozmaite kryteria: Ze wzgldu na udzia w syntezie peptydw wyrnia si aa biakowe i niebiakowe. Kady aa biakowy

    posiada co najmniej jeden kodon kodujcy go ukad 3 nukleotydw w mRNA; list 20 aa biakowych zawiera powysza tabela. Aa niebiakowe nie s zawarte w informacji genetycznej, powstaj za w wyniku modyfikacji aa biakowych. Dalsze kryteria klasyfikacji odnosz si wycznie do aa biakowych.

  • - - 9

    Ze wzgldu na polarno rodnika (R) aa biakowe dzieli si na: ! aa z R niepolarnym: G, A, V, L, I, P, F, ! aa z R polarnym niejonizujcym: S, T, Y, C, M, Q, N, W, ! aa z R polarnym jonizujcym:

    " kwane: D, E, " zasadowe: K, R, H.

    Ze wzgldu na budow chemiczn R: ! aa z R alifatycznym: G, A, V, L, I, ! aa z R zawierajcym grup hydroksylow: S, T, Y, ! aa z R zawierajcym atom siarki: C, M, ! aa z R zawierajcym grupy kwasowe lub ich amidy: D, E, N, Q, ! aa z R zawierajcym grupy zasadowe: K, R, H, ! aa z R zawierajcym piercie aromatyczny: F, Y, W, H, ! aa o charakterze iminokwasw: P. Ze wzgldu na zdolno organizmu ludzkiego do ich syntezy, aa dzieli si na endo- i egzogenne. ! Aa endogenne s syntetyzowane przez ludzkie hepatocyty i nie wymagaj dostarczania ich z

    pokarmem. Nale do nich: G, A, P, S, Y, D, E, N, Q. ! Aa egzogenne (niezbdne, niezastpione) nie s syntetyzowane w ludzkim ustroju, a ich obecno i

    odpowiednie stenie w biakach spoywczych decyduje o ich wartoci odywczej. S to: V, L, I, F, T, M, W, K, R, H (histydyna jest niezbdna dla dzieci do lat 12, ale nie jest niezbdna dla dorosych).

    Ze wzgldu na produkty metabolizmu wyrnia si: aa glikogenne, metabolizowane do prekursorw wglowodanw oraz aa ketogenne, metabolizowane do cia ketonowych. (patrz rwnie punkt V-3)

    d) funkcje

    Najwaniejsz funkcj aa jest wzajemne czenie si, w wyniku czego powstaj czsteczki o wyszych

    poziomach organizacji peptydy, polipeptydy oraz biaka (tworzenie wizania peptydowego omwione jest dalej). Ponadto aa bior udzia w takich procesach fizjologicznych jak: przekanictwo w ukadzie nerwowym (Gly, Glu, Asp, GABA), regulacja procesw wzrostu komrki (Phe i Tyr substraty do syntezy T3/4), biosynteza zasad azotowych, porfiryn i mocznika (Orn, Cyt, Arg-bursztynian) oraz transdukcja sygnaw wewntrzkomrkowych (odwracalna fosforylacja Ser, Thr i Tyr).

    e) waciwoci fizyczne

    W warunkach naturalnych aa maj posta krystalicznych cia staych; nie absorbuj wiata widzialnego, dlatego s bezbarwne (mona je wybarwi i uwidoczni specjalnymi metodami, o czym pniej).

    Z wyjtkiem glicyny wszystkie -aa wykazuj czynno optyczna, tzn. ich roztwory skrcaj paszczyzn wiata spolaryzowanego. Wykazuj rwnie izomeri optyczn, tworzc szeregi konfiguracyjne D i L. Skadnikami biaek s wycznie L-aa, co oznacza, i numeracja podstawnikw przy chiralnym atomie wgla (C) wg kryterium masy ronie przeciwnie do ruchu wskazwek zegara. Cho wykazano wystpowanie D-aa (Ser, Asp), w ukadzie nerwowym ssakw, to nie wchodz one w skad peptydw i biaek; ponadto D-aa wystpuj w cianach komrkowych niektrych bakterii (Ala, Glu) oraz w antybiotykach.

    Wikszo aa jest dobrze rozpuszczalna w wodzie i tworzy roztwory, w ktrych wykazuje charakter na og obojtny. Dziki obecnoci w czsteczce zarwno grupy karboksylowej o charakterze kwanym, jak i aminowej o charakterze zasadowym, aa mog tworzy wewntrzne sole wystpowa w postaci jonw obojnaczych (H3N+-CH(R)-COO-) i tworzy krysztay jonowe. Tumaczy to polarn i krystaliczn struktur aa, z czego wynikaj wysokie temperatury topnienia (dalsze ogrzewanie prowadzi do rozkadu).

    Moliwe formy jonowe aa bez bocznych grup hydrolizujcych przedstawione s poniej: R-CH(N(+)H3)-COOH K1 R-CH(N(+)H3)-COO- K2 R-CH(NH2)-COO-

    (I) pH < pI (II) pI (III) pH > pI Krzywa miareczkowania takiego aa skada si z dwch sigmoidalnych czci, rozdzielonych punktem izoelektrycznym: pH = pK1 + log [II]/[I] dla pH < pI

    pK2 + log [III]/[II] dla pH < pI Przez punkt izoelektryczny (pI) rozumiemy warto pH, w ktrej aa wystpuje niemal w caoci w postaci jonu obojnaczego, nie wdruje w polu elektrycznym i cechuje si minimaln moliw rozpuszczalnoci w wodzie. pI to innymi sowy warto pH w punkcie pomidzy wartociami pK po obydwu stronach form izojonowych (jonu obojnaczego) std dla aa z R niepolarnym pI = x (pK1 + pK2).

  • - - 10

    Jeeli chodzi o aa z rodnikiem polarnym i jonizujcym, sytuacja przedstawia si odmiennie dla kwasw oraz zasad. W przypadku kwasu najpierw tracony jest proton z wasnej reszty karboksylowej, nastpnie z grupy bocznej, a na samym kocu z wasnej grupy aminowej; wobec tego pI oblicza si podobnie jak dla aa z R niepolarnym, czyli: pI = x (pK1 + pK2). Natomiast w przypadku zasady najpierw tracony jest proton z reszty karboksylowej, nastpnie z grupy bocznej, a ostatecznie z wasnej grupy aminowej; wyraenie opisujce pI przyjmuje zatem posta: pI = x (pK2 + pK3).

    f) waciwoci chemiczne reakcje aa

    Aa posiadaj kilka grup funkcyjnych -aminow, -karboksylow oraz reaktywne grupy w obrbie R (niektre aa) dziki czemu mog ulega wielu rozmaitym przemianom.

    Reakcje grupy karboksylowej: ! dysocjacja i tworzenie soli (aa + zasada):

    H2N-CH(R)-COOH OH- H2N-CH(R)-COO- H2N-CH(R)-COOH + NaOH H2N-CH(R)-COONa (sl sodowa aa)

    ! tworzenie estrw (aa + alkohol): H2N-CH(R)-COOH + R1-OH H2N-CH(R)-CO-O-R1

    ! tworzenie amidw ! tworzenie bezwodnikw kwasowych ! dekarboksylacja (pod wpywem ogrzewania lub enzymatycznie):

    H2N-CH(R)-COOH T, -CO2 R-CH2-NH2 Reakcje grupy aminowej: ! dysocjacja i tworzenie soli:

    H2N-CH(R)-COOH H+ H3N+-CH(R)-COOH H2N-CH(R)-COOH + HCl Cl-H3N+-CH(R)-COOH = HCl.H2N-CH(R)-COOH (chlorowodorek aa)

    ! estryfikacja, acylacja, N-formylacja ! dezaminacja (g. enzymatyczna):

    H2N-CH(R)-COOH R-CO-COOH (ketokwas) Grupa hydroksylowa (Ser, Thr, Tyr) estryfikacja Grupa sulfhydrylowa (Cys): ! utlenianie

    " do cystyny: 2 Cys-SH -2H Cys-S-S-Cys " do kwasu cysteinowego (przez silne utleniacze, np. kwas nadmrwkowy):

    Cys HCOOOH HO2S-CH2-CH(NH2)-COOH ! alkalizacja Jeeli grupa aminowa znajduje si w dalekim pooeniu w stosunku do grupy karboksylowej (tj. przy

    C4-C6), wwczas w wyniku ogrzewania nastpuje wewntrzna cyklizacja i powstaj cykliczne amidy laktamy. Np. kwas 6-aminoheksanowy tworzy kaprolaktam, bdcy surowcem do produkcji poliamidw.

    Jak wczeniej wspomniano, aa maj posta bezbarwnych cia staych. Mona jej jednak wybarwi poprzez reakcj z ninhydryn. Jest to reakcja charakterystyczna aa, pozwalajca na ich identyfikacj. Jej produktami s aldehydy poch. od aa oraz zoony barwnik, ktrego anion posiada intensywnie purpurow barw.

    Reakcja powstawania i charakterystyka wizania peptydowego patrz punkt I-2-a.

  • - - 11

    g) techniki rozdziau

    Skad mieszaniny aa, np. pochodzcej z hydrolizy peptydu, mona okreli za pomoc chromatografii lub elektroforezy.

    Istot chromatografii jest rozdzia skadnikw midzy faz stacjonarn a ruchom, spowodowany ich silniejszym wizaniem si z jedn z tych faz. Istnieje kilka rodzajw chromatografii.

    Chromatografia bibuowa jest najprostsza do przeprowadzenia, gdy nie wymaga specjalnego sprztu. Kropl roztworu zawierajc aa nanosi si na pasek bibuy (std nazwa), ktry nastpnie umieszcza si w szczelnym naczyniu, tak i koniec paska styka si z rozpuszczalnikiem. Ten stopniowo wdruje wzdu paska, wcigany przez higroskopijn struktur bibuy. Po przepywie rozpuszczalnika do koca pasek suszy si oraz identyfikuje (wybarwia) aa przez dodanie roztworu ninhydryny powstaj w ten sposb purpurowe plamy. Pozycja plamy danego aa, uwarunkowana jego ruchliwoci chromatograficzn, zaley od jego wzgldnej polarnoci aa z R niepolarnymi i dugimi wdruj na pasku dalej ni aa z R krtszymi lub polarnymi. Dla kadego aa mona wyznaczy jego wzgldn ruchliwo (Rf), definiowan jako stosunek odlegoci przebytej przez dany aa do odlegoci przebytej przez czoo rozpuszczalnika.

    Chromatografia cienkowarstwowa (ang. thin-layer chromatography = TLC) dzieli si na podziaow (partition TLC = PTLC) oraz adsorpcyjn (adsorption TLC = ATLC).

    ! W PTLC wykorzystuje si rozdzia skadnikw mieszaniny pomidzy faz stacjonarn oraz ciek ruchom, ktre dodatkowo rni si polarnoci.

    " W typowej PTLC faza stacjonarna jest bardziej polarna, za rozpuszczalnik zawiera zarwno skadniki polarne, jak i mao polarne. Wraz z przesuwem rozwijacza nad nonikiem zmienia si skad rozpuszczalnika, gdy jego bardziej polarne skadniki wi si z polarnymi grupami hydroksylowymi celulozy wskutek tego przesuwajce si czoo rozpuszczalnika staje si stopniowo coraz mniej polarne. W typowej PTLC sabiej polarne skadniki mieszaniny wdruj wic dalej od polarnych podobnej wielkoci.

    " W PTLC w fazie odwrconej polarno faz oraz szybko wdrwki skadnikw prby s odwrotne ni powyej faza stacjonarna jest mniej polarna, a faza ruchoma utrzymuje swoj polarno. Dlatego polarne skadniki mieszaniny wdruj z czoem rozpuszczalnika, a mniej polarne pozostaj z tyu.

    ! W ATLC wykorzystuje si adsorpcj skadnikw prby na praonym elu krzemionkowym. Faza ruchoma eluuje (wymywa) zaadsorbowane skadniki, wspzawodniczce o miejsce wizania na elu skadniki sabiej zwizane wymywane s w pierwszej kolejnoci.

    Klasyczna chromatografia kolumnowa przeprowadzana jest w kolumnie szklanej, wypenionej ciliwym zoem, w warunkach wykluczajcych stosowanie wysokich cinie; ogranicza to maksymaln szybko przepywu rozpuszczalnika, a tym samym szybko caego procesu chromatografii. Udoskonaleniem tej metody jest wysokosprawna chromatografia cieczowa (ang. high performance liquid chromatography = HPLC), prowadzona w kolumnach ze stali nierdzewnej, wypenionych mniejszymi i bardziej jednorodnymi czsteczkami nieciliwego wymiennika jonowego, sita molekularnego lub zoa stosowanego w chromatografii oddziaywa hydrofobowych. Bywa rwnie okrelana jako wysokocinieniowa, gdy wartoci uywanych cinie osigaj wartoci 5 10 tys. psi. Do jej zalet naley znaczne skrcenie czasu rozdziau, co ogranicza dyfuzj boczn i zapewnia lepszy rozdzia skadnikw prby. Rozdzia aa metod HPLC uwzgldnia ich reakcj z odczynnikiem umoliwiajcych ich identyfikacj i ocen ilociow. Reakcj t przeprowadza si albo przed (pre-column) albo po (post-column) waciwej chromatografii. Przy barwieniu post-column uywa si znanej ju ninhydryny, ktra tworzy barwne zwizki indygowe (pochaniajce promieniowanie z zakresu wiata widzialnego). Z kolei przy barwieniu pre-column uywa si odczynnika okrelanego skrtem AQC, ktry wykazuje zdolno fluorescencji aa identyfikuje si wic przez owietlenie lamp UV.

    Elektroforeza wysokonapiciowa (ang. high-voltage electrophoresis = HVE) suy do rozdzielania mieszanin amfolitw, czyli czsteczek, ktrych wypadkowy adunek zaley od pH otoczenia. Zaliczamy tu m. in. aa, polipeptydy, nukleotydy, fosfosacharydy i inne. Prbki nanosi si na nonik zwilony buforem o odpowiednim pH i nastpnie umieszcza w polu elektrycznym. Wwczas kationy wdruj do katody, a aniony do anody, przy czym szybko wdrwki skadnikw zaley od ich adunku elektrycznego (wprost proporcjonalnie) oraz od masy czsteczkowej (odwrotnie proporcjonalnie). Po zakoczeniu rozdziau produkty uwidacznia (wybarwia) si odpowiednim odczynnikiem.

    ! Rozdzia aa prowadzi si na bibule lub cienkowarstwowej pytce pokrytej sproszkowan celuloz, a wybarwia roztworem ninhydryny.

    ! Rozdzia polipeptydw i biaek prowadzi si na usieciowanym elu poliakrylamidowym (PAG).

  • - - 12

    ! Do rozdziau oligomerw nukleotydowych uywa si agarozy i PAG, do wybarwiania produktw suy za bromek etydyny (identyfikacja w wietle UV).

    2. Peptydy a) synteza i waciwoci wizania peptydowego

    Tworzenie wizania peptydowego jest najistotniejsz reakcj aa z biologicznego punktu widzenia. Polega ono na kondensacji dwch aa, a dokadniej na reakcji grupy karboksylowej jednego aa z grupa aminow drugiego aa, czemu towarzyszy eliminacja czsteczki wody:

    ...-COOH + H2N-... -H2O ...-CO-NH-... Staa rwnowagi powyszej reakcji jest przesunita na korzy hydrolizy wizania peptydowego. Jego

    powstanie musi by zatem poprzedzone aktywacj grupy karboksylowej laboratoryjnie osiga si to przez przeksztacenie aa w chlorek kwasowy, za w organizmach ywych aa ulega kondensacji z ATP, tworzc aktywny aminoacyloadenylan (patrz punkt VIII-4-b).

    Wizanie peptydowe moe wystpowa w formie ketonowej (-CO-NH-), bd enolowej (-CO(-)=N(+)H-), ktre wzajemnie w siebie przechodz (zjawisko to okrelane jest jako tautomeria keto-enolowa). Stabilizacja rezonansowa wizania peptydowego nadaje mu charakter czciowo (ok. 40%) wizania podwjnego. Ma to daleko idce konsekwencje wie si bowiem ze skrceniem dugoci i usztywnieniem wizania oraz zablokowaniem wok niego rotacji przylegych atomw. Sprawia to, i wszystkie 4 atomy tworzce wizanie (C, O, N, H) znajduj si w jednej paszczynie (tzn. s koplanarne) i pozbawione s moliwoci wzajemnego ruchu. To z kolei umoliwia wystpowanie izomerii geometrycznej wzgldem atomu tlenu: cis (Z) i trans (E), przy czym fizjologicznie wyranie dominuje ta druga. Rotacja moe odbywa si jedynie wok wiza C-C oraz N-C. Charakter tej rotacji opisuj ilociowo tzw. kty torsyjne: (C-C) i (N-C). Maj one okrelone wartoci dla uporzdkowanych struktur II-rzdowych (por. dalej).

    Wizanie peptydowe nie posiada adunku w adnym istotnym fizjologicznie pH. Pomimo to peptydy s w fizjologicznym pH obdarzone adunkiem elektrycznym dziki adunkom ich grup kocowych (karboksylowej i aminowej) oraz polarnych grup R. Warto tego adunku zaley od wartoci pK i otoczenia grup dysocjujcych oraz od pH otoczenia. Podobnie jak kademu aa mona przyporzdkowa pI, tak kademu peptydowi odpowiada punkt izojonowy warto pH, przy ktrej liczba protonw zwizanych z grupami zasadowymi jest rwna liczbie protonw odszczepionych przez grupy kwasowe (wyrwnanie liczby adunkw). Wasno ta dotyczy czystych peptydw, a warto jest dla danego zwizku staa i charakterystyczna.

    Wizanie peptydowe nie absorbuje promieniowania z zakresu widzialnego, tote nie nadaje zawierajcym je zwizkom barwy. Pochania natomiast promieniowanie UV z zakresu = 220-230 nm.

    Obecno wizania peptydowego, poczwszy od trjpeptydw, mona wykaza za pomoc reakcji biuretowej. Nazwa ta pochodzi od biuretu (H2N-CO-NH-CO-NH2) najprostszego zwizku dajcego pozytywny wynik wspomnianej reakcji. Przeprowadza si j dodajc do prby zasadowego roztworu siarczanu miedzi (CuSO4) wynik pozytywny objawia si intensywnie fioletowym zabarwieniem.

    b) nazewnictwo, podzia i funkcje peptydw

    W kadym peptydzie wyrniamy dwa koce aminowy (N) oraz karboksylowy (C), zalenie od rodzaju

    wystpujcej na nim wolnej grupy funkcyjnej. Jeli chodzi o nazewnictwo, obowizuje zasada podawania kolejnoci aa od N-koca do C-koca. Peptydy traktuje si jako acyloaminokwasy, wic kocwk nazwy aa, ktrego grupa karboksylowa jest podstawiona, zmienia si na -ylo. Jedynie aa znajdujcy si na C-kocu z woln grup karboksylow zachowuje niezmienion nazw. Np. Ile-Cys-Gly to izoleucylo-cysteinylo-glicyna. Wiele naturalnych peptydw zawiera zmodyfikowane aa lub nietypowe wizania.

    Ze wzgldu na ilo reszt aa wchodzcych w skad peptydu, wyrniamy: oligopeptydy (3-10; 3 trjpeptydy, 4 tetrapeptydy itd.), polipeptydy (10-100) oraz biaka (>100). Zgodnie z innym kryterium (masy) peptydy o masie

  • - - 13

    c) przykady peptydw aktywnych biologicznie

    Nie tylko wielkoczsteczkowe biaka o skomplikowanej i wielorzdowej strukturze, ale proste oligopetydy, zoone ze stosunkowo niewielkiej liczby aa, mog peni w organizmie wane i niezastpione funkcje. Omwione zostan wg liczby reszt aa.

    Istotnymi biologicznie dwupeptydami s: karnozyna, homokarnozyna i anseryna.

    ! Karnozyna, czyli N-(-alanylo)histydyna, w znacznych ilociach wystpuje w miniach

    szkieletowych wyszych krgowcw i czowieka. Wzmaga aktywno ATP-azy miozynowej oraz chelatuje jony Cu2+ i pobudza pobieranie zwizkw miedzi.

    ! Homokarnozyna, czyli N-(4-aminobutyrylo)histydyna, jest dwupeptydem orodkowego ukadu nerwowego, wystpujcym w tkance mzgowej, ktrego funkcja nie jest znana.

    ! Anseryna, czyli -metylokarnozyna lub N-(3-aminopropionylo)--metylohistydyna, wystpuje w miniach szkieletowych wyszych krgowcw, ktre odznaczaj si szybk czynnoci skurczow, np. minie koczyn krlika lub minie piersiowe ptakw. Brak anseryny w miniach czowieka. U niszych krgowcw, np. u ryb kostnoszkieletowych wystpuje ona w znacznych ilociach, w porwnaniu ze ladow iloci karnozyny.

    Aktywnym trjpeptydem jest tyreoliberyna (TRH) produkowana przez podwzgrze stanowi czynnik

    uwalniajcy tyreotropin z przedniego pata przysadki. Jej pena nazwa to: piroglutamylohistydyloprolinoamid. Skada si z reszt aminokwasowych Glu, His i Pro, przy czym N-kocowy kwas glutaminowy ulega wewntrznej cyklizacji o kwasu piroglutaminowego, za C-kocowa grupa karboksylowa proliny wystpuje jako amid kwasowy.

    Innym aktywnym trjpeptydem, penicym rol biologicznego ukadu redox, jest glutation, czyli -glutamylocysteinyloglicyna. Zawiera on reszty Glu, Cys i Gly, przy czym Glu czy si z Cys wizaniem nie--peptydowym wizanie peptydowe tworzy nie grupa karboksylowa przy asymetrycznym C1, lecz przy C3. Glutation wystpuje w komrkach w stosunkowo duych ilociach rzdu 5 mM. Obecny jest w postaci dwch form utlenionej i zredukowanej, przy czym tej drugiej jest zazwyczaj okoo 500 razy wicej. Glutation peni rol buforujc stanowic bufor hydrosulfidowy. Peni rwnie role odtruwajc, poniewa jest przeciwutleniaczem reagujcym z nadtlenkiem wodoru i nadtlenkami organicznymi, unieszkodliwiajc te uboczne i toksyczne produkty metabolizmu.

  • - - 14

    Do aktywnych piciopeptydw zaliczamy enkefalin metioninow i leucynow. Pierwsza ma posta: Tyr-Gly-Gly-Phe-Met, druga za: Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu rni si zatem jedynie C-kocowym aminokwasem, uwzgldnionym w nazwie. Wraz z endorfinami (, , ) grup polipeptydw o 20-30 resztach aminokwasowych stanowi one naturalne peptydy opioidowe, przeciwblowe, o dziaaniu podobnym do morfiny, lecz silniejszym 18-20 razy.

    Aktywnym omiopeptydem jest angiotensyna II (hipertensyna), powstajca z osoczowego

    angiotensynogenu pod wpywem reniny wydzielanej w nerkach, a nastpnie pod wpywem dziaania enzymu konwertujcego. Skutkiem dziaania reniny na angiotensynogen jest powstanie dziesiciopepetydu angiotensyny I, z ktrej pod wpywem wspomnianego enzymu powstaje angiotensyna II. Ma ona struktur: Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe. Angiotensyna zwa naczynia krwionone i jest najsilniejszym czynnikiem podwyszajcym cinienie krwi. Pobudza kor nadnerczy do syntezy aldosteronu, ktry zwiksza resorpcj zwrotn jonu Na+ w nerkach, przeciwdziaajc ich utracie z moczem.

    Bradykinina to dziewiciopeptyd rozszerzajcy naczynia krwionone i obniajcy cinienie krwi, dziaa

    zatem antagonistycznie do angiotensyny II. Odpowiedzialna jest rwnie za uczucie blu towarzyszce zranieniu skory. Ma posta: Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg. Bradykinina stanowi typowa kinin powstajc ze specjalnych biaek, kininogenw, nalecych do 2-globulin osocza pod wpywem swoistych enzymw proteolitycznych, zwanych kalikreinami.

    Dziwiciopeptydami wykazujcymi aktywno klasycznych hormonw s wazopresyna i oksytocyna,

    produkowane w podwzgrzu, a magazynowane w tylnym pacie przysadki. Maj prawie identyczn sekwencje aminokwasow, rni si jedynie dwoma aminokwasami, dlatego hormony te wywouj pewne wsplne efekty biologiczne. Wazopresyna czyli hormon antydiuretyczny (ADH) zwiksza wchanianie zwrotne wody w dystalnych kanalikach nerkowych. Niedobr ADH prowadzi do moczwki prostej. Oksytocyna stymuluje skurcze mini gadkich macicy (przez co rozpoczyna akcj porodow) i gruczou sutkowego.

    Niektre peptydy wykazuj aktywno biologiczn antybiotykw. Antybiotyki peptydowe maj bardzo charakterystyczn cykliczna struktur i mog zawiera D-aminokwasy.

  • - - 15

    Penicylina jest produkowana przez ple Penicillium, gdzie powstaje z Val i Cys, ktre tworz 4-czonowy piercie -laktamowy i 5-czonowy piercie tiazolidynowy. Do pierwszego z nich przyczana jest wizaniem peptydowym zmienna grupa kwasowa (R), ktra moe by rna i przez to wyrniamy rne rodzaje penicylin. Penicylina poprzez reaktywny piercie -laktamowy zawierajcy wizanie peptydowe nieodwracalnie hamuje transpeptydaz glikopeptydow kluczowy enzym w syntezie cian komrkowych bakterii. W praktyce najczciej uywa si penicyliny G.

    Symbol Nazwa penicyliny Wzr R F pentylopenicylina -CH2-CH=CH-CH2-CH3 G benzylopenicylina -CH2-C6H5 K heptylopenicylina -(CH2)6-CH3 V fenoksymetylopenicylna -CH2-O-C6H5 X hydroksybenzylopenicylina -CH2-C6H4-OH

    Aktynomycyna D pochodzi ze szczepu Streptomyces. W swej strukturze zawiera grup barwnikow

    (kwas fenoksazonodikarboksyowy), ktra poczona jest wizaniami peptydowymi z dwoma piciopeptydami. Kocowe grupy karboksylowe obu piciopeptydw tworz makrocykliczne piercienie laktonowe. W piciopeptydach wystpuje D-Val. Aktynomycyna D jest specyficznym inhibitorem syntezy RNA, czyli transkrypcji, zarwno w komrkach prokariotycznych, jak i eukariotycznych, dlatego czsto jest wykorzystywana w badaniach biochemicznych. Aktynomycyna D wie si specyficznie z 2-niciowym DNA, uniemoliwiajc jego uycie jako matrycy w syntezie RNA. Obnienie stenia mRNA prowadzi do hamowania syntezy biaka. Piercie fenoksazonowy aktynomycyny interkaluje, czyli wlizguje si pomidzy pary zasad CG w 2-niciowym DNA, natomiast cykliczne polipeptydy wystaj jeden ponad, a drugi pod piercieniem fenoksazonowym Symetria aktynomycyny D dokadnie odpowiada symetrii specyficznej sekwencji zasad CG. Ponadto aktynomycyna D ma dziaanie cytostatyczne, czyli hamuje podzia komrek, w tym komrek szybko dzielcych si, dlatego znalaza zastosowanie w leczeniu niektrych nowotworw.

    Walinomycyna ma struktur cykliczn, utworzon z aminokwasw i hydroksykwasw poczonych na przemian wizaniami estrowymi i peptydowymi. Skada si z trzykrotnie powtrzonego elementu, w skad ktrego wchodz reszty L-mleczanu (Lac), L-waliny, D-hydroksyizowalerianu (Hiv) i D-waliny. Walinomycyna jest jonoforowym antybiotykiem nonikowym, pod wpywem ktrego bony biologiczne staj si przepuszczalne dla jonu K+. Organizmy znajdujce si pod wpywem

  • - - 16

    antybiotykw jonoforowych pozbawione s moliwoci kontroli nad wymian skadnikw z otoczeniem. Walinomycyna koordynacyjnie wie jon K+ z 6 atomami tlenu reszt walin centralnej przestrzeni czsteczki i jako nonik przenosi je na drug stron bony.

    Gramicydyna S jest cyklicznym dziesiciopeptydem, w strukturze ktrego wystpuj 2 reszty D-fenyloalaniny.

    Gramicydyna A jest rwnie polipepetydowym antybiotykiem jonoforowym, zbudowanym z 15 naprzemiennie wystpujcych reszt L- i D-aminokwasowych, ktry na N-kocu posiada grup formylow. Przyjmuje struktur -helisy. Poprzez N-formylowe koce dwa takie polipeptydy cz si, tworzc dimeryczny, funkcjonalny kana jonowy dla kationw jednowartociowych, np. Na+, lecz nie dla dwuwartociowych. Kana ten spontanicznie otwiera si i zamyka, przepuszczajc w cigu sekundy ponad 107 kationw. Por tego kanau wycielony jest polarnymi grupami karboksylowymi peptydu, a hydrofobowe acuchy boczne ustawione s na obwodzie kanau. Uoenie to umoliwiaj zestawione naprzemiennie reszty L i D-aminokwasowe.

    3. Biaka a) klasyfikacja Ze wzgldu na ksztat czsteczki i rozpuszczalno w wodzie biaka dzieli si na: ! globularne o wspczynnikach osiowych 3-4, a wic w przyblieniu kuliste, dobrze rozp. w wodzie, ! fibrylarne o wspczynnikach osiowych > 10 (ksztat wyduony), nierozpuszczalne w wodzie. Ze wzgldu na stan skupienia dzieli si biaka na: stae (kolagen, elastyna), ppynne

    (cytoplazmatyczne) oraz pynne (biaka osocza). Ze wzgldu na budow czsteczki obecno dodatkowych skadnikw na: ! biaka proste (proteiny) zbudowane wycznie z aa i nie posiadajce dodatkowych elementw, m. in.:

    albuminy, globuliny, histony, protaminy, skleroproteiny, ! biaka zoone (proteidy) zawierajce dodatkowe skadniki niebiakowe, np. czsteczki

    wglowodanw (glikoproteiny), lipidw (lipoproteiny), reszt kwasu fosforowego (fosfoproteiny), atom metalu (metaloproteiny), czsteczk barwnika (chromoproteiny) lub zwizane z kwasem nukleinowym (nukleoproteiny).

    Ze wzgldu na penione w organizmie funkcje: ! enzymatyczne np. dehydrogenaza mleczanowa (LDH), transaminaza asparaginianowa (AspAT),

    cyklooksygenaza (COX), ! hormonalne np. hormony przedniego pata przysadki (GH, PRL, ACTH, TSH, FSH, LH), hormony

    trzustki (insulina, glukagon), parathormon (PTH), ! strukturalne np. kolagen, elastyna, keratyna, ! transportowe np. transferryna, hemoglobina (HGB), ceruloplazmina (CER), transkobalamina (TC), ! zapasowe np. mioglobina, ferrytyna, ! odpornociowe np. immunoglobuliny, biaka ukadu dopeniacza (C), biaka ostrej fazy, ! kurczliwe lub porednio biorce udzia w ruchu np. aktyna, miozyna, tropomiozyna, troponina, ! toksyny np. tcowa (tetanospazmina i tetanolizyna), botulinowa, toksyna cholery. Biaka pokarmowe dzieli si ze wzgldu na przydatno dla organizmu na: penowartociowe

    zawierajce aa egzogenne oraz niepenowartociowe zoone z aa endogennych.

  • - - 17

    b) identyfikacja

    Obecno biaka w rodowisku mona wykaza za pomoc kilku reakcji: Reakcja ksantoproteinowa (gr. ksantos ty, proteina biako) polega na dziaaniu na prb

    stonym kwasem azotowym (HNO3). Jeeli w prbie tej znajduje si biako zawierajce aa aromatyczne, to ulegn one reakcji nitrowania, dajc produkty dysocjujce do to-pomaraczowego anionu, np.:

    Tyr + HNO3 T, -H2O 3-nitrozotyrozyna Reakcja biuretowa bierze swoj nazw od biuretu (dwumocznika: H2N-CO-NH-CO-NH2)

    najprostszego zwizku dajcego jej pozytywny wynik. Pozwala ona na wykrycie obecnoci wizania peptydowego, poczwszy od trjpeptydw wzwy. Przeprowadza si j dodajc do prby zasadowego roztworu siarczanu miedzi (CuSO4). Jeeli w prbie znajduje si zwizek zawierajcy dwa ssiadujce wizania peptydowe, to utworzy on z jonami miedzi (II) poczenie kompleksowe o intensywnie fioletowym zabarwieniu. Naley jednak zaznaczy, i pozytywne miano nie potwierdza obecnoci w prbie zwizkw aminokwasowych.

    Reakcja cystynowa pozwala na wykrycie biaek zawierajcych wizania dwusiaczkowe (S-S). Przeprowadza si j w rodowisku zasadowym, z dodatkiem rozpuszczalnej soli oowiu, np. octanu. Pod wpywem wysokiego pH nastpuje rozpad wspomnianych wiza z uwolnieniem anionu wodorosiarczkowego:

    Cys-S-S-Cys + H2O + OH- 2 CH3COCOOH + 2 NH3 + HS- + S , ktry czy si z kationem oowiu, prowadzc do strcenia czarnego osadu siarczku oowiu:

    Pb(CH3COO)2 + HS- CH3COOH + CH3COO- + PbS .

    c) poziomy organizacji i fadowanie

    Biaka nale do najbardziej zoonych zwizkw chemicznych wystpujcych w przyrodzie. Ich budowa wykazuje pewne poziomy organizacji, std dla precyzyjnego jej opisu wprowadzono pojcie struktury I, II, III i IV-rzdowej. Metody laboratoryjne okrelania kolejnych struktur nieznanych biaek opisane zostan dalej.

    Przez struktur I-rzdow rozumiemy liczb, budow i kolejno (sekwencj) poczonych ze sob reszt aa tworzcych dane biako, wraz ze wskazaniem miejsc wystpowania wiza dwusiarczkowych (S-S). Struktura I-rzdowa opisuje wic konfiguracj peptydu. Przez konfiguracj rozumiemy powizania geometryczne midzy danym zbiorem atomw, ktrych zmiana wie si z zerwaniem i ponownym uformowaniem wiza kowalencyjnych.

    Struktura II-rzdowa okrela sposb skrcenia acucha polipeptydowego, czyli jego konformacj. Konformacja to trjwymiarowa architektura czsteczki, inaczej przestrzenne powizania midzy atomami; moe ona ulec zmianie przez reorganizacj stabilizujcych j wiza niekowalencyjnych (wizania kowalencyjne zostaj zachowane por. wyej). Czsteczka biaka o okrelonej konfiguracji (strukturze I-rz.), wobec moliwoci swobodnej rotacji wok duej czci (ok. 2/3) wiza gwnego acucha polipeptydowego, moe posiada nieproporcjonalnie du liczb moliwych konformacji, cho zwykle tylko niektre z nich umoliwiaj czsteczce penienie funkcji biologicznych. Liczba ta ograniczona jest czciowo podwjnym charakterem wizania peptydowego, jak rwnie rodzajem i ksztatem grup bocznych (R) aa. Kty rotacji i musz wic przyjmowa takie kombinacje wartoci, aby wykluczy przestrzenne konflikty midzy poszczeglnymi atomami czsteczki, a ich znajomo pozwala na jednoznaczne okrelenie konformacji wszystkich atomw g. acucha polipeptydowego. Dozwolone wartoci obejmuj konformacje regularne -helis, -kartk, zwrot , superhelis kolagenu oraz nieregularne ptle i zwoje.

    ! Oglnie rzecz biorc, kada helisa (zwj) tworzona jest przez szkielet polipeptydowy skrcajcy si rwnomiernie wok kadego atomu C. Istniej rne typy helis, rnice si midzy sob rozmiarami i kierunkiem skrtu. Budow helisy opisuje si wic przez podanie: liczby reszt aa przypadajcych na jeden skrt (n) oraz skoku ruby (p) lub odlegoci midzy ssiednimi skrtami. Helisy polipeptydowe zabudowane z aa chiralnych s rwnie chiralne, tzn. prawo- bd lewoskrtne, przy czym w naturalnych biakach wystpuj niemal wycznie te pierwsze. Taki kierunek skrtu zdeterminowany jest przez fakt budowy czsteczki z enancjomerw L: w wyniku przycigania si atomw wizania peptydowego lejsza grupa N-H zblia si w stron ciszej grupy C-O wanie w prawo. -helisa cechuje si korzystnymi wartociami ktw rotacji oraz ukadem stabilizujcych wiza wodorowych. Zawiera zazwyczaj 4 50 (r. ok. 12) reszt aa, posiada parametry: n=3,6, p=0,54 nm. Rwnowane atomy z ssiednich reszt acucha gwnego oddalone s o 0,15 nm (mierzone wzdu osi). Grupy R skierowane s na zewntrz helisy, co minimalizuje wzajemne interakcje przestrzenne. We wntrzu helisy praktycznie brak wolnej przestrzeni. Dziki maksymalnej liczbie wiza wodorowych jest to konformacja o najniszej energii i tym samym najwikszej stabilnoci, dlatego formuje si ona

  • - - 18

    spontanicznie. Wizania wodorowe wystpuj midzy atomem N wizania peptydowego oraz atomem O wchodzcym w skad czwartego kolejnego wizania peptydowego tego samego acucha (wizania wewntrzacuchowe); maj one optymaln odlego 0,28 nm. Dodatkow funkcj peni wizania van der Waalsa (por. dalej), zwaszcza dziaajce poprzecznie do osi helisy, pomidzy ciasno upakowanymi atomami jej rdzenia. Jedynie peptydowy atom N proliny nie moe uformowa wizania wodorowego, dlatego aa ten pasuje jedynie do 1. obrotu helisy w innym miejscu wytwarza on zgicie. -helisy wystpuj zwykle na powierzchni czsteczek biaek, chocia mog by rwnie czciowo lub cakowicie schowane w ich wntrzu. Szczeglny przypadek stanowi helisy amfipatyczne, w ktrych aa polarne i niepolarne zmieniaj si ze sob co 3 4 reszty w ten sposb mog one kontaktowa si ze rodowiskiem polarnym z jednej strony, a z niepolarnym z drugiej. Helisy amfipatyczne wystpuj m. in. w: lipoproteinach osocza, hormonach, toksynach, antybiotykach, glikoproteinach wirusa HIV oraz w kinazie biakowej regulowanej kalmodulin.

    ! Struktura nazywana jest inaczej -kartk, -harmonijk lub pofadowanym arkuszem. Nazwy te odnosz si do jej ksztatu, obserwowanego wzdu krawdzi C i zwizane z nimi R wystpuj naprzemiennie nieco powyej i poniej paszczyzny gwnego acucha polipeptydowegom ktry jest niemal w peni rozcignity. -kartka posiada powtarzajce si co do wartoci kty i oraz jest stabilizowana maksymaln iloci wiza wodorowych. Te jednak, w przeciwiestwie do -helisy, maj charakter midzyacuchowy wystpuj midzy atomami N i O wiza peptydowych ssiadujcych pasm acuchw peptydowych; w ich tworzenie zaangaowane s odcinki o dugoci 5 10 aa z rnych regionw struktury I-rz. Struktury mog by rwnolege lub antyrwnolege (przeciwrwnolege, przeciwbiene); w pierwszym przypadku ssiednie acuchy peptydowe biegn w tym samym kierunku, w drugim za w przeciwnym. Z wyjtkiem pasm granicznych tworz si wszystkie moliwe wizania wodorowe. W strukturze antyrwnolegej pary wiza wodorowych wystpuj na przemian raz blisko, a raz daleko od siebie, a zorientowane s mniej wicej prostopadle do szkieletu polipeptydowego. Z kolei w strukturze rwnolegej wizania wodorowe s rozmieszczone rwnomiernie, ale le wzgldem siebie ukonie i w zmiennych kierunkach. Powszechne s regiony poczenia struktur rwnolegych i antyrwnolegych, wiele acuchw moe te wystpowa w obrbie jednej kartki (chocia struktury rwnolege zoone z < 5 acuchw s nieco mniej stabilne i przez to rzadko spotykane). Niemal wszystkie pasma harmonijki s zwinite prawoskrtnie, tworzc centralny rdze wielu biaek globularnych.

    ! Zwrot (zagicie , -skrt) to ukad umoliwiajcy zmian kierunku przebiegu struktury , czsto czcy koce dwch przylegych pasm antyrwnolegych. Zwrot umoliwiajcy zmian kierunku acucha o 180o skada si z 4 aa, z czego pierwszy tworzy wizania wodorowe z czwartym. Ponadto czsto zawiera glicyn z powodu niewielkiego rozmiaru oraz prolin gdy ok. 6 % jej wiza peptydowych posiada konfiguracj cis. Jest to struktura regularna, czsto obecna na powierzchni biaek.

    ! W typowym biaku globularnym jedynie ok. poowa aa wchodzi w skad struktur i , podczas gdy reszta wystpuje w postaci struktur nieregularnych, tj. ptli i zwojw. Szczeglnie dotyczy to obu kocw (N i C) oraz reszt R lizyny. Obszary ptli warunkuj gwnie waciwoci powierzchni czsteczek biaek. Bezadna struktura wie si z gitkoci i atwoci dopasowania, przy czym wiele obszarw bezadnych ulega organizacji pod wpywem specyficznych ligandw; z tego powodu regiony nieregularne czsto wystpuj w miejscach interakcji czsteczek biaek z innymi czsteczkami (ligandami), np. w centrach katalitycznych enzymw, czy na powierzchni biaek odpornociowych, gdzie ksztatuj obszary oddziaywania przeciwciaa z antygenem. Ptle o ksztacie spinki do wosw spinaj ssiadujce antyrwnolege struktury .

    ! Struktury II-rz. mog tworzy motywy naddrugorzdowe, np. klucz grecki pojedynczy i podwjny, motyw czy -spink (antyrwnolege pasma zespolone krtk ptl).

    Struktura III-rz. okrela przestrzenne powizania midzy elementami struktury II-rz. (helisami, kartkami, innymi), jak rwnie wzajemne oddziaywania midzy domenami, sposoby fadowania oraz oddziaywania stabilizujce takie uoenie.

    ! Struktura III-rz. stabilizowana jest przez rnorodne rodzaje wiza niekowalencyjnych: " wizania wodorowe wytwarzane przez polarne R aa " oddziaywania hydrofobowe wystpuj pomidzy niepolarnymi R aa " oddziaywania elektrostatyczne (mostki solne) tworz si midzy przeciwnie naadowanymi

    grupami, np. kocami N i C peptydw bd R polarnymi jonizujcymi (np. Lys i Asp) " siy van der Waalsa s bardzo sabe i dziaaj jedynie na niewielkie odlegoci, rwne sumie

    promieni van der Waalsa atomw pomidzy ktrymi wystpuj Biaka mog by dodatkowo stabilizowane kowalencyjnymi wizaniami dwusiarczkowymi (S-S); rozwizanie takie wystpuje w niektrych enzymach (np. rybonukleaza), hormonach (np. insulina) czy biakach strukturalnych (keratyna).

  • - - 19

    ! Struktury II-rz. i motywy naddrugorzdowe, zwaszcza w duych biakach, mog by zorganizowane w poczone ze sob fragmenty, zwane domenami. Domena to lokalna, zwarta, globularna, potencjalnie niezalene jednostka fadowania biaka, zwizana z nim jednak wizaniami kowalencyjnymi. Domena reprezentuje zwarty genetycznie segment, np. domeny w Ig, dehydrogenazach czy globinach; ponadto interesujce jest, i sekwencje aa charakterystyczne dla danej domeny mona spotka w innych, podobnych domenach tego samego biaka lub w innych biakach. Domeny czsto nadaj biakom w ktrych wystpuj zdolno penienia specyficznych funkcji, np. wizania swoistych ligandw (nukleotydw, polisacharydw). Przestrze midzy domenami wyznacza czsto centrum aktywne biaka, a powierzchnia kontaktu midzy nimi jest miejscem przenoszenia mechanizmw allosterycznych.

    ! Zaburzenia struktury II/III-rz. biaek stanowi istot chorb prionowych (TSE) zmiany w konformacji biaek powoduj zastpienie -helisy przez -kartk oraz wystpienie opornoci na proteoliz enzymatyczn.

    Struktura IV-rz. okrelona jest w przypadku biaek oligomerycznych, tj. zoonych z 2 acuchw polipeptydowych zwanych protomerami lub podjednostkami poczonych siami niekowalencyjnymi. Opisuje ona sposb uoenia w przestrzeni kilku wzajemnie ze sob oddziaywujcych acuchw. Cechuje si ponadto najwiksz zoonoci, a zarazem jest najsabiej poznana. Ze wzgldu na liczb podjednostek wyrniamy odpowiednio di-, tri-, tetramery itd. Homooligomery skadaj si z kilku identycznych podjednostek, podczas gdy heterooligomery z rnych; rne protomery biaek heterooligomerycznych peni zazwyczaj specyficzne funkcje, np. katalityczne, regulacyjne czy rozpoznajce ligandy. Waciwoci chemiczno-biologiczne biaek podjednostkowych zale od przestrzennej orientacji ich podjednostek.

    W odpowiednich warunkach mona pozbawi biako struktur wyszych rzdw. ! Denaturacja polega na zniszczeniu wiza niekowalencyjnych biaka, a tym samym na trwaej utracie

    jego struktury II, III i IV-rz. oraz aktywnoci biologicznej. Do denaturacji dochodzi pod wpywem tzw. czynnikw denaturujcych, do ktrych zaliczamy: wysok temperatur, silnie polarne (kwane lub zasadowe) rodowisko oraz okrelone substancje: alkohol, formalina, rozpuszczalne sole metali cikich (gwnie oowiu, rtci i srebra), SDS.

    ! W przeciwiestwie do denaturacji, koagulacja (wysolenie) polega na odwracalnej utracie postaci biaka pod wpywem dziaania soli metali lekkich, np. NaCl, NH4Cl. Sole te, dziki waciwociom higroskopijnym, wi i pozbawiaj biako pewnej iloci wody, wskutek czego naturalny ppynny zol biakowy zmienia posta na pstay el. Dodanie do skoagulowanego biaka wody powoduje przywrcenie mu pierwotnej konsystencji, co nazywa si peptyzacj.

    Natywne biaka nie maj postaci prostych acuchw, lecz s w skomplikowany sposb zwinite lub inaczej mwic sfadowane. Fadowanie biaek nie odbywa si na drodze prb i bdw, o czym wiadczy chociaby paradoks Levinthala czas przypadkowego poszukiwania odpowiedniej struktury sfadowania nawet w przypadku niewielkiego peptydu byby teoretycznie duszy ni szacowany wiek wszechwiata. Oczywiste jest zatem, i fadowanie biaek to nieprzypadkowy i wysoce zorganizowany proces.

    ! Proces fadowania skada si z kilku faz: formowania krtkich fragmentw struktury i ich wzrostu uformowania domen (w biakach wielodomenowych poczonych w tzw. stopion globul) zmian konformacyjnych nadajcych struktur III-rz. osignicia natywnej struktury (na tym koczy si fadowanie biaek monomerycznych) ew. czenia podjednostek i formowania oligomerw.

    ! acuchy polipeptydowe wielu zdenaturowanych biaek spontanicznie (bez zewntrznej interwencji, same z siebie) zwijaj si powtrnie w warunkach in vitro, cznie z przywrceniem aktywnoci biologicznej, cho trwa to o wiele duej ni w warunkach in vivo; zjawisko to okrela si mianem renaturacji.

    ! In vivo procesy fadowania przebiegaj o wiele szybciej i s wyranie ukierunkowane, m. in. dziki obecnoci specyficznych enzymw: " izomeraza dwusiarczkowa biaek (ang. protein disulphide isomerase PDI) uatwia przetasowanie

    wiza dwusiarczkowych (S-S) przez zwikszenie szybkoci wzajemnej wymiany mostkw S-S, " izomeraza peptydylo-prolinowa cis-trans (ang. peptidil-proline isomerase PPI) katalizuje

    izomeryzacj wiza peptydowych X-Pro z formy trans do cis (przeksztaceniu ulega ok. 10 % wiza),

    " chaperony (biaka opiekucze, m. in. tzw. biaka szoku cieplnego ang. heat shock protein = Hsp) przyspieszaj proces fadowania przez zapewnienie biaku ochronnego rodowiska oraz preferencje przemian powstrzymujcych niewaciwe interakcje midzy powierzchniami komplementarnymi i uatwiajcych waciwe interakcje.

  • - - 20

    d) rozdzia i okrelanie struktury biaek Aby mc bada struktur biaek, naley je wpierw wyizolowa w stanie czystym, tzn. pozbawi

    zanieczyszcze i oddzieli od innych biaek. Do najczciej stosowanych technik oczyszczania i izolacji biaek nale:

    ! Chromatografia jonowymienna i HVE stosowane s do aa i polipeptydw; podstaw rozdziau jest adunek elektryczny.

    ! Filtracja elowa z uyciem wysokich ste (1-4M) kwasu mrwkowego lub octowego stosowana do wielkoczsteczkowych hydrofobowych peptydw; wykorzystuje odmienne zatrzymywanie i wymywanie peptydw z porw sita molekularnego (Sephadex).

    ! HPLC w odwrconym ukadzie faz (niepolarny nonik + polarny rozpuszczalnik) stosowana j.w., czasem w poczeniu z poprzednio omwiona metod do oczyszczania zoonych mieszanin peptydw, otrzymywanych przez czciowe trawienie biaek.

    ! HVE na sitach molekularnych (sczenie molekularne) technicznie przeprowadza si na skrobii, agarozie lub elu poliakrylamidowym (PAG; usieciowany polimer akrylamidu). Stosuje si do polipeptydw i polinukleotydw. Prbk w buforze nanosi si na pytk lub do rurki, rozdziela elektroforetycznie i ostatecznie identyfikuje peptydy bkitem brylantowym Coomassie lub solami srebra, za polinukleotydy bromkiem etydyny. Czasem wykorzystuje si odmian tej metody w warunkach denaturujcych (mocznik, SDS) acuch peptydowy ulega wwczas rozprostowaniu, dodatkowo wic na powierzchni adunek ujemny proporcjonalnie do swojej wielkoci (waciwie do iloci wiza peptydowych), wic rozdzia elektroforetyczny opiera si tu porednio na masie czsteczkowej. Metod PAGE-SDS stosuje si wic do okrelania masy czsteczkowe biaek przez porwnanie ich ruchliwoci elektroforetycznej z ruchliwociami wzorcw o znanych masach.

    Po uzyskaniu czystego biaka mona przystpi do stopniowego okrelania jego struktury. Wiele biaek skada si z 2 acuchw polipeptydowych poczonych wizaniami niekowalencyjnymi lub przez mostki dwusiarczkowe, ktre musz by rozbite przed sekwencjonowaniem. W tym celu roztwr badanego biaka traktuje si czynnikami denaturujcymi (mocznik, chlorowodorek guanidyny), ktre rozbijaj wizania wodorowe i niektre niekowalencyjne oraz czynnikami redukujcymi lub utleniajcymi, ktre pozbawiaj peptydy mostkw dwusiarczkowych czynniki utleniajce, np. kwas nadmrwkowy (HCOOOH), utleniaj reszty cystyny do kwasu cysteinowego (Cys-SO3-), natomiast czynniki redukujce, np. 2-merkaptoetanol, redukuj je do cysteiny (Cys-SH).

    Polipeptydy wielkoczsteczkowe rozbija si, czasami kilkuetapowo, na mniejsze fragmenty o dugoci 20-60 aa. Do tego celu uywa si nastpujcych odczynnikw (w nawiasach podano rodzaj rozbijanego wizania): bromocyjan CNBr (Met-X), trypsyna (Lys-X, Arg-X), o-jodobenzen (Trp-X), hydroksyloamina (Asn-Gly), proteaza V8 Staphylococcus aureus (Glu-aa hydrofobowy), agodna hydroliza kwana (Asp-Pro).

    Przed rozpoczciem sekwencjonowania biaka okrela si jego skad aminokwasowy poprzez poddanie go kwanej hydrolizie (6M HCl, 11oC, 1-4 doby), a nastpnie rozdzielenie i identyfikacj wolnych aa metod HPLC, chromatografii jonowymiennej bd elektroforetyczn. Wad takiego postpowania jest zniszczenie struktury wielu aa przez agresywne rodowisko cakowicie niszczone s Trp i Cys, czciowo Met, Tyr, Ser, Thr, ponadto zachodzi deamidacja Glu i Asn, natomiast wizania Val-Val, Ile-Ile, Val-Ile, Ile-Val wykazuj oporno na ten rodzaj hydrolizy. Aby tego unikn, wykonuje si kilka zabiegw:

    ! Cys utlenia si do kwasu cysteinowego opornego na dziaanie kwanego rodowiska, ! obecno Trp oznacza si po hydrolizie zasadowej (ktra za to niszczy Ser, Thr, Arg i Cys), ! okrela si tempo spadku poziomw Ser i Thr, po czym dane te ekstrapoluje si do czasu 0, ! obecno aa rozgazionych oznacza si po 96 h hydrolizy, ! obecno aa kwanych oraz ich amidw okrela si cznie jako Glx (Glu + Gln) i Asx (Asp + Asn). Po okreleniu procentowego udziau poszczeglnych aa w budowie badanego biaka, mona przystpi

    do jego sekwencjonowania, czyli okrelenia struktury I-rz. Istnieje tu kilka metod: ! Najstarsze metody sekwencjnowania opieraj si na przeprowadzeniu N-kocowego aa peptydu w

    okrelon pochodn, hydroliz peptydu oraz identyfikacj powstaej pochodnej aa. Taka jest m. in. idea metody Sangera uywa si w niej odczynnika Sangera DNFB (2,4-dinitro-1-fluorobenzenu), ktry reaguje wycznie z N-kocowymi resztami aa, po czym prowadzi si hydroliz i identyfikacj.

    ! Bardziej zaawansowana metoda Edmana wnosi automatyczne usuwanie i identyfikacj N-kocowych reszt aa peptydw w postaci pochodnych. Wykorzystuje si tu odczynnik Edmana fenyloizotiocyjanian, ktry reagujc z kocem aminowym peptydu daje kwas fenylotiohydantoinowy, ktry w rodowisku kwanym i obecnoci niehydroksylowych rozpuszczalnikw (np. nitrometanu) rozpada si na fenylotiohydantoinow pochodn aa oraz peptyd skrcony o jeden N-kocowy aa. W przeciwiestwie do metody Sangera, po usuniciu N-kocowego aa peptyd pozostaje niezmieniony.

  • - - 21

    Pochodne aa identyfikuje si metod HPLC, po czym opisany cykl powtarza si 30 80 x w jednym cigu operacyjnym.

    ! Oznaczenie struktury I-rz. wszystkich peptydw otrzymanych ze wstpnej hydrolizy prbki pozostawia do wyjanienia jedynie kolejno ich uoenia. Dlatego naley otrzyma i zsekwencjonowa dodatkowe peptydy o nakadajcych si resztach N i C-kocowych (techniki rozrywajce polipeptyd w innych miejscach).

    ! W celu oznaczenia pooenia wiza dwusiarczkowych rozdziela si zarwno peptydy pochodzce z hydrolizy prbki pierwotnej, jak i zmodyfikowane metodami utleniania / redukcji za pomoc chromatografii dwuwymiarowej lub chromatografii i elektroforezy.

    ! Metoda Maxima i Gilberta prezentuje inne podejcie do problemu opiera si na szybkim sekwencjonowaniu DNA genu kodujcego dane biako i okreleniu sekwencji aa na podstawie tabeli kodu genetycznego. Jej wad jest brak ujawniania miejsc wiza dwusiarczkowych oraz obecnoci posttranslacyjnych modyfikacji aa (hydroksylacja, metylacja, fosforylacja, estryfikacja, izoprenylacja). Stosowana jest w identyfikacji labilnych pre- lub prepropeptydw istotnych w katalizie lub w badaniu kierowania peptydw do okrelonych organelli komrkowych.

    ! Alternatywnym sposobem sekwencjonowania krtkich (do ok. 25 aa) peptydw jest szybkie bombardowanie atomowe (FAB) ze spektroskopi masow (MS) w dwch poczonych spektrometrach. Szybkie bombardowanie atomami gazw szlachetnych (Ar lub Xe) daje w efekcie kationy peptydw. W pierwszym spektrometrze oddzielane s zanieczyszczenia, po czym jony peptydw zderzaj si w komorze z atomami He, ulegajc fragmentacji do wielu jonw o zmniejszajcych si rozmiarach, ktrych masy czsteczkowe oznaczane s w drugim spektrometrze porwnanie jonw z rosncymi masami pozwala na identyfikacj wszystkich reszt aa i ich kolejnoci. Metoda FAB-MS umoliwia identyfikacj aa zmodyfikowanych posttranslacyjnie oraz w przeciwiestwie do metody Edmana umoliwia sekwencjonowanie peptydw z zablokowanym (np. zacylowanym) kocem aminowym.

    Trjwymiarow struktur biaek mona bada metodami krystalografii rentgenowskiej oraz MRS. ! Krystalografia rentgenowska ujawnia statyczny obraz biaka krystalicznego. Wymaga duych,

    doskonale uporzdkowanych krysztaw biaka, zawierajcych szereg powtarzajcych si regularnie identycznych czsteczek, silnie zaamujcych promienie X. Obraz powstay w wyniku zaamania wizki promieni na krysztale biaka pozwala na odtworzenie struktury pojedynczej czsteczki. Krysztay biaek hoduje si technik wiszcej kropli, po czym eksponuje na monochromatyczne (o jednej, staej i okrelonej dugoci fali) promieniowanie X i obraza w celu uzyskania wszystkich moliwych odwzorowa dyfrakcyjnych. Promienie X s wwczas rozpraszane i tworz obraz zaleny od gstoci elektronowej w rnych czciach biaka. Maksima dyfrakcji s analizowane komputerowo, aby na tej podstawie skonstruowa mapy gstoci elektronowej (amplitudy i fazy). Reprezentuj one seri rwnolegych przekrojw przez biako, co z kolei pozwala na konstrukcj trjwymiarowych map gstoci elektronowej i dalej model fizyczny lub przyblione dopasowanie struktury I-rz. Dokadne wyznaczenie pooe atomw moliwe jest jedynie po zsekwencjonowaniu badanego biaka.

    ! Spektroskopia jdrowego rezonansu magnetycznego (ang. magnetic resonance spectroscopy = MRS) jest technik dostarczajc informacji o strukturze biaka w roztworze. Parametrami bezporednio mierzonymi jest otoczenie chemiczne jder atomowych wykazujcych moment magnetyczny albo spin (gwnie 1H), co dostarcza informacji o odlegoci atomw w czsteczce przesuniciach chemicznych. Dwuwymiarowa MRS analizuje skomplikowane widma otrzymywane z biaek zmieniajcych si w czasie, dlatego jest wykorzystywana do badania tworzenia struktur przejciowych w procesie zwijania acuchw biakowych.

    Do metod badania struktury IV-rz. biaek i oznaczania ich mas czsteczkowych zaliczamy m. in.: ! Ultrawirowanie analityczne pomiar szybkoci sedymentacji biaka przy wirowaniu z przyspieszeniem

    ktowym 10 tys. x wikszym ni przyspieszenie ziemskie. ! Wirowanie w gradiencie gstoci (zwykle 5 20 % roztworu zbuforowanej sacharozy) porwnanie

    poziomu biaka w prbwce w odniesieniu do poziomw biaek o znanych masach czsteczkowych przy wirowaniu w powyszych warunkach.

    ! Filtracja elowa mas czsteczkow nieznanego biaka oblicza si z porwnania jego objtoci elucyjnej z analogicznymi objtociami biaek wzorcowych.

    ! PAGE rozdzia biaek w elach o zmiennej porowatoci i wykrywanie bkitem brylantowym lub solami srebra. PAGE-SDS stosowane jest do okrelania rozmiarw podjednostek oligomerw.

    ! Mikrofotografia elektronowa obrazowanie kompleksw makromolekularnych wirusw, kompleksw enzymatycznych czy oligomerw.

  • - - 22

    e) zwizek budowy i funkcji biaek fibrylarnych i globularnych

    Biaka fibrylarne cechuj si m. in. wyduonym ksztatem i brakiem rozpuszczalnoci w wodzie. Peni one funkcje biaek strukturalnych w skrze, tkance cznej oraz rnego rodzaju wknach (wosy, jedwab, wena). Czsto zawieraj atypowe sekwencje aa lub zmodyfikowane aa, co przekada si na struktur II i III-rz. i konsekwentnie dalej na waciwoci mechaniczne. Przykadami biaek fibrylarnych s: kolagen (patrz punkt VII-9-b), elastyna (VII-8-a), miozyna (VII-7-a), keratyna, fibroina.

    ! Keratyna nie jest pojedynczym biakiem, lecz ca rodzin, wrd ktrej mona wyrni tzw. keratyny twarde i mikkie. Oglnie cechuj si one wysok odpornoci na czynniki fizyczne, chemiczne i dziaanie proteaz oraz wysok zawartoci aa zawierajcych siark Cys (17%) i Met (0,5%).Wykazano istnienie ok. 10 izoform keratyn twardych, obecnych w rozmaitych wytworach naskrka zwierzt paznokciach, pirach, rogach, wenie i innych. W ludzkich komrkach nabonkowych zidentyfikowano ok. 20 izoform cytokeratyn (40-70 kDa), nalecych do keratyn mikkich. Cytokeratyny stanowi najwiksz i najbardziej zrnicowan grup filamentw porednich, wchodzc w skad cytoszkieletu komrkowego. Podjednostki keratyn zbudowane s wedug wsplnego planu wyrniamy w nich -helisow domen centraln oraz globularne domeny N i C- kocowe. Ta pierwsza posiada wysoce konserwatywny charakter i skada si z 310-315 reszt aa, za domeny terminalne licz od 15 do 30 reszt. Podjednostki keratyn, asocjujc w struktury wyszego rzdu, tworz kolejno: dimery protofilamenty protofibryle filamenty porednie. W przeciwiestwie do cytokeratyn, keratyny twarde s strukturami dwufazowymi, w ktrych wkna keratyny s zatopione w bezpostaciowej macierzy zbudowanej z biaek o duej zawartoci siarki. Enzymy proteolityczne zdolne do hydrolizy keratyny to wystpujce u krgowcw kaspazy degradujce cytokeratyny (udzia w procesie apoptozy) lub syntetyzowane przez mikroorganizmy keratynazy.

    ! Fibroina stanowi gwne biako jedwabiu. 85% jej skadu stanowi Gly, wystpujca na zmian z Ser lub Ala. acuchy polipeptydowe formuj szereg rozcignitych antyrwnolegych pasm , tak i grupy boczne (R) Gly wyaniaj si z jednej powierzchni, za Ser lub Ala z drugiej. W ten sposb ukad stabilizowany jest nie przez wizania wodorowe, lecz przez oddziaywania hydrofobowe. Wtrcone co pewien odcinek aa z duym R (Val, Tyr) zaburzaj regularn struktur i zwikszaj gitko caoci konstrukcji.

    Jedn z grup globularnych biaek zoonych s chromoproteiny, reprezentowane w ludzkim ustroju g.

    przez biaka hemowe nazwane tak od doczonego do acucha peptydowego barwnika hemu. Rola biaek hemowych polega na transporcie i magazynowaniu tlenu oraz transporcie elektronw. Ich zdolno wizania tlenu uwarunkowana jest obecnoci jonu Fe2+, zlokalizowanego w centrum grupy hemowej, stanowicej grup prostetyczn hemoglobiny i mioglobiny. Grupa hemowa wystpuje rwnie w wielu enzymach cytochromach, katalazie (CT), syntazie tlenku azotu (NOS), 2,3-dioksygenazie tryptofanowej i innych.

    ! Hem jest cyklicznym tetrapirolem skada si z 4 grup pirolowych poczonych 4 mostkami metinowymi midzy atomami C (ukad porfiny), za przy atomach C obecne s charakterystyczne podstawniki. Ukad wielu sprzonych wiza podwjnych nadaje czsteczce paski ksztat (piercienie pirolowe, atomy C mostkw metinowych i jon Fe2+ le praktycznie w jednej paszczynie) oraz warunkuje pochanianie wiata w niskim zakresie wiata widzialnego, dziki czemu ma ona a przez to rwnie HGB i krew barw czerwon. Przy atomach C wystpuj grupy: metylowe (M w pozycjach 1, 3, 5, 8), winylowe (V 2 i 4) oraz propionowe (P 6 i 7). Te ostatnie, stanowic jedyne polarne acuchy boczne hemu, s zwrcone w stron powierzchni hemoprotein. Jak wczeniej wspomniano, jon elaza zajmuje centralne miejsce w czsteczce hemu, wic si dwoma wizaniami kowalencyjnymi oraz dwoma koordynacyjnymi z czterema atomami N tetrapirolu. Pozostae (5. i 6.) wizania koordynacyjne jonu elaza le prostopadle do paszczyzny porfiny odpowiednio nad i pod ukadem tetrapirolu.

    ! Funkcj mioglobiny (MGB skrt nieformalny) jest magazynowanie tlenu w miniach czerwonych. Jej czsteczka zoona jest z pojedynczego acucha polipeptydowego (masa ok. 17 kDa), zoonego ze 153 reszt aa. Zewntrzna cz czsteczki jest polarna, za wewntrzna niepolarna, co ma zwizek z rozpuszczalnoci w wodzie. Wyjtkowo we wntrzu czsteczki znajduj si dwa aa polarne His wice grup hemow do czci polipeptydowej. Czsteczka mioglobiny ma ksztat w przyblieniu kulisty, pomimo nieregularnej i niesymetrycznej budowy. Poszczeglne -helisy, struktury i ptle okrela si za pomoc liter i cyfr. A ok. 75 % acucha wystpuje w formie 8 prawoskrtnych -helis, o dugociach 7 20 reszt aa, oznaczonych literami od A do H, poczwszy od N-koca. Fragmenty midzyhelikalne oznacza si literami dwch odcinkw helikalnych przez nie poczonych. Pojedyncze

  • - - 23

    reszty aa oznacza si podajc liter oznaczajc helis oraz liczb pozycj aa w danej helisie, poczwszy od N-koca. " Aa zajmujce odlege miejsca w strukturze I-rz. mog w wyniku skomplikowanego fadowania

    znale si blisko siebie w strukturze III-rz., np. His F8 i His E7. Informacja zawarta w strukturze I-rz. apomioglobiny jest odpowiedzialna za prawidowe i swoiste upakowanie biaka w obecnoci hemu. Grupa hemowa znajduje si w zagbieniu midzy helisami E i F, jon elaza wie si 5. wizaniem koordynacyjnym z piercieniem imidazolowym His F8 (tzw. His proksymalna). Po przeciwnej stronie paszczyzny hemu (w stosunku do His F8) znajduje si His E7 (tzw. His dystalna), ktra nie zajmuje jednak 6. pozycji koordynacyjnej Fe2+. W odtlenowanej MGB jon Fe2+ jest lekko (0,03 nm) wysunity poza paszczyzn hemu w kierunku His F8, natomiast w MGB utlenowanej gdy czsteczka O2 zajmuje 6. pozycj koordynacyjn wysunicie to jest 3 x mniejsze, wynoszc 0,01 nm. Zwizaniu czsteczki tlenu towarzyszy wic ruch jonu elaza i His F8 w stron paszczyzny porfiryny, co daje zmiany konformacyjne czsteczki biaka.

    " W utlenowanej MGB wizanie Fe2+ O jest prostopade do paszczyzny porfiryny, natomiast 2. atom tlenu przyczony jest pod pewnym ktem (skonie). Z kolei tlenek wgla (CO) preferuje przyczanie si w caoci prostopadle do tej paszczyzny taka orientacja jest jednak moliwa jedynie w wyizolowanym hemie, bowiem fizjologicznie w MGB His dystalna stanowi przestrzenn zawad dla wizania CO pod tym ktem. Zatem otoczenie hemu w MGB zmniejsza powinowactwo CO do elaza hemowego, ktre w przypadku czystego hemu jest a 25 tys. razy wiksze ni powinowactwo O2 do tego elaza. Dziki opisanemu mechanizmowi czsteczka CO zmuszona jest do wizania si w mniej korzystnej konfiguracji, co obnia wzgldne powinowactwo do ok. 200.

    " MGB jest biakiem magazynujcym, a nie transportujcym tlen. Ilo O2 zwizanego przez biako (nasycenie, saturacja) zaley od stenia (cinienia) tego gazu pO2. Nie jest to jednak zaleno liniowa, lecz obrazuje j krzywa dysocjacji tlenowej. Dla MGB krzywa ta ma ksztat hiperboli, co oznacza, i oddaje ona tlen dopiero przy znacznym spadku pO2, co ma miejsce przy duym deficycie tlenowym w warunkach wysokiej aktywnoci fizycznej. MGB nie mogaby peni funkcji transportu tlenu z puc do tkanek, gdy przy granicznych w tych warunkach wartociach pO2 oddaje ona jedynie znikom cz zmagazynowanego O2.

    ! Hemoglobina (HGB) spenia funkcj transportu gazw oddechowych O2 z puc do tkanek oraz CO2 i H+ w kierunku przeciwnym. " HGB jest tetramerem zoonym z pary dwch typw acuchw polipepydowych, oznaczanych ,

    , , , S itd. acuchy te stanowi podjednostki HGB posiada ona zatem struktur IV-rz., dziki czemu zyskuje nowe waciwoci, ktrych nie prezentuje MGB. acuch skada si ze 141 reszt aa, a ze 146, oba s kodowane przez odmienne geny. Znanych jest wiele typw HGB, jednak do najwaniejszych nale: HbA (22; podstawowa fizjologiczna HGB dorosych), HbA2 (22; fizjologiczna HGB dorosych, stanowi ok. 2,5 %), HbF (22; podowa), HbS (2S2; wystpuje w sierpowatych erytocytach).

    " MGB i podjednostki HbA wykazuj praktycznie identyczn struktur II i III-rz., podobna jest rwnie lokalizacja grup hemowej i odcinkw helikalnych, cho HbA posiada ich tylko 7.

    " Hem kadej podjednostki HGB przycza 1 czsteczk O2, wic caa HGB wie cznie 4 czsteczki tlenu. Co wicej, przyczenie O2 do jednego hemu uatwia wizanie kolejnych O2 przez pozostae grupy hemowe okrela si to jako kooperatywne wizanie O2 z HGB. Zjawisko to pozwala na zwizanie maksymalnej iloci tlenu w pucach oraz uwalnianie moliwie najwikszej iloci tlenu w tkankach. Zjawisko kooperatywnoci powoduje, e krzywa dysocjacji tlenowej HGB ma ksztat sigmoidalny (wygity jak litera S). Wniosek jest taki, i poczenie acuchw polipeptydowych w tetramer pozwala na zwikszenie wydajnoci transportu tlenu.

    " Rne typy HGB cechuj si odmiennym powinowactwem do O2. Jego ilociow miar jest wskanik P50, tj. warto pO2, przy ktrej HGB jest wysycona tlenem w 50 %. P50 dla HbA wynosi 26 mmHg, a dla HbF 20 mmHg oznacza to, i HbF silniej wie O2 (przy danej prnoci jest wysycony w wikszym stopniu) waciwo ta pozwala na przekazywanie tlenu z HbA na HbF w obrbie oyska. Po porodzie odsetek HbF szybko maleje, gdy jego obecno nie jest ju uzasadniona puca pracuj, a wysokie powinowactwo HbF do tlenu utrudnia jego oddawanie w tkankach. Na jego miejsce syntetyzowana jest HbA. Nagy rozpad duych iloci HbF wie si z powstaniem duych iloci bilirubiny (por. punkt VI-5-b/c), co jest przyczyn taczki noworodkw.

    " Przyczeniu O2 towarzyszy rozerwanie wiza poprzecznych (niekowalencyjnych elektrostatycznych) midzy kocami C wszystkich podjednostek HGB, co zmienia jej struktur II, III i IV-rz. Jedna para podjednostek + wykonuje obrt o ok. 15o w stosunku do drugiej pary, w wyniku czego podjednostki zbliaj si do siebie i wzrasta powinowactwo do tlenu. Struktura IV-rz. HGB czciowo utlenowanej okrelana jest jako stan naprony (T), za HGB cakowicie

  • - - 24

    utlenowanej jako stan rozluniony (R). Podczas utlenowania HGB atomy Fe, lece 0,06 nm poza paszczyzn porfiryny w HGB pozbawionej tlenu, wsuwaj si bliej tej paszczyzny, pocigajc za sob His F8 i ssiadujce z ni reszty aa. Prawdopodobiestwo przejcia TR wzrasta wraz z przyczaniem olejnych czsteczek O2 do HGB, gdy wizanie O2 osabia i rozbija wizania poprzeczne utrzymujce HGB w stanie T. Rwnowaga TR znajduje si pod wpywem takich czynnikw jak: H+, CO2, Cl-, BPG, ktre zwikszaj ilo zwizanego O2 wymaganego do przejcia TR.

    " Po oddaniu O2 HGB wie CO2, transportujc go do puc w ten sposb przenoszonych jest ok. 15% cakowitego CO2 transportowanego przez krew. CO2 wchodzi w reakcj z N-kocami acuchw HGB, dajc karbaminiany:

    HGB-NH3+ + CO2 HGB-NH-COO- + 2 H+. Powstajce w tej reakcji protony odpowiedzialne s za efekt Bohra. Zmiana adunkw N-kocw HGB umoliwia tworzenie wiza poprzecznych pomidzy podjednoskami tak jak w formie nieutlenowanej. W pucach utlenowaniu HGB towarzyszy odczenie i wydalenie CO2. CO2 docierajcy do krwi przeksztacany jest przez anhydraz wglanow (CA) do H2CO3, ktry samorzutnie dysocjuje do H+ + HCO3-. Protony wi si z HGB (Hb . 2 H+), za aniony wodorowglanowe stanowi gwn form transportu CO2 przez krew. Przez efekt Bohra okrela si zmniejszenie powinowactwa tlenu do HGB wraz ze spadkiem pH dziki temu w tkankach nastpuje bardziej efektywne oddawanie O2, a krzywa dysocjacji tlenowej HGB przesuwa si przez to w prawo. Zjawisko odwrotne, tj. zwikszenie oddawania CO2 pod wpywem wizania O2 nosi nazw efektu Haldena. Efekt Bohra jest charakterystyczny dla tetramerycznej HGB, zaley bowiem od interakcji pomidzy grupami hemowymi, czyli kooperatywnoci wizania O2 nie wykazuje go zatem MGB. Dziki zdolnoci wymiany protonw z otoczeniem, HGB peni funkcj ukadu buforowego krwi.

    " Protony odpowiedzialne za efekt Bohra powstaj w wyniku rozerwania wiza poprzecznych podczas utlenowania formy T, pochodz gwnie z atomw N piercieni imidazolowych C-kocowych reszt His acuchw (HC3; His 146). Z kolei odczenie O2 i zwizane z tym tworzenie wiza poprzecznych wymaga przyczenia H+ do w/w miejsc. Obecno protonw w tkankach uatwia wic tworzenie wiza poprzecznych poprzez protonacj C-kocowych reszt His acuchw , a odtwarzanie tych wiza sprzyja przejciu RT, czyli oddawaniu O2.

    " 2,3-bisfosfoglicerynian (BPG) powstaje w tkankach w wyniku niedoboru O2, jako modyfikacja podstawowego szlaku glikolizy. BPG wie si z HGB w stosunku stechiometrycznym 1:1, w miejscu pomidzy podjednostkami w centrum czsteczki. Rozmiar tej wnki odlego pomidzy helisami H acuchw odpowiada BPG jedynie w formie T. BPG tworzy wizania poprzeczne w obrbie acuchw (z N-kocem ValNA1, Lys EF6 i His H21), przez co stabilizuje i preferuje form T, zwiksza zatem oddawanie O2 przez HGB w tkankach. BPG o wiele sabiej dziaa w przypadku HbF, gdy posiada ona w pozycji H21 Ser zamiast His, w zwizku z czym nie tworzy wiza poprzecznych. Adaptacja organizmu do duych wysokoci polega m. in. na zwikszeniu syntezy BPG, co zmniejsza P50, a zwiksza uwalnianie tlenu do tkanek.

    ! Stany patologiczne zwizane z HGB: " Hemoglobinopatie s to zaburzenia funkcji biologicznej HGB, bdce nastpstwem mutacji

    genw kodujcych jej acuchy polipeptydowe ( i ). Znanych jest kilkaset hemoglobinopatii, jednak ogromna wikszo wystpuje rzadko i ma agodny przebieg, tak e wiksze znaczenie posiada zaledwie kilka z nich.

    # HbM: His F8 Tyr Mutacja taka powoduje stabilizacj elaza hemowego w formie Fe3+, gdy tworzy ono trwae poczenie z anionem fenolanowym Tyr. Powoduje to methemoglobinemi podobnie jak sulfonamidy lub stany obnienia aktywnoci reduktazy methemoglobiny i zwizany z tym spadek zdolnoci HGB do wizania i transportu O2. Przy wariantach HbM dotyczcych acuchw wystepuje preferencja formy T, obnienie powinowactwa do tlenu i zniesienie efektu Bohra; natomiast przy wariantach dotyczcych acuchw przejcie RT nie zostaje zakcone, podobnie jak efekt Bohra.

    # HbS: Glu A2(6) Val Mutacja powoduje powstanie na powierzchni HGB lepkich miejsc, komplementarnych do odpowiednich miejsc na powierzchni nieutlenowanej HGB (zarwno A, jak i S). Komplementarno oddziaujcych powierzchni powoduje polimeryzacj nieutlenowanej HbS powstaj w ten sposb helikalne wkna HGB, ktre wytrcaj si i znieksztacaj erytrocyty, ktre przyjmuj ksztat sierpowaty, posiadaj obnion oporno hemolityczn oraz wiksz tendencj do agregacji i zlepiania. Objawy anemii sierpowatokrwinkowej pogbiaj si przy obnieniu pO2 polimeryzuje przecie forma T, czyli nieutlenowana. Barier i zatrzymanie polimeryzacji powoduje przyczenie

  • - - 25

    prawidowej HbA zarwno w formie R i T, gdy pomimo istnienia miejsc komplementarnych, nie posiada ona lepkich kocw.

    " Talasemie s to choroby, ktrych istot jest zmniejszona synteza acuchw HGB ( lub ), co jest przyczyn anemii.

    " HGB glikowana (HbA1c) jest to HGB poddana procesowi glikacji. Glikacja jest procesem nieenzymatycznej glikozylacji biaek w tym przypadku HGB zachodzcym w warunkach podwyszonego poziomu glukozy w rodowisku, np. cukrzycy. Anomeryczna grupa hydroksylowa glukozy reaguje z grup aminow Lys oraz aa N-kocowych. HbA i HbA1c mona rozdzieli stosujc chromatografi jonowymienn lub elektroforez. HbA1c stanowi fizjologicznie < 5 % HGB i jest proporcjonalne do redniego stenia glukozy we krwi w okresie 1,5 3 miesicy poprzedzajcych badanie (dugofalowa kontrola terapii cukrzycy).

    " Mioglobinuria jest stanem wydalania z moczem MGB pochodzcej z rozlegego uszkodzenia mini szkieletowych (w mniejszym stopniu serca), przez co mocz ma barw ciemnoczerwn. Stan taki moe prowadzi do ostrej niewydolnoci nerek (ONN).

  • - - 26

    ROZDZIA II STRUKTURA I FUNKCJE ENZYMW

    1. Ogle waciwoci enzymw

    a) klasyfikacja i nazewnictwo

    Podstaw klasyfikacji enzymw jest typ i mechanizm katalizowanej przez nie reakcji. Kady enzym posiada swj kod o postaci: EC xx.xx.xx.xx, gdzie litery x oznaczaj cyfry arabskie. Symbol EC zaznacza, e dalsza cz kodu to numer w midzynarodowym katalogu enzymw (ang. Enzyme Commission, fr. Enzyme Catalogue). Sam numer skada si z 4 czonw:

    ! pierwszy okrela gwn klas, charakteryzujc typ katalizowanej reakcji; system zawiera 6 klas enzymw i katalizowanych przez nie reakcji: " 1 oksydoreduktazy katalizuj reakcje utleniania i redukcji (redox; patrz punkt III-3) " 2 transferazy katalizuj reakcje przenoszenia grup funkcyjnych " 3 hydrolazy katalizuj reakcje rozpadu pod wpywem wody (hydrolizy) " 4 liazy katalizuj reakcje rozpadu bez udziau czsteczek wody " 5 izomerazy katalizuj reakcje zmian pooenia grup chemicznych z zachowaniem szkieletu " 6 ligazy katalizuj reakcje tworzenia wiza kowalnecyjnych

    ! drugi okrela podklas, charakteryzujc zazwyczaj rodzaj wizania lub grupy, ktrej dotyczy reakcja ! trzeci okrela podpodklas, ktra moe zawiera: dokadniejsz specyfikacj wizania, grup zwizkw

    do ktrej naley substrat, nazw donora lub akceptora ! czwarty wskazuje na okrelony enzym przez podanie nazwy substratu reakcji.

    Nazwa enzymu jest dwuczciowa cz pierwsza, zakoczona przyrostkiem -aza, okrela typ katalizowanej reakcji, druga substrat(y) reakcji.

    b) centrum katalityczne

    Enzymy posiadaj zdolno przyczania substratw i miejscowego zwikszania ich stenia, przez co przyspieszaj przebieg katalizowanej reakcji. Zazwyczaj czsteczka biaka enzymatycznego jest wielokrotnie wiksza (nawet o kilka rzdw wielkoci) od czsteczki substratu, co sugeruje istnienie ograniczonego obszaru centrum katalitycznego bezporednio wicego substrat.

    Model miejsca katalitycznego wg Fishera przedstawia je jako sztywn konstrukcj, a interakcj z substratem jako przestrzenne uoenie dopasowanych do siebie geometrycznie (niczym klucz do zamka) czsteczek. Koncepcja ta wyjania specyficzno pocze E-S, nie tumaczy jednak dynamicznych zmian towarzyszcych procesom katalitycznym.

    W przeciwiestwie do w/w, model indukowanego dopasowania, zaproponowany przez Koshlanda, zakada i blisko substratu indukuje zmiany konformacyjne w czsteczce enzymu, tak e moe nastpi poczenie pasujcych do siebie powierzchni. Z chemicznego punktu widzenia polega to na przyjciu odpowiedniej konformacji przez grupy funkcyjne czsteczki enzymu, co umoliwia interakcj z czsteczk substratu i waciw kataliz. Reszty aa znajdujce si w miejscu katalitycznym mog by od siebie znacznie oddalone w strukturze I-rzdowej, lecz przestrzennie zblione w strukturze III-rzdowej.

    Miejsca aktywne (katalityczne) enzymw zoonych z pojedynczej podjednostki s czsto zlokalizowane w bruzdach czsteczki enzymu, natomiast w oligomerach znajduj si zazwyczaj przy powierzchniach midzy podjednostkami. Wykazano, i w skad miejsca katalitycznego wchodzi wiele reszt aa, a gwn rol w katalizie odgrywaj pewne okrelone reszty w szczeglnoci aa z boczn grup sulfhydrylow (Cys) lub hydroksylow (Ser, Thr, Tyr) oraz kwane (Asp, Glu) i zasadowe (Lys, His, Arg), poniewa ich acuchy boczne stanowi czynniki nukleofilowe katalizatory kwane lub zasadowe bd akceptory grupy ulegajcej przeniesieniu. Wszystkie formy enzymu, katalizujce okrelon reakcj (lub typ reakcji), posiadaj jednakowy i uniwersalny mechanizm, wystpujcy w caej przyrodzie. Zwizany jest z tym fakt, i reszty aa istotne w procesie katalitycznym, jak rwnie ich najblisze otoczenie w czsteczce enzymu, wykazuj wysok konserwatywno, zachowan i utrwalon w procesie ewolucji. Poniewa jednak dany motyw struktury III-rz. moe by utworzony przez rne kombinacje struktur I-rz., tote ta pierwsza wykazuje zdecydowanie wiksz konserwatywno.

    c) koenzymy i witaminy bdce ich prekursorami

    Wiele enzymw do przeprowadzenia reakcji wymaga, poza substratem, obecnoci dodatkowej substancji niebiakowej, okrelanej jako koenzym. Wwczas sam biakow cz enzymu nazywamy apoenzymem, a poczenie apoenzym z koenzymem holoenzymem. Koenzymy zwikszaj moliwoci katalityczne enzymw

  • - - 27

    poza te wynikajce z obecnoci grup funkcyjnych reszt aa. Koenzymy cile zwizane z enzymami okrela si mianem grup prostetycznych. Obecnoci koenzymw wymagaj generalnie enzymy katalizujce reakcje redox, przenoszenia grup, izomeryzacji i tworzenia wiza kowalencyjnych (klasy EC 1, 2, 5 i 6), nie potrzebuj ich natomiast enzymy lityczne hydrolazy i liazy (EC 3 i 4). Czsto koenzym bywa rozpatrywany jako kolejny substrat reakcji po pierwsze poniewa zmienia si wraz z podstawowym substratem, po drugie gdy czsto to wanie jego przemiany s fizjologicznie istotne. Prekursorami wielu koenzymw s witaminy, g. z grupy B (por. niej). W zalenoci od przenoszonej grupy, koenzymy dzieli si na:

    ! przenoszce protony: NAD(P)+, FMN, FAD, CoQ, kwas liponowy, ! przenoszce inne grupy: fosforany sacharydw, CoA, DPT, PLP, koenzymy folianowe, biotyna,

    koenzymy kobalaminowe, kwas liponowy. W tabeli poniej przedstawiono najwaniejsze koenzymy i grupy prostetyczne, witaminy bdce ich

    prekursorami oraz przykady zawierajcych je enzymw.

    koenzym Lp. grupa skrt(y) pena nazwa witaminy przykad enzymu odnoniki

    1. NAD+,

    NADH dinukleotyd

    nikotynamidoadeninowy dehydrogenaza

    mleczanowa

    2.

    nukleotydy adeninowe NADP+,

    NADPH fosforan dinukleotydu

    nikotynamidoadeninowego

    PP dehydrogenaza glukozo-6-fosforanow

    3. FMN mononukleotyd flawinowy dehydrogenaza NADH

    4.

    nukleotydy flawinowe FAD dinukleotyd flawinoadeninowy

    B2 (ryboflawina) oksydaza -

    aminokwasw

    III-3

    5. - - kwas liponowy (lipoinowy) - oksydaza -ketokwasw III-10

    6. - CoA1 koenzym A kwas pantotenowy syntetaza kwasw

    tuszczowych III-9 i 10, V-5 i 6

    7. - CoQ koenzym Q, ubichinon - -2 III-5

    8. cytochromy b, c, c1, a, a3 cytochrom - -3 III-3, III-5

    9. - - biotyna H karboksylaza pirogronianowa IV-4-b

    10. - DPT difosfotiamina B1 (tiamina) dekarboksylaza pirogronianowa III-10

    11. - PLP fosforan pirydoksalu B6 (pirydoksal) transaminaza

    alaninowa VI-2-a

    12. - THF, FH4 tetrahydrofolian kwas foliowy

    hydroksymetylo-transferaza serynowa

    VI-4-h

    13. - - kobalamina B12 (kobalamina)

    mutaza metylomalonylo-

    CoA IV-4-b

    1 CoA = {P} + ryboza + adenina + 2 {P} + kwas pantotenowy + merkaptoetanoloamina kwas pantotenowy = kwas pantoinowy + -alanina 2 CoQ peni funkcj przenonika elektronw midzy metaloflawoproteinami a cytochromami w acuchu oddechowym 3 cytochromy s przenonikami elektronw w acuchu oddechowym

    d) swoisto dziaania enzymw

    W przeciwiestwie do katalizatorw nieorganicznych czy prostych katalizatorw organicznych, enzymy charakteryzuje wysoka swoisto substratowa i aktywno katalityczna, bdce wynikiem wyksztacenia miejsc katalitycznych dostosowanych do szybkiej i selektywnej katalizy indywidualnych reakcji.

    Jedn z najwaniejszych cech enzymw jest ich zdolno do swoistej katalizy tylko jednej reakcji (ew. jednego typu reakcji), dziki czemu szybko procesw metabolicznych moe by regulowana przez modyfikacj aktywnoci odpowiednich enzymw (por. punkt II-4).

  • - - 28

    Enzymy s stereoswoistymi katalizatorami; wikszo substratw tworzy z nimi 3 wizania, przez co czsteczki symetryczne pod wzgldem budowy chemicznej mog nabywa cech asymetrii (por. punkt V-1-d kwasy tuszczowe w pozycjach 1 i 3 glicerolu).

    Enzymy wykazuj absolutn swoisto optyczn dla przynajmniej jednej czsteczki substratu gwnie dla form D wglowodanw i form L aa. Wyjtkiem s epimerazy racemazy.

    Enzymy (poza pewnymi wyjtkami) wykazuj rwnie swoisto wobec okrelonego koenzymu, nawet jeli przenoszenie danej grupy moe si odbywa z udziaem innego (por. wyej).

    e) aktywno enzymw, jednostki aktywnoci

    Z powodu zazwyczaj bardzo maej iloci enzymw w materiale biologicznym czsto okrela si nie ilo

    samego biaka enzymatycznego, lecz jego aktywno katalityczn. Zakada si przy tym, e w warunkach badania szybko reakcji katalizowanej przez enzym zaley proporcjonalnie od iloci tego enzymu. Wobec tego ilo enzymu w prbce mona okreli na podstawie tempa ubytku substratw lub pojawiania si produktw w rodowisku reakcji. Wyniki podaje si odpowiednich jednostkach:

    IU midzynarodowa jednostka aktywnoci enzymu, oznaczajca tak jego ilo, ktra przemienia 1 mol reagentu w cigu 1 min.

    Katal (kat) jednostka SI aktywnoci enzymw i innych katalizatorw, oznacza ilo konwertujc 1 mol reagentu w czasie 1 s. Zwizek midzy katalem a IU przestawia si nastpujco: 1 kat = 60 mln U). Katal jest zatem jednostk wzgldnie du, dlatego w praktyce uywa si kat i nkat.

    Liczba obrotw enzymu ilo czsteczek substratu, ktre mog zosta przeksztacone przez enzym w produkt w cigu 1 sekundy. Zwykle wynosi ona od kilku tysicy do kilku milionw.

    Aktywno specyficzna jest to wyraenie aktywnoci enzymu, jak posiada jednostkowa masa biaka enzymatycznego, np. 1 U/mg oznacza, e 1 mg biaka posiada aktywno 1 IU.

    Aktywno cakowita jest to wyraenie aktywnoci enzymu, jak posiada jednostkowa masa lub objto materiau biologicznego, z ktrego ten enzym jest izolowany, np. 1 U/ml oznacza, e 1 ml pynu ustrojowego posiada dan aktywno enzymatyczn o wartoci 1 IU.

    Wyjtkowo w przypadku pewnych enzymw oznacza si ich bezwzgldn ilo metodami immunochemicznymi (por. punkt II-5-c CK-MB mass).

    f) kompartmentacja komrkowa enzymw

    Enzymy, ich substraty i koenzymy nie wystpuj zazwyczaj jednorodnie w obrbie komrki, lecz w jej okrelonych przestrzeniach, zwanych kompartmentami. Rozmieszczenie to mona bada metodami histochemicznymi. Kompartmetacja komrki umoliwia wzajemn izolacj jej przedziaw i zachodzenie w nich przeciwstawnych procesw biochemicznych, np. syntezy i degradacji tej samej grupy zwizkw.

    Rozmieszczanie w komrce przykadowych, kluczowych dla jej funkcjonowania, enzymw: cytoplazma: aldolaza, izomeraza fosfoheksozowa, dehydrogenza mleczanowa, aminotransferaza

    alaninowa, dehydrogenaza sorbitolowa, mitochondria: enzymy cyklu Krebsa, oksydazy, dehydrogenaza glutaminianowa, aminotransferaza

    asparaginianowa, ER: esterazy, reduktazy, acetylazy, GGTP, rybosomy: enzymy syntezy biaek, ceruloplazmina, cholinesteraza, lizosomy: proteazy, fosfatazy, kolagenazy

    g) izoenzymy

    Izoenzymy (izozymy) s to fizycznie odmienne formy tej samej aktywnoci katalitycznej, innymi sowy

    biaka o odmiennej strukturze, lecz katalizujce przebieg tej samej reakcji. Poszczeglne izoenzymy pojedynczej aktywnoci mog wystpowa w rnych kompartmentach subkomrkowych lub nawet w odmiennych typach komrek (tkankach std te czsto pochodz ich nazwy), rnic si dodatkowo powinowactwem do substratw (por. punkt IV-4-a aldolaza A i B).

    Izoenzymy s produktami ekspresji blisko spokrewnionych genw. Enzymy oligomeryczne z rnymi protomerami mog wystpowa w kilku postaciach, ponadto jedna tkanka moe produkowa jeden rodzaj protomeru, druga za inny. Jeli protomery mog czy si w rny sposb, aby utworzy aktywny enzym, tworz si wwczas tzw. izoenzymy rzekome danej aktywnoci. Okrela si je jako rzekome, gdy s to produkty asocjacji mniejszej liczby rodzajw protomerw. Np. dla LDH z 2 produktw translacji (posiadajcych odmienne mRNA) powstaje 5 izoenzymw rzekomych (patrz punkt II-5-b). Izoenzymy prawdziwe rni si natomiast tym, e kady z nich jest produktem translacji innego mRNA.

  • - - 29

    Znane s izoenzymy szeregu dehydrogenaz, oksydaz, transaminaz, fosfataz i proteaz. Rozdzia i identyfikacja izoenzymw okrelonych aktywnoci ma istotne znaczenie diagnostyczne (por. punkt II-5).

    h) izolacja enzymw

    Enzymy mog by otrzymywane przez oczyszczanie z komrek ywych organizmw, w ktrych naturalnie wystpuj, bd metodami rekombinacji DNA z komrek, gdzie fizjologicznie ich brak. Ze wzgldu na szybki wzrost uywa si do tych celw komrek drody i bakterii. Ponadto techniki ukierunkowanej mutagenezy pozwalaj na manipulacj skadem aa rekombinowanego enzymu, np. w celu okrelenia roli strukturalno funkcjonalnej pewnych jego regionw (czy nawet pojedynczych reszt aa).

    Do technik oczyszczania enzymw z materiau biologicznego zaliczamy: strcanie solami o rnych steniach ((NH4)2SO4, Na2SO4) lub rozpuszczalnikami (aceton, etanol), rnicow denaturacj ciepln, denaturacj spowodowan zmianami pH, wirowanie rnicowe, elektroforez, filtracj elow, chromatografi jonowymienn (jonity: A DEAE/C, K CMC), sczenie na sitach molekularnych oraz chromatografi powinowactwa (z uyciem substratw, pochodnych koenzymw lub barwnikw organicznych, ligandw hydrofobowych). Homogenno biaka (tu enzymu) potwierdza si technik PAGE SDS lub elektroforez dwuwymiarow.

    Technologii rekombinacji DNA skada si z kilku etapw: sklonowanie genu kodujcego enzym zsekwencjonowanie genu wprowadzenie do wektorw plazmidowych lub fagowych umieszczenie w docelowym genomie. Ostatecznie gen enzymu powinien znale si pod kontrol silnego promotora, najlepiej z moliwoci jego kontroli przez specyficznie chemicznie induktor wwczas podanie tego ostatniego do poywki wzrostowej spowoduje produkcje enzymu w ilociach wielokrotnie wikszych ni naturalnie. Technologia ta moe by stosowana do otrzymywania zmodyfikowanych tzw. fuzyjnych biaek. W tym celu do oryginalnego genu docza si tak sekwencj, aby powstay biakowy produkt by odpowiednim ligandem dla specyficznego nonika w chromatografii powinowactwa, po czym po rozdzieleniu usuwa si dodany fragment (tzw. domen fuzyjn).

    2. Mechanizmy dziaania enzymw

    a) typy reakcji enzymatycznych przy dwch substratach

    Cho rozwaania dotyczce reakcji enzymatycznych najprociej jest przedstawi i zrozumie w sytuacji pojedynczy substrat : pojedynczy produkt, to w rzeczywistoci wikszo reakcji obejmuje dwa lub wicej substratw i produktw. Ich liczb okrela si terminami: uni-, bi-, ter-, quad- itd., za rodzaj reakcji ze wzgldu na liczb reagentw przez podanie terminw okrelajcych ilo substratw i produktw. Bardzo czsto spotykane s reakcje


Historia mediów - skrypt

Historia mediów - skrypt

skrypt z filozofii

skrypt z filozofii

Skrypt z cytofizjologii

Skrypt z cytofizjologii

Podstawy teleinformatyki - skrypt

Podstawy teleinformatyki - skrypt

Gazownictwo skrypt

Gazownictwo skrypt

biochemia- skrypt

biochemia- skrypt

Hps Skrypt

Hps Skrypt

Skrypt Biofizyka

Skrypt Biofizyka

Skrypt higiena

Skrypt higiena

El en Skrypt

El en Skrypt

Mathcad skrypt

Mathcad skrypt

Skrypt szkoleniowy

Skrypt szkoleniowy

Fizstat skrypt

Fizstat skrypt

skrypt z Boncy

skrypt z Boncy

Rachunek wyrównawczy - skrypt

Rachunek wyrównawczy - skrypt

Skrypt (Prof. Sperka)

Skrypt (Prof. Sperka)

Skrypt APSC

Skrypt APSC

Skrypt mat

Skrypt mat

Skrypt Do Specjalizacji

Skrypt Do Specjalizacji

Bardach - skrypt 2

Bardach - skrypt 2