Shields Mutants Of

8/2/2019 Shields Mutants Of

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A P P L I E D AND ENVIRONMENTAL M I C R O B I O L O G Y , J U l Y 1 9 9 1 , P . 1 9 3 5 - 1 9 4 10 0 9 9 - 2 2 4 0 / 9 1 / 0 7 1 9 3 5 - 0 7 $ 0 2 . 0 0 / 0C o p y r i g h t C 1 9 9 1 , A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g y

M u t a n t s o f Pseudomonas c e p a c i a G4 D e f e c t i v e i n C a t a b o l i s m o fA r o m a t i c Compounds a n d T r i c h l o r o e t h y l e n e tMALCOLM S . S H I E L D S , ' * STACY 0. MONTGOMERY,1 STEPHEN M. CUSKEY,2 PETER J . CHAPMAN,2

AND P . H. P R I T C H A R D 2T e c h n i c a l R e s o u r c e s I n c . ' and U n i t e d S t a t e s E n v i r o n m e n t a l P r o t e c t i o n Agency E n v i r o n m e n t a lR e s e a r c h L a b o r a t o r y , 2 G u l f B r e e z e , F l o r i d a 3 2 5 6 1

R e c e i v e d 2 9 J a n u a r y 1 9 9 1 / A c c e p t e d 2 Ma y 1 9 9 1P s e u d o m o n a s c e p a c i a G4 possesses a n o v e l pathway o f t o l u e n e c a t a b o l i s m t h a t i s shown t o b e r e s p o n s i b l e f o rt h e d e g r a d a t i o n o f t r i c h l o r o e t h y l e n e ( T C E ) . T h i s p a t h w a y i n v o l v e s c o n v e r s i o n o f t o l ue ne v i a o - c r e s o l t o3 - m e t h y l c a t e c h o l . I n o r d e r t o d e t e r m i n e t h e enzyme o f t o l u e n e d e g r a d a t i o n t h a t i s r e s p o n s i b l e f o r TCEd e g r a d a t i o n , c h e m i c a l l y i n d u c e d m u t a n t s , b l o c k e d i n t h e t o l u e n e o r t h o - m o n o o x y g e n a s e (TOM) p a t h w a y o f G 4 ,

w e r e e x a m i n e d . M u t a n t s o f t h e p h e n o t y p i c c l a s s d e s i g n a t e d TOM A - were a l l d e f e c t i v e i n t h e i r a b i l i t y t oo x i d i z e t o l u e n e , o - c r e s o l , m - c r e s o l , a n d p h e n o l , s u g g e s t i n g t h a t a s i n g l e enzyme i s r e s p o n s i b l e f o r c o n v e r s i o n o ft h e s e c o m p o u n d s t o t h e i r h y d r o x y l a t e d p r o d u c t s ( 3 - m e t h y l c a t e c h o l f r o m t o l u e n e , o - c r e s o l , a n d m - c r e s o l andc a t e c h o l f r o m p h e n o l ) i n t h e w i l d t y p e . M u t a n t s o f t h i s c l a s s d i d n o t d e g r a d e TCE. T w o o t h e r mutant c l a s s e sw h i c h were b l o c k e d i n t o l u e n e c a t a b o l i s m , TOM B - , w h i c h l a c k e d c a t e c h o l - 2 , 3 - d i o x y g e n a s e , and TOM C-,w h i c h l a c k e d 2 - h y d r o x y - 6 - o x o h e p t a d i e n o i c a c i d h y d r o l a s e a c t i v i t y , were f u l l y c a p a b l e o f TCE d e g r a d a t i o n .T h e r e f o r e , T C E d e g r a d a t i o n i s d i r e c t l y a s s o c i a t e d w i t h t h e m o n o o x y g e n a t i o n c a p a b i l i t y r e s p o n s i b l e f o r t o l u e n e ,c r e s o l , a n d p h e n o l h y d r o x y l a t i o n .

T r i c h l o r o e t h y l e n e ( T C E ) i s t h e m o s t f r e q u e n t l y e n c o u n -t e r e d p r i o r i t y p o l l u t a n t o f g r o u n d w a t e r s o f t h e U n i t e d S t a t e s( 2 6 ) . T C E r e m a i n s a p e r s i s t e n t compound i n t h e e n v i r o n -m e n t d e s p i t e d e m o n s t r a t i o n s o f i t s d e g r a d a t i o n b y s e v e r a lb a c t e r i a . F o r e x a m p l e , Pseudomonas p u t i d a F l ( 2 2 , 3 0 ) ,Pseudomonas m e n d o c i n a ( 3 2 ) , Pseudomonas c e p a c i a G4( 1 8 , 2 0 - 2 2 ) , P s e u d o m o n a s p i c k e t t i i PKO1 ( 1 5 ) , t w o m e t h a n -o t r o p h i c b a c t e r i a , M e t h y l o s i n u s t r i c h o s p o r i u m OB3b ( 2 4 , 2 8 )a n d a n u n i d e n t i f i e d m e t h a n o t r o p h i c i s o l a t e , 4 6 - 1 ( 1 7 ) , t h el i t h o t r o p h N i t r o s o m o n a s europaea ( 1 ) , s e v e r a l p r o p a n e-u t i l i z i n g M y c o b a c t e r i u m i s o l a t e s ( 2 9 ) , i s o p r e n e - u t i l i z i n g A l -c a l i g e n e s d e n i t r i f i c a n s s u b s p . x y l o s o x i d a n s J E 7 5 , a n dR h o d o c o c c u s e r y t h r o p o l i s J E 7 7 ( 9 ) h a v e a l l b e e n r e p o r t e d t od e g r a d e TCE.M e t h a n o t r o p h s d e g r a d e T C E v i a a s o l u b l e m e t h a n e mono-o x yg e n a s e ( 1 1 ) . N i t r o s o m o n a s e u r o p a e a i s p r e s u m e d t o u s eammonia m o n o o x y g e n a s e , a n d A . d e n i t r i f i c a n s a n d R . e r y t h -r o p o l i s are t h o u g h t t o u t i l i z e pr o p e n e m o n o o x y g e n a s e s . T C Ed e g r a d a t i o n b y P . p u t i d a F l h a s b e e n shown t o b e c at a l yz e db y t o l u e n e d i o x y g e n a s e ( 2 0 , 2 9 ) . H o w e v e r , m e t h a n e monox-yg e n a s e a n d t o l u e n e d i o x y g e n a s e a c t i o n s o n T C E r e s u l t i na n a u t o i n a c t i v a t i o n o f t h e enzymes b y a m e c h a n i s m t h a tl e a d s t o c o v a l e n t m o d i f i c a t i o n o f c e l l u l a r component s ( r e -s u l t i n g i n t o x i c i t y t o P . p u t i d a F l ) ( 1 1 , 3 1 ) . Th e p a r a - a c t i n gt o l u e n e m o n o o x y g e n a s e o f P . m e n d o c i n a i s r e s p o n s i b l e f o rd e g r a d a t i o n o f T C E b y t h i s o r g a n i s m ( 3 2 ) , a s i s t h e meta-a c t i n g t o l u e n e m o n o o x y g e n a s e o f P . p i c k e t t i i PKO1 ( 1 5 ) .P . c e p a c i a G4 d e g r a d e s T C E whe n i n d u c e d b y a v a r i e t y o fa r o m a t i c c o m p o u n d s i n c l u d i n g t o l u e n e , p h e n o l , o - c r e s o l ,m - c r e s o l , a n d b e n z e n e ( 2 0 , 2 2 ) . A n o v e l p a t h w a y o f t o l ue ned e g r a d a t i o n b y P . c e p a c i a G4 h a s b e e n d e s c r i b e d i n w h i c ht o l u e n e i s s e q u e n t i a l l y h y d r o x y l a t e d t o f o r m f i r s t o - c r e s o la n d t h e n 3 - m e t h y l c a t e c h o l ( 2 7 ) . P h e n o l - i n d u c e d c u l t u r e s o f

* C o r r e s p o n d i n g a u t h o r .t C o n t r i b u t i o n no. 73 0 of t h e U . S . E n v i r o n m e n t a l ResearchL a b o r a t o r y , G u l f B r e e z e , FL 3 2 5 6 1 .

P . c e p a c i a G4 e f f i c i e n t l y d e g r a d e T C E a t c o n c e n t r a t i o n s upt o 1 8 0 , u M ( 1 0 ) . To d e t e r m i n e t h e e n z y m e ( s ) r e s p o n s i b l e f o rT C E d e g r a d a t i o n , mutants o f P . c e p a c i a G4 t h a t wered e f e c t i v e i n t o l u e n e c a t a b o l i s m were i s o l a t e d . A n a l y s e s o ft h e s e mutants s u g g e s t t h a t a n e n z y m e ( s ) o f P . c e p a c i a G4c a t a l y z e s m o n o o x y g e n a t i o n o f t o l u e n e a t t h e o r t h o p o s i t i o na n d may b e r e s p o n s i b l e f o r T C E d e g r a d a t i o n . E v i d e n c e i sp r e s e n t e d t o s u g g e s t t h a t t h i s enzyme may a l s o c a t a l y z e t h ec o n v e r s i o n o f o - c r e s o l t o 3 - m e t h y l c a t e c h o l .

M A T E R I A L S ANDMETHODSB a c t e r i a l s t r a i n s a n d c h e m i c a l s . The i s o l a t i o n , c h a r a c t e r i z a -t i o n , a n d i d e n t i f i c a t i o n o f P . c e p a c i a G4 h a v e b e e n p r e v i o u s l yd e s c r i b e d ( 1 8 , 2 1 ) . C a r b e n i c i l l i n , D - c y c l o s e r i n e , p i p e r a c i l l i n ,f o r m a m i d e , N - m e t h y l - N ' - n i t r o - N - n i t r o s o g u a n i d i n e ( N T G ) ,t r i p h e n y l t e t r a z o l i u m c h l o r i d e ( T T C ) , a n d m - t r i f l u o r o m e t h -y l p h e n o l (TFMP) were o b t a i n e d f r o m S i g m a C h e m i c a l C o . ,S t . L o u i s , Mo. A c u l t u r e o f P . p u t i d a U (ATCC 1 7 5 1 4 ) waso b t a i n e d f r o m t h e c o ll e ct i o n o f t h e l a t e S . D a g l e y , U n i v e r s i t yo f M i n n e s o t a ( 2 , 6 ) .C u l t u r e c o n d i t i o n s . B a s a l s a l t s m e d i u m (BSM) ( 1 3 ) c on-t a i n i n g 2 0 mM s o d i u m l a c t a t e was u s e d f o r t h e r o u t i n eg r o w t h o f G 4 . S o l i d m e d i a c o n t a i n i n g BSMw e r e p r e p a r e d b yi n c o r p o r a t i o n o f p u r i f i e d agar ( D i f c o ) t o 1 . 6 % . P h e n o l a t 2mM a n d o - c r e s o l , m - c r e s o l , a n d c a t e c h o l a t 1 mM w e r e

s u p p l i e d a s t h e s o l e c a r b o n sources b y a d d i t i o n o f f i l t e r -s t e r i l i z e d s o l u t i o n s t o a u t o c l a v e d BSM. P . p u t i d a U wasgrown i n BSM c o n t a i n i n g 5 mM s u c c i n a t e and 2 mM p h e n o l .U n l e s s o t h e r w i s e n o t e d , a l l i n c u b a t i o n s were c a r r i e d o u t a t3 0 C w i t h r o t a r y s h a k i n g .Growth o f G4 on t o l u e n e was a c c o m p l i s h e d b y b u b b l i n g as t e r i l e a i r - t o l u e n e m i x t u r e i n t o a 1 2 5 - m l E r l e n m e y e r f l a s kf i t t e d t o a S h e r e r g l a s s i m p i n g e r w i t h a 2 4 / 4 0 g r o u n d g l a s sj o i n t ( A c e G l a s s I n c . , V i n e l a n d , N . J . ) which c o n t a i n e d 50 mlo f BSM a n d t h e c e l l i n o c u l u m . T h i s s t e r i l e a i r - t o l u e n em i x t u r e was g e n e r a t e d b y p a s s i n g a n a i r s t r e a m ( a t 2 0 0 t o 250m l m i n - 1 ) i n t o a 1 - l i t e r E r l e n m e y e r f l a s k c o n t a i n i n g 1 0 ml o f

1 9 3 5

V o l . 5 7 , N o . 7


2/7

1 9 3 6 SHIELDS E T AL.t o l u e n e a n d o u t t h r o u g h a 0 . 2 - , u m - p o r e - s i z e m e m b r a n e f i l t e r( N u c l e o p o r e ) . G4 w a s g r o w n w i t h t o l u e n e a s t h e s o l e c a r b o ns o u r c e o n s o l i d m e d i a b y d i r e c t i n g a i r - e n t r a i n e d t o l u e n e i n t oa 4 0 - l i t e r g l a s s c h a m b e r ( i n v e r t e d a q u a r i u m ) ( 2 5 b y 3 5 b y 4 6c m ) i n w h i c h c a r b o n - f r e e p l a t e s w e r e s t a c k e d a t d e l i v e r yr a t e s o f 0 . 3 t o 0 . 7 l i t e r s m i n - ' . D i s t i n c t c o l o n i e s w e r ee v i d e n t w i t h i n 3 d a y s .

M u t a g e n e s i s . A n o v e r n i g h t c u l t u r e o f G4 g r o w n o n BSM-l a c t a t e w a s d i l u t e d i n f r e s h medium ( 1 2 . 5 % i n o c u l u m ) c o n -t a i n i n g NTG ( 5 0 j i g m l - ' ) . A t 3 0 , 4 5 , 6 0 , 9 0 , a n d 1 2 0 m i n ,5 - m l s u b s a m p l e s w e r e r e mo v e d , w a s h e d t wi c e w i t h 5 m l o fBSM, s u s p e n d e d i n 5 m l o f B S M - l a c t a t e , a n d h e l d o v e r n i g h ta t 0 C . S a m p l e s e x h i b i t i n g b e t w e e n 7 0 a n d 9 0% c e l l d e a t h( d e t e r m i n e d b y d i l u t i o n p l a t i n g t h e c e l l s t o l a c t a t e p l a t e s a n dt h e n c o m p a r i n g t h e m w i t h u n t r e a t e d c e l l s ) w e r e p o o l e d .M u t a n t s u n a b l e t o u s e t o l u e n e w e r e e n r i c h e d b y t h e a n t i b i -o t i c c o u n t e r s e l e c t i o n m e t h o d o f O r n s t o n e t a l . ( 2 5 ) w i t ht o l u e n e v a p o r a s t h e s o l e g r o w t h s u b s t r a t e . T h e c o u n t e r s e -l e c t i v e a n t i b i o t i c s p i p e r a c i l l i n ( 7 ) a n d D - c y c l o s e r i n e w e r ee m p l o y e d a t 1 4 0 a n d 2 0 0 , u g m l - ' , r e s p e c t i v e l y . C o u n t e r s e -l e c t i o n i n v o l v e d t h r e e c y c l e s o f g r o w t h w i t h t o l u e n e i n t h ep r e s e n c e o f t h e s e a n t i b i o t i c s a l t e r n a t e d w i t h g r o w t h o nl a c t a t e ( 2 0 m M ) i n t h e a b s e n c e o f a n t i b i o t i c s .M u t a n t d e t e c t i o n . S u r v i v o r s o f m u t a g e n e s i s a n d c o u n t e r -s e l e c t i o n w e r e s c r e e n e d f o r p o s s i b l e t o l u e n e c a t a b o l i c m u -t a t i o n s b y u s i n g e i t h e r T T C o r TFMP a s t h e i n d i c a t o r o ft o l u e n e c a t a b o l i c a c t i v i t y .T h e s u r v i v o r s w e r e d i l u t e d , a n d h a l f w e r e s p r e a d t o 4 0i n d i c a t o r p l a t e s ( c o n t a i n i n g p u r i f i e d a g a r [ 1 . 6 % ] , T TC [ 0 . 0 2 5m g m l - ' ] , a n d p e p t o n e [ 0 . 1 m g m l - 1 ] i n BSM) a n d g r o w n i nt h e p r e s e n c e o f t o l u e n e i n t h e v a p o r c h a m b e r . C o l o n ys e l e c t i o n w a s b a s e d o n t h e TT C d y e r e d u c t i o n p r i n c i p l e o fB o c h n e r a n d S a v a g e a u ( 4 ) , i n w h i c h c o l o r l e s s TT C i s r e -d u c e d t o r e d t r i p h e n y l t e t r a z o l i u m c h l o r i d e - f o r m a z a n i n t h ep r e s e n c e o f e x ce s s c e l l u l a r r e d u c t a n t s . W i l d - t y p e G4 f o r m e dc o l o r l e s s c o l o n i e s i n t h e p r e s e n c e o f T TC w i t h o u t a n a d d i -t i o n a l c a r b o n s o u r c e ; i n t h e p r e s e n c e o f t o l u e n e v a p o r t h e yb e c a m e d a r k r e d . M u t a n t c o l o n i e s u n a b l e t o u t i l i z e t o l u e n e

f a i l e d t o r e d u c e T T C a n d t h e r e f o r e r e m a i n e d c o l o r l e s s i n t h ep r e s e n c e o f t o l ue ne v a p o r . P u t a t i v e m u t a n t s i d e n t i f i e d i n t h i sm a n n e r w e r e t h e n t e s t e d f o r s u b s t r a t e u t i l i z a t i o n , c o l o r e dm e t a b o l i t e f o r m a t i o n , a n d t r a n s f o r m a t i o n o f TFMP ( s e eb e l o w ) .The r e m a i n i n g h a l f o f t h e c o u n t e r s e l e c t i o n s u r v i v o r s w e r ep l a t e d o n B S M - l a c t a t e p l a t e s . S i n g l e c o l o n i e s w e r e p i c k e d t od u p l i c a t e B S M - l a c t a t e p l a t e s ( m a x i m u m , 5 0 p e r p l a t e ) .T h e s e i s o l a t e s w e r e t e s t e d f o r t h e i r a b i l i t y t o t r a n s f o r mTFMP. G4 c a n m e t a b o l i z e TFMP t o a y e l l o w p r o d u c t ( 7 , 7 , 7 -t r i f l u o r o - 2 - h y d r o x y - 6 - o x o - 2 , 4 - h e p t a d i e n o i c a c i d [ T F H A ] )( 8 ) . W i l d - t y p e G4 c o l o n i e s g r o w n o v e r n i g h t o n B S M - l a c t a t ep l a t e s i n t h e p r e s e n c e o f t o l u e n e v a p o r t u r n e d y e l l o w w i t h i n3 0 m i n when s p r a y e d w i t h 5 mM TFMP.O x i d a t i o n o f a r o m a t i c c o m p o u n d s . O x y g e n u p t a k e r a t e s f o rt o l u e n e , p h e n o l , o - c r e s o l , o r 3 - m e t h y l c a t e c h o l ( a l l a t 1 m M )w e r e d e t e r m i n e d b y u s i n g w h o l e c e l l s g r o w n o v e r n i g h t w i t h2 0 mM l a c t a t e a n d 2 mM p h e n o l a n d i n d u c e d t h e n e x tm o r n i n g w i t h p h e n o l ( 2 m M ) f o r a n a d d i t i o n a l 2 h . C e l l s w e r ew a s h e d w i t h a n d s u s p e n d e d i n BSM t o a n A 6 . o f 2 . 0 .M e a s u r e m e n t s o f o x y g e n u p t a k e w e r e p e r f o r m e d w i t h aG i l s o n o x y g r a p h e q u i p p e d w i t h a c l a r k e l e c t r o d e ( G i l s o nM e d i c a l E l e c t r o n i c s , I n c . , M i d d l e t o n , W i s . ) i n a t o t a l r e a c -t i o n v o l u m e o f 2 m l ( c o n s i s t i n g o f 0 . 0 5 m l o f c e l l s , 1 . 9 3 m l o fBSM, a n d 0 . 0 2 m l o f a 0 . 1 M c a r b o n s o u r c e ) a s p r e v i o u s l yd e s c r i b e d ( 2 0 ) .E n z y m e a s s a y c o n d i t i o n s . O v e r n i g h t c u l t u r e s g r o w n i nB S M - l a c t a t e m e d i u m w e r e i n d u c e d b y t o l u e n e - v a p o r e x p o -

s u r e d u r i n g t h e f i n a l 6 h o f i n c u b a t i o n . C e l l s w e r e h a r v e s t e db y c e n t r i f u g a t i o n , w a s h e d i n 1 0 0 m l o f BSM, a n d s t o r e d a s ap e l l e t a t - 7 0 C . C e l l e x t r a c t s w e r e p r e p a r e d b y t h e m e t h o do f H u g h e s ( 1 4 ) a s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d ( 2 7 ) . C a t e c h o l - 2 , 3 -d i o x y g e n a s e a c t i v i t y w as m e a s u r e d b y t h e p r o c e d u r e o fN o z a k i e t a l . ( 2 3 ) a s d e s c r i b e d b y G i b s o n ( 1 2 ) . H y d r o x y m u -c o n i c s e m i a l d e h y d e h y d r o l a s e a c t i v i t y w as d e t e r m i n e d b yt h e r a t e o f d e c r e a s e i n 2 - h y d r o x y - 6 - o x o h e p t a - 2 , 4 - d i e n o a t e( m o l a r e x t i n c t i o n c o e f f i c i e n t a t 3 8 8 n m [ 6 3 8 8 ] = 1 3 , 8 0 0 ) o r2 - h y d r o x y m u c o n i c s e m i a l d e h y d e ( 6 3 7 6 = 3 3 , 0 0 0 ) c o n c e n t r a -t i o n s . S o l u t i o n s o f e a c h s u b s t r a t e were p r o d u c e d b y u s i n gh e a t - t r e a t e d c e l l e x t r a c t s o f p h e n o l - g r o w n P . p u t i d a U a sd e s c r i b e d b y D a g l e y a n d G i b s o n ( 6 ) . 2 - H y d r o x y m u c o n i cs e m i a l d e h y d e h y d r o l a s e a c t i v i t y was d e t e r m i n e d a s d e -s c r i b e d b y B a y l y a n d W i g m o r e ( 3 ) i n 3 - m l r e a c t i o n m i x t u r e sc o n t a i n i n g 1 4 5 , u m o l o f p o t a s s i u m p h o s p h a t e b u f f e r ( p H 7 . 5 ) ,1 , u m o l o f c at e c h o l o r 3 - m e t h y l c a t e c h o l , a n d h e a t - t r e a t e d P .p u t i d a U c e l l e x t r a c t ( 2 0 t o 5 0 p u g o f p r o t e i n ) . A f t e r c o m p l e t ec o n v e r s i o n o f c a t e c h o l t o 2 - h y d r o x y m u c o n i c s e m i a l d e h y d eo r o f 3 -m et h y l c a t e ch o l t o 2 - h y d r o x y - 6 - o x o h e p t a - 2 , 4 - d i -e n o a t e b y t h e P . p u t i d a U e n z y m e , c e l l e x t r a c t s o f G4 o r t h em u t a n t s t r a i n s w e r e a d d ed a n d t h e r a t e o f 2 - h y d r o x y m u c o n i cs e m i a l d e h y d e o r 2 - h y d r o x y - 6 - o x o h e p t a - 2 , 4 - d i e n o a t e d i s a p -p e a r a n c e w a s d e t e r m i n e d .T h e i n c r e a s e i n t h e r a t e o f 2 - h y d r o x y m u c o n i c s e m i a l d e -h y d e d i s a p p e a r a n c e a f t e r a d d i t i o n o f 0 . 3 x m o l o f N AD+( c o r r e c t e d f o r a c t i v i t y d u e t o t h e P . p u t i d a U e x t r a c t a l o n e )w a s r e p o r t e d a s h y d r o x y m u c o n i c s e m i a l d e h y d e d e h y d r o g e -n a s e a c t i v i t y . P r o d u c t i o n o f c i s - ci s - m uc o n a t e f r o m c a t e c h o lb y c a t e c h o l - 1 , 2 - d i o x y g e n a s e w a s m o n i t o r e d a t 2 6 0 n m ( c i s -c i s - m u c o n a t e r 2 6 0 = 1 6 , 9 0 0 ) ( 1 2 ) . I n a c t i v a t i o n o f c a t e c h o l -2 , 3 - d i o x y g e n a s e a c t i v i t y w i t h 3 0 mM H 2 0 2 w a s p e r f o r m e d a sd e s c r i b e d b y M u r r a y a n d W i l l i a m s ( 1 9 ) . P r o t e i n c o n c e n t r a -t i o n w a s d e t e r m i n e d b y t h e m e t h o d o f B r a d f o r d ( 5 ) w i t hb o v i n e s e r u m a l b u m i n a s a s t a n d a r d .C h e m i c a l a n a l y s e s . T C E c o n c e n t r a t i o n s w e r e d e t e r m i n e db y g a s c h r o m a t o g r a p h i c a n a l y s i s o f p e n t a n e e x t r a c t s o f t h er e a c t i o n v e s s e l a n d i t s c o n t e n t s ( 2 0 ) a n d r e p o r t e d a s t h o u g ha l l t h e r e m a i n i n g T C E w a s i n a q u e o u s s o l u t i o n . H i g h -p r e s s u r e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y ( H P L C ) a n a l y s e s w e r e p e r -f o r m e d a s p r e v i o us l y d e sc r i b e d ( 2 7 ) .

RESULTSM e t a b o l i s m o f TFMP. A c u l t u r e o f p h e n o l - i n d u c e d G 4 ,e x p o s e d t o 5 mM TFMP, b e c a m e y e l l o w w i t h i n 5 m i n . A f t e r3 0 m i n , c e l l s w e r e r e m o v e d b y c e n t r i f u g a t i o n a n d t h e UV-v i s i b l e s p e c t r u m o f t h e s u p e r n a t a n t w a s r e c o r d e d . T h ea b s o r b a n c e s p e c t r u m o f t h e y e l l o w s u p e r n a t a n t ( d a t a n o ts h o w n ) c l o s e l y m a t c h e d t h a t o f t h e p r e s u m e d r i n g c l e a v a g ep r o d u c t 7 , 7 , 7 - t r i f l u o r o - 2 - h y d r o x y - 6 - o x o - 2 , 4 - h e p t a d i e n o i c a c i d(TFHA) ( a b s o r b a n c e maximum a t pH 7 . 4 , 3 8 5 n m ; 8 3 8 5 ,2 6 , 9 0 0 ) r e p o r t e d b y E n g e s s e r e t a l . ( 8 ) . On t h e b a s i s o f t h i sd a t a a n d t h e p r e v i o u s l y d e m o n s t r a t e d a b i l i t y o f G4 t o

p r o d u c e o - c r e s o l f r o m t o l u e n e ( 2 7 ) , a p a t h w a y i s p r o p o s e df o r TFHA f o r m a t i o n b y G4 ( F i g . 1 ) .M u t a n t s d e f e c t i v e i n t o l u e n e c a t a b o l i s m . Tw o p r o c e d u r e sw e r e u s e d f o r p r e l i m i n a r y s e l e c t i o n o f m u t a n t s d e f e c t i v e i nt o l u e n e c a t a b o l i s m f o l l o w i n g N T G m u t a g e n e s i s a n d a n t i b i -o t i c c o u n t e r s e l e c t i o n . B o t h t h e TFMP c o l o r r e a c t i o n a n d t h eTTC d y e r e d u c t i o n a s s a y s r e v e a l e d c o l o n i e s t h a t w e r eu n a b l e t o e f f e c t t h e c o l o r c h a n g e s s e e n w i t h w i l d - t y p e c e l l s .I n a d d i t i o n , c e r t a i n c o l o n i e s w e r e i d e n t i f i e d , i n b o t h p r o c e -d u r e s , w h i c h w e r e a b l e t o f o r m a d i f f u s i b l e b r o w n p r o d u c t i nt h e p r e s e n c e o f t o l u e n e o r p h e n o l . T h e s e c o l o n i e s w e r ep r e s u m e d t o l a c k a c t i v e c a t e c h o l - 2 , 3 - d i o x y g e n a s e , c a u s i n g

A P P L . E N V I R O N . M I C R O B I O L .


3/7

C A T A B O L I C MUTANTS O F P . C E P A C I A G4 1 9 3 7N o n - m e t a b o l i z a b l e

C F 3

1 / 2 0 2OH

TFMP

C F 3I OH

0

OH

TFMCC o l o r l e s s

C F 3-O

C O O HOH

I TFHAYellow

F I G . 1 . P r o p o s e d t r a n s f o r m a t i o n o f TFMP b y P . c e p a c i a G 4 .TFMC, 3 - t r i f l u o r o m e t h y l c a t e c h o l .

T A B L E 2 . T o l u e n e - i n d u c e d enzyme a c t i v i t i e sS p a c t ( n m o l m i n - 1 mg o f p r o t e i n - l ) a

S t r a i n C a t e c h o l - 2 , 3 - H y d r o l a s e D e h y d r o g e n a s ed i o x y g e n a s eC a t 3 m C a t H m s Hod H m s

G4 6 , 5 5 0 3 , 7 8 0 1 1 2 1 , 3 6 0 5 2G4 1 0 0 5 , 2 9 0 1 , 9 7 0 1 9 5 6 8 3 1 2 2G4 1 0 O R 3 , 3 9 0 5 , 9 0 0 2 8 1 8 7 1 8 6G4 1 0 2 0 . 3 0 . 6 1 4 8 5 6 3 7 4G4 1 0 3 1 , 6 8 0 1 , 2 1 0 0 . 2 0 . 5 3 4a Enzyme a c t i v i t i e s o f c e l l e x t r a c t s o f t o l u e n e - i n d u c e d c e l l s . V a l u e s a r e t h ea v e r a g e o f d u p l i c a t e d e t e r m i n a t i o n s f o l l o w i n g i n d u c t i o n w i t h t o l u e n e . S u b -s t r a t e a b b r e v i a t i o n s : C a t , c a t e c h o l ; 3 m C a t , 3 - m e t h y l c a t e c h o l ; Hms, 2 - h y -d r o x y m u c o n i c s e m i a l d e h y d e ; H o d , 2 - h y d r o x y - 6 - k e t o h e p t a - 2 , 4 - d i e n o a t e .

t h e a c c u m u l a t i o n o f c a t e c h o l w h i c h a u t o o x i d i z e s t o s o l u b l ebrown p r o d u c t s i n t h e t e s t m e d i a . P r o d u c t i o n o f t h i s brownc o l o r o b s c u r e s t h e a s s e s s m e n t o f c o l o r r e a c t i o n s w i t h TFMPa n d TTC. C o n v e r s e l y , c o l o n i e s f a i l i n g t o p r o d u c e e i t h e r t h ebrown c o l o r o r t h e y e l l o w p r o d u c t f r o m TFMP were a s-sumed t o b e d e f e c t i v e i n r e a c t i o n s p r e c e d i n g c a t e c h o l r i n gc l e a v a g e .Each p u t a t i v e mutant was t e s t e d f o r i t s a b i l i t y t o groww i t h t o l u e n e , p h e n o l , o r o- o r m - c r e s o l a n d f o r t h e p r o d u c -t i o n o f y e l l o w or brown p r o d u c t s when grown on BSM-l a c t a t e i n t h e presence o f p h e n o l o r t o l u e n e . From 4 4 9p u t a t i v e mutants i d e n t i f i e d ( 1 8 9 b y t h e TFMP p r o c e d u r e a n d2 6 0 b y t h e T T C s c r e e n ) , t h r e e d i s t i n c t m u t a n t c l a s s e s c o u l db e d i s c e r n e d ( T a b l e 1 ) . T h e f i r s t c l a s s , o f w h i c h G4 1 0 0 i st y p i c a l , f a i l e d t o u t i l i z e any a r o m a t i c s u b s t r a t e s o r t o f o r ma n y c o l o r ed p r o du ct s . The s e c o n d c l a s s , t y p i f i e d b y G4 1 0 2 ,p r o d u c e d a brown d i s c o l o r a t i o n o f t h e medium i n t h e pres-e n c e o f a l l a r o m a t i c s u b s t r a t e s a n d grew w i t h o n l y p h e n o lb u t a t r a t e s c o n s i d e r a b l y s l o w e r t h a n t h o s e o f t h e w i l d - t y p ec e l l s ( a s j u d g e d b y t h e f a c t t h a t t h e c o l o n i e s were muchs m a l l e r t h a n t h o s e o f t h e w i l d t y p e a f t e r 3 d a y s o f g r o wt h ) .M u t a n t G4 1 0 3 was t y p i c a l o f t h e t h i r d c l a s s a n d f o r m e d ay e l l o w c o l o r a t i o n i n t h e presence o f a l l t e s t e d a r o m a t i c se x c e p t f o r p h e n o l . The U V - v i s i b l e spectrum o f t h i s y e l l o ws u p e r n a t a n t ( d a t a n o t s h o w n ) m a t c h e d t h a t o f 2 - h y d r o x y - 6 -o x o h e p t a d i e n o i c a c i d ( 2 ) . T h i s t h i r d c l a s s r e t a i n e d t h e a b i l i t yt o grow w i t h p h e n o l as t h e s o l e c a r b o n source. A f t e ri n d u c t i o n b y g r o w t h on l a c t a t e i n t h e presence o f p h e n o l ,c e l l s o f G4 1 0 3 f o r m e d a y e l l o w c o l o r f r o m TFMP.G4 1 0 0 a n d n i n e o t h e r m u t a n t s w i t h i n d i s t i n g u i s h a b l ep h e n o t y p e s were t e s t e d f o r r e v e r s i o n b y e x a m i n i n g f o rc o l o n i e s w i t h t h e a b i l i t y t o gro w w i t h t o l u e n e va p or a s t h es o l e c a r b o n source. G4 1 0 0 a n d t w o o f t h e o t h e r s gave r i s e t os p o n t a n e o u s r e v e r t a n t t o l u e n e - u t i l i z i n g c o l o n i e s . N o rever-

t a n t s were d e t e c t e d f o r t h e r e m a i n i n g s eve n. R e v e r t a n t s o fG4 1 0 0 a p p e a r e d a t a f r e q u e n c y o f 1 x 1 0 - 7 ( w i t h t h e o t h e rt w o r e v e r t i n g a t f r e q u e n c i e s o f 1 . 6 x 1 0 - 8 a n d 3 x 1 0 - 9 ) .One s u c h r e v e r t a n t o f G4 1 0 0 ( d e s i g n a t e d s t r a i n G4 1 0 0 R )was p u r i f i e d a n d was shown t o h a v e r e a c q u i r e d t h e a b i l i t y t op r o d u c e TFHA f r o m TFMP a n d t o u t i l i z e a l l t h e s u b s t r a t e ss u p p o r t i n g g r o w t h o f w i l d - t y p e G 4 .O x y g e n u p t a k e a n d e n z y m e a c t i v i t i e s . P h e n o l - i n d u c e d c e l l swere s c r e e n e d f o r t h e i r a b i l i t i e s t o o x i d i z e t o l u e n e , p h e n o l ,o - c r e s o l , a n d 3 - m e t h y l c a t e c h o l . G4 1 0 0 a n d 1 6 o t h e r p h e n o -t y p i c a l l y i n d i s t i n g u i s h a b l e i s o l a t e s d i d n o t e x h i b i t s i g n i f i c a n to x y g e n u p t a k e a c t i v i t y w i t h t o l u e n e b u t d i d u t i l i z e . 3 3 0n m o l o f 02 m i n - ' w i t h 3 - m e t h y l c a t e c h o l . F o u r o f t h e s ei s o l a t e s ( i n c l u d i n g G4 1 0 0 ) were t e s t e d a n d showed no 02u p t a k e w i t h p h e n o l o r o - c r e s o l . HPLC a n a l y s i s o f t h e c u l t u r es u p e r n a t a n t o f G4 1 0 0 f a i l e d t o i n d i c a t e d i s a p p e a r a n c e ort r a n s f o r m a t i o n o f t o l u en e or p h e n o l . G4 1 0 0 R e x h i b i t e d r a t e so f oxy g en c o n s u m p t i o n s i m i l a r t o t h o s e o f w i l d - t y p e c e l l sw i t h o - c r e s o l ( 2 3 0 n m o l o f o x y g e n m i n - ' mg o f p r o t e i n - ' )a n d r e d u c e d r a t e s w i t h t o l ue ne a n d p h e n o l ( 4 0 a n d 1 6 3 nmolo f o x y g e n m i n - ' mg o f p r o t e i n - ' , r e s p e c t i v e l y ) . G4 1 0 2 ,w h i c h p r o d u c e d a brown d i s c o l o r a t i o n o f t h e medium i n t h epresence o f p h e n o l o r t o l u e n e , d i d n o t d e m o n s t r a t e s i g n i f i -c a n t o x y g e n u p t a k e r a t e s w i t h t o l u e n e , p h e n o l , or o - c r e s o l ,a s G4 1 0 0 d i d , b u t i t was d i s t i n g u i s h a b l e b y i t s f a i l u r e t oo x i d i z e c a t e c h o l or 3 - m e t h y l c a t e c h o l . G4 1 0 3 e x h i b i t e d r a t e so f o x i d a t i o n o f t o l u e n e , p h e n o l , a n d o - c r e s o l t h a t were o n l y2 0 t o 30 % t h a t o f w i l d - t y p e c e l l s .Enzyme a c t i v i t i e s were d e t e r m i n e d f o r r e p r e s e n t a t i v et o l u e n e - i n d u c e d c u l t u r e s o f e a c h mutant c l a s s ( T a b l e 2 ) . C e l le x t r a c t s o f G4 1 0 0 d e m o n s t r a t e d a c t i v i t i e s s i m i l a r t o t h o s e o ft h e w i l d t y p e f o r a l l e n z y m e s a s s a y e d . T h i s agrees w i t h t h e

T A B L E 1 . M u t a n t p h e n o t y p e sA c t i o n o n TFMP G r o w t h o n :S t r a i n P h e n o t y p i c c l a s s i n d u c e d w i t h a :

T o l u e n e P h e n o l T o l u e n e P h e n o l o - C r e s o l m - C r e s o lG4 W i l d t y p e + + + + + +G4 1 0 0 TOM A-G4 1 0 O R TOM A+ r e v e r t a n t + + + + + +G4 1 0 2 TOM B- B r Br _ bG4 1 0 3 TOM C- Ye + - +

a C o n v e r s i o n o f TFMP t o i t s y e l l o w r i n g c l e a v a g e p r o d u c t i s i n d i c a t e d b y " + . " F a i l u r e t o d o s o o r f a i l u r e t o g r o w o n i n d i c a t e d c a r b o n sources i s i n d i c a t e d b y." B r a nd Y e , TFMP c o n v e r s i o n was n o t d e t e c t a b l e i n t h e s e c o l o n i e s b e c a u s e o f a c c u m u l a t i o n o f brown ( B r ) o r y e l l o w ( Y e ) m e t a b o l i t e s i n t h e p r e s e n c e o ft h i s i n d u c e r .b V e r y s l o w g r o w t h ( 5 t o 7 d a y s f o r p i n p o i n t c o l o n i e s ) .

V O L . 5 7 , 1 9 9 1


4/7


T A B L E 3 . P h e n o l - a n d t o l u e n e - i nd u ce d d e g r a da t i o n o f T C ET C E ( p L M ) r e m a i n i n g "S t r a i n P h e n o l T o l u e n e

G4 < 0 . 0 2 < 0 . 0 2G4 1 0 0 3 . 6 7 0 . 0 3 3 . 5 6 + 0 . 4 6G4 1 0 O R < 0 . 0 2 < 0 . 0 2G4 1 0 2 < 0 . 0 2 < 0 . 0 2

a M e a n s o f t r i p l i c a t e T C E d e t e r m i n a t i o n s ( - s t a n d a r d d e v i a t i o n ) u si n g 2 4 - hl a c t a t e c u l t u r e s i n d u c e d b y e x p o s u r e t o t o l u e n e v a p o r o r 2 mM p h e n o l f o r 2 h .T h e a m o u n t o f TCE r e m a i n i n g i n u n i n o c u l a t e d c u l t u r e s was 3 . 7 2 + 0 . 0 7 , u M .c o n c l u s i o n s made f r o m o x y g e n u p t a k e s t u d i e s a n d s u g g e s t st h a t e n z y m e s m e t a b o l i z i n g c a t e c h o l o r 3 - m e t h y l c a t e c h o l t o2 - k e t o p e n t - 4 - e n o a t e a n d b e y o n d w e r e p r e s e n t a n d i n d u c i b l e .H y d r o l a s e a n d d e h y d r o g e n a se a c t i v i t i e s t o w a r d 2 - h y d r o x y -m u c o n i c s e m i a l d e h y d e a p p e a r t o b e s l i g h t l y e l e v a t e d r e l a t i v et o w i l d - t y p e l e v e l s i n G4 1 0 0 . E x t r a c t s o f G4 1 0 3 d i d n o tp o s s e s s d e t e c t a b l e h y d r o l a s e a c t i v i t y t o w a r d s e i t h e r 2 - h y -d r o x y m u c o n i c s e m i a l d e h y d e o r i t s m e t h y l h o m o l o g 2 - h y -d r o x y - 6 - o x o h e p t a d i e n o i c a c i d . T h e a b s e n c e o f a n y y e l l o wm e t a b o l i t e a c c u m u l a t i o n i n t h e p r e s e n c e o f p h e n o l b y c e l l s o fG4 1 0 3 i s e x p l a i n e d b y t h e d e m o n s t r a t e d a c t i v i t y o f h y d r o x y -

CH 3

OH

CH 3

0

1 / 2 0 2

C H 31 / 2 0 2 OH 1 / 2 0 2

-o -

m u c o n i c s e m i a l d e h y d e d e h y d r o g e n a s e t h a t c o n v e r t s 2 - h y -d r o x y m u c o n i c s e m i a l d e h y d e t o 2 - h y d r o x y m u c o n a t e b u t c a n -n o t a c t o n t h e m e t h y l a t e d r i n g c l e a v a g e p r o d u c t 2 - h y dr o x y -6 - o x o h e p t a - 2 , 4 - d i e n o a t e .C a t e c h o l - 2 , 3 - d i o x y g e n a s e a c t i v i t y was p r e s u m e d t o b ea b s e n t i n G4 1 0 2 b e c a u s e t h i s s t r a i n a c c u m u l a t e d p r e s u m e dc a t e c h o l b r e a k d o w n p r o d u c t s when i n c u b a t e d w i t h p h e n o lo r t o l u e n e . T h i s was c o n f i r m e d b y enzyme a s s a y s ( T a b l e 2 ) .G4 1 0 2 a l s o e x h i b i t e d a l o s s o f a b i l i t y t o p r o d u c e a s m a l li n c r e a s e i n A 2 6 0 f o l lo wi n g t h e a d d i t i o n o f c a t e c h o l ( d a t a n o ts h o w n ) . T h i s was i n i t i a l l y i n t e r p r e t e d a s a l o s s o f c a t e c h o l - 1 ,2 - d i o x y g e n a s e a c t i v i t y . H o w e v e r , t h i s a p p a r e n t c a t e c h o l - 1 ,2 - d i o x y g e n a s e a c t i v i t y i n t o l u e n e - i n d u c e d G4 c e l l e x t r a c t sw a s l o s t a f t e r t r e a t m e n t w i t h 3 0 mM H202 ( d a t a n o t s h o w n ) .L o s s o f t h i s a c t i v i t y a f t e r e x p o s u r e t o H202 ( a t r e a t m e n ts h o w n t o i n a c t i v a t e c a t e c h o l - 2 , 3 - d i o x y g e n a s e b u t n o t c a t e -c h o l - 1 , 2 - d i o x y g e n a s e i n P . p u t i d a e x t r a c t s [ 1 9 ] ) s u g g e s t e dt h a t t h e s m a l l c h a n g e i n A 2 6 0 ( t h e a b s o r p t i o n maximum o fc i s - c i s - m u c o n a t e ) w a s p r o b a b l y c a u s e d b y t h e f o r m a t i o n o f2 - h y d r o x y m u c o n i c s e m i a l d e h y d e ( a b s o r p t i o n m a x i m u m , 3 7 5n m ) t h r o u g h t h e a c t i o n o f c a t ec h o l - 2 ,3 - d i o x y g en a se o n p h e -n o l .T C E d e g r a d a t i o n . T h e a b i l i t y o f r e p r e s e n t a t i v e s o f e a c hm u t a n t c l a s s t o d e g r a d e T C E a f t e r i n d u c t i o n w i t h e i t h e r

CH/H1 0 OH

CH30 - -

COOHOH H 2 0 CH 3 C O O H

T OM A

OH 1 / 2 0 20~T O M B

, - , O H0-,,-OH

TOM CH-O

C O O HOH

K . CH2C O O H

O H

H C O O HH20

NADNADH

C O O HI COOH

OH

F I G . 2 . Summary o f t h e o b s e r v e d c a t a b o l i c t r a n s f o r m a t i o n o f t o l u e n e , o - c r e s o l , m - c r e s o l , a n d phenol. Fo r e a c h step a mutant p h e n o t y p i cc l a s s i s g i v e n .

TOM A

1 9 3 8 SHIELDS E T AL.


5/7

C A T A B O L I C MUTANTS OF P . C EPAC IA G4 1 9 3 90 H 3

P . p u t l d a F l

' 1 4 C H 3 OHOH P . c e p a c i a G4

P . p / c k e t t i l P K 0 1C O O H

OHOHOH

OH

P . m e n d o c i n a K R - 1

TOL p l a s m i dF I G . 3 . Summary o f t h e know n a e r o b i c b a c t e r i a l p a t h w a y s f or t h e c at a bo l i sm o f t o l u e n e . TOL i n di c at e s t h e pathway encoded by t h ep l a s m i d pWWO.

p h e n o l ( 2 m M ) o r t o l u e n e ( v a p o r ) was d e t e r m i n e d . G4 1 0 0was t h e o n l y mut ant l a c k i n g t h e a b i l i t y t o d e g r a d e TCE( T a b l e 3 ) . T h i s mut ant a l s o f a i l e d t o i n i t i a t e a t t a c k ont o l u e n e , o - c r e s o l , m - c r e s o l , a n d p h e n o l (HPLC a n a l y s e s nots h o w n ) . One o t h e r TOM A - s t r a i n was a l s o t e s t e d f o r T C Ed eg r a da t i o n w i t h i d e n t i c a l r e s u l t s ( d a t a n o t s h o w n ) . T h i smut ant was a p p a r e n t l y n o t a s i b l i n g , s i n c e ( u n l i k e G4 1 0 0 ) i td i d n o t s p o n t a n e o u s l y r e v e r t t o p h e n o l a n d t o l u e n e u t i l i z a -t i o n . R ev e r t an t s o f t h i s mut ant were f o u n d o n l y a f t e r reex-posure t o NTG.

DISCUSSIONM u t a n t s o f P . c e p a c i a G4 u n a b l e t o c a t a b o l i z e t o l u e n e

were o r g a n i z e d i n t o t h r e e p h e n o t y p i c c l a s s e s ( TOM A - ,TOM B - , a n d TOM C - ) a c c o r d i n g t o p a t t e r n s o f h y d r o c a r -b o n u t i l i z a t i o n , t h e r e s u l t s o f c h r o m o g e n i c r e a c t i o n s , a n denzyme a s s ays ( F i g . 2 ) . T h o u g h o n l y o n e r e p r e s e n t a t i v e o fe a c h c l a s s i s r e p o r t e d i n d e t a i l , t h e r e were 1 1 0 o f t h e TOMA - t y p e , 9 5 o f t h e TOM B- t y p e , a n d 4 1 o f t h e TOM C-t y p e i n i t i a l l y s c r e e n e d f r o m a t o t a l o f 4 4 9 p u t a t i v e NTG-g e n e r a t e d mutants s e l e c t e d b y TFMP a n d T T C i n d i c a t o rm e t h o d s .M u t a n t s b e l o n g i n g t o t h e TOM A- c l a s s ( e . g . , G4 1 0 0 )po s s e s s no d e t e c t a b l e a c t i v i t y t o w a r d s t o l u e n e , o - c r e s o l ,m - c r e s o l , or p h e n o l . We s u g g e s t t h a t t h i s p h e n o t y p e i sc a u s e d b y a m u t a t i o n e i t h e r i n a s t r u c t u r a l g e n e e n c o d i n g t h eoxy g ena s e p r e v i o u s l y shown t o b e r e s p o n s i b l e f o r h y d r o x y -l a t i o n o f t h e a r o m a t i c r i n g o f t o l u e n e a n d / o r t h e c r es o l s ( 2 7 )or i n a r e g u l a t o r y comp onent t h a t p r e v e n t s s y n t h e s i s o f t h i se n z y m e ( s ) . T h i s c l a s s was shown t o r e t a i n t h e enzymesr e q u i s i t e f o r t h e o x i d a t i o n o f c a t e c h o l or 3 - m e t h y l c a t e c h o la n d m e t a b o l i s m o f t h e i r r i n g f i s s i o n p r o d u c t s . T h e s e f i n d i n g s ,t o g e t h e r w i t h t h e o b s e r v e d f r e q u e n c y o f r e v e r s i o n t o a w i l dp h e n o t y p e ( 1 0 - 6 t o 1 0 - 9 ) , are c o n s i s t e n t w i t h t h e h y p o t h e s i st h a t a s i n g l e g e n e t i c l e s i o n i s r e s p o n s i b l e f o r t h i s p h e n o t y p e .I n t h i s s t u d y t h e o n l y mutants o f G4 t h a t are i m p a i r e d f o rT C E d e g r a d a t i o n are t h o s e b e l o n g i n g t o t h e TOM A - c l a s s .

T h e r e f o r e , t h e e n z y m e ( s ) r e q u i r e d f o r m e t a b o l i s m o f T C E i st h a t r e q u i r e d f o r m o n o o x y g e n a t i o n o f t o l u e n e , p h e n o l ,o - c r e s o l , a n d m - c r e s o l . I t i s p o s s i b l e t h a t r e p r e s e n t a t i v e s o ft h e TOM A - c l a s s h a v e p o l a r m u t a t i o n s t h a t i m p a i r t h ee x p r e s s i o n o f t w o or more g enes, one whose p r o d u c t i sr e s p o n s i b l e f o r t h e h y dr o xy l a t i o n o f t o l u e n e a n d a n o t h e rw h o s e p r o d u c t i s r e s p o n s i b l e f o r t h e h y d r o x y l a t i o n o f p h e n o la n d t h e c r e s o l s .Th e mut ant c l a s s TOM B- ( e . g . , G4 1 0 2 ) i s d e f e c t i v e f o rc a t e c h o l - 2 , 3 - d i o x y g e n a s e a c t i v i t y . M u t a n t s o f t h i s c l a s swere r e a d i l y i d e n t i f i e d b y t h e i r g r o w t h a n d oxygen u p t a k ep a t t e r n s a n d t h e a c c u m u l a t e d p r o d u c t s e x p e c t e d f o r a mu-t a n t l a c k i n g t h i s e n z y m e . I n d e e d , s t r a i n G4 1 0 2 h a s p r e v i -o u s l y b e e n shown t o a c c u m u l a t e 3 - m e t h y l c a t e c h o l f r o mt o l u e n e ( 2 7 ) .I n a n e a r l i e r s t u d y ( 2 0 ) w i l d - t y p e G4 was r e p o r t e d t opo s s e s s t o l u e n e - i n d u c i b l e c a t e c h o l - 1 , 2 - d i o x y g e n a s e a c t i v i t y .Th e a b s e n c e o f a n y d e t e c t a b l e l e v e l o f t h i s enzyme i n G4 1 0 2( w h e r e no c a t e c h o l - 2 , 3 - d i o x y g e n a s e a c t i v i t y can b e s h o w n )s u g g e s t s t h a t s m a l l c h a n g e s i n t h e A 2 6 0 p r e v i o u s l y a t t r i b u t e dt o c a t e c h o l - 1 , 2 - d i o x y g e n a s e a c t i v i t y are i n s t e a d c a u s e d b yr a p i d f o r m a t i o n o f 2 - h y d r o x y m u c o n i c s e m i a l d e h y d e . Th epresence o f c a t e c h o l - 1 , 2 - d i o x y g e n a s e a c t i v i t y i n G4 u n d e rp h e n o l - i n d u c e d c o n d i t i o n s appears l i k e l y s i n c e TOM B-s t r a i n s are c a p a b l e o f s l o w g r o w t h on p h e n o l . D u r i n g g r o w t hw i t h t o l u e n e o r c r e s o l s , t h e t h i r d mut ant c l a s s d e s c r i b e d ,TOM C- ( e . g . , G4 1 0 3 ) , was shown t o a c c u m u l a t e a y e l l o wm e t a b o l i t e w i t h t h e U V - v i s i b l e s p e c t r u m o f 2 - h y d r o x y - 6 -o x o h e p t a d i e n o i c a c i d . M u t a n t s o f t h i s c l a s s l a c k e d t h e2 - h y dr o x y - 6 - o x o h e p t a- 2 ,4 - di e n o a t e h y d r o l a s e a c t i v i t y whichi s n eces s ary f o r t o l u e n e d e g r a d a t i o n b u t which i s n o t r e -q u i r e d f o r p h e n o l c a t a b o l i s m . W h i l e c e l l e x t r a c t s o f TOM C+s t r a i n s c o u l d h y d r o l y z e 2 - h y d r o x y m u c o n i c s e m i a l d e h y d e( t h e c o r r e s p o nd i n g p h e n o l m e t a b o l i t e ) , i t s p r i n c i p a l r o u t e o fm e t a b o l i s m a p p e a r e d t o o c c u r v i a NAD-dependent d e h y d r o -g e n a t i o n o f 2 - h y d r o x y m u c o n i c s e m i a l d e h y d e . E x t r a c t s o f G4w e r e s h o w n t o h a v e h y d r o l a s e a c t i v i t y t h a t was 1 2 - f o l dg r e a t e r t o w a r d s 2 - h y d r o x y - 6 - o x o h e p t a - 2 , 4 - d i e n o a t e t h a n

CH 3

C30 * 4 3

C H

O H

COH

VOL. 5 7 , 1 9 9 1


6/7


t o w a r d s 2 - h y d r o x y m u c o n i c s e m i a l d e h y d e ( T a b l e 2 ) . S i n c et h e N A D - d e p e n d e n t 2 - h y d r o x y m u c o n i c s e m i a l d e h y d e d e h y -d r o g e n a s e d o e s n o t a c t o n 2 - h y d r o x y - 6 - o x o h e p t a - 2 , 4 - d i -e n o a t e , i t s a c c u m u l a t i o n i n t h e p r e s e n c e o f t o l ue ne a n d t h ea b s e n c e o f a n y a c c u m u l a t i o n o f 2 - h y d r o x y m u c o n i c s e m i a l -d e h y d e i n t h e p r e s e n c e o f p h e n o l b y t h e TOM C - s t r a i n G41 0 3 a r e e x p l a i n e d .T h e d e s c r i p t i o n o f a n o t h e r t o l u e n e c a t a b o l i c p a t h w a y t h a ti n c l u d e s a n e n z y m e w i t h a c t i v i t y t o w a r d s T C E now b r i n g st h e t o t a l n u m b e r o f s u c h known p a t h w a y s t o f o u r : t h et o l u e n e d i o x y g e n a t i o n p a t h w a y o f P . p u t i d a F l ( 2 2 , 3 0 ) , t h et o l u e n e o - m o n o o x y g e n a t i o n p a t h w a y o f G4 ( 2 7 ) , t h e t o l u e n em - m o n o o x y g e n a t i o n p a t h w a y o f P . p i c k e t t i i PKO1 ( 1 5 , 1 6 ) ,a n d t h e t o l u e n e p - m o n o o x y g e n a t i o n p a t h w a y o f P . m e n -d o c i n a ( 3 2 ) ( F i g . 3 ) . A n o t h e r t o l u e n e - d e g r a d a t i v e p a t h w a yt h a t i s i n i t i a t e d b y t h e t o l u e n e m o n o o x y g e n a s e o f t h e T O Lp l a s m i d (pWWO) ( 3 3 ) i n v o l v e s a n a t t a c k u p o n t h e m e t h y lg r o u p r a t h e r t h a n t h e a r o m a t i c r i n g o f t o l u e n e . E n z y m e s o ft h i s p a t h w a y f a i l t o a c t o n T C E ( 2 2 ) . T C E i s d e g r a d e d i n a l lc a s e s i n w h i c h a n o x y g e n a s e t h a t d i r e c t s t h e a d d i t i o n o fm o l e c u l a r o x y g e n t o t h e a r o m a t i c n u c l e u s o f t o l u e n e i se x p r e s s e d . T h i s w o u l d i n d i c a t e t h a t common f e a t u r e s a r es h a r e d b e t w e e n T C E a n d t h e a r o m a t i c r i n g o f t o l ue ne w h i c h

a l l o w t h e t o l u e n e r i n g o x y g e n a s e s t o a c c e p t b o t h a s s u b -s t r a t e s .I n v i e w o f t h e d e s i g n a t i o n o f t h e t o l u e n e d i o x y g e n a s eg e n e s o f P . p u t i d a F l a s t o d ( 3 4 ) a n d t h e d e s i g n a t i o n o fp a r a - t o l u e n e d i o x y g e n a s e o f P . m e n d o c i n a a s TMO ( 3 2 ) , w ep r o p o s e t h e g e n e d e s i g n a t i o n t o m f o r t h e g e n e s o f t h e P .c e p a c i a t o l u e n e o r t h o - m o n o o x y g e n a s e p a t h w a y .ACKNOWLEDGMENTS

We g r a t e f u l l y a c k n o w l e d g e t h e t e c h n i c a l a s s i s t a n c e o f B e a t B l a t t -man a n d M a u r e e n Downey f o r H P L C a n d g a s c h r o m a t o g r a p h ya n a l y s i s .T h i s w o r k w a s s u p p o r t e d t h r o u g h c o n t r a c t 6 8 - 0 3 - 3 4 7 9 b e t w e e nT e c h n i c a l R e s o u r c e s I n c . a n d t h e U . S . E n v i r o n m e n t a l P r o t e c t i o nA g e n c y , G u l f B r e e z e , F l a .REFERENCES

1 . A r c i e r o , D . , T . V a n n e l l i , M. L o g a n , a n d A . B . H o o p e r . 1 9 8 9 .D e g r a d a t i o n o f t r i c h l o r o e t h y l e n e b y t h e a m m o n i a - o x i d i z i n g b a c -t e r i u m N i t r o s o m o n a s e u r o p a e a . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m -m u n . 1 5 9 : 6 4 0 - 6 4 3 .2 . B a y l y , R . C . , S . D a g l e y , a n d D . T . G i b s o n . 1 9 6 6 . T h e m e t a b o l i s mo f c r e s o l s b y s p e c i e s o f P s e u d o m o n a s . B i o c h e m . J . 1 0 1 : 2 9 3 -3 0 1 .3 . B a y l y , R . C . , a n d G . J . W i g m o r e . 1 9 7 3 . M e t a b o l i s m o f p h e n o la n d c r e s o l s b y m u t a n t s o f P s e u d o m o n a s p u t i d a . J . B a c t e r i o l .1 1 3 : 1 1 1 2 - 1 1 2 0 .4 . B o c h n e r , B . R . , a n d M. A . S a va g ea u. 1 9 7 7 . G e n e r a l i z e d i n d i c a -t o r p l a t e f o r g e n e t i c , m e t a b o l i c , a n d t a x o n o m i c s t u d i e s w i t hm i c r o o r g a n i s m s . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 3 3 : 4 3 4 - 4 4 4 .5 . B r a d f o r d , M. M. 1 9 7 6 . A r a p i d a n d s e n s i t i v e m e t h o d f o r t h eq u a n t i t a t i o n o f m i c r o g r a m q u a n t i t i e s o f p r o t e i n u t i l i z i n g t h ep r i n c i p l e o f d y e b i n d i n g . A n a l . B i o c h e m . 7 2 : 2 4 8 - 2 5 4 .6 . D a g l e y , S . , a n d D . T . G i b s o n . 1 9 6 5 . T h e b a c t e r i a l d e g r a d a t i o n o fc a t e c h o l . B i o c h e m . J . 9 5 : 4 6 6 - 4 7 4 .7 . D a y , D . L . , D . Y a s i n o w , J . M c D o n o u g h , a n d C . W. S h u s t e r .1 9 8 4 . U s e o f u r e i d o p e n i c i l l i n s f o r s e l e c t i o n o f p l a s m i d v e c t o rt r a n s f o r m a n t s i n P s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a a n d P s e u d o m o n a sp u t i d a . J . B a c t e r i o l . 1 5 7 : 9 3 7 - 9 3 9 .8 . E n g e s s e r , K . H . , R . B . C a i n , a n d H . J . K n a c k m u s s . 1 9 8 8 .B a c t e r i a l m e t a b o l i s m o f s i d e c h a i n f l u o r i n a t e d a r o m a t i c s : c o m e -t a b o l i s m o f 3 - t r i f l u o r o m e t h y l ( T F M ) - b e n z o a t e b y P s e u d o m o n a sp u t i d a ( a r v i l l a ) m t - 2 a n d R h o d o c o c c u s r u b r o p e r t i n c t u s N 6 5 7 .A r c h . M i c r o b i o l . 1 4 9 : 1 8 8 - 1 9 7 .9 . E w e r s , J . , D . F r e i e r - S c h r o d e r , a n d H . J . K n a c k m u s s . 1 9 9 0 .S e l e c t i o n o f t r i c h l o r o e t h e n e ( T C E ) d e g r a d i n g b a c t e r i a t h a t r e s i s t

i n a c t i v a t i o n b y TCE. A r c h . M i cr o bi o l. 1 5 4: 4 1 0 - 4 1 3.1 0 . F o l s o m , B . R . , P . J . C h a p m a n , a n d P . H . P r i t c h a r d . 1 9 9 0 . P h e n o la n d t r i c h l o r o e t h y l e n e d e g r a d a t i o n b y P s e u d o m o n a s c e p a c i a G 4 :k i n e t i c s a n d i n t e r a c t i o n s b e t w e e n s u b s t r a t e s . A p p l . E n v i r o n .M i c r o b i o l . 5 6 : 1 2 7 9 - 1 2 8 5 .1 1 . F o x , B . G . , J . G . B o r n e m a n , L . P . W a c k e t t , a n d J . D . L i p s c o m b .1 9 9 0 . H a l o a l k a n e o x i d a t i o n b y t h e s o l ub le m e t h a n e m o n o o x y -g e n a s e f r o m M e t h y l o s i n u s t r i c h o s p o r i u m O B 3 b : m e c h a n i s t i ca n d e n v i r o n m e n t a l i m p l i c a t i o n s . B i o c h e m i s t r y 2 9 : 6 4 1 9 - 6 4 2 7 .1 2 . G i b s o n , D . T . 1 9 7 1 . A s s a y o f e n z y m e s o f a r o m a t i c m e t a b o l i s m ,p . 4 6 2 - 4 7 1 . I n J . R . N o r r i s a n d D . W. R i b b o n s ( e d . ) , M e t h o d s i nm i c r o b i o l o g y , v o l . 6 A . A c a d e m i c P r e s s I n c . , Ne w Y o r k .1 3 . H a r e l a n d , W . , R . L . C r a w f o r d , P . J . C h a p m a n , a n d S . D a g l e y .1 9 7 5 . M e t a b o l i c f u n c t i o n a n d p r o p e r t i e s o f 4 - h y d r o x y p h e n y l a c e -t i c a c i d 1 - h y d r o x y l a s e f r o m P s e u d o m o n a s a c i d o v o r a n s . J . B a c -t e r i o l . 1 2 1 : 2 7 2 - 2 8 5 .1 4 . H u g h e s , D . E . 1 9 5 1 . A p r e s s f o r d i s r u p t i n g b a c t e r i a a n d o t h e rm i c r o o r g a n i s m s . J . E x p . P a t h o l . 3 2 : 9 7 - 1 0 2 .1 5 . K a p h a m m e r , B . , J . J . K u k o r , a n d R . H . O l s e n . 1 9 9 0 . C l o n i n ga n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f a n o v e l t o l u e n e d e g r a d a t i v e p a t h w a yf r o m Pseudomonas p i c k e t t i i P K O 1 , a b s t r . K - 1 4 5 , p . 2 4 3 . A b s t r .9 0 t h A n n u . M e e t . Am. S o c . M i c r o b i o l . 1 9 9 0 . A m e r i c a n S o c i e t yf o r M i c r o b i o l o g y , W a s h i n g t o n , D . C .1 6 . K u k o r , J . J . , a n d R . H . O l s e n . 1 9 9 0 . M o l e c u l a r c l o n i n g , c h a r -a c t e r i z a t i o n , a n d r e g u l a t i o n o f a P s e u d o m o n a s p i c k e t t i i PKO1g e n e e n co d i ng p h e no l h y d r o x y l as e a n d e x p r e s s i o n o f t h e g e n e i nP s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a P A 0 1 c . J . B a c t e r i o l . 1 7 2 : 4 6 2 4 - 4 6 3 0 .1 7 . L i t t l e , C . D . , A . V . P a l u m b o , S . E . H e r b e s , M. E . L i d s t r o m ,R . L . T y n d a l l , a n d P . J . G i l m e r . 1 9 8 8 . T r i c h l o r o e t h y l e n e b i o -d e g r a d a t i o n b y a m e t h a n e - o x i d i z i n g b a c t e r i u m . A p p l . E n v i r o n .M i c r o b i o l . 5 4 : 9 5 1 - 9 5 6 .1 8 . M o n t g o m e r y , S . O . , M. S . S h i e l d s , P . J . C h a p m a n , a n d P . H .P r i t c h a r d . 1 9 8 9 . I d e n t i f i c a t i o n a n d c h a r ac t er i z a t i o n o f t r i c h l o r o -e t h y l e n e d e g r a d i n g b a c t e r i a , a b s t r . K - 6 8 , p . 2 5 6 . A b s t r . 8 9 t hA n n u . M e e t . Am. S o c . M i c r o b i o l . 1 9 8 9 . A m e r i c a n S o c i e t y f o rM i c r o b i o l o g y , W a s h i n g t o n , D . C .1 9 . M u r r a y , K . , a n d P . A . W i l l i a m s . 1 9 7 4 . R o l e o f c a t e c h o l a n d t h em e t h y l c a t e c h o l s a s i n d u c e r s o f a r o m a t i c m e t a b o l i s m i n P s e u d o -m o n a s p u t i d a . J . B a c t e r i o l . 1 1 7 : 1 1 5 3 - 1 1 5 7 .2 0 . N e l s o n , M . J . K . , S . 0 . M o n t g o m e r y , W. R . M a h a f f e y , a n d P . H .P r i t c h a r d . 1 9 8 7 . B i o d e g r a d a t i o n o f t r i c h l o r o e t h y l e n e a n d i n -v o l v e m e n t o f a n a r o m a t i c b i o d e g r a d a t i v e p a t h w a y . A p p l . E n v i -r o n . M i c r o b i o l . 5 3 : 9 4 9 - 9 5 4 .

2 1 . N e l s o n , M. J . K . , S . 0 . M o n t g o m e r y , E . J . O ' N e i l l , a n d P . H .P r i t c h a r d . 1 9 8 6 . A e r o b i c m e t a b o l i s m o f t r i c h l o r o et h y l e ne b y ab a c t e r i a l i s o l a t e . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 5 2 : 3 8 3 - 3 8 4 .2 2 . N e l s o n , M . J . K . , S . 0 . M o n t g o m e r y , a n d P . H . P r i t c h a r d . 1 9 8 8 .T r i c h l o r o e t h y l e n e m e t a b o l i s m b y m i c r o o r g a n i s m s t h a t d e g r a d ea r o m a t i c c o m p o u n d s . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 5 4 : 6 0 4 - 6 0 6 .2 3 . N o z a k i , M . , H . K a g a m i y a m a , a n d 0 . H a y a i s h i . 1 9 6 3 . M e t a p y r o -c a t e c h a s e I p u r i f i c a t i o n , c r y s t a l l i z a t i o n a n d some p r o p e r t i e s .B i o c h e m . Z . 3 3 8 : 5 8 2 - 5 9 0 .2 4 . O l d e n h u i s , R . , R . L . J . M. V i n k , D . B . J a n s s e n , a n d B . W i th o lt .1 9 8 9 . D e g r a d a t i o n o f c h l o r i n a t e d a l i p h a t i c h y d r o c a r b o n s b yM e t h y l o s i n u s t r i c h o s p o r i u m OB3b e x p r e s s i n g s o l u b l e m e t h a n em o n o o x y g e n a s e . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 5 5 : 2 8 1 9 - 2 8 2 6 .2 5 . O r n s t o n , L . N . , M. K . O r n s t o n , a n d G . C h o u . 1 9 6 9 . I s o l a t i o n o fs p o n t a n e o u s m u t a n t s t r a i n s o f P s e u d o m o n a s p u t i d a . B i o c h e m .B i o p h y s . R e s . Commun. 3 6 : 1 7 9 - 1 8 4 .2 6 . R a j a g o p a l , R . 1 9 8 6 . C o n c e p t u a l d e s i g n f o r a g r o u n d w a t e r q u a l -i t y m o n i t o r i n g s t r a t e g y . E n v i r o n . P r o f . 8 : 2 4 4 - 2 6 4 .2 7 . S h i e l d s , M. S . , S . 0 . M o n t g o m e r y , P . J . C h a p m a n , S . M.C u s k e y , a n d P . H . P r i t c h a r d . 1 9 8 9 . N o v e l p a t h w a y o f t o lu en ec a t a b o l i s m i n t h e t r i c h l o r o e t h y l e n e - d e g r a d i n g b a c t e r i u m G 4 .A p p I. E nv i r o n. M i c r o b i o l . 5 5 : 1 6 2 4 - 1 6 2 9 .2 8 . T s e i n , H . - C . , G . A . B r us se a u, R . S . H a n s o n , a n d L . P . W a c k e t t .1 9 8 9 . B i o d e g r a d a t i o n o f t r i c h l o r o e t h y l e n e b y M e t h y l o s i n u s t r i -c h o s p o r i u m O B 3 b . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 5 5 : 3 1 5 5 - 3 1 6 1 .2 9 . W a c k e t t , L . P . , G . A . B r us se au , S . R . H o u s e h o l d e r , a n d R . S .H a n s o n . 1 9 8 9 . A s u r v e y o f m i c r o b i a l o x y g e n a s e s : t r i c h l o r o e t h -y l e n e d e g r a d a t i o n b y p r o p a n e - o x i d i z i n g b a c t e r i a . A p p l . E n v i -r o n . M i c r o b i o l . 5 5 : 2 9 6 0 - 2 9 6 4 .3 0 . W a c k e t t , L . P . , a n d D . T . G i b s o n . 1 9 8 8 . D e g r a d a t i o n o f t r i c h l o -

1 9 4 0 SHIELDS E T AL.


7/7

C A T A B O L I C MUTANTS OF P . C EPAC IA G4 1 9 4 1r o e t h y l e n e b y t o l u e n e d i o x y g e n a s e i n w h o l e - c e l l s t u d i e s w i t hPseudomonas p u t i d a F l . A p p l . E nv i r o n . M i c r o b i o l . 5 4 : 1 7 0 3 -1708.3 1 . W a c k e t t , L . P . , a n d S . R . H o u s e h o l d e r . 1 9 8 9 . T o x i c i t y o ft r i c h l o r o e t h y l e n e t o Pseudomonas p u t i d a F l i s m e d i a t e d b yt o l u e n e d i o x y g e n a s e . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 5 5 : 2 7 2 3 - 2 7 2 5 .3 2 . W i n t e r , R . B . , K . - M . Y e n , a n d B . D . E ns le y . 1 9 89 . E f f i c i e n td eg r ad at i o n o f t r i c h l o r o e t h y l e n e b y a r e c o m b i n a n t E s c h e r i c h i a

c o l i . B i o i T e c h n o l o g y 7 : 2 8 2 - 2 8 5 .3 3 . W o r s e y , M. J . , a n d P . A . W i l l i a ms . 1 9 7 5. M e t a b o l i s m o f t o l u e n ea n d x y l e n e s b y P s e u d o m o n a s p u t i d a ( a r v i l l a ) m t - 2 : e v i d e n c e f o ra new f u n c t i o n o f t h e TOL p l a s m i d . J . B a c t e r i o l . 1 3 0 : 1 1 4 9 - 1 1 5 8 .3 4 . Z y l s t r a , G . J . , W. R . McCombie, D . T . G i b s o n , a n d B . A .F i n e t t e . 1 9 8 8 . T o l u e n e d e g r a d a t i o n b y P s e u d o m o n a s p u t i d a F l :g e ne t i c o r g a n i z at i o n o f t h e t o d operon. A p p l . E n v i r o n . M i c r o -b i o l . 5 4 : 1 4 9 8 - 1 5 0 3 .

VOL. 5 7 , 1 9 9 1

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