Seminar Tugas Akhir Juni 2014

1

SHAKER WATERBATH

Qurrotu Ainy1, Priyambada.C.Nugraha2, Triana Rahmawati 3

ABSTRAK

Shaker water bath merupakan salah satu peralatan laboratorium yang digunakan untuk proses inkubasi larutan sekaligus dishaker. Alat ‘Shaker Waterbath’ ini dibuat sesuai dengan standar operational prosedur PulseNet PFGE pada Clostridium botulinum dengan suhu inkubasi 55°C±2°C, kecepatan putar 70 rpm, serta pemilihan waktu 4 jam untuk proses lisis sel di agarose plug dan 15 menit untuk proses pencucian agarose plug yang akan ditampilkan pada display LCD.

Suhu chamber dideteksi oleh sensor suhu lm35 diukur menggunakan termometer sedangkan kecepatan putar motor diukur menggunakan tachometer.

Data pengambilan RPM, timer dan suhu dilakukan sebanyak sembilan kali. Dan proses pengambilan data pada RPM ada dua proses yaitu Ada dan tanpa ada beban . Berdasarkan hasil analisis pengukuran nilai error pada kecepatan motor 70 rpm selama 4 jam tanpa beban sebesar -1% dan dengan beban sebesar 0,33%, pengukuran selama 15 menit tanpa beban sebesar -1.1 %dan dengan beban sebesar -0,14%. Nilai error pada pengukuran timer 4 jam sebesar 0.167 % dan timmer 15 menit sebesar 0 %. Sedangkan nilai error pada pengukuran suhu 55 oC saat motor berputar selama 4 jam sebesar -1,7 % dan 15 menit sebesar -1,82 %. Berdasarkan data hasilpengukuran dan analisis maka dapat disimpulkan bahwa alat ‘Shaker Waterbath’ ini dapat bekerja dengan baik.

Kata Kunci: Rpm,Suhu , Timer

PENDAHULUANLatar Belakang

Waterbath merupakan peralatan laboratorium yang mempertahankan suhu dengan media air dalam kondisi tertentu selama selang waktu yang ditentukan. Fungsi Waterbath untuk pemanasan pada suhu rendah 300C sampai 1000C dan menguapkan zat atau larutan dengan suhu yang tidak terlalu tinggi. Shaker memiliki banyak jenis dengan model pergerakan yang berbeda beda. Pada umumnya alat ini digunakan untuk mengocok atau mencampur sampel, baik bahan maupun larutan kimia satu sama lain sampai homogen.Sesuai dengan standar operasional prosedurPulseNet PFGE pada Clostridium botulinum tahap proses lisis sel diagarose plug menggunakan alat shaker waterbath dengan suhu inkubasi 55°C ±2°C waktu minimum 2 jam dan optimal 4 jam dengan kecepatan maksimal 70 rpm. Menggunakan

alat shaker waterbath dengan suhu tertentu dan kecepatan konstan dapat membantu mencampur sekaligus menginkubasi larutan lisis agar dapat memecah dan membuka bakteri melepaskan DNA diagarose plug. Setelah tahap proses lisis sel dilanjutkan proses pencucian agarose plug juga menggunakan alat shaker waterbath dengan suhu inkubasi 55°C ± 2°C waktu 15 menit dengan kecepatan 70 rpm. Suhu inkubasi dengan kecepatan konstan tersebut dapat membantu mencampurkan dan menginkubasi suatu larutan untuk menghilangkan kotoran ekstraseluler yang ada pada DNA genom melingkar diagarosa plug. Shaker waterbath diperlukan untuk mencampurkan larutan dengan diinkubasi sekaligus dilakukan pengocokan. Prinsipkerja shaker waterbath yaitu menjaga suhuoptimum dengan menggunakan air sebagaikonduktor dan memaksimalkan kontakmikroorganisme dan nutrien denganpengocokan. Shaker waterbath memiliki

Seminar Tugas Akhir Juni 2014

banyak fungsi salah satunya untuk prosesfermentasi yang memerlukan suhu dan agitasi khusus, sterilisasi, mengembangbiakkan mikroorganismedalam suhu optimum, menyebarkan nutrienagar merata, proses lisis sel di agarose plugdan pencucian agarose plug.Mengacu pada hasil identifikasi masalahdiatas, maka penulis ingin membuat alat “Shaker Waterbath” yang merupakanpenyempurnaan dari alat sebelumnya.Batasan Masalah

Agar dalam pembahasan alat ini tidak terjadi pelebaran masalah dalam penyajiannya, penulis membatasi pokok-pokok batasan permasalahan yang akan dibahas yaitu:

1. IC Mikrokontroller ATMega 8 sebagai pusat pengendali inputan dan outputan

2. LCD sebagai tampilan suhu dan waktu 3. Menggunakan sensor suhu LM354. Suhu inkubasi 550C5. Kecepatan Agitasi 70 rpm6. Pemilihan waktu Washing of Agarose Plugs

After Cell Lysis 15 menit dan Lysis of Cellsin Agarose Plug 4 jam.

Rumusan MasalahDapatkah dibuat alat Shaker

Waterbath dengan pengendali suhu dan gerak chamber menggunakan mikrokontroler ATMega 8 ?

TujuanTujuan Umum

Dibuat alat Shaker Waterbath dengan pengendali Suhu dan gerak chamber menggunakan mikrokontroler ATMega 8.Tujuan Khusus

1. Membuat rangkaian power supply2. Membuat rangkaian mikrokontroler dan

programnya3. Membuat rangkaian suhu menggunakan

sensor suhu LM354. Membuat rangkaian driver heater dan

buzzer5. Membuat rangkaian kontrol kecepatan

6. Melakukan uji coba dan uji fungsi

ManfaatManfaat Teoritis

Meningkatkan wawasan dan pengetahuan dibidang alat-alat laboratorium khususnya alat Shaker Waterbath.Manfaat Praktis

Dengan adanya alat ini diharapkan dapat memudahkan user dalam melakukan proses lisis sel agarose plug dan pencucian agarose plug. Dibuat alat Shaker Waterbath dengan Pengendali Suhu dan GerakChamber Menggunakan Mikrokontroler ATMega 8.

METODOLOGI

Diagram Mekanis Sistem

Gambar 1 Rancang Modul Tampak Depan

Gambar 2 Rancang Modul Tampak Belakang

Gambar 3 Rancang Control Panel

Seminar Tugas Akhir Juni 2014

Diagram Blok Sistem

IC mikrokontroler Atmega8 sebagai tempat masuknya program dan pusat pengendali inputan dan outputan .Outputan dari ic mikro yaitu Lcd digunakan untuk menampilkan suhu dan timer. Driver heater untuk mengaktifkan dan mematikan heater. Dan heater untuk memanaskan air dichamber hingga suhu chamber sesuai dengan setting di mikro 55°C. Heater akan mati jika tombol off di tekan. Rangkaian pengendali motor untuk mengatur kecepatan motor sebesar 70 rpm dan motor untuk menggerakkan chamber. Indikator suhu tercapai sebagai indikator suhu chamber sesuai dengan setting mikro 55°C. Driver buzzer untuk mematikan dan menghidupkan buzzer dan buzzer sebagai indikator semua proses selesai.

Inputan Ic mikro yaitu 2 tombol pemilihan timer 4 jam dan 15 menit untuk proses yang berbeda. Enter untuk menjalankan perintah sesuai dengan program. Rangkaian pengondisi sinyal dengan sensor suhu lm35 untuk mendeteksi suhu di chamber. Di IC Mikrokontroler ATmega8 sudah terdapat ADC didalammya sehingga output dari sensor LM35 setelah masuk rangkain pengondisi sinyal langsungdapat diolah, dibaca dan ditampilkan di LCD sehingga tidak memerlukan rangkaian ADC.

Gambar 4 Diagram Blok

Diagram Alir Proses/Program

Ketika tekan start mulai suhu sudah tersetting 550C heater on. Jika suhu tercapai maka heater akan off dan indikator nyala tetapi jika belum tercapai maka heater akan on. Melakukan pemilihan timer 4 jam untuk proses lisis sel di agarose plug atau 15 menit untuk proses washing agarose plug . Jika sudah memilih misalkan 4 jam maka motor akan bekerja dengan kecepatan 70 rpm dan timer counter down. Timer sudah habis motor akan berhenti dan buzzer on Begitu juga ketika pemilihan timer 15 menit.

Gambar 5 Diagram Alir

Urutan Kegiatan

1. Mempelajari literatur2. Menentukan topik

Seminar Tugas Akhir Juni 2014

3. Menyusun latar belakang, batasan masalah, rumusan masalah, tujuan dan manfaat

4. Membuat diagram mekanis, diagram blok sistem dan diagram alir proses/program

5. Menentukan rancangan penelitian, variabel-variabel penelitian dan definisi operasional

6. Menyusun proposal7. Merancang rangkaian mekanik dan

rangkaian elektronik dalam bentuk modul-modul

8. Menyatukan modul-modul membentuk sistem modul

9. Menguji sistem modul dan mengukur besaran-besaran fisis yang diperlukan

10. Menghitung parameter-parameter kinerja sistem

11. Membuat ulasan mengenai hasil-hasil dari penelitian ini meliputi kelebihan/kekuatan sampai dengan kekurangan/kelemahan sistem

12. Menarik kesimpulan dan saran untuk perbaikan sistem

13. Menyusun laporan karya tulis ilmiah

PENGUJIAN DAN PEMBAHASANTeknik Pengujian dan Pengukuran 1. Menyiapkan peralatan yang dibutuhkan

terutama alat ukur termometer air raksa untuk mengukur suhu chamber, tachometer untuk mengukur kecepatan motor, aplikasi stopwatch untuk mengukur timer, avometer untuk mengukur tegangan dan hambatan yang ada di tes point, dan osiloskop.

2. Merapikan kabel – kabel atau membungkusnya jadi dengan menggunakan selang agar rapi dan agar tidak terjadi konsleting pada alat kita pada saat kita uji coba.

3. Melakukan pengecekan terhadap masing-masing jalur rangkaian pada PCB tentang ketepatan komponen koneksi pin –pin IC menggunakan avometer.

4. Menyiapkan tabel untuk mencatat hasil pengukuran.

5. Menghidupkan alat terlebih dahulu tunggu suhu chamber tercapai 55°C.

6. Melakukan pengukuran suhu chamber dengan termometer, mengecek tes point Vout LM35 dengan avo digital, melihat suhu yang tampil di lcd dan dibandingkan.

7. Melakukan pemilihan timer setelah suhu tercapai 4 jam atau 15 menit dan melakukan pengukuran timer dengan aplikasi stopwatch.

8. Melakukan pengukuran kecepatan motor menggunakan tachometer ketika diberi beban 12 tabung reaksi yang diberi air.

9. Melakukan pengecekan output gelombang dan duty cycle motor dengan osiloskop.

10. Mencatat hasil pengukuaran dalam tabel yang telah disediakan

Hasil Pengukuran

Tabel 1 Pengukuran Rpm Ada Beban atauSampel Ketika Motor Berputar Selama

4jam

I II III IV V VI VII VIII IX Ada beban

sampel waktu 4jam

70 70.0 70.0 70.0 69,8 69,8 69,8 69,5 69,5 69,5

RPM DATA PENGUKURAN (TACHOMET ER)

Tabel 2 Pengukuran Rpm Ada Beban atau Sampel Ketika Motor Berputar Selama 15

Menit

I II III IV V VI VII VIII IX

Ada beban

dan waktu

15 menit

70.0 70,4 70,4 70,4 69,9 69,9 69,9 70.0 70.0 70.0

RPMDATA PENGUKURAN (TACHOMETER)

Gambar 1 Sinyal Gelombang Segitiga dan Kotak

Seminar Tugas Akhir Juni 2014

Gambar 2 Sinyal Input Komparator Gelombang Segitiga Dibandingkan dengan

Tegangan Referensi

Gambar 3 Sinyal Output PWM Pada Kecepatan Motor 70 Rpm

Tabel 3 Pengukran Timer 4Jam dan 15menit

I II III IV V VI VII VIII IX

15

MENIT900 901 900 901 901 902 900 902 900 902

DATA PENGUKURAN TIMER

14423

(DETIK)

14425 1442414424 14424 144254JAM 14400 14425 14424 14424

Tabel 4 Pengukuran Suhu Chamber Ketika Motor berputar selama 15 menit

I II III IV V VI VII VIII IX

Motor berputar15

menit55 56 56 56 5655 55 55 56 55

SUHUDATA PENGUKURAN (TERMOMETER °C)

Tabel 5 Pengukuran Suhu Chamber Ketika Motor Berputar Selama 4 Jam

I II III IV V VI VII VIII IXDATA

PENGUKURAN (TERMOMETER °C)

56

SUHU

Motor Berputar 4

Jam56 56 56 56 5655 56 55 55

AnalisisRumus yang digunakan sebagai berikut:1. Rerata(x)

Adalah nilai atau hasil pembagian dari jumlah data yang diambil atau diukur dengan banyaknya pengambilan data atau banyaknya pengukuran.Dirumuskan sebagai berikut: Rerata=

9

IXVIIIVIIVIVIVIIIIII

2. Simpangan (koreksi)Adalah selisih atau perbedaan dari

standart yang diinginkan dengan hasil dari rata – rata pengukuran. Dirumuskan sebagai berikut:Koreksi= Data Setting – Rerata3. Kesalahan (Error)

Adalah nilai persen dari simpangan terhadap nilai yang diinginkan.Dirumuskan sebagai berikut:

Error = %100xgDataSettin

xgDataSettin

4. Standart Deviasi (SD)Adalah suatu nilai yang

menunjukkan tingkat variasi kelompok data dan penyimpangan dari rata-ratanya.Dirumuskan sebagai berikut:SD=

In

rataIXrataIIrataI

222 )Re(..)Re()Re(

5. Ketidakpastian (Ua)Adalah perkiraan kesalahan

data pengukuran pada saat pengambilan data dengan pengukuran berulang, 65 % (kepercayaan). Dirumuskan sebagai berikut:

Ua= n

StDev

Seminar Tugas Akhir Juni 2014

Tabel 6 Analisis Data Rpm saat Ada Beban atau Sampel Ketika Motor Berputar Selama 4 Jam

Tabel 7 Analisis Data Ada Beban atau Sampel Motor Berputar Selama 15 Menit

Tabel 8 Analisis Data Timer

Tabel 9 Analisis Data Suhu Chamber Ketika Motor Berputar Selama 15 Menit

Tabel 10 Analisis Data Suhu Chamber Ketika Motor Berputar Selama 4 Jam

PembahasanKinerja Sistem Keseluruhan

Rata-rata yang diperoleh pengukuran rpm ada beban saat motor berputar selama 4 jam yaitu 69,7 dengan nilai koreksi atau selisih dari standart yang dinginkan sebesar 0,23. Sehingga error yang dihasilkan 0,33%. Penyimpangan nilai rata-rata dari tingkat variasi data (SD)sebesar 0,22 .Kesalahan data pengukuran pada saat pengambilan data dengan pengukuran berulang, 65 % (kepercayaan) atau Ua sebesar 0,07.

Rata-rata yang diperoleh pengukuran rpm ada beban saat motor berputar selama 15 menit yaitu 70,1 dengan nilai koreksi atau selisih dari standart yang dinginkan sebesar 0,1. Sehingga error yang dihasilkan -0,14%. Penyimpangan nilai rata-rata dari tingkat variasi data (SD)sebesar 0,23. Kesalahan data pengukuran pada saat pengambilan data dengan pengukuran berulang, 65 % (kepercayaan) atau Ua sebesar 0,08.

Rata-rata yang diperoleh pengukuran timer15 menit yaitu 901 dengan nilai koreksi atau selisih dari standart yang dinginkan sebesar 1. Sehingga error yang dihasilkan 0,11%. Penyimpangan nilai rata-rata dari tingkat variasi data (SD) sebesar 0,79.Kesalahan data pengukuran pada saat pengambilan data dengan pengukuran berulang, 65 % (kepercayaan) atau Ua sebesar 0,26.

Rata-rata yang diperoleh pengukuran timer 4 jam yaitu 14424,22 dengan nilai koreksi atau selisih dari standart yang dinginkan sebesar 24,22. Sehingga error yang dihasilkan 0,168%. Penyimpangan nilai rata-rata dari tingkat

DATA RPM

Rer

ata

Kor

eksi

Err

or %

SD Ua

Ada beban dan waktu

4 jam70

69.77

0.23

0.33

0.22

0.07

DATA RPM

Rer

ata

Kor

eksi

Err

or %

SD Ua

Ada beban

waktu 15 menit

7070.1

0.10.14

0.23

0.08

TIMER

Timer settin

g Satua

n Detik

Rer

ata

Kor

eksi

Err

or %

SD Ua

15 (MENIT)

900 901 1 0,11 0,790,26

4 (JAM)1440

014424,2

224,22 0,168 0,667

0,22

DATASUHU

oC

Rer

ata

Kor

eksi

Err

or %

SD Ua

Motor berputar15 menit

55 55,56 0,56 0,01 0,4960,16

5

DATASUHU

oC

Rer

ata

Kor

eksi

Err

or %

SD Ua

Motor berputar

4 jam55 55,78 0,78 1,418 0,441 0,146

Seminar Tugas Akhir Juni 2014

variasi data (SD) sebesar 0,667 .Kesalahan data pengukuran pada saat pengambilan data dengan pengukuran berulang, 65 % (kepercayaan) atau Ua sebesar 0,22.

Rata-rata yang diperoleh pengukuran suhu saat motor berputar 15 menit yaitu 55,56 dengan nilai koreksi atau selisih dari standart yang dinginkan sebesar 0,56. Sehingga error yang dihasilkan 0,01%. Penyimpangan nilai rata-rata dari tingkat variasi data (SD)sebesar 0,496. Kesalahan data pengukuran pada saat pengambilan data dengan pengukuran berulang, 65 % (kepercayaan) atau Ua sebesar 0,165.

Rata-rata yang diperoleh pengukuran suhu saat motor berputar 4 jam yaitu 55,78 dengan nilai koreksi atau selisih dari standart yang dinginkan sebesar 0,78. Sehingga error yang dihasilkan 1,418%. Penyimpangan nilai rata-rata dari tingkat variasi data (SD)sebesar 0,441.Kesalahan data pengukuran pada saat pengambilan data dengan pengukuran berulang, 65 % (kepercayaan) atau Ua sebesar 0,146.Dari data pengukuran rpm,suhu dan timer nilai errornya memiliki kurang dari 5% maka alat dapat digunakan.

Kelemahan/Kekurangan Sistem1. Pemanasan heater kurang maksimal karena penggunaan daya heater kurang besar sehingga mencapai suhu 55°C membutuhkan waktu lebih dari satu jam.2. Peletakkan sensor suhu tidak terletak di tengah chamber yang bergerak sehingga ada perbedaan suhu di chamber tepat dekat sensor dengan di tengah suhu chamber.3. Sistem kerja hanya bisa digunakan untuk inkubasi sekaligus shaker. Sehingga jika ingin melakukan proses inkubasi atau mencampur suatu larutan saja tidak bisa.4. Alat hanya bisa digunakan untuk dua setting timer, satu kecepatan, dan satu suhu, sehingga penggunaanya terbatas hanya untuk membantu proses lisis sel dan pencucian agarose plug.

PENUTUPKESIMPULANSecara menyeluruh penelitian ini dapat disimpulkan bahwa:1. Rangkaian power supply masih dapat

mensupply rangkaian dengan baik ketika beban resistansinya 9,8 ohm yang arusnya 1,75mV jika arusnya lebih dari itu maka terjadi drop tegangan pada power supply,.

2. Dapat dibuat rangkaian mikrokontroler untuk mengendalikan seluruh kerja alat dan menampilkan timer dan suhu sesuai program yang dibuat.

3. Berdasarkan hasil pengukuran rangkaian sensor suhu LM35 bekerja secara linier dan nilai error sebesar 1,63%.

4. Berdasarkan hasil pengukuran buzzer bekerja saat mikro memberi output 0-1,57 volt maka dari itu rangkaian driver buzzer dapat bekerja dengan baik.

5. Berdasarkan hasil pengukuran heater bekerja saat mikro memberi output 0-1,57 volt maka dari itu rangkaian driver heater dapat bekerja dengan baik.

6. Rangkain PWM dapat mengendalikan kecepatan motor sebesar 70 rpm selama 4 jam dengan error kecepatan motor 0,33%.

Setelah dilakukan uji fungsi serta pengukuran pada modul, didapat nilai error untuk suhu 55 oC saat motor berputar selama 4jam sebesar 1,82 %, saat motor berputar selama 15 menit sebesar 1,82 %.Timer 4 jam diperoleh sebesar 0,167 %, timer 15 menit diperoleh sebesar 0 %. Dan data kecepatan motor 70 rpm saat ada beban ketika berputar selama 15 menit diperoleh 0,14%, dan ketika motor berputar selama 4 jam diperoleh sebesar 0,33%maka alat memenuhi standart karena nilai error di bawah batas yang ditentukan yaitu 5%.

Seminar Tugas Akhir Juni 2014

Secara umum dapat disimpulkan bahwa alat ‘Shaker Waterbath’ dapat digunakan.

SARAN

Pengembangan penelitian ini dapat dilakukan dengan:1. Memperhitungkan daya heater

sehingga untuk mencapai suhu 55 derajat celcius lebih cepat

2. Memperhatikan dalam mendesain box secara rinci mulai peletakkan sensor, motor, rangkaian dan lain-lain.

3. Dapat menambah setting timer, rpm dan suhu agar alat ini bisa digunakan untuk membantu proses yang lain seperti fermentasi, homogenitas larutan, kimiawi, reaksi biokimia dan kerja enzim sehingga mempermudah pengguna melakukan penelitian.

4. Dapat dibuat 3 mode, mode 1 inkubasi digunakan untuk memanaskan sampel, mode 2 shaker digunakan untuk mencampur suatu larutan, dan mode 3inkubasi sekaligus dishaker digunakan untuk sampel yang membutuhkan inkubasi sekaligus pencampuran.

DAFTAR PUSTAKA

[1] Abdul Muhith Nasir, M.E Ideputri. 2011, Buku Ajar Metodologi Penelitian Kesehatan: Konsep Pembuatan Karya Tulis dan Thesis untuk Mahasiswa Kesehatan, Muha Medika, Yogyakarta.

[2] Cicik Wijayanti, 2012, Plate Shaker dengan Inkubasi BerbasisMikrokontroler At89s51, Tugas Akhir tidak diterbitkan, Prodi D-3 Teknik Elektromedik Poltekkes Kemenkes Surabaya, Surabaya.

[3] Eko Rudiawan, 2012, Belajar AVR –Sensor Interfacing–13,

http://ngooprek.com/club/blog/2012/03/19/belajar-avr-sensor-interfacing-, (diakses17 Desember 2013).

[4] Emi Endraswati, 2013, Autoclave, Oven,Watterbath, dan Inkubator, http://eendraswati.blogspot.com/autoclave-oven-watterbath-daninkubator.html, (diakses 29 September 2013).

[5] Muflih, 2011, Solid State Relayunhas.ac.id/tahir/BAHAN-KULIAH/ELIN/tugas-2011/Muflih/SSR.ppt, (diakses 31 April 2014).

[6] Mukhammad Irfan, 2011, Profil laboratorium patologi,entomologi dan mikrobiologi, http://www.fapertapetuin.com/images/download/ 07_Lab_PEM.pdf, (diakses 30 September, 2013).

[7] ---, 2011, Adc-10bit-Atmega8535-dan-LM35-dengan-Akuisi-Data-Temp, http://momogie.wordpress.com, (diakses 20 April 2014).

[8] ---, ---, Bab II Dasar Teori, elib.unikom.ac.id/.../jbptunikompp-gdl-indrapurna-26711-5-unikom_i, (diakses 31 september 2013).

[9] ---, 2010, Gearbox, http://teknisisampah.blogspot.com/2012/05/gearbox.html, (diakses 20 Desember 2013).

[10] ---, 2012, Mikrokontroler-Mcs51-Vs-Mikrokontroler-Avr, http://abuhirr.wordpress.com, (diakses 28 Mei 2014).

[11] ---, ---, Otomasi Kipas pada Ruangan Berbasis Mikrokontroler, https://www.eepis-

Seminar Tugas Akhir Juni 2014

its.edu/uploadta/downloadmk.php, (diakses 31 september 2013).

[12] ---, 2012, Penguat Penyangga (Penguat Tegangan) , http://elektronikadasar.web.id/teorielektronika/penguat-penyangga-pengikut-tegangan/, (diakses 24 Mei 2014).

[13] ---, 2009, Pulsed-Field Gel Electrophoresis(PFGE), http://www.foodsafetynews.com/2009/08/genetic-testing-1/#.UlgdtNKmir4.com, (diakses 29 September 2013).

[14] ---, 2013, Standard Operating Procedure for PulseNet PFGE of Clostridium botulinum, http://www.cdc.gov/pulsenet/PDF/c-botulinum- protocol-508c.pdf, (diakses 29 September 2013).