SKRÍNING LIEKOV

4.10.2017, BRATISLAVA

JANA STACHOVÁ

2

o Liečivá, príčina otráv a ich prejavy o Intoxikácie liečivami o Laboratórna diagnostika otráv o Skríning liekov

― imunochemické metódy (kvalitatívne, semikvantitatívne, kvantitatívne)

― izolácia liečiv a ich metabolitov frakčnou extrakciou (kyslá, alkalická, hydrolýza)

― základný skríning na neznáme lieky

― skríning na benzodiazepíny

― vyhodnocovanie - chromatografické metódy (TLC, GC-MS, HPLC)

OBSAH

3

Liečivá sú prostriedky, ktoré sa využívajú: o na ochranu zdravia

o liečenie a diagnostiku chorobných stavov

o na kontrolu fyziologických a patofyziologických procesov

LIEČIVÁ

4

Lieky sú najčastejšou príčinou otráv. Otravy liečivami tvoria až 45 % všetkých otráv.

o z hľadiska okolností intoxikácií liečivami býva príčinou nešťastná náhoda (58%), samovražda (27%), abúzus liečiv (3%) a profesionálna otrava (3%)

PRÍČINA OTRÁV

5

Charakter prejavov: 1. mierny – GIT dyskomfort, nauzea, mierne bolesti v rôznych lokalitách – brucho, hlava

2. stredne závažný – silné bolesti v oblasti GIT, hlavy, slabosť, búšenie srdca, kolapsový

stav, poruchy videnia, sluchu 3. závažný a život ohrozujúci – bezvedomie, areflexia, poruchy srdcového rytmu, krvácanie

a poškodenie krvotvorby, zlyhávanie hemodynamiky, obličiek, pečene, infekcia a iné.

PREJAVY OTRÁV

6

INTOXIKÁCIE LIEČIVAMI

V súčasnosti sa paleta liečiv spôsobujúcich intoxikácie oproti minulosti zmenila. Najčastejšie sa vyskytujú intoxikácie analgetikami (paracetamol), benzodiazepínmi (hypnotiká, anxiolytiká), antipsychotikami, antidepresívami, antiepileptikami, antihistaminikami.

7

LABORATÓRNA DIAGNOSTIKA OTRÁV

Cieľom laboratórneho toxikologického vyšetrenia je:

o potvrdiť alebo vylúčiť diagnózu otravy o zachytiť a identifikovať čo najširšie spektrum liekov

Je potrebné: o uvádzať dostupné anamnestické údaje, popis klinických príznakov, uvádzať dobu odberu

vzorky, liekovú terapiu pacienta, označiť predpokladanú škodlivinu o biologický materiál: moč, žalúdočný obsah, krv (napomáha posúdiť závažnosť otravy)

“zlatý štandard“ v klinickej toxikológii:

o imunochemické metódy (kvalitatívne, kvantitatívne) o chromatografické metódy (TLC, HPLC a GC/MS)

8

TOXIKOLOGICKÁ ŽIADANKA

9

Každá toxikologická analýza je samostatná vedecká práca.

SKRÍNING LIEKOV

10

SKRÍNING LIEKOV

Analýza sa začína jednoduchým skríningovým imunochemickým testom (na základe cut-off hodnoty, ktorú uvádza výrobca, sa hodnotia výsledky testu ako pozitívne alebo negatívne).

11

Imunochemické testy - rýchle orientačné záchytové testy, ktoré dávajú vstupnú informáciu v

urgentných stavoch pri podozrení na otravu liekmi.

Kvalitatívne testy:

o barbituráty

o tricyklické antidepresíva

o benzodiazepíny (moč, krv)

o tramal

Kvantitatívne testy – analyzátory

o CMIA (chemiluminiscenčná imunoanalýza na mikročasticiach)

o komerčné kity, ktoré sú štandardizované a validované výrobcom.

IMUNOCHEMICKÉ METÓDY KVALITATÍVNE

12

IMUNOCHEMICKÉ METÓDY KVANTITATÍVNE

U nás kvantitatívne stanovujeme v krvi hladiny:

o digoxínu

o kyseliny valproovej

o teofylínu

o fenobarbitalu

o fenytoínu

o karbamazepínu

Výhoda: rýchla dostupnosť výsledkov a vysoká citlivosť.

Architect i1000SR

13

IMUNOCHEMICKÉ METÓDY SEMIKVANTITATÍVNE

Stanovenie benzodiazepínov v sére semikvantitatívne:

o homogénna enzýmová imunoanalýza s využitím tekutých reagenčných roztokov

o analýza využíva špecifické protilátky so schopnosťou odhalenia väčšiny benzodiazepínov a ich metabolitov v sére

AU 5812

14

IZOLÁCIA LIEČIV A ICH METABOLITOV FRAKČNOU EXTRAKCIOU o zložitá a časovo náročná úprava vzorky

o dominantný dopad na konečné výsledky:

―zvolený postup extrakcie

―odstránenie balastných látok

―čistota výsledného extraktu

o Základný skríning na neznáme lieky pozostáva z kyslej a alkalickej extrakcie:

– 1. okyslenie moča alebo žalúdočného obsahu

– 2. extrakcia dietyléterom

– 3. spojenie oboch extraktov a odparenie do sucha

o kyslý éterový extrakt ExK - I. extrakčná frakcia:

―liečivá kyslého charakteru

―prvý podiel neutrálnych liečiv

15

IZOLÁCIA LIEČIV A ICH METABOLITOV FRAKČNOU EXTRAKCIOU

– 4. alkalizácia zvyšného močového (žalúdočného) extraktu

– 5. extrakcia dietyléterom

– 6. spojenie oboch extraktov a okyslenie

– 7. odparenie do sucha - alkalický extrakt ExA – II. extrakčná frakcia:

- zásadité liečivá - ďalší podiel neutrálnych liečiv

– 8. rozpustenie odparkov v etylacetáte

16

CHROMATOGRAFIA NA TENKEJ VRSTVE TLC

Separácia prítomných látok

o chromatografia na tenkej vrstve (TLC)

o plynová chromatografia s hmotnostným spektrometrom (GC-MS)

o TLC - najrozšírenejšia metóda pre svoju citlivosť, flexibilitu a stanovenie nízkych

koncentrácií látok

o stacionárna fáza – tenká vrstva silikagélu

o mobilná fáza - zmesi rozpúšťadiel o rôznych polaritách, často s prídavkom kyseliny alebo

amoniaku, aby sa potlačila ionizácia analytov, ktoré majú povahu slabých kyselín alebo

zásad.

17

o nanesenie biologického materiálu spolu so štandardnou zmesou látok na silikágel o štandardom pre kyslé látky je fenobarbital, pre alkalické a neutrálne látky AKFAD o deliaci proces prebieha v uzavretej chromatografickej komore (kyvete) v zmesi

rozpúšťadiel (etylester kyseliny octovej – etanol - amoniak) o vyhodnotenie fluorescencie v UV svetle (254 nm aj 356 nm)

CHROMATOGRAFIA NA TENKEJ VRSTVE TLC

18

ZÁKLADNÝ SKRÍNING NA LIEKY

o identifikácia liečiv - postrekom s detekčnými činidlami, zaradenie škvŕn do 5.tried:

― I. Marquisovo činidlo

― II. p – DMAB

― III. síran ceričitý

― IV. chlorid zlatitý

―V. Dragendorffovo činidlo / 50% kyselina sírová (zvýraznenie škvŕn)

o výsledkom je chromatogram, na ktorom sa hodnotí poloha látky voči štandardnej zmesi ako aj jej reaktívnosť (vznik farebnej škvrny v mieste rozdelenej látky).

19

SKRÍNING NA BENZODIAZEPÍNY

Hydrolýza H - tretia frakčná izolačná technika, ktorej cieľom je získať liečivá alebo metabolity vylučované vo forme konjugátov (benzodiazepínové deriváty) Pracovný postup: 1. zmes moča, vody a konc. HCl – var 2. po ochladení neutralizácia NaOH 3. extrakcia dietyléterom 4. spojenie extraktov a odparovanie do sucha – frakcia H

20

SKRÍNING NA BENZODIAZEPÍNY

5. rozpustenie odparku v etylacetáte ―na silufol nanesieme extrakt hydrolýzy a štandard DONL

(diazepam, oxazepam, nitrazepam lexaurin)

―vyvíjanie v chromatografickej komore (benzén-etylacetát)

―detekcia chromatogramu detekčným činidlom Breton-Marshall I, II

―vyhodnotenie chromatogramu vizuálne

―potvrdenie prítomnosti liečiva GC/MS

21

GC-MS

o GC-MS - nepostrádateľná technika v toxikológii

– veľká separačná účinnosť a citlivosť

– dobrá výpovedná schopnosť o štruktúre analyzovaných látok

– mobilnou fázou je nosný inertný plyn (hélium)

– stacionárna fáza – kolóna – delenie látok o Základný proces v MS – 5 etáp:

– prívod vzorky a jej splynenie

– ionizácia molekúl

– separácia vzniknutých iónov podľa hmotnostnej škály

– detekcia vzniknutých iónov

– registrácia vzniknutých spektier počítačom

22

GC-MS: ALKALICKÝ EXTRAKT

o Výsledkom separácie je chromatografický záznam. Na dôkaz neznámych látok používame hmotnostný detektor (MS). Na základe výšky píku vieme určiť množstvo lieku.

23

GC-MS: KYSLÝ EXTRAKT

o Automatické vyhľadávanie kandidátov toxickej látky zo širokej škály databázy liekov

24

GC-MS: HYDROLÝZA

o Data Analysis – Spectrum – Library Search Report

25

GC-MS: POROVNANIE S KNIŽNICOU

o Vlastné hmotnostné spektrum predstavuje čiarový graf, v ktorom výška každej čiary predstavuje početnosť príslušnej efektívnej hmoty.

26

GC-MS: POROVNANIE S KNIŽNICOU

o knižnice spektier: pomocou programového vybavenia počítača vieme porovnávať spektra štandardov v knižniciach s nameranými spektrami analyzovaných látok

27

PLYNOVÝ CHROMATOGRAF S DETEKTOROM HMOTNOSTNÉHO SPEKTRA o GC Agilent 6890N, MS Agilent 5793N, Injector 7683

28

VYHODNOTENIE GC-MS

Semikvantitatívne vyhodnotenie MS

0 – 100 000 stopy

100 000 – 500 000 +

500 000 – 1 000 000 ++

1 000 000 – 5 000 000 +++

5 000 000 – 10 000 000 ++++

> 10 000 000 masa

29

TABUĽKA NAJČASTEJŠÍCH INTOXIKÁCIÍ LIEKMI

Skupina liečiv Liečivo

Analgetiká Tramal, Metamizol

Antipyretiká Paracetamol, Salicylany

Antireumatiká Ibuprofén

Benzodiazepíny Diazepam, Oxazepam, Nitrazepam, Lexaurin,

Rivotril

Antidepresíva Citalopram, Venlafaxin, Quetiapin, Mirtazapin,

Sertralin, Trittico

Antihypertenzíva Bisoprolol

Tricyklické antidepresíva Dosulepin, Imipramin, Noveril, Doxepin,

Amitriptylín

30

o Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia (HPLC, predtým označovaná ako vysokotlaková kvapalinová chromatografia) je chromatografická technika používaná na oddelenie, identifikáciu a kvantifikáciu každej zložky v zmesi.

o Stanovenie v sére: lamictal, tiopental

HPLC

31

„Veľakrát je najlepším liekom žiadny liek.“

Hippokratés

ZÁVER

32

ĎAKUJEM ZA POZORNOSŤ