BAB III

KEGIATAN PRAKTEK

3.1 Deskripsi Kegiatan

Kegiatan praktik di UPT. PPMHP Surabaya dilaksanakan pada tanggal 6

Juli - 6 Agustus 2015. Kerja praktik dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi

dengan membantu pengerjaan uji cemaran mikroba dalam sampel hasil perikanan,

tetapi dalam laporan ini dikhususkan dalam pengujian salah satu sampel saja,

yaitu udang putih beku (Gambar 3.2), yang dilakukan pada minggu pertama dan

kedua. Berdasarkan SNI tahun 2006 yang digunakan sebagai acuan pada UPT.

PPMHP dan permintaan pembeli produk, jenis cemaran mikroba yang diuji adalah

Escherichia coli, ALT, dan Salmonella.

3.2 Alat

Alat-alat yang digunakan adalah tabung reaksi, cawan Petri, tabung

Durham, pipet boy, dispenser, bunsen, pipet ukur, rak tabung reaksi, timbangan

analitik, autoklaf, inkubator, waterbath, botol kaca, erlenmeyer, pisau, pinset

panjang, gunting, korek api, loyang, ose, vorteks, laminar air-flow (LAF), colony

counter, spidol marker, kulkas, oven.

3.3 Bahan

Bahan-bahan yang digunakan adalah media LB (Lactose Broth), Rappaport-

Vassiliadis (RV) broth, EC broth, Lauryl Tryptose Broth (LTB), Plate Count

Agar (PCA), XLD (Xylose-Lysine-Deoxycholate) agar, HE (Hectoen Enteric)

agar, Levine’s Eosin Methylen Blue (LEMB) agar, Butterfield’s phosphate-

Buffered Dilution Water (BFP), aquades, alkohol 70%, alkohol 96%.

14

15

3.4 Skema Pengujian

Gambar 3.1 Skema Pengujian Udang Putih Beku

3.5 Metode Penelitian

3.5.1 Persiapan Sampel, Media, dan Peralatan

Langkah awal yang harus disiapkan adalah sampel (Gambar 3.2), media dan

peralatannya. Media harus diautoklaf terlebih dahulu agar kondisi steril, tetapi ada

media yang tidak boleh diautoklaf (misalnya XLD) sehingga sterilisasinya

menggunakan filter. Peralatan disterilisasi kering dengan oven bersuhu 180oC

selama minimal 2 jam, lalu dilakukan penimbangan udang putih secara aseptis.

Gambar 3.2 Sampel dan homogenisasi sampel. Keterangan foto dari kiri ke kanan: sampel udang putih beku dan 25 gram sampel dalam 225 ml BFP.

3.5.2 Homogenisasi Sampel

Berdasarkan SNI 01-2332.3-2006 dan SNI 01-2332.1-2006, untuk

menghomogenkan sampel padat diperlukan 25 gram sampel ditambah 225 ml

larutan pengencer berupa BFP (Butterfield’s phosphate) sehingga didapatkan

225 ml BFP 225 ml LB

25 gram udang putih beku

Udang putih + BFP Udang putih + LB

Uji E. coli Uji ALT Diinkubasi 24 jam 35°C

Uji Salmonella

16

pengenceran 1:10 (10-1). Kemudian ditunggu selama 15 menit hingga sampel

terlarut/homogen. Digunakan BFP sebagai larutan pengencer karena mengandung

sumber C, P, Na, K yang baik untuk pertumbuhan mikroorganisme dan MgCl2

(menjaga tekanan osmotik sel) (Acumedia, 2013). Hasil homogenisasi udang

putih beku dengan BFP terlihat pada Gambar 3.2.

3.5.3 Uji E. coli dengan Metode MPN

3.5.3.1 Uji Pendugaan

Media yang digunakan adalah Lauryl Tryptose Broth (LTB) dengan 3 seri

pengenceran (10-1, 10-2, dan 10-3) masing-masing pengenceran menggunakan 3

tabung. Untuk membuat pengenceran 10-1, dipipet larutan BFP + udang putih

sebanyak 1 ml ke dalam tiap 3 tabung berisi 9 ml LTB (terdapat tabung Durham

terbalik). Kemudian, sebanyak 1 ml sampel pengenceran 10-1 dipipet ke dalam tiap

3 tabung berisi 9 ml LTB sehingga didapatkan pengenceran 10-2. Dilakukan juga

dengan cara yang sama pada pengenceran 10-2 terhadap pengenceran 10-3 pada tiap

3 tabung berisi 9 ml LTB (terdapat tabung Durham terbalik) yang lain. Semua

tabung diinkubasi pada inkubator selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 35°C ± 1°C.

Jumlah tabung yang keruh dan membentuk gelembung gas pada tiap pengenceran

dicatat. Jika terbentuk gas dan keruh, tabung positif LTB diinokulasi ke media EC

broth.

Sebanyak 1 ose dari tiap tabung LTB yang positif (keruh dan terbentuk gas

dalam tabung durham) dipindahkan ke dalam media EC broth secara aseptis.

Kemudian diinkubasi dalam waterbath selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 45°C ±

0,5°C. Waterbath harus dalam keadaan bersih, air di dalamnya harus lebih tinggi

dari tinggi cairan yang ada dalam tabung yang akan diinkubasi. Adanya gas dan

kekeruhan pada tabung EC broth menandakan adanya fekal koliform dalam

sampel.

3.5.3.2 Uji Penegasan

Tabung EC broth yang positif diambil 1 ose dan diinokulasi pada media

LEMB agar secara aseptis, kemudian diinkubasi selama 24 jam ± 2 jam pada suhu

35°C ± 1°C untuk uji penegasan Escherichia coli. Koloni yang diduga

17

Escherichia coli memberikan ciri yang khas warna hitam pada bagian tengah

dengan atau tanpa hijau metalik. Banyaknya bakteri Escherichia coli dapat dilihat

dengan menghitung tabung EC broth yang menunjukkan hasil positif E. coli

ketika diinokulasi di media LEMB agar, yang kemudian disesuaikan dengan tabel

MPN (Tabel 2.1) sehingga didapatkan perkiraan jumlah E. coli dalam sampel

dengan satuan APM/gram. Koloni yang terduga E. coli juga dapat ditegaskan lagi

dengan uji biokimia IMViC dan pewarnaan Gram bila waktu mencukupi.

3.5.4 Uji Angka Lempeng Total (ALT)

Uji ALT yang dilakukan menggunakan metode pour plate. Digunakan

pengenceran 10-1, 10-2, 10-3, 10-4 dan 10-5 untuk uji ini. Sebanyak 1 ml sampel dari

masing – masing pengenceran dipindahkan ke dalam cawan Petri steril. Kemudian

ke dalam setiap cawan Petri dituangkan sebanyak 12 – 15 ml media PCA cair

steril. Dibuat juga kontrol yang hanya mengandung media PCA dan media PCA +

1 ml BFP untuk mengetahui keberadaan kontaminan dalam media. Campuran

dalam cawan Petri dibiarkan membeku. Semua cawan Petri diinkubasi dalam

posisi terbalik dalam inkubator selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 35°C.

Pertumbuhan koloni pada setiap cawan Petri dicatat dan dihitung angka lempeng

total per gram sampel dengan perhitungan ALT.

3.5.5 Uji Salmonella

3.5.5.1 Tahap Pra-pengkayaan

Sebanyak 25 gram udang putih dimasukkan dalam 225 ml lactose broth

(LB) dan dikocok selama 2 menit untuk menghomogenkan, kemudian diinkubasi

24 jam ± 2 jam pada suhu 35°C ± 1°C.

3.5.5.2 Tahap Pengkayaan dan Pengkayaan Selektif

Sebanyak 0,1 ml larutan LB + sampel dipindahkan ke dalam 10 ml

Rappaport-Vassiliadis (RV) broth dan diinkubasi pada waterbath selama 24 jam

± 2 jam pada suhu 42°C ± 0,2°C. Kocok tabung (dengan vorteks) dan sebanyak 1

ose diinokulasikan ke dalam media HE dan XLD agar, kemudian diinkubasi pada

inkubator selama 24 jam pada suhu 35°C ± 1°C. Pada Hectoen Enteric (HE)

18

Agar, koloni Salmonella akan berwarna hijau kebiruan sampai biru dengan atau

tanpa inti hitam. Pada XLD Agar, koloni Salmonella akan berwarna merah

dengan atau tanpa inti hitam. Pengujian dapat dilanjutkan dengan uji biokimia bila

waktu mencukupi.

3.6 Hasil

Tabel 3.1 Hasil Pengamatan Uji Cemaran Mikroba Pada Udang Putih Beku

Uji Hasil Percobaan Interpretasi Hasil Standar(SNI)

Lolos / Tidak Lolos

Escherichia coli 0-0-0 <3 APM/g <3

APM/g Lolos

ALT (Angka Lempeng

Total)

Pengenceran Jumlah koloni

79[(1x1)+(0,1x0)]x10-3

= 7,9 x 104 koloni/g≤5 x 105

koloni/g Lolos10-1 TBUD10-2 TBUD10-3 7910-4 1410-5 0

SalmonellaXLD Negatif

Salmonella Negatif / 25 gram Negatif / 25 gram Lolos

HE Negatif Salmonella

Keterangan :TBUD : terlalu banyak untuk dihitung (>250 koloni)APM : Angka Paling Memungkinkan

3.7 Pembahasan

Pada sampel udang putih yang diteliti menunjukan hasil negatif pada uji

Escherichia coli (Gambar 3.4), karena pada media EC broth (pendugaan E. coli),

tidak memberikan hasil positif (tidak ada yang keruh dan bergas), meskipun pada

tahap uji pendugaan koliform terdapat hasil positif di media LTB (1-0-0) (Gambar

3.3). Oleh karena itu, uji E. coli tidak dilanjutkan sampai uji penegasan karena

pada uji pendugaan saja tidak ada hasil yang positif.

19

Gambar 3.3 Hasil uji pendugaan koliform di media LTB. Keterangan foto dari

kiri ke kanan: tabung kontrol positif, pengenceran 10-1, 10-2, 10-3.

Gambar 3.4 Hasil uji pendugaan E. coli di media EC broth. Keterangan tabung dari kiri ke kanan: hasil inokulasi dari LTB pengenceran 10-1 yang positif dan kontrol positif EC broth.

Uji ALT pada sampel udang putih menunjukan hasil yang tidak terlalu

tinggi, dalam artian masih di bawah batas standar (≤5 x 105 koloni/g). Dari hasil

penghitungan koloni di media PCA, koloni yang dapat dihitung adalah pada

sampel pengenceran 10-3, 10-4, dan 10-5. Karena pada pengenceran 10-4 dan 10-5

menunjukkan jumlah koloni kurang dari 25 koloni, maka pengenceran tersebut

tidak dimasukkan dalam perhitungan ALT. Oleh karena itu, sampel pengenceran

10-3 yang terhitung sebanyak 79 koloni pada media PCA digunakan untuk

perhitungan ALT. Dari hasil perhitungan, didapatkan ALT udang putih sebesar

7,9 x 104 koloni/g. Selain itu, pada kontrol media PCA maupun kontrol media PCA

+ BFP (larutan yang digunakan untuk pengenceran) tidak ada koloni bakteri yang

tumbuh (Gambar 3.5), artinya tidak ada kontaminasi pada media PCA maupun

larutan pengencer BFP. Hasil pengamatan koloni ALT dapat dilihat di Gambar

3.6.

20

Gambar 3.5 Hasil inkubasi kontrol media PCA dan BFP. Keterangan cawan Petri dari kiri ke kanan: cawan Petri berisi media PCA saja dan cawan Petri berisi media PCA + 1 ml BFP.

Gambar 3.6 Hasil uji ALT. Keterangan cawan Petri dari kiri ke kanan (atas): sampel pengenceran 10-1, 10-2, dan 10-3. Keterangan cawan Petri dari kiri ke kanan (bawah) : sampel pengenceran 10-4 dan 10-5. Tanda panah hitam merupakan contoh koloni yang dihitung, sedangkan tanda panah merah merupakan koloni jamur yang tidak dihitung untuk ALT.

Pada uji Salmonella, pra-pengkayaan di media LB (Gambar 3.7) dilanjutkan

dengan pengkayaan di media RV (Gambar 3.7), kemudian dilanjutkan dengan

pengkayaan selektif di media XLD dan HE (Gambar 3.8). Pada media XLD dan

HE, tidak ada koloni yang menunjukkan ciri-ciri koloni Salmonella. Koloni yang

tumbuh diperkirakan merupakan golongan koliform, yaitu berwarna kekuningan

(Cappucino & Sherman, 2008). Bila terdapat Salmonella pada sampel udang

putih, Salmonella akan memfermentasi xylose, mendekarboksilasi lysine dan

memproduksi H2S sehingga Salmonella akan membentuk koloni merah dengan

21

atau tanpa inti hitam di media XLD, sedangkan di media HE, koloni Salmonella

akan tumbuh dengan warna hijau kebiruan sampai biru dengan atau tanpa inti

koloni hitam, seperti pada kontrol positif (Gambar 3.9).

Gambar 3.7 Pre-enrichment dan enrichment uji Salmonella. Keterangan foto dari

kiri ke kanan: pra-pengkayaan di media LB, media RV berisi kontrol positif dan media RV berisi sampel.

Gambar 3.8 Selective enrichment uji Salmonella. Keterangan cawan Petri dari kiri ke kanan: pengkayaan selektif di media XLD dan HE. Tanda panah kuning menunjukkan salah satu koloni yang tidak menunjukkan ciri-ciri koloni Salmonella.

Gambar 3.9 Kontrol positif selective enrichment uji Salmonella. Keterangan cawan Petri dari kiri ke kanan: kontrol positif Salmonella di media XLD dan HE. Koloni-koloni yang berada di lingkaran hitam merupakan koloni Salmonella.

Berdasarkan hasil pengamatan yang dilakukan, udang putih beku ini sudah

dapat disertifikasi untuk diekspor karena uji E. coli, ALT, dan Salmonella pada

sampel ini sudah memenuhi standar SNI udang beku, sehingga dapat dikatakan

proses pengolahan maupun packing produk oleh produsen sudah cukup baik.