Imunoglobuliny – strukturaImunoglobuliny – funkceGenetický základ tvorby imunoglobulinů Biologické a chemické vlastnosti jednotlivých tříd imunoglobulinů I. (IgG, IgA)Biologické a chemické vlastnosti jednotlivých tříd imunoglobulinů II. (IgM, IgD, IgE)Izotypový přesmyk. Idiotypy a antiidiotypy - význam. Imunologická paměťOntogeneze imunitní odpovědiPrimární imunitní odpověďSekundární imunitní odpověď. Efektorové funkce protilátek

Simona Kaftanová

Struktura imunoglobulinů• 4 polypeptidové řetězce:

2 identické těžké (H)2 identické lehké (L)

H řetězce: μ, δ, γ, α, ε (rozdíly ve složení AK) L řetězce: κ, λ

Izotypy = třídy Igg:IgM (μ)IgD (δ)IgG (γ)IgA (α)IgE (ε)

Struktura Ig - členění

Dle štěpení enzymem papainem:• Fab-fragmenty – obsahují

vazebné místo pro Ag• Fc-fragment - reaguje s Fc-

receptory na buňkách těla

Domény („oblasti“) na H i L řetězci:• variabilní (V) - formuje

rozpoznávací část pro Ag• konstantní (C) - určuje sekundární

biologické funkce Ig

Paratop - vazebné místo pro Ag; reaguje specificky s epitopem Ag = oblast Ig tvořená hypervariabilními oblastmi VH a VL (hypervariabilní oblast – „špička“ variabilní oblasti s vysoce variabilním složením sekvencí AMK; určuje strukturu/specifitu vazebného místa pro Ag na základě složení sekvencí AMK, ale i morfologie a tvaru oblasti)

Idiotop - jednotlivé unikátní struktury variabilní oblasti daného Ig (Ab); některé idiotopy mohou být totožné s vazebným místem pro antigen, jiné leží mimo paratop

Idiotyp - suma všech idiotopů jedné Ig molekuly; společný identickým Ig molekulám

Struktura Ig – vazebné místo pro Ag

VL

VH

hypervariabilní úsek

Antiidiotypové protilátky• tzv. protilátky 2. generace (idiotyp protilátek I. generace se chová jako antigen, tj. mohou proti němu vznikat Abb - antiidiotypové)• tvoří vnitřní obraz antigenu (některé antiidiotypové Abb mají vazebné místo, které se alespoň částečně podobá epitopu Ag, který vyvolal tvorbu Abb I. generace)• vyvolávají další tvorbu Abb proti sobě samým → antiantiidiotypové protilátky (protilátky 3. generace)→ vzniká idiotypová síť• regulační fce

Funkce Igg

• obecně:– protilátky – Igg sekretované (solubilní)– antigenní receptor (BCR) - membránové Igg (IgM a IgD na povrchu

B lymfo) • biologické vlastnosti jednotlivých izotypů Igg dány odlišnostmi v H-

řetězcích resp. jejich konstantní částí resp. Fc-fragmentem:– při vazbě v IK váže C1 → aktivuje komplement (klasická cesta)– reaguje s Fc-receptory na buňkách těla – určuje sekundární biologické aktivity izotypů Ig (př. biologický

poločas, distribuci v těle a přechod přes placentu, schopnost opsonizace bakt., vazba IgE na mastocyty apod.)

Izotyp Obsah v séru dospěl.(g/l)

Biolog. poločas Tělesné tekutiny Funkce

IgG(podtřídy IgG1-4 )-monomer

8-18 21 dnů sérum, intersticiální tekutina

opsonizace (hlavní opsonizující Ig)neutralizaceaktivace komplementu (klasic.)přestup placentou (jediný Ig)sekundární protilátková reakce (hlavní protilátka)

IgA- sérový - slizniční (dimer + sekreční komponenta)

0,9-3,5 6 dnů sérum, slzy, sliny, povrch sliznic a jejich sekrety, mléko, pot

ochrana sliznic (neutralizace)opsonizace

IgM- pentamer- monomer (BCR)

0,9-2,5 6 dnů sérum, membrána B lymfo

aktivace komplementu (klasic.)primární protilátkové reakce (první a hlavní protilátka)při intrauterinní infekci produkovaná plodemreceptor pro Ag (BCR)

IgD-monomer

0,1 3 dny sérum, membrána B lymfo

receptor pro Ag (BCR)

IgE-monomer

3x10-4 2 dny sérum, interstic.t., povrch mastocytů a bazofilů

ochrana proti parazitůmatopická reakce

Genetické základy tvorby imunoglobulinů

Geny pro H-řetězec (14. chromozóm) • geny se člení do sekvenčních oblastí V, D, J, C (mezi nimi jsou

dlouhé nekódující sekvence)– V (několik set – zajišťují variabilitu)– D (cca 50)– J (9)– C (kódují izotypy Ig - Cμ, Cγ, Cα, Cδ, Cε)

Geny pro L-řetězec (κ - 2. chromozom, λ - 22. chromozom)• struktura jednodušší – V, J, C

a) nejprve tzv. D-J přeskupení částí genu, čímž se spojí náhodně určitý úsek D s některým úsekem J

b) vyštěpení úseku mezi některým V a D-J; dochází k tzv. V-D přeskupení

c) pokud vzniklý V-D-J produkt vyhovuje (= „dá se přečíst“), dojde k transkripci do mRNA a sestřihu (k VDJ se připojí C sekvence pro sestavování AMK pro daný Ig) d) translace v protein, jehož struktura je kódována sekvencemi V, D, J, C

Proces rekombinace těžkého řetězce:

Proces rekombinace lehkého řetězce:

Tvorba Ig molekuly

Izotypový přesmyk

• v průběhu imunitní odpovědi na Ag dochází u plazmocytů k přesmyku od tvorby IgM k produkci IgG nebo jiných tříd Ig

• mechanismus: segment Cμ je vyštěpen a na jeho místo se dostane v pořadí další segment př. Cγ (produkce protilátek IgG)

• směr přesmyku (volbu izotypu) regulují cytokiny - hlavně IL-4 (stimuluje produkci IgG1, IgE), TGF-β, IL-10 ...

• změna se týká konstantní domény H-řetězc; antigenní specifita je zachována

K velké diverzitě protilátek přispívají hlavně:

• různost kombinací genových segmentů a následný sestřih

• nepřesné spojování V, D a J a připojení náhodných segmentů • somatické mutace = mutace genů variabilní oblasti až po

přeskupení a to v okamžiku setkání zralého B lymfocytu s Ag v lymfoidních foliklech (ponechány jsou mutanty s vysokou afinitou k Ag)

Imunitní reakce založené na protilátkách

• probíhá ve dvou navazujících fázích – primární a sekundární

• charakteristický vznik paměťových bb. a vysokoafinních Abb v procesu tzv. afinitní maturace

a) Primární imunitní odpověď (protilátková reakce při primární infekci):

b) Sekundární imunitní odpověď (protilátková reakce při opětovném setkání s infekcí):

• první setkání B lymfo s Ag v sekund. lymf. org. → …viz Th2 reakce… • vznik klonu mnoha dceřiných B lymfo s identickou nebo velmi podobnou

specifitou → jejich diferenciace v plazmatické bb. (část B buněk se mění v paměťové bb.)

• část plazmatických bb. zpět do oběhu (do kostní dřeně aj. v organismu)• za 3-4 dny od imunizace (primární infekce) plazmatické bb. vyprodukují

množství Abb.• první se tvoří IgM s nízkou afinitou k Ag → účinné při blokování šíření

infekce • IgM tvoří s Ag imunokomplexy (IK) → zachycovány v sekund. lymf. org. na

povrchu tzv. folikulárních dendritických bb. (FDC) → IK mohou být skladovány na povrchu FDC či odstraňovány fagocytózou

Výjimka: T-nezávislé Ag (hl. bakteriální polysacharidy) vyvolávají diferenciaci B

lymfo na plazmatické bb. bez spolupráce s Th, př. aktivují B lymfo nespecificky tím, že se váží na receptory pro LPS, tj. nezávisle na specifitě)

Primární imunitní odpověď – primární fáze:

a) změna afinity: Agg skladované v IK na FDC jsou rozeznávány B lymfo → další dělení a diferenciaci B lymfo (spolupráce Th2) → mutace genů pro variabilní oblast Igg → vzniklé klony mají odlišná vazebná místa BCR a produkovaných Abb. než B lymfo z primární fáze → v soutěži o snižující se množství Ag uspějí B lymfo s nejvyšší afinitou k Ag (ostatní B bb. hynou) = proces afinitní maturace → vede ke vzniku Abb s několikanásobně vyšší afinitou než IgM z primární reakce („kvalitnější“ Abb)

b) izotypový přesmyk (viz Genetika Igg): záměna těžkého řetězce μ

(nevratné vyštěpení genové sekvence) původního IgM za jiný a následná tvorba odpovídajícího izotypu (IgG – druhý v pořadí nebo IgA, IgE, IgD) pod vlivem cytokinů (př. IL-4) za současného přímého kontaktu aktivovaných T lymfo s B lymfo (prostřednictvím adhezivní a kostimulační molekuly CD40/CD40L)

Pozn. po primární infekci dlouhou dobu přetrvává hladina Abb, které jsou

schopné zabránit novému vzniku té samé infekce hned v počátku.

Primární imunitní odpověď – sekundární fáze:

Sekundární imunitní odpověď (protilátková reakce při opětovném setkání s infekcí):• rychlá aktivace paměťových bb. vzniklých při primární odpovědi

→ další zvýšení afinity Abb, počtu Abb a změny v izotypovém složení (IgG dosahuje dříve vyšší hodnoty)

• potlačení infekce je rychlejší a účinnější

Imunologická paměť – část populace T a B-ly se po prvním setkání s Ag mění na paměťové buňky; jsou připraveny pro sekundární (anamnestická) odpověď, kdy jsou rychle aktivovány (vylepšují se vazebné schopnosti Abb k Ag – afinitu; rychlejší izotypový přesmyk)

Efektorové mechanismy působení protilátek:• neutralizace – Abb blokují aktivitu toxinů, virů a jiných mikroorg. tím, že

se váží na kritické epitopy nutné pro toxické působení

• inhibice adherence patogenů na buněčné povrchy – Abb navázané na patogen blokují jeho přichycení na slizniční povrchy (hl. fce sIgA)

• opsonizace – Abb navázané na Ag částici zlepšují či umožňují pohlcení této částice fagocyty či její napadení NK bb. (viz ADCC)

• ADCC (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity) – NK bb. mají receptor FcR pro IgG; je-li Ag opsonizován IgG a dojde k navázání Fc-IgG na FcR NK b., aktivuje se degranulace NK b. na Ag

• vazba Ab-Ag aktivuje komplement klasickou cestou → produkty

komplementu přispívají k opsonizaci, chemotaxi fygocytů a rozvoji zánětlivé rce, k osmotické lýze cílových buněk

Ontogeneze imunitní odpovědi

a/ prenatální vývoj • krvetvorba extraembryonální začíná ve 2.-3.týdnu gestace →

postupně se krvetvorným orgánem stávají játra (celé intrauterinní období) → částečně se zapojuje i slezina → hlavní úlohu hematopoezy přejímá kostní dřeň (pokračuje postnatálně)

• T-buňky - prekurzory postupují do thymu → diferenciaci do lymfoidních bb., selekce.

• B-buňky – syntéza specifických IgM již intrauterině, ale koncentrace prakticky neměřitelná (měřitelné konc. IgM při porodu = známka intrauterinní infekce) x IgG se začínají tvořit až po porodu.

• zralé monocyty-makrofágy, neutrofily již ve fetální cirkulaci; neutrofily v menším počtu

Ontogeneze imunitní odpovědib/ postnatální vývojB lymfo:• po narození reakce na Ag podněty - hl. tvorba IgM (konc. srovnatelná

s dospělými v 1.- 3.r.)• tvorba IgG pozvolná a současně mizí mateřské IgG (největší pokles mezi 3.

- 6. měs. → vyšší nemocnost) (konc. srovnatelná s dosp. mezi 10.-15.r. )• protilátková reakce na polysacharidové antigeny (př. haemophilus) se

objevuje až kolem 2. roku T lymfo :• po narození převážně naivní; nižší aktivita Tc, nižší funkce Th se normalizuje

do 1 roku • vzestup Th1-reaktivity kulminuje na začátku dospělosti (zvýšený výskyt AI

onem.) nespecifická imunita novorozenců – funkčně méně zdatná

Ontogeneze imunitní odpovědi

c/ stáří • snížená cytotoxicita NK-buněk a makrofágů• přesmyk od Th1 k Th2

• snížená protivirová a protinádorová imunita• nižší protilátková odpověď na nové podněty• vyšší produkce autoprotilátek

Monoklonální protilátky (mAbb)

• Abb produkované jedním určitým klonem plazmatických bb. (bb. odvozené od jednoho B lymfo)

• identické molekuly (Abb jednoho izotypu a jedné specifity - variabilní část namířena jen proti jedné specifické části daného Ag)

XXX

Polyklonální protilátky (konvenční) • „směs“ monoklonálních protilátek• Abb namířené proti různým epitopům daného Ag• získávají se obvykle imunizací zvířat – tzv. antiséra

Monoklonální protilátky (mAbb) Výskyt:a) nádor z plazmatických bb. (mnohočetný myelom, plazmocytom)b) produkt hybridonu (= in vitro výroba) Hybridon = b. získaná fúzí b. myelomu a slezinného lymfocytu myši

imunizované příslušným Ag:– nádorová b. dodává hybridonu nesmrtelnost a schopnost produkce Abb

jednoho izotypu– lymfocyt dodává specifitu vůči určitému Ag

→ spojením těchto bb. vzniknou kultivované hybridomy schopné uvolňovat mAbb do kultivačního media

Využití: mAbb označené enzymy a fluorescenčními látkami atd. (= konjugát)

→ využití v labo dg., tp. pozn. humanizované monoklon. Abb - metodou genetického inženýrství se

zmodifikují molekuly tak, že z myší pocházejí jen vazebná místa, kdežto ostatní části protilátkové molekuly jsou kódované z lidských genů

Příprava monoklonálních Abb (mAbb)

slezinné lymfo z myši imunizované příslušným Ag buňky myelomu

fúze myelomových bb. a slezinných lymfo

selekce hybridomů a jejich další kultivace

klonování hybridomů

výběr vhodných hybridních klonů tvořících jen tu žádanou mAb

Příprava polyklonálních Abb