Desarrollo de recursos para Desarrollo de recursos para estudios genómicos en cítricos: estudios genómicos en cítricos:

creación decreación deuna colección de una colección de ESTsESTs y una y una

micromatriz de micromatriz de cDNAcDNAProyecto de Genómica Funcional de Cítricos

IBMCPInstituto de Biología Molecular y

Celular de Plantashttp://www.ibmcp.upv.es

Instituto de Agroquímica yTecnología de Alimentos

http://www.iata.csic.esInstituto Valenciano de

Investigaciones Agrarias http://www.ivia.es

http://citrusgenomics.ibmcp-ivia.upv.es

Red Valenciana de Genómica y Proteómica, octubre 2004

Proyecto de Genómica Funcional de CítricosProyecto de Genómica Funcional de CítricosObjetivos GeneralesObjetivos Generales

1. Generación de una colección de ESTs representativadel conjunto total de genes expresados por los cítricos.

2. Caracterización del transcriptoma de los cítricos duranteel crecimiento, diferenciación y desarrollo vegetativo y reproductivo, y en respuesta a diferentes condiciones de estrés biótico y abiótico, mediante el desarrollo y uso de microarrays de cDNA.

3. Desarrollo de herramientasgenómicas para la mejorade los cítricos

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Proyecto de Genómica Funcional de CítricosProyecto de Genómica Funcional de CítricosGenotecas de Genotecas de cDNAcDNA estándar construidasestándar construidas

29 genotecas a partir de: Diferentes estreses bióticosInfección por viroide de la Exocortis de los

citricos (hojas)Infección por viroide HSVdInfección por virus de la tristeza (hojas y tallos)Infección por Phytophthora citrophthora (raíces

de variedad sensible)Infección por Phytophthora citrophthora (raíces

de variedad resistente)Infección por Penicillium digitatum (frutos)

Diferentes tejidos y estados de desarrolloTallos vegetativos e internodosHojasRaícesOvarios (senescentes)Ovarios (sin polinizar)Ovarios (diferentes zona de abscisión)Inflorescencias y floresFlavedo de frutos en maduraciónFlavedo de frutos senescentesFrutos enteros Diferentes estreses abióticos

Estrés salino corto (hojas)Estrés salino prolongado (hojas)Estrés hídrico (hojas)Estrés hídrico (raíces)Estrés hídrico y rehidratación (hojas)Estrés hídrico y rehidratación (zona abscisión de hojas)Estrés hídrico y rehidratación (raíces)Deficiencia en hierro (hojas)Deficiencia en hierro (raíces)Almacenamiento en frío (frutos)Tratamiento térmico y almacenamiento en frío (frutos)

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Proyecto de Genómica Funcional de CítricosProyecto de Genómica Funcional de CítricosGenotecas enriquecidas en clones de longitud completaGenotecas enriquecidas en clones de longitud completa

y/o normalizadasy/o normalizadas

12 genotecas a partir de:

Diferentes tejidos y estados de desarrolloOvariosMezcla de diferentes tejidos

Diferentes estreses bióticosInfección por viroide de la Exocortis de los

citricos (hojas)Infección por viroide HSVd (hojas)Infección por virus de la tristeza (hojas)Infección por virus de la tristeza (brotes)Infección por Phytophthora citrophthora (raíces)Infección por Penicillium digitatum (frutos)

Diferentes estreses abióticosEstrés salino e hídrico y deficiencia en hierro (hojas)Estrés salino e hídrico y deficiencia en hierro (raíces)Almacenamiento en frío (frutos)

Clones de longitud completa

Genotecas estándar

19 %

Genotecas enriquecidas en clones de longitud completa

54%

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Proyecto de Genómica Funcional de CítricosProyecto de Genómica Funcional de CítricosESTsESTs obtenidasobtenidas

31.462 Secuencias con una media de 500 pares de bases de alta calidad

+10.337 singletons 4.896 contigs

15.233 putativos genes únicos (UniGenes)(aprox. la mitad del número estimado de genes en cítricos)

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Proyecto de Genómica Funcional de CítricosProyecto de Genómica Funcional de CítricosAnotación funcional de las secuenciasAnotación funcional de las secuencias

con clasificación MIPS (Munich Information Center for Protein Sequences), KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) y GO (Gene Ontologies)

el 32% de los unigenes no poseen proteína similar en Arabidopsis thaliana

se han identificado genes de cítricos implicados en todas las categorías funcionales descritas por MIPS, y en proporción similar a A. thaliana, indicando una colección de ESTs representativa del genoma completo de cítricos

0 5 10 15 20 25 30 35

Unclassified protein

Cell type differentiation

Tissue differentiation

Storage proteins

Transposable elements and viral proteins

Development (systemic)

Transport facilitation

Control of cellular organization

Cell fate

Regulation of / Interaction with environment

Cellular transport and transport mechanisms

Energy

Protein synthesis

Signal transduction

Protein fate

Cell cycle and DNA processing

Transcription

Metabolism

% of unigenes

Arabidopsis thalianaCitrus spp.

No similar protein31,9%

Metabolism22,3%

Energy1,7%

Signal transduction2,7%

Cell cycle and DNA processing

4,9

Transcription6,2%

Protein synthesis and processing

8,7%

Development0,4%

Regulation of / Interaction with

environment1,0%

Transposable elements and viral

proteins0,2%

Unclassified16,0%

Structural components

0,5%Cellular

differentiation0,5%

Intracellular transport

1,8%

Defense1,8%

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Proyecto de Genómica Funcional de CítricosProyecto de Genómica Funcional de CítricosConstrucción del primer Construcción del primer microarraymicroarray de cítricosde cítricos

- 12672 puntos

- 6865 Unigenes(5403 singletons + 1462 contigs)

- 18 genotecas- 35% hojas- 27% flores- 22% raíces- 16% flavedo

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Proyecto de Genómica Funcional de CítricosProyecto de Genómica Funcional de CítricosAnálisis de la respuesta a estrés hídrico en Análisis de la respuesta a estrés hídrico en CitrusCitrus sppspp..

(Cinta Gimeno, Ramón Serrano)

Caracterización del transcriptoma en C. clementina injertada sobre C. reshni

Riego

Estrés hídrico

Raíces/Hojas

5 h, 10 h, 24 h

0 h

5 h, 10 h, 24 h

Inducción transitoria

•Diseño de referencia•3-4 réplicas biológicas por tiempo•20 hibridaciones

Inducción progresiva Inducción rápida

0h 5h 10h 24h

DehidrinaInositol P sintasaProteína LEA

•Aumento significativo de genes en la categoría funcional “Defensa”

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Proyecto de Genómica Funcional de CítricosProyecto de Genómica Funcional de CítricosAnálisis de la respuesta a infección por el virus de laAnálisis de la respuesta a infección por el virus de la

Tristeza de los cítricosTristeza de los cítricos (Mónica Gandía, José Guerri)

A B

•Experimento con 5 plantas de lima infectadas con el aislado agresivo de CTV T-305 frente a 4 plantas control sanas

•Cada planta infectada es hibridada frente a un pool de todas las plantas control realizando un marcaje reverso en cada caso

•5 réplicas biológicas

•10 hibridaciones

ABC transporter family protein

60S acidic ribosomal protein P1

Glutathione S-transferase GST 22

Sodium/dicarboxylatecotransporter

Tubulin beta-2 chainLYTB-like protein precursor

Putative ABC transporter family

protein

60S ribosomal protein L31Geranyl diphosphatesynthase small subunit

Lethal leaf spot 1-like protein

Transporte

Chlorophyllase 1GSH-dependent dehydroascorbate

reductase 1

Thioredoxin H-type

40S ribosomal protein S3ACooper/zinc superoxide dismutase

Stress related protein

40S ribosomal protein S25ACC oxidaseDehydrin

Histone deacetylase-like protein

Putative glutathione S-transferase T3

Glutathione S-transferase GST 14

Ribosomal protein RL5Anthranilatephosphoribosyltransfer

ase

Aldehydedehydrogenase 1

precursor

Chlorophyll a/b-binding protein type III precursor

LipoxygenasePutative Pi starvation-induced protein

40S ribosomal protein S11Lipid transfer proteinCytosolic class I small heat-shock protein

HSP1

40S ribosomal protein S9S-adenosyl-L-methionine: salicylic

acid carboxyl

Miraculin-like protein

Ribosomal proteinControlCooper chaperoneMetabolismo

Germin-like proteinStress

CONTIGS SOBREEXPRESADOS

GRUPO FUNCIONAL

CONTIGS SOBREEXPRESADO

S

GRUPO FUNCIONAL

CONTIGS SOBREEXPRESADOS

GRUPO FUNCIONAL

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Proyecto de Genómica Funcional de CítricosProyecto de Genómica Funcional de CítricosIdentificación de genes diferenciales durante elIdentificación de genes diferenciales durante el

desarrollo vegetativo y genes específicos de tejidodesarrollo vegetativo y genes específicos de tejido(Laura Huertas, José Luis García-Martinez)

Material vegetal y diseño experimental

H1 H5

E1 E5E1 E5

H5

H1

2-3 cm 6-8 cm

Diseño en bucle condoble marcaje

8 micromatrices

Confirmación de datos mediante análisis Northern

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C08004D02

C04011H07

C08002D06

rRNA

C20003D02

C01011D02

C20005D04

rRNA

E1 E2 E3 E4 E5 H1 H2 H3 H4 H5 N5 P5 E1 E2 E3 E4 E5 H1 H2 H3 H4 H5 N5 P5

hojas entrenudos

C20003D02

C01011D02

C20005D04

rRNA

E: entrenudos; H: Hojas; N: Nervios; P: Peciolos. .

Proyecto de Genómica Funcional de CítricosProyecto de Genómica Funcional de CítricosIdentificación de genes diferenciales durante fructificaciónIdentificación de genes diferenciales durante fructificación

(Raquel Arribas, M.Angel Pérez-Amador)

Evolución temporal de frutos +GA3

67 52 23 18

0 11 42

16 9 23 47

27 54 24 61

39

Log 2

Rat

io (6

35/5

32)

0.0

0.5

1.0

1.5

AAA-type ATPase

0.0

0.5

1.0

1.5

Rubisco y CBP

-4

-2

0At1g70540 Unknown

0 7 14 21Dias +GA3

4 réplicas biológicasAnálisis con referencia común

Cuantificación de los niveles de mRNA durante el desarrollodel fruto de 6 genes mediante micromatrices o en geles de RNAOv F1 F2Ov F1 F2

C20006G11

C02015B09

C20010B07

EtBr

C20007E03

C20001C03

C01006G06

EtBr

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Proyecto de Genómica Funcional de CítricosProyecto de Genómica Funcional de CítricosIdentificación de genes diferenciales durante maduraciónIdentificación de genes diferenciales durante maduración

(Manuel Cercós, Manuel Talón)

log2 ( breaker / verde )

-5 -4 -3 -2 -1 0 1

leucine-rich repeat proteincytochrome P450

cellulose synthaseearly light induced proteinvacuolar processing enzyme

acid phosphatasewound-induced basic protein40S ribosomal protein S16miraculin-like protein

lectin-related protein

log2 ( fase III / Fase II )

-6 -4 -2 0 2 4 6

beta-D-xylosidaseglycosyl-transferasethioredoxin HMajor allergen Pru ar 1phenylcoumaran benzylic ether reductaselipid-transfer proteinglycine-rich proteinchalcone synthase 2peroxidaseL-ascorbate oxidase

-Diseño de referencia-Réplicas biológicas: 4 por muestra-Identificación de genes diferencialmenteexpresados mediante análisis de diferenciasde medias (p<0.001)

GR

OW

TH (%

)

0

20

40

60

80

100

DAYS AFTER ANTHESIS

60 120 180 240

I II III

-Pulpa: fase II frente a fase III-Flavedo: verde frente a breaker

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Proyecto de Genómica Funcional de CítricosProyecto de Genómica Funcional de CítricosIdentificación de genes diferenciales duranteIdentificación de genes diferenciales durante

almacenamiento en frío en períodos postalmacenamiento en frío en períodos post--cosechacosecha(Carolina Royo, Antonio Granell)

Frutos de Clementina de Nules almacenados a 2ºC 5

6d

28d

14d

9d

24

tc0d0 h 1 9 14 28 56

Tiempo a 2ºC

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Referencia común: 0, 2, 4, 6 y 24h, y 9, 14, 28 d.4 réplicas/ muestra

0días 2, 4, 6 h 9 d24 h 56 d14 d 28 d

Referencia

Proyecto de Genómica Funcional de CítricosProyecto de Genómica Funcional de CítricosDiferenciación Diferenciación varietalvarietal en Clementinas (I)en Clementinas (I)

(Gema Ancillo, José Guerri, Luis Navarro)

Clemenules

Hernandina

Marisol

Fina

20

20

20

•68 variedades en el banco de Germoplasma del IVIA

•Diferencias en tamaño y época de maduración del fruto

Julio de 2003

Octubre de 2003Invernadero 1(Avasa-Alcocebre)

Invernadero 2(Vinaroz) Julio de 2003

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Proyecto de Genómica Funcional de CítricosProyecto de Genómica Funcional de CítricosDiferenciación Diferenciación varietalvarietal en Clementinas (II)en Clementinas (II)

(Gema Ancillo, José Guerri, Luis Navarro)

Muestras del primer vivero. Julio 2003

a) Elaboración del modelo (aprendizaje del algoritmo)b) Validación del modelo con muestras ciegas

Agrupamiento génico supervisado

HH14

HH29

HH11

HH9

HH21

SS9

SS32

SS31

SS21

SS5

PREDICCIONMUESTRA

HH14

HH29

HH11

HH9

HH21

NN33

NN27

HN20

NN21

NN37

PREDICCIONMUESTRA

SS9

SS32

SS31

SS21

SS5

NN33

NN27

NN21

NN20

NN37

PREDICCIONMUESTRA

Clemenules/Hernandina Clemenules/Marisol Marisol/Hernandina

Las variedades Nules, Marisol y Hernandina pueden ser diferenciadas en base a su perfil de expresión génica utilizando modelos de agrupamiento supervisado.

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Proyecto de Genómica Funcional de CítricosProyecto de Genómica Funcional de CítricosTrabajo en cursoTrabajo en curso

Incrementar la colección de ESTs- alcanzar 20.000 unigenes a finales de 2004- aumentar la proporción de ESTs procedentes de clones de longitud completa- aislar ESTs procedentes de genes de muy baja expresión mediante el uso de

genotecas normalizadas

Caracterizar el transcriptoma de los cítricos usando el microarray de cDNA construido- experimentos de análisis del transcriptoma durante la infección por el hongo

Phytophthora, en variedades sensibles y tolerantes- experimentos de análisis del transcriptoma durante estrés salino, en variedades

sensibles y tolerantes- experimentos de análisis del transcriptoma en condiciones de deficiencia de cloruro

(hambre prolongada y hambre más aplicación de cloruro)- experimentos de análisis del transcriptoma durante la

infección por viroides (CEVd)Construcción de un microarray de segunda generación

- representando un mayor número de genes de cítricos (>15.000)

- con selección de los mejores representantes de cada contig

- con resecuenciación de una determinada proporción de los clones depositados en el chip

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Proyecto de Genómica Funcional de CítricosProyecto de Genómica Funcional de CítricosAgradecimientosAgradecimientos

Instituto de Agroquímica y Tecnología de Alimentos

http://www.iata.csic.es

Instituto de Biología Molecular y Celular de Plantas

http://www.ibmcp.upv.es

Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias

http://www.ivia.es

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Desarrollo de recursos para Desarrollo de recursos para estudios genómicos en cítricos: estudios genómicos en cítricos:

creación decreación deuna colección de una colección de ESTsESTs y una y una

micromatriz de micromatriz de cDNAcDNAProyecto de Genómica Funcional de Cítricos

IBMCPInstituto de Biología Molecular y

Celular de Plantashttp://www.ibmcp.upv.es

Instituto de Agroquímica yTecnología de Alimentos

http://www.iata.csic.esInstituto Valenciano de

Investigaciones Agrarias http://www.ivia.es

http://citrusgenomics.ibmcp-ivia.upv.es

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