SÍNTESE DE CARBOIDRATOS POR MICROALGAS E … cludia... · CAPÍTULO II: REVISÃO DA ... 10 ( ), 11...

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE

ESCOLA DE QUÍMICA E ALIMENTOS

PÓS-GRADUÇÃO EM ENGENHARIA E CIÊNCIA DE ALIMENTOS

SÍNTESE DE CARBOIDRATOS POR MICROALGAS E PRODUÇÃO DE

BIOETANOL

Ana Cláudia Freitas Margarites

Tese apresentada como um dos

requisitos para obtenção do título de

Doutora no Programa de Pós-

Graduação em Engenharia e Ciência

de Alimentos da Universidade

Federal do Rio Grande.

.

Prof. Dr. Jorge Alberto Vieira Costa

Orientador

Rio Grande/RS

2014

Dedico este trabalho

a todas as pessoas que, de uma forma ou de outra,

colaboraram para que esse trabalho se tornasse realidade.

AGRADECIMENTOS

Ao Prof. Dr. Jorge Alberto Vieira Costa,

pela oportunidade de realizar este trabalho, orientação, confiança e incentivo.

Ao meu marido Cristiano Rocha Peres,

por todo amor, companheirismo e incentivo.

À minha mãe Claudeti Freitas Margarites,

por sempre acreditar que eu seria capaz.

Ao meu pai Paulo Valdeci Gomes Margarites (in memoriam),

que serviu de inspiração nas horas de dificuldade.

Aos meus irmãos Ane, Paula e Marcus,

pelo incentivo e grandes colaborações.

Às Prof. Dr. Telma Elita Bertolin e Luciane Maria Colla,

pela oportunidade em realizar parte dos experimentos em Passo Fundo.

Às Professoras Doutoras Jaqueline Garda Buffon e Michele da Rosa Andrade

Zimmermann de Souza

pelas grandes contribuições no exame de qualificação.

Às Dra. Jaqueline Garda Buffon, Dra. Michele da Rosa Andrade Zimmermann de

Souza, Dra. Luciane Maria Colla, Dra. Lucielen Oliveira dos Santos

Pela compreensão e por não medirem esforços para participarem da banca de defesa.

Aos queridos Noany Volpato, Elenara de Araújo e Luana Garbin Cardoso

pelo empenho, dedicação e colaboração na realização deste trabalho.

Aos amigos queridos Luiza Moraes, Pâmela Goularte, Gabriel da Rosa e

Roberta Martins,

pela companhia nas muitas madrugadas no LEB, amizade e companheirismo. A participação

de vocês foi essencial na elaboração deste trabalho!

À querida amiga Joice Aline Borges,

pela grande colaboração na execução deste trabalho.

À querida amiga Elisângela Martha Radmann,

pela incansável colaboração e incentivo.

Às amigas Lisiane Carvalho, Thaisa Santos, Cristiane Lisboa,

Ana Priscila Centeno da Rosa

Pela amizade e grandes ensinamentos.

À todos os integrantes do LEB,

por tornarem o ambiente de trabalho a minha segunda casa.

Ao Roque Zilio,

por sempre estar à disposição em me ajudar.

À Universidade Federal do Rio Grande e Programa de Pós Graduação em Engenharia e

Ciência de Alimentos

por me proporcionar a grande oportunidade de realizar o Doutorado.

À Capes

pela concessão de bolsa de estudos.

...Por hoje é só

Vou deixar passar a tempestade

Talvez amanhã

Água pura e toda verdade

Mar azul, céu azul sem nuvens

Logo ali, depois da curva

Ali, logo ali,

Ali, depois da curva.

.

Duca Leindecker e Humberto Gessinger

SÍNTESE DE CARBOIDRATOS POR MICROALGAS E PRODUÇÃO DE

BIOETANOL

RESUMO

A maior parte da energia hoje consumida no mundo é derivada de fontes como petróleo,

carvão e gás natural. Essas fontes, no entanto, não são renováveis e podem se esgotar em data

futura. Nas últimas décadas, as fontes renováveis de combustíveis de base biológica, em

especial o bioetanol, têm sido consideradas como alternativa à matriz energética

convencional. Porém, existe a necessidade de ampliação da oferta de matérias-primas para

produção de etanol, sem pressionar a área plantada para produção de alimentos, o que tem

levado empresas e países a investirem em pesquisas para maior utilização de outras matérias-

primas. As microalgas surgem como uma das alternativas mais promissoras para a produção

de bioetanol, sendo que modificações nas condições de cultivo podem propiciar incremento

na concentração de carboidratos destas. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi avaliar a

influência da concentração de nutrientes na concentração de carboidratos de microalgas e

produzir bioetanol a partir destas. Avaliou-se a síntese de carboidratos das microalgas

Chlorella homosphaera e Spirulina platensis LEB 52 em cultivos mixotróficos com

diferentes concentrações do componente nitrogenado e cloreto de sódio adicionados aos

meios de cultivo. Para a microalga Chlorella minutissima, foram avaliados os efeitos do meio

de cultivo e das concentrações dos componentes nitrogenado e fosfatados utilizados no meio

de cultivo da microalga sobre a concentração de carboidratos desta. Foram realizadas

fermentações alcoólicas utilizando como substrato biomassa das microalgas Chlorella

pyrenoidosa e Spirulina sp. LEB 18 acrescidos de glicose e sacarose. Para a microalga

Chlorella homosphaera, a maior produtividade em carboidratos foi obtida nos ensaios

realizados com a maior concentração de KNO3 com menor concentração de NaCl e menor

concentração de KNO3 com maior concentração de NaCl (0,014±0,001 g.L-1

.d-1

e

0,015±0,002 g.L-1

.d-1

, respectivamente). A maior produtividade em carboidratos nos cultivos

de Spirulina platensis LEB 52 (0,116±0,002 g.L-1

.d-1

) foi verificada no experimento no qual a

microalga foi cultivada nas menores concentrações de NaNO3 e NaCl. A microalga Spirulina

platensis LEB 52 apresentou maior produtividade em carboidratos quando comparada à

microalga Chlorella homosphaera. A microalga Chlorella minutissima cultivada em meio

Basal, com adição de 0,125 g.L-1

do componente nitrogenado (KNO3) e sem adição dos

componentes fosfatados (K2HPO4 e KH2PO4) apresentou a maior produtividade em

carboidratos nos cultivos (0,030±0,002 g.L-1

.d-1

). O ensaio com biomassa de Spirulina sp.

LEB 18 com adição de glicose apresentou eficiência superior na formação de etanol e

produtividade em etanol (68,487±2,592% e 1,182±0,051g.L-1

.h-1

, respectivamente).

Palavras-chave: fermentação alcoólica, nutrientes, microalgas.

SUMMARY OF CARBOHYDRATES BY MICROALGAE AND BIOETHANOL

PRODUCTION

ABSTRACT

Most of the energy consumed in the world today is derived from sources such as petroleum,

coal and natural gas. These sources, however, are not renewable and can be depleted at a

future date. In the last few decades, renewable biobased fuels, especially ethanol, started to be

considered as an alternative to conventional energy sources. However, there is a need to

expand the supply of raw materials for ethanol production, without pressing the acreage for

food production, which has led companies and countries to invest in research to increased use

of other raw materials. Microalgae appear as one of the most promising alternatives for the

production of bioethanol, and changes in culture conditions may provide an increase in the

concentration of these carbohydrates. In this context, the aim of this study was to evaluate the

influence of the concentration of nutrients in carbohydrate concentration of microalgae and

produce bioethanol from these. We evaluated the synthesis of carbohydrates from microalgae

Chlorella homosphaera and Spirulina platensis LEB 52 in mixotrophic cultures with different

concentrations of nitrogen component and sodium chloride added to the culture medium. For

microalgae Chlorella minutissima, it was made an evaluation of the effects of the medium and

the concentrations of nitrogen and phosphate components used in the culture medium of

microalgae on the concentration of this carbohydrate. Fermentations were carried out using as

substrate biomass from microalgae Chlorella pyrenoidosa and Spirulina sp. LEB 18 plus

glucose and sucrose. For the microalgae Chlorella homosphaera, the highest productivity in

carbohydrates was obtained in the tests with the highest concentration of KNO3 with lower

concentration of NaCl, and lower concentration of KNO3 with a higher concentration of NaCl

(0,014±0,001 g.L-1

.d-1

e 0,015±0,002 g.L-1

.d-1

, respectively). The highest productivity in

carbohydrates in cultures of Spirulina platensis LEB 52 (0,116±0,002 g.L-1

.d-1

) was observed

in the experiment in which the microalgae was cultured in lower concentrations of NaCl and

NaNO3. The Spirulina platensis LEB 52 showed higher productivity in carbohydrates when

compared to microalgae Chlorella homosphaera. The microalgae Chlorella minutissima

cultured in Basal, with the addition of 0.125 gL-1

of nitrogen component (KNO3) and without

the addition of phosphate components (K2HPO4 and KH2PO4) showed a higher productivity

in carbohydrates in cultures (0,030±0,002 g.L-1

.d-1

). The test with biomass from Spirulina sp.

LEB 18 with the addition of glucose had higher efficiency in productivity and formation of

ethanol (68.487±2.592 % and 1.18±20.051 gL-1

.h- 1

, respectively).

Keywords: alcoholic fermentation, nutrients, microalgae.

LISTA DE FIGURAS

CAPÍTULO II: REVISÃO DA LITERATURA

Figura 1- Representação da cadeia de Amilose (a) e amilopectina (b) ......................... 22

Figura 2 - Células de Saccharomyces cerevisiae. ......................................................... 25

CAPÍTULO III: DESENVOLVIMENTO DO TRABALHO

ARTIGO I: Teores de carboidratos de Spirulina platensis e Chlorella homosphaera

cultivadas em diferentes concentrações de nitrogênio e cloreto de sódio e em condições

mixotróficas

Figura 1- Curvas de crescimento dos ensaios dos Planejamentos experimentais das

microalgas (a) Chlorella homosphaera: 1 (◊), 2(■), 3(►), 4 () e controle (○) e (b)

Spirulina platensis LEB 52: 1 (◊), 2(■), 3(►), 4 () e 5 ensaio controle (○). .............. 42

Figura 2- Superfícies de Resposta para produtividade em carboidratos (g.L-1

.d-1

) nos

ensaios dos Planejamentos Experimentais de Chlorella homosphaera (a) e ................. 45

Spirulina platensis LEB 52 (b). ...................................................................................... 45

Figura 3 – Maiores teores de carboidratos e produtividades em carboidratos verificados

para as microalgas Chlorella homosphaera e Spirulina platensis LEB 52 em função dos

ensaios realizados. .......................................................................................................... 46

ARTIGO II: Concentração de carboidratos da microalga Chlorella minutissima cultivada

em diferentes meios e concentrações dos componentes nitrogenado e fosfatados

Figura 1 – Curvas de crescimento dos ensaios do Planejamento Box-Behenken para

Chlorella minutissima: (a) 1 (); 2 (); 3 (); 4 (□); 5 (○); 6 (x); (b) 7 (►); 8 (▲); 9

(); 10 (■), 11 (●);12 (◘) e (c) 13 (◄); 14 ();15 (). ............................................... 57

ARTIGO III: Produção de bioetanol a partir de microalgas em processo com adição de

glicose e sacarose

Figura 1 - Concentrações de (▲) Açúcar redutor (%), () Etanol (%) e () Biomassa

(g.L-1

) dos ensaios: (a) Sa - 110% sacarose; (b) G - 100% glicose; (c) SSa - 50% de

biomassa de Spirulina e 50% de sacarose; (d) CSa - 50% de biomassa de Chlorella e

50% de sacarose; (e) SG - 50% de biomassa de Spirulina e 50% glicose; (f) CG - 50%

de biomassa de Chlorella e 50% glicose; (g) S -100% biomassa de Spirulina e (h) C -

100% biomassa de Chlorella. ......................................................................................... 72

LISTA DE TABELAS

CAPÍTULO III: DESENVOLVIMENTO DO TRABALHO



mixotróficas

Tabela 1 – Níveis codificados e reais das variáveis concentração de nitrato de potássio

(KNO3 -X1) e cloreto de sódio (NaCl - X2) concentrações de nitrato de sódio (KNO3 -

X1) e cloreto de sódio (NaCl - X2) do Planejamento Fatorial Completo 22 utilizado para

avaliar a influência das destas sobre o acúmulo de carboidratos na microalga Chlorella

homosphaera. .................................................................................................................. 38

Tabela 2 - Níveis codificados e reais das variáveis concentração de nitrato de sódio (N

aNO3 -X1) e cloreto de sódio (NaCl - X2) do Planejamento Fatorial Completo 22

utilizado para avaliar a influência das destas sobre o acúmulo de carboidratos na

microalga Spirulina platensis LEB 52. ........................................................................... 39

Tabela 3 - Concentração final de biomassa (Xf), velocidade específica máxima de

crescimento (μmáx), produtividade máxima (Pmáx), intervalo de tempo da fase

exponencial de crescimento (fase log) e concentração de carboidratos e produtividade

de carboidratos obtidos pela microalga Chlorella homosphaera segundo o Planejamento

Fatorial Completo 22

e experimento controle (5). ........................................................... 42


crescimento (μmáx), intervalo de tempo da fase exponencial de crescimento (fase log) e

concentração de carboidratos obtidos pela microalga Spirulina platensis LEB 52 nos

experimentos realizados segundo o Planejamento Fatorial Completo 22

e ensaio controle

(5). ................................................................................................................................... 43

Tabela 5 - Estimativa dos efeitos das concentrações de KNO3 (g.L-1

) e NaCl (g.L-1

),

para a microalga Chlorella homosphaera, e concentrações de NaNO3 (g.L-1

) e NaCl

(g.L-1

), para a microalga Spirulina platensis LEB 52, na produtividade em carboidratos

(g.L-1

.d-1

), ao nível de 95% de confiança. ....................................................................... 44


em diferentes meios e concentrações dos componentes nitrogenado e fosfatados

Tabela 1- Níveis reais e codificados (entre parênteses) das variáveis concentração do

componente nitrogenado (KNO3) e componentes fosfatados (K2HPO4 e KH2PO4)

utilizados nos cultivos da microalga C. minutissima. ..................................................... 55

Tabela 2- Concentração de biomassa final (Xf), produtividade celular máxima (Pmáx),

velocidade específica máxima de crescimento (µmáx), intervalo de tempo da fase

exponencial, concentrações de carboidratos na biomassa seca e produtividade em

carboidratos de Chlorella minutissima. .......................................................................... 58

Tabela 3 - Estimativa dos efeitos lineares (L) e quadráticos (Q) do meio de cultivo,

componente nitrogenado e componentes fosfatados na produtividade em carboidratos

nos cultivos da microalga Chlorella minutissima, ao nível de 90% de confiança. ........ 59


glicose e sacarose

Tabela 1 - Tempo transcorrido nas fermentações (tfermentação), fator de conversão de

substrato em célula (YX/S), fator de conversão de substrato em produto (YP/S),

produtividade em etanol (Petanol) e eficiência na produção de etanol (η). ....................... 73

ANEXOS

Tabela 1 - Quantidades (g) de reagentes para preparo do meio Zarrouk. ...................... 90

Tabela 2- Quantidades (mL) das soluções para o meio Zarrouk. .................................. 90

Tabela 3- Quantidades (g) de reagentes para preparo do meio MBM ........................... 91

Tabela 4- Quantidades (mL) das soluções para o meio MBM ...................................... 91

Tabela 5 - Quantidades (g) de reagentes para preparo do meio Basal. .......................... 92

Tabela 6 - Quantidades (mL) das soluções para o meio Basal. ..................................... 92

Tabela 7 - Quantidades (g) de reagentes para preparo do meio BG-11. ........................ 93

Tabela 8 - Quantidades (mL) das soluções para o meio BG-11. ................................... 93

SUMÁRIO

CAPÍTULO I ............................................................................................................................ 14

1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................. 15

2 OBJETIVOS ...................................................................................................................... 16

2.1 Objetivo geral ............................................................................................................. 16

2.2 Objetivos específicos .................................................................................................. 16

3 JUSTIFICATIVA .............................................................................................................. 17

CAPÍTULO II........................................................................................................................... 20

5 REVISÃO DA LITERATURA ......................................................................................... 21

5.1 Bioetanol ..................................................................................................................... 21

5.1.1 Matérias-primas utilizadas para a produção de etanol......................................... 21

5.1.2 Fermentação Alcoólica ........................................................................................ 24

5.1.2.1 Agentes da fermentação alcoólica ................................................................ 25

5.2 Microalgas .................................................................................................................. 26

5.2.1Fatores referentes ao cultivo ................................................................................. 26

5.2.1.1 Luminosidade ............................................................................................... 27

5.2.1.2 Salinidade ..................................................................................................... 27

5.2.1.3 Nitrogênio ..................................................................................................... 28

5.2.1.4 Fósforo .......................................................................................................... 28

5.2.1.5 Carbono ........................................................................................................ 28

5.2.1.5.1 Cultivos mixotróficos ............................................................................ 29

5.2.2 Carboidratos e sua constituição em microalgas ................................................... 30

5.2.2.1 Modificações nos cultivos objetivando elevados teores de carboidratos em

microalgas ................................................................................................................. 30

5.2.3 Hidrólise dos carboidratos de microalgas ............................................................ 31

CAPÍTULO III ......................................................................................................................... 33



mixotróficas ...................................................................................................................... 35

RESUMO ..................................................................................................................... 35

ABSTRACT ................................................................................................................. 36

2 MATERIAL E MÉTODOS ....................................................................................... 38

3 CONCLUSÕES ........................................................................................................ 47

REFERÊNCIAS ........................................................................................................... 48


em diferentes meios e concentrações dos componentes nitrogenado e fosfatados .......... 52

RESUMO ..................................................................................................................... 52

ABSTRACT ................................................................................................................. 53

1 INTRODUÇÃO ........................................................................................................ 54

2 MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................... 54

2.2 Determinações analíticas durante os cultivos da microalga ............................... 56

2.2.1 Crescimento celular ..................................................................................... 56

2.2.2 Determinação de carboidratos ..................................................................... 56

3 RESULTADOS E DISCUSSÃO .............................................................................. 57

3 CONCLUSÕES ........................................................................................................ 62

REFERÊNCIAS ........................................................................................................... 62


glicose e sacarose ............................................................................................................. 65

RESUMO ..................................................................................................................... 65

ABSTRACT ................................................................................................................. 66

1 INTRODUÇÃO ........................................................................................................ 67

2 MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................... 67

2.1 Determinação de carboidratos da biomassa de microalgas ................................ 67

2.2 Hidrólise da biomassa de microalgas ................................................................. 68

2.3 Fermentação Alcoólica ...................................................................................... 68

2.3.1 Micro-organismo ......................................................................................... 68

2.3.2 Processo Fermentativo ................................................................................ 68

2.3.2.1 Determinação da concentração de biomassa de S. cerevisiae .............. 69

2.3.2.2 Determinação de açúcares redutores .................................................... 69

2.3.2.3 Determinação da concentração de etanol ............................................. 70

2.3.2.4 Parâmetros cinéticos ............................................................................ 70

2.4 Análise estatística ............................................................................................... 71

3 RESULTADOS E DISCUSSÃO .............................................................................. 71

3 CONCLUSÕES ........................................................................................................ 75

REFERÊNCIAS ........................................................................................................... 76

CAPÍTULO IV: CONCLUSÕES GERAIS ............................................................................. 78

6 CONCLUSÕES GERAIS ................................................................................................. 79

7 SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS ............................................................. 80

CAPÍTULO V: REFERÊNCIAS ............................................................................................. 81

REFERÊNCIAS ................................................................................................................... 82

ANEXO A: Meio Zarrouk ........................................................................................................ 90

ANEXO B: Meio Bristol`S Modificado (MBM) ..................................................................... 91

ANEXO C: Meio Basal ............................................................................................................ 92

ANEXO D: Meio BG-11 .......................................................................................................... 93

CAPÍTULO I

15

1 INTRODUÇÃO

A crise do petróleo que se instaurou nas últimas décadas, aliada ao aumento da

demanda por combustíveis e à crescente preocupação com o meio ambiente, preconizou a

busca por fontes alternativas de energia no Brasil e no mundo. As pesquisas têm se

concentrado no desenvolvimento de novos insumos básicos, de caráter renovável, para a

produção de combustíveis que possam substituir os derivados de petróleo, o que coloca a

biomassa em um papel de destaque, em razão da sua natureza renovável, ampla

disponibilidade, biodegradabilidade e baixo custo.

Os problemas associados à expansão da oferta dos biocombustíveis convencionais

explicam a atenção dedicada aos processos avançados de obtenção de combustíveis líquidos

com base na biomassa. De fato, tais processos permitiriam o emprego, em grande escala, de

matérias-primas que fossem provenientes de áreas pouco adequadas à agricultura

convencional, diminuindo assim a pressão sobre a produção de alimentos.

Além do desenvolvimento científico e tecnológico, uma questão que permeia a

utilização de biomassa para produzir combustível é a preocupação entre a segurança alimentar

e energética. Diversos países e organizações internacionais mostram a preocupação no

aumento da crise mundial dos alimentos, argumentando que ela foi agravada pelo

deslocamento das áreas tradicionalmente utilizadas no cultivo de alimentos para a produção

de insumos destinados à indústria dos biocombustíveis.

O uso de matérias-primas alternativas emerge como fundamental para a

expressiva ampliação pretendida com a produção de etanol, que hoje esbarraria em limitações

para expansão da área plantada, seja por competir com a produção de alimentos, seja pelo

nível de seus preços relativos frente ao petróleo e aos próprios alimentos.

As microalgas têm atraído interesse mundial como um meio alternativo para as

produções de energia sustentável. Modificações nas condições de cultivo podem proporcionar

aumento no teor de carboidratos destas que, posteriormente, podem ser utilizados como

substrato para a produção de bioetanol.

16

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo geral

Avaliar a influência de concentração de nutrientes no teor de carboidratos de

microalgas e produzir bioetanol a partir destas.

2.2 Objetivos específicos

Avaliar a síntese de carboidratos das microalgas Spirulina platensis LEB 52 e

Chlorella homosphaera cultivadas em diferentes concentrações dos componentes nitrogenado

e cloreto de sódio adicionados nos meios de cultivo;

Cultivar Chlorella minutissima em diferentes meios de cultivo e concentrações

dos componentes nitrogenado e fosfatos e avaliar o efeito destes na concentração de

carboidratos da microalga;

Produzir bioetanol utilizando como matéria-prima as microalgas Spirulina sp.

LEB 18 e Chlorella pyrenoidosa em processos com adição de glicose e sacarose.

17

3 JUSTIFICATIVA

O acelerado crescimento da população mundial e o desenvolvimento de uma série

de economias emergentes têm levado ao aumento no consumo mundial de energia (HARUN;

DANQUAH; FORPE, 2010). No entanto, o uso de combustíveis fósseis está associado à

poluição ambiental, ao efeito estufa e as mudanças climáticas (HO et al., 2011).

O etanol produzido biologicamente pela fermentação de várias fontes de biomassa

é largamente reconhecido como combustível com poderosos atributos econômicos,

ambientais e estratégicos. Porém, as matérias-primas normalmente utilizadas, como sacarose

e amiláceos, são insuficientes para atender as futuras demandas por combustíveis e, o uso de

culturas alimentares para a produção de combustíveis pode levar a crise de alimentos e

problemas ambientais prejudiciais, como desflorestamentos para aumentar as terras de cultivo

(AMARO et al., 2102; ROSA e GARCIA, 2009). Alternativamente, o etanol pode ser

produzido a partir de microalgas, que surgem como uma nova alternativa renovável para esta

produção (DISMUKES, 2008).

As perspectivas de consolidação do mercado de etanol e alcance das metas de

expansão de seu uso exigem a ampliação da produção em níveis não passíveis de serem

atendidos. A ampliação da produção de etanol, sem aumento da área cultivada, requer o uso

de fontes alternativas como a biomassa, que poderá tornar o etanol competitivo em custos. De

fato, é a necessidade de ampliação da oferta de matérias-primas para produção de etanol, sem

pressionar a área plantada para produção de alimentos, que tem levado empresas e países a

investirem em pesquisas para maior utilização de outras matérias-primas (BASTOS, 2007;

LEE et al., 2013).

A utilização da biomassa de microalgas para a produção de bioetanol é vantajosa,

uma vez que microalgas apresentam taxas de crescimento e fixação de gás carbônico mais

elevados que plantas terrestres, podendo ser cultivadas em condições climatológicas e em

solos não adequados às culturas tradicionais, utilização de áreas desérticas, com baixo valor

econômico para outros usos. No cultivo de microalgas pode ser usada água do mar, águas

salobras e, como fontes de carbono, resíduos industriais (como efluentes orgânicos e CO2)

(BERTOLDI et al., 2008; HARUN; DANQUAH; FORPE, 2010; HO et al., 2012).

Os biocombustíveis produzidos a partir de microalgas não liberam novo carbono

para a atmosfera, já que o CO2 gerado em sua queima é assimilado por estes micro-

organismos no processo de fotossíntese. Portanto, os biocombustíveis podem ser uma

18

alternativa viável frente aos combustíveis fósseis a curto e médio prazo (ALAM et al., 2012).

Além disso, as microalgas são produzidas de forma contínua, ocupam áreas pequenas de

cultivo, podem ser passíveis de manipulação genética visando a obtenção da composição

bioquímica desejada e não estão sujeitas às variações ambientais. São facilmente controladas,

não afetam drasticamente o meio ambiente, pois não precisam de aplicação de pesticidas

(BENEMAN, 1990).

Algumas espécies de microalgas apresentam altas concentrações de carboidratos,

sendo excelentes substratos para a produção de bioetanol (CHEN et al., 2011; CHISTI, 2007;

HO et al., 2010). Na literatura são reportados estudos que demonstram que microalgas como

Chlorella, Chlamydomonas, Dunaliella, Scenedesmus e Tetraselmis acumulam elevados

teores de carboidratos (> 40 % em massa seca) quando são realizadas modificações nas

condições de cultivo (HO et al., 2013; JOHN et al., 2011; MARKOU, 2012).

Muitas microalgas podem ser fonte de proteínas quando cultivadas em condições

repletas de nutrientes. Porém, quando se realiza a restrição de alguns nutrientes, estes cultivos

podem ser facilmente induzidos para alterar a composição microalgal. Utilizando-se essas

técnicas, o conteúdo de proteína pode ser convertido a compostos de armazenamento de

energia, como carboidratos (DISMUKES et al., 2008). Porém, estas modificações geram

estresse às células de microalgas, ocasionando, frequentemente, baixas produtividades de

biomassa, e, em geral, baixa produtividade de carboidratos. Portanto, o estabelecimento de

estratégias que permitam alcançar a melhor combinação de conteúdo de carboidratos e taxa de

produção de biomassa deve ser aplicado (HO et al., 2012).

A adição de fonte de carbono aos cultivos possibilita maior rendimento em

biomassa, já que haverá maior disponibilidade de carbono, além do assimilado através do

metabolismo fotossintético, e este maior teor assimilado, pode gerar maior produção de

carboidratos (DERNER, 2006; RICHMOND, 2004)

Na fermentação convencional de etanol, as leveduras, como Saccharomyces

cerevisiae podem converter até 95% do carboidrato disponível em etanol e dióxido de

carbono na proporção 1:1 (p/p). Os carboidratos algáceos são misturas complexas de mono,

poli, e oligossacarídeos, como pentoses e hexoses. Assume-se que dois terços do carboidrato

total de microalgas podem ser hidrolisados a hexose fermentescível, e que, apenas um terço é

hidrolisado a pentoses, que é não fermentescível em prática comercial (FEINBERG, 1984;

LOURENÇO, 2006).

O incremento da produção de etanol de primeira geração, produzido a partir de

sacarose e amiláceos, com microalgas poderia diminuir a necessidade da utilização de

19

matérias-primas utilizadas como alimentos. Além disso, a produção de bioetanol a partir de

microalgas gera rendimentos inferiores quando comparados à produção a partir de sacarose e

amiláceos. A adição de carboidratos provenientes de microalgas aos processos de obtenção de

etanol já estabelecidos poderia estimular a utilização desta fonte renovável de matéria-prima.

O laboratório de Engenharia Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande-

FURG possui uma unidade piloto de produção da microalga Spirulina localizada no

município de Santa Vitória do Palmar-RS, às margens da Lagoa Mangueira (MORAIS et

al.,2009), com capacidade para produção de 70 kg de biomassa por mês, biomassa que pode

ser utilizada para a produção de bioetanol.

20

CAPÍTULO II

21

5 REVISÃO DA LITERATURA

5.1 Bioetanol

O álcool etílico ou etanol (C2H5OH) é produzido desde os tempos antigos pela

fermentação dos açúcares encontrados em produtos vegetais (cereais, beterraba e cana-de-

açúcar) (BASTOS, 2007). A maior parte do etanol industrial é produzida por meio da

fermentação alcoólica, embora também seja produzido sinteticamente de fontes como eteno,

derivado do petróleo (DEMIRBAS, 2008). O álcool não é encontrado espontaneamente na

natureza, podendo ser obtido por diferentes processos, a partir de diversas fontes (LIMA et

al., 2001).

O etanol é um biocombustível obtido via processo bioquímico, através da

fermentação de biomassas sacaríneas e, após hidrólise, de amiláceas e celulósicas

(CARDOSO, 2011).

As biomassas freqüentemente empregadas na obtenção de etanol, como o milho e

a cana-de-açúcar, apresentam problemas em comum: são muito utilizadas na alimentação e,

além disso, necessitam da disponibilização de terras agricultáveis para serem produzidas

(HARUN; DANQUAH; FORPE. 2010).

5.1.1 Matérias-primas utilizadas para a produção de etanol

Bioetanol pode ser produzido a partir de diferentes materiais naturais: glicose,

sacarose, amido e materiais lignocelulósicos. Atualmente, o bioetanol é produzido, na sua

maioria, a partir da cana de açúcar e milho. No entanto, a produção dessas matérias-primas

está disputando terras limitadas contra a produção de alimentos. O aumento da produção de

bioetanol não é viável utilizando as tecnologias atuais (ZHU et al. 2014).

A beterraba sacarina, o sorgo sacarino e a cana-de-açúcar são exemplos de

biomassa em que a glicose é armazenada na forma de sacarose (OGBONNA et al., 2001; WU

et al., 2010). A sacarose é facilmente hidrolisada pela levedura Saccharomyces cerevisiae aos

seus dois monômeros constituintes, glicose e frutose, o que evita a necessidade de aplicação

de pré-tratamentos (SÁNCHEZ e CARDONA, 2008).

Entre os vários tipos de biomassa rica em amido encontram-se o milho, o trigo e a

batata. Contudo, como as leveduras não são capazes de hidrolisar este polissacárido, é

22

necessário um pré-tratamento para hidrólise do amido, como as hidrólises enzimática ou àcida

(TASIC et al., 2009).

O amido (Figura 1) é um polissacarídeo, composto por carbono, hidrogênio e

oxigênio na proporção de 6:10:5. As unidades de glicose estão ligadas entre si pelo C1 e C4

através de oxigênio, formando uma ligação glicídica. O amido é composto por dois tipos de

polímeros de glicose: a amilose e a amilopectina. A diferença básica entre estes é a

ramificação da cadeia. Ambos possuem cadeias nas quais as unidades de glicose se unem

mediante ligações (α1→ 4). Por sua vez, a amilopectina apresenta pontos de ramificação com

ligações glicosídicas (α1→ 6) (BELITZ e GROSCH, 1997).

Figura 1- Representação da cadeia de Amilose (a) e amilopectina (b)

Fonte: CORRADINI et al., 2005

A produção de bioetanol a partir de culturas sacarinas e amiláceas não é o processo mais

sustentável de produção de combustíveis, pois provoca pressão sobre o preço dos alimentos, já que

muitas destas matérias-primas também podem ser utilizadas para alimentação humana e animal, causa

a degradação acelerada dos solos e consome grandes quantidades de água. Além disso, a produção de

etanol de 1ª geração está sujeita à sazonalidade das culturas (CARDOSO, 2011).

Materiais lignocelulósicos são abundantes em quase todo o mundo e que pode ser

utilizado para a produção de bioetanol, já que apresentam alto teor de celulose e

hemicelulose. No entanto, a conversão de materiais lignocelulósicos a etanol é muito mais

difícil do que com a utilização de cana de açúcar e materiais ricos em amido. A conversão de

23

lignoceluloses de etanol envolve três etapas: pré-tratamento, hidrólise e fermentação alcoólica

(ZHU et al., 2014).

Lignocelulose é composto principalmente de celulose, hemicelulose e lignina. A

celulose é um polissacarídeo homogéneo de cadeia longa de unidades de D-glicose unidas por

ligações glicosídicas β-1,4 glicosídicas. A hemicelulose é um complexo e heterogêneo

polímeros de açúcares e derivados de açúcar, que formam um grande rede ramificada e os

monômeros incluem hexoses (glicose, galactose, e manose) e pentoses (xilose e arabinose).

A lignina é uma mistura heterogênea de compostos fenólicos e, principalmente, seus

derivados. É o componente principal das paredes de células de plantas. A lignina mantém as

fibras de celulose e hemicelulose juntos e fornece apoio para as plantas (CHENG e

TIMILSINA, 2011).

Segundo Ogeda e Petri (2010), os processos hidrolíticos de materiais

lignocelulósicos não são triviais devido às complexas interações entre hemicelulose e celulose

presentes nas paredes celulares dos vegetais e entre estes polissacarídeos e ligninas; à natureza

cristalina da celulose e à barreira física formada por ligninas ao redor das fibras celulósicas.

Por esta razão, a biomassa sofre um pré-tratamento para separar a matriz de lignina, reduzir a

cristalinidade da celulose e hidrolisar a hemicelulose, separando o hidrolisado da celulose, a

qual sofre tratamento específico para a obtenção de glicose.

O bioetanol obtido a partir da biomassa lignocelulósica é denominado de

biocombustíveil de segunda geração por ser obtido de matéria-prima não convencional (cana-

de-açúcar e amido). A produção comercial do bioetanol a partir dessa matéria-prima será

possível, mas exigirá o domínio de tecnologias ainda não completamente desenvolvidas que

atualmente são complexas, com baixo rendimento na conversão da matéria-prima em

bioetanol, balanço energético negativo e com custo de produção elevada (BRETHAUER e

WYMAN, 2010; LADISCH et al, 2009).

As microalgas surgem, no atual panorama energético, como uma matéria-prima

sustentável capaz de assegurar a produção de biocombustíveis. A produção de

biocombustíveis a partir de microalgas apresenta menor impacto ambiental, não competindo

por espaço com as culturas alimentares, ao contrário dos biocombustíveis produzidos a partir

de outras matérias-primas (CHISTI , 2007; HARUN et al., 2010; ZHU et al., 2014).

Matsumoto et al., (2003) procederam à seleção de várias espécies de microalgas

marinhas ricas em açúcares tendo identificado um total de 76 espécies de microalgas

contendo teores em açúcares entre 40 e 53 %.

24

Choi; Nguyen e Sim (2010) ao avaliarem o potencial de produção de bioetanol a

partir da microalga Chlamydomonas reinhardtii e utilizando as enzimas α-amilase e a

amiloglucosidase na hidrólise dos polissacarídeos, obtiveram eficiência do processo de 57%.

5.1.2 Fermentação Alcoólica

Os microrganismos capazes de se desenvolver em ausência de oxigênio e de

qualquer outro aceptor final de elétrons exógeno conseguem oxidar substratos através de um

processo denominado fermentação. Fermentação é o termo que denota a degradação

anaeróbica da glicose ou de outros nutrientes orgânicos por estes micro-organismos em vários

produtos para obter energia na forma de ATP (BARBOSA e TORRES, 1998; LEHNINGER,

2000).

A reação global da fermentação (Equação 1) demonstra que 1 mol de glicose (180

g) produz 2 moles de etanol (92 g) e 2 moles de dióxido de carbono (88 g). Assim, o

rendimento teórico para a produção de etanol é de 0,511 g/g. Na prática, segundo Oura

(1974), este valor não é observado devido à utilização de parte da glicose para produção de

gliceróis e ácidos orgânicos, substâncias necessárias para a síntese de material celular e

manutenção da levedura.

C6H1206 2C2H60 + 2CO2

(1)

Na fermentação alcoólica, o piruvato obtido da glicólise, é descarboxilado a

acetaldeído e CO2 em um processo de dois passos. No primeiro passo, o piruvato sofre

descarboxilação em uma reação irreversível catalisada pela enzima piruvato descarboxilase

que requer a presença de Mg2+

. No segundo passo, através da ação da álcool desidrogenase , o

acetaldeído é reduzido a etanol, com NADH, derivado da atividade da gliceraldeído-3-fosfato

desidrogenase, fornecendo o poder redutor. Assim, o etanol e CO2 são os produtos finais da

fermentação alcoólica. A enzima piruvato descarboxilase está caracteristicamente presente

nas leveduras de cervejaria e padaria e em todos os outros organismos que promovem a

fermentação alcoólica (LEHNINGER, 2000).

O processo de fermentação descontínua, para a produção de etanol, apresenta três

fases características: preliminar, tumultuosa e complementar. A fase preliminar é

caracterizada pela adaptação das leveduras e multiplicação celular. Nessa fase garante-se a

produção de grande quantidade de células de poder fermentativo máximo. A fase tumultuosa

25

caracteriza-se pelo desprendimento volumoso e intenso de dióxido de carbono, conseqüência

da existência de um número suficiente de células para transformar os açúcares

fermentescíveis em etanol. (LIMA et al., 2001). A fase complementar caracteriza-se pela

diminuição da intensidade do desprendimento do dióxido de carbono devido à redução da

atividade fermentativa (CARDOSO, 2006).

5.1.2.1 Agentes da fermentação alcoólica

As leveduras, principalmente do gênero Saccharomyces, têm sido amplamente

utilizadas em diversos processos biotecnológicos para produção de etanol. Saccharomyces

cerevisiae é considerada o agente predominante nas fermentações, mas outras espécies como

S. bayanus e S. paradoxus, têm sido isoladas a partir de processos industriais (QUEROL e

BOND, 2009).

A levedura Saccharomyces (Figura 2) é um anaeróbio facultativo, tem a

habilidade de se ajustar metabolicamente, tanto em condições de aerobiose como de

anaerobiose. Os produtos finais da metabolização do açúcar irão depender das condições

ambientais em que a levedura se encontra. Enquanto em aerobiose, uma porção do açúcar é

transformada em biomassa, CO2, H2O e outras substâncias orgânicas; em anaerobiose, a

maior parte é convertida em etanol e CO2, processo denominado fermentação alcoólica. Os

carboidratos considerados substratos para a fermentação, tanto podem ser endógenos

(constituintes da levedura, como glicogênio e trealose) como exógenos (sacarose, glicose,

frutose e outros), estes últimos fornecidos à levedura (LIMA et al., 2001).

Figura 2 - Células de Saccharomyces cerevisiae.

Fonte: PELCZAR, 1997.

26

A levedura, ao metabolizar anaerobicamente o açúcar, gera uma forma de energia

(ATP) que será empregada na realização dos diversos trabalhos fisiológicos (absorção,

excreção e outros) e biossínteses, necessários à manutenção da vida, crescimento e

multiplicação, para perpetuar a espécie (LILLIE e PRINGLE, 1980). O etanol e o CO2 são

apenas produtos de excreção da célula e não são utilizadas pela levedura em condições

anaeróbicas. Além das rotas que levam à formação do etanol, rotas alternativas são utilizadas

para formação de materiais necessários à constituição de biomassa (polissacarídeos, lipídios,

proteínas, ácidos nucléicos e outros), além de produtos necessários à adaptação e

sobrevivência (BARBOSA e TORRES, 1998).

5.2 Microalgas

As microalgas são micro-organismos fotossintetizantes que apresentam

crescimento acelerado e em diferentes condições ambientais devido à sua estrutura celular

simples, unicelular ou multicelular (LOURENÇO, 2006). Filogeneticamente podem ser

procarióticas ou eucarióticas (OLAIZOLA, 2003).

As microalgas podem ser encontradas em água salgada ou doce. Embora o

mecanismo fotossintético seja semelhante ao das plantas superiores, a ausência de estruturas

como o caule e folhas, e o fato de se encontrarem submersas em água facilita o acesso ao

dióxido de carbono e a nutrientes, conferindo uma maior eficiência na conversão da energia

solar em biomassa (SCHENK et al., 2008).

Devido à identificação de diversas substâncias sintetizadas pelas microalgas, têm

aumentado o interesse no seu potencial biotecnológico. Por isso, cultivos de microalgas têm

sido realizados visando à produção de biomassa para uso na alimentação bem como para

obtenção de compostos naturais com alto valor no mercado mundial (DENER, 2006; PLAZA

et al., 2010).

5.2.1Fatores referentes ao cultivo

A composição bioquímica da biomassa das microalgas não é determinada

somente pela natureza de cada espécie algal, dependendo de fatores como, intensidade de luz,

temperatura, pH, nutrientes e agitação (MIAO e WU, 2004).

27

Como qualquer outro micro-organismo, as microalgas reagem a variações do

meio exterior com alterações do seu meio intracelular. Desta maneira, a manipulação de

condições de cultivo, nomeadamente a presença ou ausência de determinados nutrientes,

estimula a biossíntese de compostos que vão desde enzimas a fármacos estimulantes da

tiróide e antioxidantes naturais, alguns de elevado valor comercial (RICHMOND, 2004).

5.2.1.1 Luminosidade

A luz é fundamental para o crescimento microalgal, pois atua como a principal

fonte de energia no processo de produção de biomassa, influenciando diretamente no

crescimento (LACAZ-RUIZ, 1996).

Níveis extremos de iluminância no cultivo de microalgas podem conduzir a um

processo desfavorável ao crescimento, a fotoinibição, que ocorre quando o fluxo de fótons

absorvido pelos cloroplastos é tão alto que a concentração de elétrons de alta energia na célula

é excessiva para ser consumida pelo Ciclo de Calvin. Estes elétrons de alta energia reagem

com a água e formam peróxido de hidrogênio, tóxico às células (GRIMA et al., 1996;

HIRAYAMA et al., 1996 ). A fotolimitação é um fenômeno que ocorre devido ao

sombreamento que as células da superfície causam nas células em maiores profundidades no

interior de meio de cultivo (VONSHAK e RICHMOND, 1988).

Muitos sistemas de cultivo de microalgas são planejados para utilizar a luz

natural. A principal vantagem deste método é o decréscimo no custo de produção, no entanto,

inconvenientes como a falta de controle do fotoperíodo da intensidade luminosa e, também,

variações ambientais fazem com que os cultivos que utilizem luz natural não sejam estáveis

(BECKER, 1981).

5.2.1.2 Salinidade

A salinidade pode afetar o crescimento de microalgas em virtude do estresse

osmótico e iônico e das modificações nas proporções iônicas celulares devido à

permeabilidade seletiva da membrana aos íons. Porém, alterações nas suas concentrações nos

meios de cultivo podem influenciar na síntese de carboidratos, sendo que a diminuição da

fonte de nitrogênio e o aumento da concentração de cloreto de sódio acarretam no aumento da

concentração de carboidratos (BARROS, 2010; BRAND, 1984; LOURENÇO, 2006;

RICHMOND, 2004; VONSHAK, 1997).

28

5.2.1.3 Nitrogênio

O nitrogênio é um dos elementos mais importantes no metabolismo de

ecossistemas aquáticos. Após o carbono, o nitrogênio é o elemento com maior participação,

em termos quantitativos, na matéria seca da alga (RICHMOND, 2004).

O nitrogênio é componente fundamental de três classes de substâncias estruturais

e do metabolismo primário das células: proteínas, ácidos nucléicos e pigmentos

fotossintetizantes (clorofilas e ficobilinas). Se o suprimento de nitrogênio é abundante em

cultivos, verifica-se tendência de aumento nas concentrações de proteína e clorofila nas

células. Já baixas concentrações diminuem o teor dessas duas substâncias, diminuindo

drasticamente também a taxa de divisão celular (LOURENÇO, 2006).

Vários compostos nitrogenados, tanto orgânicos como inorgânicos, podem servir

como fonte de nitrogênio para o crescimento de diversas microalgas. Quando a fonte de

nitrogênio apresenta-se na forma de nitrato, a microalga realiza gastos celulares energéticos

para reduzir esse íon a nitrito através da enzima nitrato-redutase. Posteriormente, ocorre outra

redução pela nitrito-redutase gerando a amônia (forma de nitrogênio utilizada pela alga em

seu metabolismo) (CORNET et al., 1998).

5.2.1.4 Fósforo

O fósforo apresenta importantes funções na célula, estando envolvido na

transferência de energia e constituiçãoo de moléculas como o ATP, açúcares fosfatados,

ácidos nucléicos e fosfoenzimas (LOURENCO, 2006). No meio de cultivo, o fósforo pode ser

adicionado na forma de fósforos e polifósforos, como fósforo de sódio e potássio (CHISTI,

2007).

Lombardi e Wangerski (1991) cultivaram a microalga Chaetoceros gracilis em

meio com baixa concentração de fósforo e verificaram a diminuição dos teores de

fosfolipídios e baixo crescimento celular.

5.2.1.5 Carbono

O carbono é o elemento necessário em maiores concentrações em cultivos de

microalgas, pois constitui em torno de 50% da biomassa seca. Pode estar na forma inorgânica,

como o CO2 e compostos derivados (H2CO3, HCO3- ou CO3

2-), sendo proveniente do ar

29

atmosférico ou de ar injetado na cultura; ou na forma orgânica, como a glicose, acetato,

lactato e aminoácidos (DERNER, 2006).

O carbono inorgânico, fundamental para o processo de fotossíntese, constitui

fonte relacionada ao pH. Em pH abaixo de 5,0 apenas o CO2 é consumido pela microalga,

entre 7 e 9 o bicarbonato passa a ser importante e acima de 9,5 destaca-se o carbonato O pH

do meio é importante no processo de cultivo, variando de neutro a alcalino para a maioria das

espécies de microalgas (RAVEN, 1990).

Embora a maior parte das microalgas cresça fotoautotroficamente, pela conversão

da energia solar à energia química através da fotossíntese, com consumo de gás carbônico,

várias espécies apresentam também metabolismo heterotrófico e mixotrófico. No

metabolismo heterotrófico, a fonte de energia é exclusivamente carbono orgânico, geralmente

sob a forma de glicose e/ou acetato (PEREZ-GARCIA et al., 2011; WEN e CHEN, 2003) não

havendo a necessidade de energia luminosa. Algumas espécies de microalgas apresentam um

metabolismo mixotrófico e conseguem simultaneamente realizar a fotossíntese e assimilar

carbono inorgânico e orgânico, o que permite aumentar a sua produtividade (BHATNAGAR

et al., 2011; CHOJNACKA e MARQUEZ-ROCHA, 2004)

5.2.1.5.1 Cultivos mixotróficos

O cultivo com adição de fonte orgânica de carbono é conhecido como cultivo

mixotrófico. Melaço, glicose, glicerol e uréia são fontes de carbono usadas nos cultivos de

microalgas. O regime mixotrófico é amplamente definido como um regime de crescimento

em que o carbono orgânico e CO2, simultaneamente, são assimilados pelo metabolismo

respiratório e fotossintético. A taxa específica de crescimento da cultura mixotróficas é,

portanto, aproximadamente a soma da taxa de crescimento específico de células cultivadas em

condições fotoautotrófica e heterotróficas (RICHMOND, 2004).

Em cultivos densos, a assimilação do carbono inorgânico fica prejudicada devido

à alta densidade celular, devido à baixa 42 disponibilidade de luz. Quando a microalga

assimila mais carbono tem sua produção de carboidratos, proteínas e lipídeos aumentada

(DERNER, 2006).

Na literatura, são relatados aumentos significativos no crescimento de microalgas

em cultivos mixotróficos. Segundo Muliterno et al. (2005), a concentração de 0,5 g.L-1

de

glicose adicionada no meio Zarrouk , sob modo de cultivo em batelada alimentada, gerou 5,38

30

g.L-1

de biomassa. Chen e Zang (1997) registraram o aumento de mais de 5 vezes na

produção de biomassa cultivada com glicose, quando comparada com a produção

fotoautotrófica de Spirulina platensis.

A glicose á a fonte orgânica de carbono mais usualmente empregada em cultivos

de microalgas, sendo que pode proporcionas altas taxas de crescimento, devido ao seu alto

teor energético. (PEREZ-GARCIA et al., 2011).

5.2.2 Carboidratos e sua constituição em microalgas

O acúmulo de carboidratos por microalgas é devido a fixação de CO2 durante o

processo fotossintético. A fotossíntese é o processo biológico no qual organismos

fotossintetizantes podem converter CO2 e H2O, na presença de luz, em glicose e outros

açúcares por via metabólica, processo esse conhecido como o ciclo de Calvin (BARBOSA e

TOREES, 1998; LEHNINGER, 2000).

Segundo Lourenço (2006), o produto de reserva das cianobactérias é um

polissacarídeo formado por monômeros de glicose unidos por ligações glicosídicas do tipo α-

1,4, conhecido como amido das cianofíceas, e que esta substância difere do amido por

apresentar ramificações mais abundantes em relação à cadeia principal de polissacarídeo.

Portanto, o amido das cianofíceas é muito semelhante ao glicogênio encontrado em animais.

Vidotti e Rollemberg (2004) afirmam que no caso de microalgas da divisão Chlorophyta,

como microalgas do gênero Chlorella, acumulam amido como fonte de reserva.

5.2.2.1 Modificações nos cultivos objetivando elevados teores de carboidratos em

microalgas

A maioria das microalgas é fonte de proteínas quando cultivadas em condições

repletas de nutrientes. Porém, quando se realiza a restrição de alguns nutrientes, estes cultivos

podem ser facilmente induzidos para alterar a composição microalgal. Utilizando-se essas

técnicas, o conteúdo de proteína pode ser convertido a compostos de armazenamento de

energia, como carboidratos (DISMUKES et al., 2008).

O teor de carboidratos de microalgas pode ser aumentado pelo uso de várias

estratégias de cultivo, como intensidade luminosa (SUKENIK, 1991), limitação de nitrogênio

(FEINBERG, 1984), limitação de fósforo (LOURENÇO, 2006; MACEDO e ALEGRE,

31

2001), aumento do teor de cloreto de sódio (VONSHAK, 1997), variação da temperatura (DE

OLIVEIRA, 1999) e suplementação de carbono (DERNER, 2006).

Dragone et al. (2011) testaram a influência da concentração de nitrogênio e ferro

sobre o acúmulo de amido em Chlorella vulgaris. Os autores observaram que o maior teor de

amido (acima de 41%) foi obtido nas menores concentrações destes compostos Entretanto, a

concentração de biomassa foi inferior comparada aos cultivos em que foram adicionadas as

maiores concentrações desses nutrientes.

Segundo Ben-Amotz (1983), na ausência de nitrogênio, mas na presença de luz,

as células de microalgas continuam a fixar carbono, mas não podem sintetizar proteínas,

então, o carbono é utilizado para a síntese de carboidratos e lipídos, que podem ser

acumulados na célula. Douskova et al. (2009) conseguiram induzir uma acumulação de amido

de 83% e 50% na microalga Chlorella vulgaris, pela privação de fosfato e nitrato,

respectivamente.

O fósforo é um elemento essencial para o ATP e, portanto, a restrição deste

nutriente afeta a estratégia global de energia dos micro-organismos, resultando na diminuição

da síntese de proteínas e acúmulo de carboidratos e/ou lipídios (MARKOU, 2012).

Markou (2012) observou alterações na composição da biomassa de Spirulina em

cultivos com limitação de fósforo, sendo obtido aumento nos teores de carboidratos de 9%

para 65%, enquanto o teor de proteínas diminuiu de 46,5 % para 25 % em cultivos semi-

contínuos.

A adição de fonte de carbono aos cultivos possibilita maior rendimento em

biomassa, já que haverá maior disponibilidade de carbono, além do produzido através do

metabolismo fotossintético (DERNER, 2006; RICHMOND, 2004).

Moura et al. (2006) e Renaud et al. (1999) afirmam que em cultivos estanques o

teor de proteínas de microalgas é maior durante a fase exponencial de crescimento e o teor de

carboidratos é maior durante a fase estacionária, quando, as células são mais velhas.

5.2.3 Hidrólise dos carboidratos de microalgas

Segundo Reguly (1996), para que os polissacarídeos sejam utilizados por

microrganismos nos processos fermentativos eles devem ser previamente hidrolisados, já que

na forma macromolecular não são assimiláveis se não após desmólise enzimática, onde as

respectivas enzimas, que têm essas moléculas como substrato, promovem a sua cisão

32

hidrolítica, ou a desmólise através de processos químicos e físico-químicos, mais drásticos,

em que a cisão pela água é catalisada por agentes químicos, em geral ácidos minerais.

Segundo Chu et al. (1982) e Lourenço (2006) e os carboidratos de microalgas são,

em sua maioria, polissacarídeos de reserva, portanto, devem ser hidrolisados antes do

processo de fermentação alcoólica. Esta hidrólise pode ser realizada pela ação de enzimas ou

por via ácida, a fim de se obter açúcares fermentescíveis. Grandes esforços têm sido feitos

para substituir a tradicional hidrólise ácida pela hidrólise enzimática na produção de glicose,

já que são obtidos maiores rendimento sob condições suaves, menor geração de subprodutos,

além da ausência de problemas com corrosão (PHILL et al., 2010).

A hidrólise enzimática tem sido muito utilizada pelas indústrias na produção de

etanol a partir de amiláceos. Uma das características mais importantes da catálise enzimática

é sua especificidade, muito maior do que a da catálise química, quanto à reação e quanto ao

substrato.

As enzimas amilolíticas representam o grupo enzimático de grande aplicação

industrial. A α-amilase é uma endoenzima carboidrase com atividade hidrolítica das ligações

α-1,4 em polissacarídeos dispersos em meio aquoso, contendo, pelo menos, três resíduos de

glicose na cadeia. Algumas α-amilases apresentam atividade de hidrólise das ligações

glicosídicas α-1,6, mas com eficiência reduzida (BON et al., 2008; LIMA et al., 2001;

REGULY, 1996).

A amiloglicosidase é uma enzima sacarificante utilizada para produzir glicose a

partir do amido, hidrolisando ligações tipo α-1,4 e α-1,6. A ação da amiloglucosidase é lenta

no ataque inicial à amilose, pois, sendo uma exoenzima, só atua a partir da extremidade não-

redutora e não penetra no interior da estrutura helicoidal da amilose (OBEL, 2001).

33

CAPÍTULO III

34

5 DESENVOLVIMENTO DO TRABALHO

O trabalho foi dividido em três artigos científicos:

ARTIGO I: Teores de carboidratos de Spirulina platensis e Chlorella homosphaera cultivadas

em diferentes concentrações de nitrogênio e cloreto de sódio.

ARTIGO II: Concentração de carboidratos da microalga Chlorella minutissima cultivada em

diferentes meios e concentrações dos componentes nitrogenado e fosfatados.

ARTIGO III: Produção de bioetanol a partir de microalgas em processo com adiçâo de

glicose e sacarose.

35



mixotróficas

RESUMO

As microalgas têm atraído interesse mundial como um meio alternativo para as produções de

energia sustentável, como biodiesel e bioetanol. Até o momento, poucos estudos são relatados

na literatura sobre o uso de carboidratos de microalgas para produção de bioetanol.

Modificações nas condições de cultivo podem proporcionar aumento no teor de carboidratos

destas. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi avaliar a influência das concentrações do

componente nitrogenado e cloreto de sódio no acúmulo de carboidratos das microalgas

Chlorella homosphaera e Spirulina platensis LEB 52 em cultivos mixotróficos. Para tal,

foram realizados Planejamentos Fatoriais Completos 22

nos quais foram avaliadas o efeito das

concentrações do componente nitrogenado, nitrato de sódio (NaNO3) ou nitrato de potássio

(KNO3); e cloreto de sódio (NaCl), adicionados aos meios de cultivo das microalgas, na

produtividade em carboidratos (g.L-1

d.-1

). Para a microalga Chlorella homosphaera, a maior

produtividade em carboidratos obtida nos ensaios realizados com a maior concentração de

KNO3 com menor concentração de NaCl e menor concentração de KNO3 com maior

concentração de NaCl (0,014±0,001 g.L-1

.d-1

e 0,015±0,002 g.L-1

.d-1

, respectivamente). A

maior produtividade em carboidratos nos cultivos de Spirulina platensis LEB 52

(0,116±0,002 g.L-1

.d-1

) foi verificada no experimento no qual a microalga foi cultivada nas

menores concentrações de NaNO3 e NaCl. A microalga Spirulina platensis LEB 52

apresentou maiores concentração e produtividade em carboidratos quando comparada à

microalga Chlorella homosphaera.

Palavras-chave: carboidratos, microalgas, nitrogênio.

36

Carbohydrate contents of Spirulina platensis and Chlorella homosphaera grown in

different concentrations of nitrogen and sodium chloride and mixotrophic conditions.

ABSTRACT

Changes in nutrient contents in microalgae cultivations may favor an increase in the content

of their carbohydrates. In this context, the aim of this study was to evaluate the influence of

the concentration of nitrogen component and sodium chloride in productivity in carbohydrates

of microalgae Chlorella homosphaera and Spirulina platensis LEB 52 in mixotrophic

cultivations. To this end, 22 Full Factorial designs were conducted in which the effect of the

concentration of nitrogen component, sodium nitrate (NaNO3) or potassium nitrate ( KNO3 )

were evaluated, and sodium chloride (NaCl) added to the culture medium of microalgae in

productivity in carbohydrates (g.L-1

.d-1

). For the microalgae Chlorella homosphaera the

greatest productivity in carbohydrates was obtained in the tests with the highest concentration

of KNO3 with lower concentrations and lower concentration of NaCl, and lower concentration

of KNO3 with a higher concentration of NaCl (0,014±0,001 g.L-1

.d-1

e 0,015±0,002 g.L-1

.d-1

,

respectively). The highest productivity in carbohydrates of Spirulina platensis LEB 52

(0,116±0,002 g.L-1

.d-1

) was observed in the experiment in which the microalgae was cultured

in lower concentrations of NaCl and NaNO3. The Spirulina platensis LEB 52 showed higher

concentration and productivity in carbohydrates when compared to microalgae Chlorella

homosphaera.

Keywords: carbohydrate, microalgae, nitrogen.

37

1 INTRODUÇÃO

O estudo de microalgas vem crescendo significativamente nos últimos anos

devido à sua grande aplicabilidade, como, por exemplo, em suplementos alimentares e

fármacos (HO et al., 2010), ou ainda para a mitigação de problemas ambientais, no tratamento

de efluentes (MEZZOMO et al., 2010) e na biofixação de CO2 (MORAIS e COSTA, 2007;

ROSA et al., 2011).

Mais recentemente, as microalgas têm sido indicadas como uma potencial

alternativa para a produção de combustíveis devido à sua capacidade de serem utilizadas

como matéria-prima para a produção de biodiesel e bioetanol (BRENNAN e OWENDE,

2010; CHEN et al. 2013; CHISTI , 2007; HARUN; DANQUAH; FORPE, 2010; ZHU et al.,

2014). Embora os biocombustíveis produzidos a partir de microalgas sejam promissores, as

atuais práticas e tecnologias não são suficientes para tornar a produção em larga escala

economicamente favorável. Assim, melhorias e inovações para o processo de produção de

biocombustíveis devem ser alcançadas incluindo o desenvolvimento da abordagem de

biorrefinaria, para a utilização de todas as frações da biomassa de microalgas (SOH et al.,

2014).

A maioria das microalgas é fonte de proteínas quando cultivadas em condições

repletas de nutrientes. Porém, quando se realiza modificações nos teores de alguns nutrientes,

estes cultivos podem ser facilmente induzidos para alterar a composição microalgal.

Utilizando-se essas técnicas, o conteúdo de proteína pode ser convertido a compostos de

armazenamento de energia, como carboidratos (DISMUKES et al., 2008).

A diminuição na concentração de nitrogênio e aumento dos teores de cloreto de

sódio favorecem o acúmulo de carboidratos por microalgas (LOURENÇO, 2006;

RICHMOND, 2004; VONSHAK,1997), contudo, estas modificações alteram a concentração

celular, sendo esta diminuída (BARROS, 2010; BRAND, 1984; RICHMOND, 2004). Porém,

a adição de fonte de carbono, em cultivos mixotróficos, possibilita maior rendimento em

biomassa, já que haverá maior disponibilidade de carbono além do produzido via

metabolismo fotossintético (ANDRADE e COSTA, 2008; CHEN e ZHANG, 1997; ZHANG

et al., 1999).

Neste contexto, objetivou-se avaliar a influência das concentrações do

componente nitrogenado e cloreto de sódio no acúmulo de carboidratos das microalgas

Chlorella homosphaera e Spirulina platensis LEB 52 em cultivos mixotróficos.

38

2 MATERIAL E MÉTODOS

As microalgas utilizadas neste estudo foram Chlorella homosphaera e Spirulina

platensis LEB 52. A Chlorella homosphaera foi cultivada em meio Bristol`s Modificado

(MBM) (WATANABE, 1960), que consiste em (g.L-1

): CaCl2, 0,005; MgSO4.7H2O, 0,0375;

NaCl, 0,0125, FeSO4.7H2O, 0,01 e 1 mL.L-1

de solução A5 de micronutrientes. A microalga

Spirulina platensis LEB 52 foi cultivada em meio Zarrouk (ZARROUK, 1966) modificado,

que contemplou: NaHCO3, 8,4; K2HPO4, 0,25; K2SO4, 0,5; MgSO4.7H2O, 0,10; CaCl2, 0,02,

FeSO4.7H2O, 0,005; EDTA, 0,04 e 1 mL.L-1

das soluções A5 e B6 de micronutrientes.

O efeito das concentrações do componente nitrogenado (nitrato de sódio-Meio

Zarrouk ou nitrato de potássio-Meio MBM e de cloreto de sódio sobre o acúmulo de

carboidratos nas microalgas, foi avaliado através um Planejamento Fatorial Completo 22. A

estratégia de modificação dos meios de cultivo baseou-se na redução de 50% ou 100% do

componente nitrogenado e no aumento de 5% ou 10% de NaCl, conforme Tabelas 1 e 2. Para

cada microalga foi realizado um planejamento, sendo os experimentos realizados em

duplicata.

Para efeitos de comparação foram realizados experimentos controle com meio

MBM e Zarrouk padrões. Todos os experimentos, com exceção dos controles, foram

realizados em condições mixotróficas, com adição de glicose na concentração 0,5 g L-1

a

partir do momento que os cultivos atingiram 0,3 g L-1

de concentração celular.

Tabela 1 – Níveis codificados e reais das variáveis concentração de nitrato de potássio

(KNO3 -X1) e cloreto de sódio (NaCl - X2) concentrações de nitrato de sódio (KNO3 -X1) e

cloreto de sódio (NaCl - X2) do Planejamento Fatorial Completo 22 utilizado para avaliar a

influência das destas sobre o acúmulo de carboidratos na microalga Chlorella homosphaera.

Experimento X1 (KNO3 – g.L-1

) X2 (NaCl – g.L-1

)

1 -1 (0,0625) -1 (0,0137)

2 +1 (0,0937) -1 (0,0137)

3 -1 (0,0625) +1 (0,0150)

4 +1 (0,0937) +1 (0,0150)

5 Controle (0,1250) (0,0125)

39

Tabela 2 - Níveis codificados e reais das variáveis concentração de nitrato de sódio (N aNO3 -

X1) e cloreto de sódio (NaCl - X2) do Planejamento Fatorial Completo 22 utilizado para

avaliar a influência das destas sobre o acúmulo de carboidratos na microalga Spirulina

platensis LEB 52.

Experimento X1 (NaNO3 gL-1

) X2 (NaCl g.L-1

)

1 -1 (0,625) -1 (0,55)

2 +1 (0,937) -1 (0,55)

3 -1 (0,625) +1 (0,60)

4 +1 (0,937) +1 (0,60)

5 Controle (C) (1,250) (0,50)

Os cultivos foram realizados em fotobiorreatores fechados tipo erlenmeyer de 2 L

com concentração inicial do inóculo 0,10 g.L-1

para Chlorella homosphaera, e 0,25 g.L-1

, para

Spirulina platensis LEB 52, sendo estes mantidos com agitação contínua por meio de injeção

de ar e fotoperíodo 12 h claro/escuro. Os experimentos foram incubados a 30 °C em câmara

termostatizada não estéril, até a fase estacionária de crescimento.

Ao final dos cultivos, a biomassa da microalga C. homosphaera foi floculada pela

adição de 2 g.L-1

de CaCl2 e ajuste do pH em 10 com adição de solução de NaOH 1 mol.L-1

.

A biomassa foi então disposta em funil de separação com capacidade de 2 L no qual

permaneceu até total floculação (12-24 h) (MARIOKA et al., 2014). A biomassa floculada foi

centrifugada, sob refrigeração a 10 °C, por 40 min a 4000 rpm. A biomassa resultante foi seca

em estufa por 12 h a 60 °C, e esta foi utilizada para a determinação de carboidratos.

A microalga S. platensis foi filtrada em tela de poliéster 180 fios para retenção da

biomassa, sendo posteriormente liofilizada e utilizada para determinação de carboidratos.

3.2 Determinações analíticas

A concentração de biomassa das microalgas foi determinada a cada 48 h através

da medida de densidade ótica em espectrofotômetro a 670 nm (COSTA et al., 2002),

utilizando-se uma relação pré-estabelecida entre a massa seca de biomassa e a absorbância.

Foram avaliados os parâmetros concentração final de biomassa (Xf, g.L-1

);

produtividade máxima de biomassa (Pmáx, g.L-1

.d-1

), obtida segundo a Equação 1, e

velocidade específica máxima de crescimento (μmáx, d-1

), obtida por regressão exponencial

aplicada à fase logarítmica de crescimento (SCHMIDELL et al., 2001).

40

Produtividade em biomassamáx(g. L−1. d−1) =X−X0

t−t0 (1)

Sendo,

X = concentração de biomassa (g.L-1

) no tempo t (d)

X0 = concentração de biomassa (g.L-1

) no tempo t0 (d)

A concentração de carboidratos das biomassas secas (% p/p) foi avaliada através

do método 3,5 DNS adaptado, com prévia hidrólise ácida dos polissacarídeos. Para tal,

adicionou-se 20 mL de HCl (1,5 M) em 0,2 g de biomassa seca de microalga e a solução foi

aquecida a 121°C durante 20 min. A seguir, a mistura foi resfriada à temperatura ambiente,

neutralizada com NaOH (40% e 10%) e transferida para balão volumétrico (50 mL), na qual

adicionaram-se 1 mL de ferrocianeto de potássio 15% e 1 mL de sulfato ou acetato de zinco

30%. Completou-se o volume com água destilada homogeneizando-se. A solução permaneceu

em repouso por 15 min para posterior decantação e filtração do precipitado. Em 25 mL do

filtrado, adicionou-se 0,5 mL de álcool etílico (99,5%) e 2 mL de tampão acetato pH 7,0,

homogeneizando por 10 min em agitador magnético. Em seguida, a solução permaneceu em

banho-maria a 70 ºC por 20 min. Após, adicionou-se 0,2 mL de tungstato de sódio (12%), e a

mistura, filtrada em papel filtro, desprezando as 10 primeiras gotas e, então retirou-se 1 mL

do filtrado para realizar a determinação dos açúcares redutores através do método proposto

por Miller (1959).

A produtividade em carboidratos nos cultivos (g.L-1

.d-1

) foi obtida de acordo com

a Equação 2:

Produtividade em carboidratos (g. L−1. d−1) =Xf × CHO

100 × tc (2)

Sendo,

Xf = concentração final de biomassa (g.L-1

);

CHO = concentração de carboidratos (%);

tc= tempo de cultivo (d).

41

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

A Figura 1 apresenta as curvas de crescimento das microalgas Chlorella

homosphaera (1 a) e Spirulina platensis LEB 52. O menor tempo de cultivo para a microalga

Chlorella homosphaera foi observado no experimento 1, na qual a microalga foi cultivada

com adição de 0,0625 g.L-1

de KNO3 e 0,0125 g.L-1

de NaCl. Isto pode ser explicado pela

baixa concentração da fonte de nitrogênio no cultivo, pois, segundo Richmond, (2004), o

nitrogênio é um dos elementos mais importantes no metabolismo de ecossistemas aquáticos.

Após o carbono, o nitrogênio é o elemento com maior participação, em termos quantitativos,

na matéria seca da alga, sendo também responsável pela formação das proteínas, um dos

componentes básicos da biomassa.

Os cultivos foram mantidos até a fase estacionária de crescimento já que nesta

fase há maior acúmulo de carboidratos. Brown et al. (1997), Moura (2006) e Renaud et al.

(1999) afirmaram que, no decorrer dos cultivos, as algas apresentam variação na composição

bioquímica e, na fase estacionária, o nível de carboidratos e lipídios é alto, porém com baixo

teor de proteínas devido à limitação de nitrogênio. Para a microalga Chlorella homosphaera,

a maior concentração celular final foi verificada no ensaio 2 (1,091±0,013 g.L-1

), no qual a

microalga foi cultivada com a maior concentração do componente nitrogenado e menor

concentração de cloreto de sódio (Tabela 4). O nitrogênio é responsável pela formação das

proteínas, um dos componentes básicos da biomassa, podendo então, sua limitação acarretar

na diminuição da concentração celular (RICHMOND, 2004). A salinidade pode afetar o

crescimento de microalgas em virtude do estresse osmótico e iônico e das modificações nas

proporções iônicas celulares devido à permeabilidade seletiva da membrana aos íons

(BARROS, 2010; BRAND, 1984). Porém, alterações nas suas concentrações nos meios de

cultivo podem influenciar na síntese de carboidratos, sendo que a diminuição da fonte de

nitrogênio e o aumento da concentração de cloreto de sódio acarretam no aumento da

concentração de carboidratos (LOURENÇO, 2006; RICHMOND, 2004; VONSHAK, 1997).

42

Figura 1- Curvas de crescimento dos ensaios dos Planejamentos experimentais das

microalgas (a) Chlorella homosphaera: 1 (◊), 2(■), 3(►), 4 () e controle (○) e (b) Spirulina

platensis LEB 52: 1 (◊), 2(■), 3(►), 4 () e 5 ensaio controle (○).

(a)

(b)

O efeito da diminuição da concentração de biomassa com a diminuição da

concentração de nitrogênio no meio de cultivo não foi observado para a microalga Spirulina

platensis, já que o ensaio 2, realizado com a maior concentração de nitrogênio e menor de

cloreto de sódio, apresentou igualdade no valor de Xf ao ensaio 1, realizado nas menores

concentrações de nitrogênio e cloreto de sódio. Isto pode ser justificado ao fato de que o Meio

Zarrouk apresenta concentração de NaNO3 10 vezes superior quando comparada à

concentração de KNO3 presente no Meio MBM.


crescimento (μmáx), produtividade máxima (Pmáx), intervalo de tempo da fase exponencial de

crescimento (fase log) e concentração de carboidratos e produtividade de carboidratos obtidos

pela microalga Chlorella homosphaera segundo o Planejamento Fatorial Completo 22

e

experimento controle (5).

Ensaio Xf

(g.L-1

)

Pmáx

(g.L-1

.d-1

)

µmáx

(d-1

)

Intervalo

fase log

(d)

Carboidratos

(%)

Produtividade

Carboidratos

(g.L-1

.d-1

)

1 0,820±0,042b 0,073±0,001

a 0,104±0,005

c 6-22 36,50±2,51

b 0,012±0,001

2 1,091±0,013c 0,165±0,006

b 0,100±0,007

c 4-24 47,56±3,58

c 0,014±0,001

3 0,886±0,028b 0,152±0,041

b 0,085±0,005

b 2-24 53,96±3,72

c 0,015±0,002

4 0,902±0,042b 0,220±0,036

b 0,102±0,001

c 6-24 49,80±2,94

c 0,013±0,001

5 0,390±0,015a 0,019±0,032

a 0,039±0,005

a 2-20 19,68±1,48

a 0,002±0,001

Valores médios de análise realizadas em triplicata ± desvio padrão. Letras iguais na mesma coluna indicam que

não apresentaram diferença significativa ao nível de 95% de confiança (p>0,05).

43


crescimento (μmáx), intervalo de tempo da fase exponencial de crescimento (fase log) e

concentração de carboidratos obtidos pela microalga Spirulina platensis LEB 52 nos

experimentos realizados segundo o Planejamento Fatorial Completo 22

e ensaio controle (5). Ensaio Xf

(g.L-1

)

Pmáx

(g.L-1

.d-1

)

µmáx

(d-1

)

Intervalo

fase log

(d)

Carboidratos

(%)

Produtividade

Carboidratos

(g.L-1

.d-1

)

1 3,068±0,070d 0,739±0,123

d 0,103±0,031

b 4-12 60,30±0,44

c 0,116±0,002

2 3,126±0,169d 0,650±0,098

cd 0,133±0,002

b 4-14 33,30±1,53

b 0,065±0,006

3 1,427±0,123b 0,392±0,04

b 0,051±0,009

a 4-10 65,48±3,35

d 0,054±0,007

4 2,097±0,055c 0,480±0,02

bc 0,266±0,012

c 4-16 62,32±2,74

cd 0,084±0,001

5 0,907±0,064a 0,091±0,02

a 0,064±0,007

a 4-16 14,48±1,11

a 0,008±0,001



Em todos os ensaios do planejamento, Chlorella homosphaera apresentou Xf e

μmáx superiores quando comparados ao ensaio controle. Estes aumentos podem ser justificados

pela adição de glicose nesses ensaios (Tabela 3). Para a microalga Spirulina platensis LEB

52, o ensaio controle apresentou menores valores de Xf e Pmáx do que os demais ensaios

(p<0,05), porém para μmáx, o ensaio 3 apresentou igualdade ao ensaio controle neste

parâmetro (p=0,79). Andrade e Costa (2008) também verificaram aumento da concentração

celular máxima de Spirulina plantensis em cultivos mixotróficos com adição de melaço em

pó, sendo que foram obtidos 2,59 g.L-1

de biomassa frente aos 1,44 g.L-1

no ensaio

autotrófico. Derner (2006) e Richmond (2004) relataram que a adição de fonte de carbono aos

cultivos possibilita maior rendimento em biomassa, já que haverá maior disponibilidade de

carbono, além do produzido através do metabolismo fotossintético.

A maior concentração de carboidratos da biomassa de Chlorella homosphaera foi

verificada no ensaio 3 (53,96±3,72%), cultivo este realizado na menor concentração de

nitrogênio e maior concentração de cloreto de sódio. Esta concentração foi em média 34%

superior à concentração de carboidratos obtida no ensaio controle. A concentração de KNO3

adicionada no ensaio 3 é 100% inferior e a de cloreto de sódio 9% inferior às adicionadas no

ensaio controle.

Para a microalga Spirulina, as maiores concentrações de carboidratos na biomassa

seca foram obtidos nos ensaios 3 (65,48±3,35%) e 4 (62,32±2,74%), cultivos realizados com

a menor concentração de nitrogênio, maior concentração de cloreto de sódio e maiores

concentrações de nitrogênio e cloreto de sódio, respectivamente. O ensaio controle apresentou

menores concentrações de carboidratos do que todos os demais ensaios.

44

Tabela 5 - Estimativa dos efeitos das concentrações de KNO3 (g.L-1

) e NaCl (g.L-1

), para a

microalga Chlorella homosphaera, e concentrações de NaNO3 (g.L-1

) e NaCl (g.L-1

), para a

microalga Spirulina platensis LEB 52, na produtividade em carboidratos (g.L-1

.d-1

), ao nível

de 95% de confiança.

Fator Efeitos Erro padrão t p

Chlorella homosphaera

Média 0,011 <0,001 181,305 <0,001

KNO3 (g.L-1

) -0,006 <0,001 -49,521 <0,001

NaCl (g.L-1

) -0,004 <0,001 -32,355 <0,001

KNO3 (g.L-1

) x NaCl (g.L-1

) -0,008 <0,001 -67,012 <0,001

Spirulina platensis LEB 52

Média 0,078 <0,001 180,480 <0,001

NaNO3 (g.L-1

) -0,011 <0,001 -12,222 <0,001

NaCl (g.L-1

) -0,022 <0,001 -25,044 <0,001

NaNO3 (g.L-1

) x NaCl (g.L-1

) 0,044 <0,001 52,182 <0,001

Observa-se que, nas faixas investigadas, as concentrações dos componentes

nitrogenados e concentração de cloreto de sódio, bem como as suas interações, apresentaram

efeito significativo (p<0,05) sobre a produtividade em carboidratos para as microalgas

Chlorella homosphaera e Spirulina platensis LEB 52 (Tabela 5).

De acordo com a Análise de Variância para a produtividade em carboidratos (g.L-

1.d

-1) de Chlorella homosphaera e Spirulina platensis LEB 52, observou-se que os dados

experimentais se ajustaram ao modelo de primeira ordem, visto que Fcalculado (30,9 e 1.133,

respectivamente) foram superiores ao Ftabelado (6,59), com coeficientes de determinação (R2)

igual a 0,99, sendo possível gerar os modelos de primeira ordem (Equação 3 e 4,

respectivamente) e as Superfícies de Resposta (Figura 2a e 2b, respectivamente).

Produtividade em carboidratos 𝐶ℎ𝑙𝑜𝑟𝑒𝑙𝑙𝑎 ℎ𝑜𝑚𝑜𝑠𝑝ℎ𝑎𝑒𝑟𝑎 (g. L−1. d−1) =

0,011 - 0,003 × KNO3 - 0,002×NaCl - 0,004 × KNO3 × NaCl

(3)

45

Produtividade em Carboidratos 𝑆𝑝𝑖𝑟𝑢𝑙𝑖𝑛𝑎 𝑝𝑙𝑎𝑡𝑒𝑛𝑠𝑖𝑠 LEB 52 g. L−1. d−1 =

0,078 - 0,005 × NaNO3 - 0,011× NaCl + 0,022 × NaNO3× NaCl

(4)

Figura 2- Superfícies de Resposta para produtividade em carboidratos (g.L-1

.d-1

) nos ensaios

dos Planejamentos Experimentais de Chlorella homosphaera (a) e

Spirulina platensis LEB 52 (b).

(a)

(b)

Na avaliação da produtividade de carboidratos (g.L-1

.d-1

) nos cultivos de

Chlorella homosphaera, observa-se que, na faixa investigada, as maiores produtividades em

carboidratos foram verificadas nos ensaios 2 e 3, nos quais a microalga Chlorella foi

cultivada na maior concentração de KNO3 e menor concentração de NaCl (Experimento 2) e

na menor concentração de KNO3 e maior concentração de NaCl (Experimento 3)

(1,042±0,096 g.L-1

.d-1

e 0,015±0,002 g.L-1

.d-1

, respectivamente) (Figura 3a).

Para a microalga Chlorella homosphaera, a diminuição simultânea nas

concentrações de nitrato de potássio e cloreto de potássio, bem como seus aumentos

simultâneos, não favoreceram o aumento da produtividade de carboidratos nos cultivos.

Quando avalia-se a produtividade de carboidratos (g.L-1

.d-1

) nos cultivos de

Spirulina platensis LEB 52 (Figura 3b), pode-se verificar que a maior produtividade em

carboidratos (0,116±0,002 g.L-1

.d-1

) foi verificada no experimento no qual a microalga foi

cultivada nas menores concentrações de NaNO3 e NaCl (experimento 1), e não nos

experimentos 3 e 4, que apresentaram maiores teores de carboidratos da biomassa seca

(65,48±3,35% e 62,32±2,74%, respectivamente). Isto pode ser explicado devido ao fato de

que o ensaio 1 apresentou elevada concentração final de biomassa (3,068±0,070 g.L-1

)

46

comparada aos ensaios 3 e 4 (1,427±0,123 g.L

-1 e 2,097±0,055 g.L

-1, respectivamente) o que

acarretou em superior produtividade em carboidratos, já que esta leva em consideração o

crescimento da microalga.

Figura 3 – Maiores teores de carboidratos e produtividades em carboidratos verificados para

as microalgas Chlorella homosphaera e Spirulina platensis LEB 52 em função dos ensaios

realizados.

Comparando-se os resultados obtidos pelas microalgas estudadas (Figura 3),

pode-se verificar que Spirulina platensis LEB 52 apresentou as maiores concentrações de

carboidratos (65,48±3,35%) e produtividade em carboidratos (0,116±0,002 g.L-1

.d-1

) (ensaio

1), comparados aos obtidos pela microalga Chlorella homosphaera (47,56±3,58% e

0,014±0,001 g.L-1

.d-1

; 53,96±3,72%, e 0,015±0,002 g.L-1

.d-1

, ensaios 2 e 3 respectivamente).

Portanto, a microalga Spirulina apresentou-se mais apropriada para uso como matéria prima

na produção de bioetanol, devido às elevadas concentrações de carboidratos e produtividade

em carboidratos obtidas.

As microalgas podem desempenhar um papel importante na produção de

biocombustíveis e produtos biotecnológicos com base em todos os seus componentes naturais

(YEN et a.l, 2013). Os carboidratos da microalga Spirulina podem ser utilizados como fonte

de carbono nos processos de produção de bioetanol; os lípidos, extraídos da biomassa,

utilizados como matéria-prima para produção de biodiesel (EL-SHIMI et al., 2013; AFIFY et

al., 2010); e resíduos oriundos destes processos podem ser utilizados para a produção de

biometano (COSTA et al., 2013).

A Spirulina é uma microalga que oferece um conjunto único de fatores biológicos

com funções altamente favoráveis para uma ampla gama de aplicações em saúde. Esta

47

microalga possui o certificado GRAS (Generally Recognized as Safe) do FDA (Food and

Drug Administration) e no Brasil é reconhecida como alimento pela Agência Nacional de

Vigilância Sanitária (ANVISA), podendo ser utilizada como aditivo nutritivo ou

farmacêutico, sem oferecer risco à saúde. As proteínas presentes na biomassa de Spirulina são

importantes suplementos alimentares, pois apresentam todos os aminoácidos essenciais

(DILLON et al., 1995) e pigmentos encontrados nesta microalga podem ser aplicadas nas

indústrias alimentícia e farmacêutica (CHAIKLAHAN et al., 2011) e no tratamento de

doenças (ROMAY et al., 2003; ERIKSEN, 2008).

3 CONCLUSÕES

As condições de cultivo influenciaram o teor de carboidratos das microalgas

avaliadas, sendo importante seu estudo a fim de que sejam obtidos maiores teores de

carboidratos que podem ser utilizados para a produção de bioetanol.

Para a microalga Chlorella homosphaera, as maiores produtividades em

carboidratos foram obtidas nos ensaios realizados com a maior concentração de KNO3 e

menor concentração de NaCl (Experimento 2) e menor concentração de KNO3 e maior

concentração de NaCl (Experimento 3) (0,014±0,001 g.L-1

.d-1

e 0,015±0,002 g.L-1

.d-1

,

respectivamente).

A maior produtividade em carboidratos para Spirulina platensis LEB 52

(0,116±0,002 g.L-1

.d-1


menores concentrações de NaNO3 e NaCl (experimento 1).

Para a microalga Spirulina platensis LEB 52 foram obtidas as maiores

concentrações de carboidratos e produtividade deste componente em comparação à microalga

Chlorella homosphaera.

A microalga Spirulina platensis LEB 52, cultivada em condições mixotróficas, e

com diminuição de 100% da concentração de NaNO3 e aumento de 5% na concentração de

NaCl, em comparação ao meio Zarrouk padrão, é capaz de ajustar seu metabolismo a fim de

apresentar elevada concentração de carboidratos e produtividade deste componente, o que

demonstra sua potencialidade para a produção de bioetanol.

48

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52

ARTIGO II: Concentração de carboidratos da microalga Chlorella minutissima

cultivada em diferentes meios e concentrações dos componentes nitrogenado e

fosfatados

RESUMO

As microalgas, como qualquer outro micro-organismo, reagem a variações do meio exterior

com alterações do seu meio intracelular. Assim, a manipulação das condições de cultivo,

principalmente a presença ou ausência de determinados nutrientes, estimula a biossíntese de

compostos de interesse. Os carboidratos destas podem ser utilizados para a produção de

bioetanol. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito do meio de cultivo e das

concentrações dos componentes nitrogenado e fosfatados utilizados no meio de cultivo da

microalga Chlorella minutissima na concentração de carboidratos desta. Foi utilizado

Planejamento Box-Behenken, totalizando 15 ensaios. Os cultivos foram realizados até início

da fase estacionária de crescimento da microalga, em reatores fechados de 2 L. Ao final dos

cultivos, foram determinadas as concentrações de carboidratos da biomassa seca (%) e

produtividade em carboidratos (g.L-1

.d-1

). De acordo com a análise de efeitos, a microalga

Chlorella minutissima cultivada em meio Basal, com adição de 0,125 g.L-1

do componente

nitrogenado (KNO3) e sem adição dos componentes fosfatados (K2HPO4 e KH2PO4)

apresentou a produtividade em carboidratos nos cultivos (0,030±0,002 g.L-1

.d-1

).

Palavras chave: meio de cultivo, microalgas, nutrientes.

53

Carbohydrate concentration of microalgae Chlorella minutissima grown in

different media and concentrations of nitrogen and phosphate components

ABSTRACT

The microalgae react to changes in the external environment with changes in its intracellular

environment. This way, manipulation of the culture conditions, particularly the presence or

absence of nutrients, stimulates the biosynthesis of compounds of interest. These

carbohydrates can be used to produce bioethanol. The aim of this study is to evaluate the

effect of medium and concentrations of nitrogen and phosphate components used in the

culture medium of microalgae Chlorella minutissima in its carbohydrate concentration. Box–Behnken factorial design was used, summing up 15 experiments. The cultivation was carried

out until early stationary phase of growth of microalgae, in 2 L closed photobioreactors. At

the end of the cultures, carbohydrate concentrations of the dry biomass (%) and productivity

in carbohydrates (g.L-1

.d-1

) were determined. According to the analysis of effects, the

microalgae Chlorella minutissima cultured in Basal medium, with the addition of 0.125 gL-1

of nitrogen component (KNO3) and without addition of phosphate components (K2HPO4 and

KH2PO4) showed a higher productivity in carbohydrates in cultivations (0,030±0,002 g.L-1

.d-

1).

Keywords: culture medium, microalgae, nutrients.

54

1 INTRODUÇÃO

As microalgas são caracterizadas como micro-organismos fotossintéticos, que

combinam água e dióxido de carbono atmosférico com luz solar, produzindo biomassa que

pode ser utilizada na produção de biocombustíveis e suplementos alimentares, assim como

pode ser empregada na captura de dióxido de carbono da atmosfera (BRENNAN e

OWENDE, 2010). Segundo S´Anchez e Cardona (2008), as microalgas, que possuem

carboidratos em sua constituição, são um recurso alternativo para a produção de bioetanol.

Como qualquer outro micro-organismo, as microalgas reagem a variações do

meio exterior com alterações do seu meio intracelular. Assim, a manipulação das condições

de cultivo, principalmente a presença ou ausência de determinados nutrientes, estimula a

biossíntese de compostos de interesse (RICHMOND, 2004). O cultivo de microalgas em

meios com redução de nitrogênio e fósforo, importantes elementos para o metabolismo das

microalgas, permite que lipídios e carboidratos sejam sintetizados preferencialmente

(RIGANO et al., 1998). O aumento da concentração de carboidratos da biomassa microalgal

favorece sua utilização como matéria prima alternativa na produção de bioetanol

(DISMUKES, 2008).

A biomassa de microalgas apresenta-se como uma alternativa às biomassas

comumente utilizadas para a obtenção de biocombustíveis, devido às suas características de

crescimento rápido e ao fato da forma de obtenção dos biocombustíveis a partir das

microalgas ser semelhante aos processos utilizados para outras matérias-primas (BRENNAN

e OWEDE, 2010; CARDOSO; VIEIRA; MARQUEZ, 2011).

O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito do meio de cultivo e das

concentrações dos componentes nitrogenado e fosfatados na concentração de carboidratos da

microalga Chlorella minutissima.


A microalga estudada no presente trabalho foi Chlorella minutissima, que

pertence à Coleção do Laboratório de Engenharia Bioquímica da Universidade Federal do Rio

Grande (FURG).

Para avaliar os efeitos das variáveis meio de cultivo, concentração do componente

nitrogenado e concentração dos componentes fosfatados na concentração de carboidratos da

55

microalga Chlorella minutissima realizou-se Planejamento Box-Behenken, totalizando 15

experimentos (Tabela 1).

Os meios de cultivo utilizados foram Meio Bristol`s modificado (MBM)

(WATANABE, 1960), BG-11 (RIPPKA et al., 1979) e Basal (XIONG et al., 1998). O Meio

MBM consiste (g.L-1

): CaCl2, 0,01; MgSO4.7H2O, 0,075; NaCl, 0,025, FeSO4.7H2O, 0,02 e 1

mL.L-1

de solução de micronutrientes A5. O Meio BG-11 contempla (g.L-1

): MgSO4.7H2O,

0,075; CaCl2.2H2O, 0,036; Citrato férrico amoniacal, 0,006; EDTA dissódico, 0,001; Na2CO3,

0,02, Ácido cítrico, 0,006 e 1mL.L-1

de solução de micronutrientes A5+Co. Compõe o Meio

Basal (g.L-1

): MgSO4.7H2O, 0,3; FeSO4.7H2O, 0,003 e 1 mL.L-1

de solução de

micronutrientes A5. Foram utilizadas as mesmas fontes de nitrogênio (KNO3) e fósforo

(K2HPO4/ KH2PO4) nos três meios de cultivo, sendo as diferenças entre estes apenas

contempladas nos demais componentes.

Os cultivos foram realizados em fotobiorreatores fechados de 2 L, com agitação

contínua por meio de injeção de ar estéril, iluminância 2500 lux e fotoperíodo 12 h

claro/escuro, e concentração inicial de inóculo 0,20 g.L-1

.

Tabela 1- Níveis reais e codificados (entre parênteses) das variáveis concentração do

componente nitrogenado (KNO3) e componentes fosfatados (K2HPO4 e KH2PO4) utilizados

nos cultivos da microalga C. minutissima.

Ensaio Meio de Cultivo Componente nitrogenado

(KNO3, g.L-1

)

Componentes fosfatados

(K2HPO4/ KH2PO4, g.L-1

)

1 Basal (-1) 0 (-1) 0,0375 / 0,0875 (0)

2 BG-11 (+1) 0 (-1) 0,0375 / 0,0875 (0)

3 Basal (-1) 0,250 (+1) 0,0375 / 0,0875 (0)

4 BG-11(+1) 0,250 (+1) 0,0375 / 0,0875 (0)

5 Basal (-1) 0,125 (0) 0 / 0 (-1)

6 BG-11 (-1) 0,125 (0) 0 / 0 (-1)

7 Basal (-1) 0,125 (0) 0,075 / 0,175 (+1)

8 BG-11 (-1) 0,125 (0) 0,075 / 0,175 (+1)

9 MBM (0) 0 (-1) 0 / 0 (-1)

10 MBM (0) 0,250 (+1) 0 / 0 (-1)

11 MBM (0) 0 (-1) 0,075 / 0,175 (+1)

12 MBM (0) 0,250 (+1) 0,075 / 0,175 (+1)

13 MBM (0) 0,125 (0) 0,0375 / 0,0875 (0)

14 MBM (0) 0,125 (0) 0,0375 / 0,0875 (0)

15 MBM (0) 0,125 (0) 0,0375 / 0,0875 (0)

56

2.2 Determinações analíticas durante os cultivos da microalga

2.2.1 Crescimento celular

A concentração de biomassa foi determinada a cada 24 h através da medida de

densidade ótica em espectrofotômetro a 670 nm (COSTA et al., 2002), utilizando-se relação

pré-estabelecida entre a massa seca de biomassa e a absorbância. Os cultivos foram mantidos

até o início da fase estacionária de crescimento.

Foram avaliados os parâmetros concentração final de biomassa (Xf, g.L-1

); a

produtividade máxima (Pmáx, g.L-1

.d-1

), calculada segundo a Equação1 e velocidade específica

máxima de crescimento (μmáx, d-1

) obtida por regressão exponencial aplicada à fase

logarítmica de crescimento (SCHMIDELL et al., 2001).

P g. L−1d−1 =𝑋−𝑋0

𝑡−𝑡0 (1)

sendo:

X = concentração de biomassa (g.L-1

) no tempo t (d)

X0 = concentração de biomassa (g.L-1

) no tempo t0 (d)

2.2.2 Determinação de carboidratos

A concentração de carboidratos da biomassa seca (% p/p) foi avaliada ao final dos

cultivos da microalga C. minutissima. O método utilizado foi uma adaptação de DNS

(MILLER, 1959), com prévia hidrólise ácida dos polissacarídeos, com adição de HCl 1,5 N.

A produtividade em carboidratos nos cultivos (g.L-1

.d-1

) foi obtida de acordo com

a Equação 2:

Produtividade em carboidratos (g. L−1. d−1) =Xf × CHO

100 × tc (2)

Sendo,

Xf = concentração final de biomassa (g.L-1

);

CHO = concentração de carboidratos (%);

tc= tempo de cultivo (d).

57


A microalga C. minutissima apresentou comportamento diferente para os ensaios

realizados (Figura 1) (Tabela 2). Isto pode ser justificado pelas diferenças nas proporções dos

componentes nitrogenado e fosfatados, bem como aos diferentes meios de cultivo utilizados.

Figura 1 – Curvas de crescimento dos ensaios do Planejamento Box-Behenken para

Chlorella minutissima: (a) 1 (); 2 (); 3 (); 4 (□); 5 (○); 6 (x); (b) 7 (►); 8 (▲); 9 ();

10 (■), 11 (●);12 (◘) e (c) 13 (◄); 14 ();15 ().

(a)

(b)

(c)

58

Os cultivos atingiram a fase estacionária em tempos diferentes, sendo que nos

ensaios 9 e 11, foram atingidos os menores tempos de cultivo (5 d e 6 d, respectivamente).

Estes cultivos foram realizados em meio MBM, sendo que no ensaio 9 não houve adição dos

componentes nitrogenado e fosfatados, e o ensaio 11 foi realizado sem adição de fonte de

nitrogênio, porém os componentes fosfatados foram adicionados nas maiores concentrações

do planejamento (0,075 g.L-1

e 0,175 g.L-1

de K2HPO4 e KH2PO4, respectivamente). As baixas

concentrações de nitrogênio e fósforo podem ter limitado o tempo de cultivo, acarretando

baixas concentrações celulares, já que estes componentes são essenciais para o crescimento

celular (BERGSTROM; JONSSON; JANSSON, 2008). O nitrogênio e o fósforo

desempenham um papel importante no metabolismo celular, já que estão presentes em muitos

processos bioquímicos. O nitrogênio é responsável pela formação das proteínas, aminoácidos

e ácidos nucléicos, enquanto o fósforo é componente de ácidos nucléicos e fosfolípidos

(RICHMOND, 2004), atuando também como transportador de substratos ou energia química,

já que faz parte das membranas (ROCHE et al., 1993).

Tabela 2- Concentração de biomassa final (Xf), produtividade celular máxima (Pmáx),

velocidade específica máxima de crescimento (µmáx), intervalo de tempo da fase exponencial,

concentrações de carboidratos na biomassa seca e produtividade em carboidratos de Chlorella

minutissima.

Ensaio

Concentração

de biomassa

final (g.L-1

)

Pmáx

(g.L-1.d

-1)

µmáx

(d-1

)

Intervalo

fase

exponencial

(d)

Concentração

carboidratos

biomassa

seca (%)

Produtividade

em

carboidratos

(g.L-1

.d-1

)

1 0,270±0,006b 0,012±0,003

ab 0,032±0,004

c 3-12 61,33±1,31

g O,012±0,001

2 0,465±0,012d 0,043±0,003

f 0,055±0,003

e 4-13 55,99±1,34

ef 0,011±0,001

3 0,603±0,009f 0,041±0,002

ef 0,058±0,002

e 4-15 52,17±1,54

e 0,017±0,002

4 0,438±0,008d 0,032±0,006

cd 0,039±0,002

d 3-15 21,52±0,97

b 0,006±0,001

5 0,604±0,015f 0,039±0,004

def 0,058±0,003

e 5-12 69,20±0,67

h 0,030±0,002

6 0,538±0,004e 0,060±0,003

g 0,017±0,002

b 6-21 24,54±1,13

b 0,006±0,001

7 0,599±0,005f 0,029±0,004

bc 0,060±0,002

e 5-15 50,57±2,03

fg 0,016±0,002

8 0,343±0,029c 0,045±0,002

f 0,017±0,002

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d 0,022±0,002

10 0,511±0,006e 0,075±0,003

h 0,055±0,001

e 2-10 23,60±2,70

b 0,008±0,001

11 0,211±0,003a 0,009±0,001

a 0,016±0,001

b 1-4 30,51±1,85

c 0,011±0,003

12 0,826±0,008h 0,098±0,004

i 0,112±0,002

g 2-10 46,95±1,03

d 0,026±0,003

13 0,682±0,012g 0,112±0,002

ij 0,079±0,001

f 2-10 45,42±2,24

d 0,019±0,002

14 0,707±0,005g 0,105±0,001

ij 0,077±0,002

f 2-10 44,19±1,19

d 0,020±0,002

15 0,708±0,005g 0,107±0,002

j 0,075±0,002

f 2-10 44,21±2,12

d 0,020±0,001



59

No ensaio 12, cultivo realizado em meio MBM, em níveis superiores das

concentrações de KNO3 (0,250 g.L-1

) e K2HPO4 / KH2PO4 (0,075 g.L-1

e 0,175 g.L-1

,

respectivamente) foram obtidas os maiores valores de Xf (0,826±0,008 g.L-1

) e µmáx

(0,112±0,002 g.L-1

) , indicando que a utilização de teores de nitrogênio e fósforo mais

elevados nos cultivos resultam em maiores crescimentos celulares.

As interações do meio de cultivo com componente nitrogenado, meio de cultivo

com componente fosfatado e componente nitrogenado com componente fosfatado

apresentaram efeito significativo na concentração de carboidratos nos cultivos (Tabela 3).

Tabela 3 - Estimativa dos efeitos lineares (L) e quadráticos (Q) do meio de cultivo,

componente nitrogenado e componentes fosfatados na produtividade em carboidratos nos

cultivos da microalga Chlorella minutissima, ao nível de 90% de confiança.

Fator Efeitos Erro padrão t p

Média 0,0138 <0,001 448,330 <0,001

X1 - Meio de cultivo (L) -0,0125 <0,001 -165,224 <0,001

X1 - Meio de cultivo (Q) 0,0055 <0,001 100,082 <0,001

X2 - Componente nitrogenado

(KNO3) (L)

0,0004 <0,001 5,635 0,030

X2 - Componente nitrogenado

(KNO3) (Q)

-0,0024 <0,001 -43,059 <0,001

X3 - Componentes fosfatados

(K2HPO4/ KH2PO4) (L)

-0,0026 <0,001 -35,372 <0,001

X3 - Componentes fosfatados

(K2HPO4/ KH2PO4) (Q)

0,0004 <0,001 8,968 0,012

X1 x X2

X1 x X3

-0,0055

0,0055

<0,001

<0,001

-53,076

51,726

<0,001

<0,001

X2 x X3 0,0144 <0,001 134,628 <0,001

De acordo com a avaliação dos efeitos das interações, quando a microalga

Chlorella minutissima foi cultivada em meio Basal, com adição de 0,125 g.L-1

do componente

nitrogenado (KNO3) e sem adição dos componentes fosfatados (K2HPO4 e KH2PO4) a

produtividade em carboidratos nos cultivos foi superior (0,030±0,002 g.L-1

.d-1

).

60

Pode-se verificar através da Tabela 2 que no ensaio 5, na qual se obteve a maior

concentração de carboidratos, não foi verificada a maior concentração final de biomassa

(0,604±0,015

g.L-1

). Segundo Dismukes et al. (2008) e Lourenço (2006), baixas

concentrações de fósforo e nitrogênio no meio de cultura podem limitar o crescimento de

algumas espécies de microalgas, porém a carência destes nutrientes produz aumento no teor

de carboidratos da biomassa microalgal.

Na literatura também são relatados experimentos na qual a concentração de

nitrogênio e fósforo influenciaram a concentração de carboidratos de microalgas. Markou

(2012) relatou que a diminuição de 8 mg.g-1

para 2 mg.g-1

de fósforo intracelular em Spirulina

platensis acarretou em aumento de 55% de carboidratos. Santos, Macedo e Alegre (2003)

verificaram o efeito da concentração do componente nitrogenado no teor de carboidratos de

microalgas. Com a diminuição pela metade na concentração de KNO3 houve uma diminuição

de 28,84% no teor protéico e aumento de 30,34% no teor de carboidratos de Spirulina

máxima.

Neste estudo, quando se compara o ensaio na qual a microalga apresentou o maior

teor de carboidratos na biomassa, que não leva em consideração o crescimento celular (ensaio

5 - 69,20±0,67%), realizado em meio de cultivo Basal com adição de concentração

intermediária de fonte de nitrogênio (0,125 g.L-1

) e sem adição de fonte de fósforo, com o

ensaio em que se obteve a menor concentração de carboidratos (ensaio 8 - 15,28±1,27%),

ensaio realizado em meio BG-11 com adição de 0,125 g.L-1

de KNO3, 0,075 g.L-1

de K2HPO4

e 0,175 g.L-1

de KH2PO4, o aumento no teor de carboidratos foi aproximadamente 353%.

Quando o meio de cultivo apresenta carência em nitrogênio ou fósforo, fato que

pode ser verificado na fase estacionaria do cultivo ou quando o meio de cultivo possui teores

reduzidos destes nutrientes, as células exibem um aumento da velocidade de captação do

nutriente limitante. À medida que o nutriente vai se esgotando no meio, fica mais difícil para

a célula utilizá-lo. O fato de a célula ter aprimorado seus sistemas de captação para manter

sua velocidade de crescimento, e não haver disponibilidade do nutriente para isso ocorrer,

gera um estresse fisiológico que aumenta à medida que a concentração dos nutrientes diminui.

Esse estresse altera o metabolismo microalgal, direcionando os processos metabólicos para a

produção de carboidratos ou lipídios de reserva para preparar a célula para o período de

privação (LOURENÇO, 2006; MACEDO e ALEGRE, 2001).

Comparado aos demais meios de cultivo utilizados, o meio Basal, possui maior

concentração de sulfato de magnésio (0,3 g.L-1

) frente 0,075 g.L-1

nos meios MBM e BG-11.

Este componente pode ter influenciado a concentração de carboidratos nos cultivos, já que o

61

magnésio exerce papel essencial para as microalgas por ser constituinte da molécula de

clorofila (LOURENÇO, 2006), o que pode acarretar em um aumento da eficiência

fotossintética destas. Além de sua importância na fotossíntese, o magnésio tem outras funções

essenciais à célula como agregação de ribossomos em unidades funcionais e formação da

catalase (BECKER, 2004).

Para as concentrações de nitrogênio e fósforo, verificou-se que é necessário que

ao menos um destes componentes seja adicionado, já que ambos afetam o crescimento celular

e, por consequência, o teor de carboidratos dos cultivos.

Na análise dos meios de cultivo, foram evidenciadas condições diferentes para

obtenção de maiores produtividades em carboidratos. Para o meio BG-11, a maior

produtividade em carboidratos foi verificada no ensaio 2 (0,011±0,001 g.L-1

.d-1

), no qual a

microalga foi cultivada sem adição do componente nitrogenado e no nível intermediário dos

componentes fosfatados (0,0375 g.L-1

de K2HPO4 e 0,0875 g.L-1

KH2PO4). Esta

concentração de carboidratos é 72% inferior quando comparado a concentração de

carboidratos obtida no ensaio 5, realizado em meio Basal.

Nos cultivos realizados em meio MBM, a maior produtividade em carboidratos

foi obtida no ensaio 12 (0,026±0,003 g.L-1

.d-1

), realizado com adição dos componentes

nitrogenado e fosfatados em níveis superiores (0,250 g.L-1

de KNO3; 0,075 g.L-1

de K2HPO4 e

0,175 g.L-1

KH2PO4) e no ensaio 12 (0,388±0,010 g.L-1

), cultivo que também apresentou a

maior concentração celular final (0,826±0,008

g.L-1

). No experimento 5, no qual foi

verificada a maior produtividade em carboidratos (0,030±0,002 g.L-1

.d-1

), obteve-se, em

média, aumento de 15% em relação ao ensaio 12.

Em meio Basal, a maior produtividade em carboidratos nos cultivos foi verificada

no ensaio 5 (0,030±0,002 g.L-1

.d-1

), com adição de 0,125 g.L-1

de KNO3 e sem adição de

fontes de fósforo, e 3 (0,017±0,002 g.L-1

.d-1

), realizado com maior concentração de nitrogênio

(0,250 g.L-1

de KNO3) e níveis intermediários de fontes de fósforo (0,0375 g.L-1

de K2HPO4

e 0,0875 g.L-1

de KH2PO4). O ensaio 5 apresentou aumento de 76% na produtividade em

carboidratos quando comparado ao ensaio 3.

As microalgas produzem uma ampla variação de carboidratos que, na sua maioria,

são produtos de reserva, como amido (BROWN et al., 1997; CHU; DUPUY; WEBB, 1982).

Alterações na constituição bioquímica de microalgas são importantes para que se obtenha

elevados teores de carboidratos e estes possam ser utilizados como matéria prima alternativa

para produção de bioetanol. Neste estudo, foram obtidas elevadas concentrações de

62

carboidratos para a microalga Chlorella minutissima, e estes carboidratos podem ser

utilizados na produção de bioetanol.

3 CONCLUSÕES

A microalga Chlorella minutissima apresentou maiores valores de concentração

final de biomassa (0,826±0,008 g.L-1

) e velocidade específica máxima de crescimento

(0,112±0,002 g.L-1

) no ensaio 12, realizado em meio MBM com as maiores concentrações de

nitrogênio e fósforo.

A maior produtividade em carboidratos nos cultivos (0,030±0,002 g.L-1

.d-1

) foi

obtida quando a microalga Chlorella minutissima foi cultivada em meio Basal, com adição de

0,125 g.L-1

do componente nitrogenado (KNO3) e sem adição dos componentes fosfatados

(K2HPO4 e KH2PO4).

No ensaio com maior produtividade em carboidratos (ensaio 5) houve aumento de

15% neste teor quando comparado ao ensaio realizado com meio MBM sem diminuição dos

componentes nitrogenado e fosfatado (ensaio 12).

As alterações realizadas quanto às concentrações dos componentes nitrogenado e

fosfatados, bem como ensaios em diferentes meios de cultivo, possibilitaram a verificação de

melhores condições para obtenção de incremento no teor de carboidratos da microalga

Chlorella minutissima.

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65


glicose e sacarose

RESUMO

As microalgas têm atraído interesse mundial como um meio alternativo para a produção de

biocombustíveis, como biodiesel e bioetanol. Até o momento, poucos estudos são relatados na

literatura sobre o uso de carboidratos de microalgas para produção de bioetanol. O uso de

microalgas surge como alternativa para produção de bioetanol, porém a eficiência deste

processo ainda não é comparável com os de matérias-primas comumente utilizadas. Neste

contexto, objetivou-se produzir bioetanol a partir da biomassa de microalgas com adição de

glicose e sacarose. Os polissacarídeos das microalgas Chlorella pyrenoidosa e Spirulina sp.

LEB 18 hidrolisados foram utilizados para realizar fermentações alcoólicas: utilizando a

biomassa e biomassa adicionada ou não de glicose e sacarose. As fermentações alcoólicas

foram realizadas em erlenmeyers de 2 L com volume útil de 1 L, em condições anaeróbicas,

sendo a levedura S. cerevisiae agente do processo. O ensaio com Spirulina acrescida de

glicose apresentou a maior eficiência na formação de etanol e produtividade em etanol

(68,49±2,592% e 1,182±0,05g.L-1

.h-1

, respectivamente).

Palavras-chave: Chlorella, etanol, Spirulina.

66

Bioethanol production from microalgae in process with addition of glucose and sucrose

ABSTRACT

Microalgae have attracted worldwide interest as an alternative source for the production of

biofuels such as biodiesel and bioethanol. Nowadays, few studies are reported in the literature

about the use of microalgae carbohydrates for bioethanol production. The use of microalgae

is an alternative for bioethanol production, but the efficiency of this process is still not

comparable to those of commonly used materials. In this context, the aim was to produce

bioethanol from microalgae carbohydrates adding glucose and sucrose. The hydrolysates

polysaccharides from microalgae Chlorella pyrenoidosa and Spirulina sp. LEB 18 were used

to perform fermentations: utilizing biomass and biomass or without added glucose and

sucrose. The fermentations were carried out in Erlenmeyer flasks with 2 L working volume of

1 L, under anaerobic conditions, and the yeast S. cerevisiae agent process.The test with

Spirulina plus glucose was the most efficient in the formation of ethanol and ethanol

productivity (68.49± 2.592% and 1.182±0.05 g.L-1

.h-1

, respectively).

Keywords: Chlorella, ethanol, Spirulina.

67

1 INTRODUÇÃO

Microalgas são consideradas como uma das matérias-primas renováveis mais

promissora para a produção de biocombustíveis, devido às suas vantagens de crescimento

rápido, fixação eficiente de dióxido de carbono, não competem com a produção de alimentos

por terras agricultáveis e água potável, e, potencialmente, acumulam grandes quantidades de

carboidratos (DEMIRBAS, 2011; ZHU et al., 2014).

Até o momento, existem poucos estudos na literatura sobre o uso de carboidratos

à base de microalgas para produção de bioetanol, o que requer mais compreensão e

conhecimento para apoiar a utilização desta matéria-prima de última geração (CHEN, 2013).

A produção de bioetanol a partir de culturas sacarinas e amiláceas não é o

processo mais sustentável de produção de combustíveis, pois provoca pressão sobre o preço

dos alimentos, já que muitas destas matérias-primas também podem ser utilizadas para

alimentação humana e animal; causam a degradação acelerada dos solos e consomem

elevadas quantidades de água. No entanto, a produção de etanol a partir destas matérias-

primas está sujeita à sazonalidade das culturas (BASTOS, 2007; HARUN; DANQUAH;

FORPE, 2010; ROSA e GARCIA, 2009). O incremento da produção de etanol de primeira

geração com microalgas poderia diminuir a necessidade da utilização de matérias-primas

utilizadas como alimentos. Além disso, a produção de bioetanol a partir de microalgas gera

rendimentos inferiores quando comparado a produção a partir de sacarose e amiláceos

(ASADA, 2012; CHOI; NGUYEN; SIM., 2010; NIKOLIC et al., 2010; SILVA et al., 2008).

A adição de carboidratos provenientes de microalgas aos processos de obtenção de etanol já

estabelecidos poderia estimular a utilização desta fonte renovável de matéria-prima.

Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi produzir etanol a partir da biomassa

de microalgas acrescidas de glicose e sacarose.


2.1 Determinação de carboidratos da biomassa de microalgas

A concentração de carboidratos da biomassa (% p/p) de Spirulina sp. LEB 18 e

Chlorella pyrenoidosa foi determinada por adaptação do métodos de 3,5 DNS (MILLER,

1959), com prévia hidrólise ácida dos polissacarídeos, com adição de HCl 1,5 N.

68

2.2 Hidrólise da biomassa de microalgas

As biomassas de microalgas estudadas foram acrescidas de água na proporção 1:2

(p/v) e pH ajustado em 6,0. Esta mistura foi autoclavada a 121°C por 20 min. A liquefação foi

realizada com adição de 1,2% (v/p de carboidratos) de enzima amilase comercial

(Termamyl®

, Novozymes) (atividade específica=3,32 gaçúcar redutor.min-1

.mgproteína-1

), e

incubada por 1 h a 85 ºC a 100 rpm em agitador orbitalr. O mosto liquefeito foi resfriado, pH

ajustado em 4,5 e adicionado 2,5% (v/p de carboidratos) de enzima amiloglicosidase

comercial (AMG®

, Novozymes) (atividade específica= 1,8 gaçúcar redutor.min-1

.mgproteína-1

). Os

mostos foram incubados por 24 horas a 58 °C a 100 rpm em agitador orbital e posteriormente

centrifugados a 9.000 rpm, sendo o sobrenadante esterilizado a 121°C por 30 min.

2.3 Fermentação Alcoólica

2.3.1 Micro-organismo

A cepa utilizada foi a levedura Saccharomyces cerevisiae SA-1, cedida pelo

Centro de Tecnologia Canavieira (CTC – Piracicaba/SP – Brasil), sendo sua ativação

realizada a 30 °C por 48 h em meio contendo (g.L-1

): glicose (20), extrato de levedura (10) e

peptona (20) (BRINGHENTI e CABELLO, 2005).

Os inóculos foram preparados utilizando-se meio contendo (g.L-1

): carboidratos

hidrolisados da biomassa da microalga (30), glicose (20), extrato de levedura (10) e peptona

(20) (BRINGHENTI e CABELLO, 2005).

2.3.2 Processo Fermentativo

Foram realizados 8 ensaios de fermentação alcoólica com biomassas das

microalgas Spirulina sp. LEB 18 e Chlorella pyrenoidosa, sendo: (S) utilizando somente

biomassa de Spirulina sp. LEB 18, (SG) utilizando 50% de biomassa de Spirulina sp. LEB 18

e 50% de glicose, (SSa) utilizando 50% de biomassa de Spirulina sp. LEB 18 e 50% de

sacarose, (C) utilizando somente biomassa de Chlorella pyrenoidosa, (CG) utilizando 50% de

biomassa de Chlorella pyrenoidosa e 50% de glicose, (CSa) utilizando 50% de biomassa de

69

Chlorella pyrenoidosa e 50% de sacarose; além de (G) fermentação utilizando somente

glicose e (Sa) utilizando somente sacarose.

A biomassa de Spirulina sp. LEB 18 foi proveniente de cultivos realizados na

planta piloto de produção de microalgas do Laboratório de Engenharia Bioquímica (LEB) da

Universidade Federal do Rio Grande (FURG) situada na cidade Santa Vitória do Palmar/RS

(33° 30′ 13″ N; 53° 08′ 59″ W) (MORAIS et al., 2009) e microalga Chlorella pyrenoidosa foi

obtida comercialmente.

As fermentações alcoólicas foram iniciadas com concentração inicial de

carboidratos de 12% (p/v). Foram adicionados ao mosto os nutrientes (g.L-1

): extrato de

levedura (5); (NH4)2SO4 (7,5); K2HPO4 (3,5); MgSO4.7H2O (0,75); CaCl2.2H2O (1). O pH do

mosto foi ajustado entre 4,5 e 5,0 e posteriormente esterilizado e inoculado com 10% (v/v) de

inóculo da levedura S. cerevisiae. Os ensaios foram realizados em erlenmeyers de 2 L, com

volume útil de 1 L. O processo foi conduzido em estufa termostatizada a 30 ºC e em

condições anaeróbicas.

As amostras foram coletadas no tempo zero de fermentação e a cada 4 h para a

determinação da concentração de açúcares redutores (AR), concentração de etanol e

concentração celular de S. cerevisiae.

2.3.2.1 Determinação da concentração de biomassa de S. cerevisiae

A determinação da concentração celular foi realizada por espectrofotometria,

através da leitura da absorbância do meio de cultura a 600 nm. O sobrenadante obtido após

centrifugação foi utilizado como branco para eliminar a interferência de coloração do meio de

cultivo.

2.3.2.2 Determinação de açúcares redutores

O consumo do substrato pela levedura foi verificado através da determinação de

açúcares redutores (AR), o qual foi quantificado pelo método 3,5 DNS (MILLER, 1959),

utilizando-se uma curva padrão, obtida a partir de solução estoque de glicose anidra.

70

2.3.2.3 Determinação da concentração de etanol

A concentração de etanol foi determinada através do método espectrofotométrico

para determinação de teores alcoólicos em misturas hidroalcoólicas (SALIK e POVH, 1993).

A eficiência (η) na formação de etanol foi obtido através da Equação 1 (HANG;

LEE; WOODAMS, 1981).

𝜂(%) =∆E

0,511 x (S0 − S) x 100 (1)

sendo,

ΔE = Variação da concentração de etanol (g.L-1

;

S0 = Concentração de açúcares redutores totais no início da fermentação

(g.L-1

);

S = Concentração de açúcares redutores totais no final da fermentação (g.L-1

).

2.3.2.4 Parâmetros cinéticos

Foram determinados os parâmetros fator de conversão de substrato em células

(YX/S) (Equação 2), fator de conversão de substrato em produto (YP/S) (Equação 3) e

produtividade em etanol (Petanol) (Equação 4) (SCHMIDELL et al., 2001).

𝑌𝑋/𝑆 𝑔𝑐é𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 . 𝑔𝑠𝑢𝑏𝑠𝑡𝑟𝑎𝑡𝑜−1 =

∆𝑋

−∆𝑆 (2)

sendo,

ΔX = Variação da concentração de células (g.L-1

);

ΔS = Variação da concentração de substrato (g.L-1

).

𝑌𝑃/𝑆 𝑔𝑝𝑟𝑜𝑑𝑢𝑡𝑜 .𝑔𝑠𝑢𝑏𝑠𝑡𝑟𝑎𝑡𝑜−1 =

∆𝑃

−∆𝑆 (3)

sendo,

ΔP = Variação da concentração de etanol (g.L-1

);

ΔS = Variação da concentração de substrato (g.L-1

).

71

𝑃𝑒𝑡𝑎𝑛𝑜𝑙 g. L−1h−1 =∆𝐸

∆𝑡 (4)

sendo,

ΔE = Variação da concentração de etanol (g.L-1

);

Δt = Variação do tempo de fermentação (h).

2.4 Análise estatística

As diferenças entre as médias dos ensaios foram avaliadas pela análise de

variância no nível de 95% de confiança e com posterior comparação entre estas pelo Teste de

Tukey.


As microalgas Chlorella pyrenoidosa e Spirulina sp. LEB 18 apresentaram teores

de carboidratos de 18,7±0,25% e 22,9±0,47% (p/p), respectivamente. Estes teores foram

utilizados na base de cálculo para que todas as fermentações alcoólicas realizadas iniciassem

com concentração de carboidratos de 12% (p/v).

De acordo com Böger, Ernest e Chen (1987) e Moreno e Ramírez (2006), as

células de cianobactérias, como Spirulina, possuem inclusões citoplasmáticas tais como

grânulos de glicogênio, depositados princpalmente no citoplasma e servem como fonte de

carbono e energia. Vidotti e Rollemberg (2004) afirmaram que no caso de microalgas da

divisão Chlorophyta, como microalgas do gênero Chlorella, acumulam amido como fonte de

reserva. Os polissacarídeos de reserva das microalgas Chlorella e Spirulina podem ser

hidrolisados pela ação de enzimas amilolíticas (CHOI, 2010), o que foi verificado neste

estudo. Após 4 h decorridas nas fermentações, a concentração de açúcares redutores diminui

rapidamente, com concomitante aumento da concentração de células de Saccharomyces

cerevisiae e produção de etanol (Figura 1).

72

Figura1 - Concentrações de (▲) Açúcar redutor (%), () Etanol (%) e () Biomassa (g.L-1

)

dos ensaios: (a) Sa - 110% sacarose; (b) G - 100% glicose; (c) SSa - 50% de biomassa de

Spirulina e 50% de sacarose; (d) CSa - 50% de biomassa de Chlorella e 50% de sacarose; (e)

SG - 50% de biomassa de Spirulina e 50% glicose; (f) CG - 50% de biomassa de Chlorella e

50% glicose; (g) S -100% biomassa de Spirulina e (h) C -100% biomassa de Chlorella.

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(g)

(h)

73

Na análise da produtividade em etanol para a microalga Chlorella pyrenoidosa

(Tabela 1), houve aumento nos ensaios acrescidos de glicose (CG) e sacarose (CSa) (140% e

68%, respectivamente) (p<0,001) em relação à fermentação alcoólica realizada somente com

a biomassa da microalga (C).

Para Spirulina, os ensaios acrescidos de glicose elevaram a produtividade em

etanol em 43% em comparação ao ensaio realizado apenas com a microalga (p<0,001), porém

a adição de sacarose não influenciou este parâmetro (p=0,94).

Tabela 1 - Tempo transcorrido nas fermentações (tfermentação), fator de conversão de substrato

em célula (YX/S), fator de conversão de substrato em produto (YP/S), produtividade máxima

em etanol (Petanol) e eficiência na produção de etanol (η).

Ensaios*

Parâmetros

tfermentação

(h)

YX/S

(gcél.g.substrato-1

)

YP/S

(getanol.g.substrato-1

)

Petanol

(g.L-1

.h-1

)

η

(%)

Sa 24 0,098±0,001b 0,409±0,009

d 1,505±0,084

e 84,33±1,78

e

G 24 0,112±0,003c 0,396±0,005

d 1,923±0,028

f 89,60±0,98

e

SSa 24 0,087±0,002a 0,295±0,004

c 0,862±0,100

c 57,46±3,24

bc

CSa 24 0,097±0,005b 0,241±0,002

b 0,660±0,016

b 53,47±2,17

ab

SG 20 0,114±0,004c 0,249±0,005

b 1,182±0,051

d 68,49±1,59

d

CG 20 0,113±0,002c 0,302±0,003

c 0,959±0,039

c 61,71±2,61

c

S 20 0,095±0,003ab

0,291±0,004c 0,822±0,017

c 63,68±0,14

c

C 20 0,101±0,002b 0,141±0,004

a 0,399±0,016

a 47,26±3,53

a



*Sa - 110% sacarose; G - 100% glicose; SSa - 50% de biomassa de Spirulina e 50% de sacarose; CSa - 50% de

biomassa de Chlorella e 50% de sacarose; SG - 50% de biomassa de Spirulina e 50% glicose; CG - 50% de

biomassa de Chlorella e 50% glicose; S -100% biomassa de Spirulina; C -100% biomassa de Chlorella.

Para a microalga Chlorella pyrenoidosa, a eficiência na formação de etanol foi

aumentada em 14% em comparação ao ensaio realizado somente com a microalga (C) e

processo de fermentação simultânea de Chlorella e glicose (CG) (p<0,001).

Em relação ao ensaio de fermentação alcoólica de biomassa de Spirulina (S) a

adição de sacarose não influenciou a eficiência da formação de etanol em comparação ao

ensaio realizado somente com a biomassa da microalga (p=0,386). Porém, a adição de glicose

apresentou influência neste parâmetro, visto que no ensaio realizado com Spirulina e glicose

obteve-se eficiência superior em comparação ao ensaio realizado apenas com a microalga

(p=0,0223). Estes resultados apontam para que a fermentação concomitante de carboidratos

extraídos de microalgas e amiláceos, previamente hidrolisados, que geram glicose como

74

substrato; poderia elevar a produtividade em etanol e eficiência do processo em comparação

às fermentações realizadas apenas com a utilização de carboidratos de microalgas.

Neste estudo, apenas os ensaios realizados com biomassa de Chlorella acrescida

de sacarose (CSa) e apenas biomassa de Chlorella (C), foram obtidas inferiores eficiências na

formação de etanol (53,47±2,17% e 47,261±3,53%, respectivamente) do que os obtidos por

Choi, Nguyen e Sim (2010) que ao estudarem o processo de produção de bioetanol a partir

dos carboidratos de Chlamydomonas reinhardtii, obtiveram eficiência do processo de 57%.

Porém neste estudo, as eficiências na formação de etanol foram inferiores aos obtidos por

Asada et al. (2012), que obtiveram 79,5% de eficiência ao realizarem processos de

sacarificação e fermentação simultâneos com biomassa de Chlamydomonas fasciata pré-

tratada com homogeneizador ultrassônico.

Comparando os melhores resultados obtidos nos ensaios com microalgas e os

ensaios que apresentaram melhores resultados na eficiência na formação de etanol (G e Sa), o

ensaio realizado com biomassa de Chlorella adicionados de glicose (CG) apresentou

diminuição da eficiência em relação aos ensaios com sacarose e glicose (22% e 29%,

respectivamente, p<0,001). Para o ensaio de Spirulina com adição de glicose (SG), a

diminuição da eficiência do processo para os ensaios com sacarose e glicose foi inferior, em

torno de 16% em relação ao ensaio com sacarose (p<0,001) e 21% ao ensaio com glicose

(p<0,001).

Para os ensaios realizados somente com as biomassas das microalgas estudadas (S

e C), a microalga Spirulina sp. LEB 18 apresentou-se mais vantajosa na produção de

bioetanol, já que apresentou incremento de 16% na eficiência do processo fermentativo e

106% na produtividade em etanol e fator de conversão de substrato em etanol em relação à

Chlorella pyrenoidosa (p<0,001).

Nos ensaios acrescidos de glicose (SG e CG), Spirulina também se apresentou

mais eficiente como matéria prima do que Chlorella pyrenoidosa, já que houve aumento de

6,77% na eficiência na formação de etanol em comparação ao ensaio realizado com Chlorella

pyrenoidosa (p=0,020), além do aumento na produtividade em etanol de 23% (p<0,001). Esta

diminuição na eficiência na produção de etanol pela microalga Chlorella pode ter sido

influenciada pela presença do carboidrato xilose, que é uma pentose não fermentescível pela

levedura Saccharomyces cerevisiae (CHANDEL et al. 2007; LEE et al., 1997). Ho et al.

(2013) ao analisarem os carboidratos de Chlorella vulgaris, identificaram a presença de cerca

de 7% de xilose na biomassa da microalga.

75

A adição de glicose elevou as produtividades em etanol e eficiências dos

processos nos ensaios realizados com as microalgas, porém o mesmo não foi verificado na

adição de sacarose. A glicose é diretamente utilizada pela levedura Saccharomyces cerevisiae

e a sacarose deve ser primeiramente hidrolisada pela ação da enzima invertase, produzida pela

levedura, aos seus dois monômeros constituintes, glicose e frutose (SÁNCHEZ e

CARDONA, 2008). Além da glicose proveniente da hidrólise da sacarose, os mostos dos

cultivos com microalgas continham glicose proveniente da hidrólise dos carboidratos das

microalgas, e isto pode acarretar o fenômeno chamado diauxia. Este efeito consiste no

consumo preferencial de um substrato em relação a outro quando mais de um substrato estão

presentes no meio fermentativo. Se o meio de cultivo possui duas fontes de carbono, os

micro-organismos tendem a utilizar a que lhes proporcione maior rendimento energético

(FERREIRA, 2003; TOSSETO, 2002). Este efeito pode ter causado a diminuição da

eficiência e a produtividade em etanol, nos ensaios realizados com carboidratos de microalgas

adicionadas de sacarose, em relação aos ensaios com adição de glicose, já que após toda a

glicose ser consumida, as células da levedura já poderiam apresentar viabilidade diminuída e,

em conseqüência pode ter ocorrido a não utilização de toda frutose disponível para produção

de etanol.

A partir dos resultados obtidos neste estudo, é possível afirmar de que há grande

potencial na produção de bioetanol a partir da biomassa de microalgas, já que foi obtido

eficiência do processo de até 68%.

3 CONCLUSÕES

A adição de glicose às fermentações alcoólicas utilizando as biomassas de

microalgas elevou as eficiências na formação de etanol, o que pode favorecer a utilização de

microalgas como fonte alternativa na produção de etanol.

O ensaio realizado com biomassa de Spirulina acrescida de glicose apresentou

eficiência superior na formação de etanol e produtividade em etanol (68,487±2,592% e

1,182±0,051 g.L-1

.h-1

, respectivamente).

A fermentação utilizando biomassa da microalga Spirulina sp. LEB 18,

adicionados de glicose, apresentou aumento de 6,77% na eficiência do processo e 23% na

produtividade em etanol comparados ao ensaio realizado a biomassa de Chlorella

pyrenoidosa, adicionados de glicose.

76

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78

CAPÍTULO IV: CONCLUSÕES GERAIS

79

6 CONCLUSÕES GERAIS

As modificações nas condições de cultivo das microalgas estudadas elevaram as

concentrações de carboidratos destas.

Para a microalga Chlorella homosphaera, as maiores produtividades em

carboidratos foram obtidas nos ensaios realizados com a maior concentração de KNO3 com

menor concentração de NaCl e menor concentração de KNO3 com maior concentração de

NaCl (0,014±0,001 g.L-1

.d-1

e 0,015±0,002 g.L-1

.d-1

, respectivamente).

A maior produtividade em carboidratos nos cultivos de Spirulina platensis LEB

52 (0,116±0,002 g.L-1

.d-1


menores concentrações de NaNO3 e NaCl.

A microalga Spirulina platensis LEB 52 apresentou maior produtividade em

carboidratos quando comparada à microalga Chlorella homosphaera.

A maior produtividade em carboidratos nos cultivos (0,030±0,002 g.L-1

.d-1

) foi

obtida quando a microalga Chlorella minutissima foi cultivada em meio Basal, com adição de

0,125 g.L-1

do componente nitrogenado (KNO3) e sem adição dos componentes fosfatados

(K2HPO4 e KH2PO4).

Na produção de etanol, dos ensaios realizados com microalgas, o ensaio com

Spirulina acrescida de glicose apresentou superior eficiência na formação de etanol e

produtividade em etanol (68,487±2,592% e 1,182±0,051g.L-1

.h-1

, respectivamente).

A adição de glicose às fermentações alcoólicas utilizando os carboidratos de

microalgas elevou as eficiências na formação de etanol.

Os aumentos na concentração de carboidratos obtidos para as microalgas

Chlorella homosphaera, Spirulina platensis LEB 52 e Chlorella minutissima e elevadas

eficiências na produção de bioetanol a partir de carboidratos de Spirulina sp. LEB 18

demonstraram que estas podem ser utilizadas como matéria-prima alternativa à matriz

energética atual, diminuindo os problemas atuais, como a utilização de alimentos e de terras

agricultáveis para produção de biocombustíveis.

80

7 SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS

Utilizar resíduos da produção de etanol a partir de microalgas para produção de

outros biocombustíveis, como biometano;

Cultivar as microalgas Spirulina platensis LEB 52, Chlorella homosphaera e

Chlorella minutissima nas condições verificadas para obtenção de elevados teores de

carboidratos, com posterior produção de bioetanol;

Identificar carboidratos das microalgas Spirulina platensis LEB 52, Chlorella

homosphaera e Chlorella minutissima.

81

CAPÍTULO V: REFERÊNCIAS

82

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90

ANEXO A: Meio Zarrouk

Tabela 1 - Quantidades (g) de reagentes para preparo do meio Zarrouk.

Componente g.L-1

NaHCO3 16,8

K2HPO4 0,5

NaNO3 2,5

K2SO4 1,0

NaCl 1,0

MgSO4.7H2O 0,2

CaCl2 0,04

FeSO4.7H2O 0,01

EDTA 0,08

Tabela 2- Quantidades (mL) das soluções para o meio Zarrouk.

Solução mL.L-1

A5 1,0

B6 1,0

Solução A5: 2,86 g.L-1

de H3BO3; 1,81 g.L-1

de MnCl2.4H2O; 0,222 g.L-1

de ZnSO4.7H2O;

0,079 g.L-1

de CuSO4. 5H2O; 0,015 g.L-1

de NaMoO4

Solução B6: 22,96m g.L-1

de NH4VO3; 96 mg.L-1

de K2Cr2(SO4)4.24H2O; 47,85 mg.L-1

de

NiSO4.7H2O; 17,94 mg.L-1

de Na2WO4.2H2O; 61,1 mg.L-1

de TiOSO4.H2SO4.8H2O; 43,98

mg.L-1

de CO(NO3)2.6H2O

91

ANEXO B: Meio Bristol`S Modificado (MBM)

Tabela 3- Quantidades (g) de reagentes para preparo do meio MBM

Tabela 4- Quantidades (mL) das soluções para o meio MBM

Solução mL.L-1

A5 1,0


de H3BO3; 1,81 g.L-1

de MnCl2.4H2O; 0,222 g.L-1

de ZnSO4.7H2O;

0,079 g.L-1

de CuSO4. 5H2O; 0,015 g.L-1

de NaMoO4

Componente g.L-1

KNO3 0,25

CaCl2 0,01

MgSO4.7H2O 0,075

K2HPO4 0,075

KH2PO4 0,175

NaCl 0,025

FeSO4.7H2O 0,02

92

ANEXO C: Meio Basal

Tabela 5 - Quantidades (g) de reagentes para preparo do meio Basal.

Tabela 6 - Quantidades (mL) das soluções para o meio Basal.

Solução mL.L-1

A5 1,0


de H3BO3; 1,81 g.L-1

de MnCl2.4H2O; 0,222 g.L-1

de ZnSO4.7H2O;

0,079 g.L-1

de CuSO4. 5H2O; 0,015 g.L-1

de NaMoO4

Componente g.L-1

KH2PO4 0,7

K2HPO4 0,3

MgSO4.7H2O 0,3

FeSO4.7H2O 0,003

C2H5NO2 0,1

93

ANEXO D: Meio BG-11

Tabela 7 - Quantidades (g) de reagentes para preparo do meio BG-11.

Tabela 8 - Quantidades (mL) das soluções para o meio BG-11.

Solução mL.L-1

A5+Co 1,0

Solução A5 + Co: 2,86 g.L-1

de H3BO3; 1,81 g.L-1

de MnCl2.4H2O; 0,222 g.L-1

de

ZnSO4.7H2O; 0,079 g.L-1

de CuSO4. 5H2O; 0,015 g.L-1

de NaMoO4; 0,0494 g.L-1

de

Co(NO3)2.6H2O.

Componente g.L-1

NaNO3 1,5

K2HPO4.3H2O 0,04

MgSO4.7H2O 0,075

CaCl2.2H2O 0,036

Citrato férrico amoniacal 0,006

EDTA dissódico 0,001

Na2CO3 0,02

Ácido cítrico 0,006

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