Colture cellulari

Prof. Diana Conte

Prof. Jean-François DESAPHY

Sezione di Farmacologia, Dipartimento Farmacobiologico

Facoltà di Farmacia, Università degli Studi di Bari Aldo Moro

Sezione di Farmacologia, Dipartimento Farmacobiologico

Facoltà di Farmacia, Università degli Studi di Bari Aldo Moro

Sistemi semplificati per mantenere in vitro (ex-vivo) cellule in vita

COLTURE CELLULARI

� Cellule procariotiche: batteri

� Cellule eucariotiche: cellule animali o vegetali

Norme di Sicurezza per l’uso delle

colture cellulari

Norme di Sicurezza per l’uso delle

colture cellulari

Es.

Cellule geneticamente modificate

Virus altamente infettivi

Cellule tumorali

COLTURE CELLULARI

�Studi di fenomeni biologici legati alla crescita, differenziamento, e morta cellulare

(cancerogenesi, apoptosi, …)

�Studi di genetica, della struttura e della funzione dei geni

�Studio dei meccanismi molecolari/cellulari coinvolti nelle funzioni cellulari

�Strumenti per la biologia molecolare (amplificazione genica, produzione/estrazione

di proteine …)

�Strumenti per test di tossicità (Test di AMES, …)

�Strumenti per la terapia

(Terapia cellulare, cellule staminali, terapia genica, rigenerazione tessutale,

produzione di farmaci biotecnologici)

Alcuni applicazioni

Alcuni vantaggi

COLTURE CELLULARI

Alcuni svantaggi

�Aspetto etico: permette di ridurre la sperimentazione animale o umana

�Standardizzazione facile, elevata riproducibilità dei risultati

�Semplificazione del sistema: meccanismi cellulari e molecolari

�Semplicità d’uso, costi limitati

�Semplificazione del sistema: limiti nell’applicazione del risultato in vivo

�Rischi di contaminazione richiedono attenzioni particolari e controllo qualità

con relativi costi

CONDIZIONI DI COLTURA

Riprodurre al meglio le condizioni fisico-chimiche di sopravivenza delle cellule:

�fabbisogno energetico: (nutrienti, minerali, ioni, aminoacidi, glucosio, vitamine …)

�pH, Temperatura, osmolarità

�Fattori di crescita per favorire la proliferazione cellulare

�Ormoni ed altre molecole indispensabili per mantenere funzioni cellulari specifiche

�Protezione

Terreni di coltura Strumenti di incubazione

AMBIENTE STERILE e CONTROLLATO

celllule

SUPPORTI PER COLTURE CELLULARI

�Fiasche o piastre di vetro o plastica

�Piastre con pozzetti

Supporti sterili

vetro a 150°C/autoclavato

plastica monouso sterile

Supporti aderenti trattati chimicamente

#

Coltura in sospensione

Permettono scambi gassosi

La scelta dipende dal tipo cellulare e dalla

quantità di cellule

Fiasche col tappo permettono il trasporto

al di fuori dell’ambiente sterile

Beuta per colture

di cellule

in sospensione

nell’incubatore

ad agitazione

Supporti per colture

di cellule adese

TERRENI DI COLTURA

TERRENI DI COLTURA

Osmolarità, normale funzione cellulare

Sistema tampone del pH: bicarbonate/CO2

Sintesi proteica, precursori metabolici

Precursori metabolici, numerosi funzioni cellulari

combustibile Antibiotici per la protezione

Indicatore colorato del pHgiallo acido

rosso a pH 7.4

viola basico

Fattori di crescita

Terreno di coltura

Siero

Antibiotici (streptomicina/penicillina)

Sistema filtrante: diametro dei pori 0.22 µm

INCUBATORI

Gli incubatori sono strumenti che permettono di mantenere costanti:

la temperatura (spesso 37°C)

varia in funzione del tipo cellulare e dell’organismo originario

la concentrazione in anidra carbonica CO2

l’atmosfera interno all’incubatore è composto da 5% CO2 / 95% aria

corrisponde alla pressione parziale di CO2 nei tessuti di mammiferi

permette di mantenere il pH a 7.4 con il bicarbonato

tasso di umidità saturo

CAPPA A FLUSSO LAMINARE VERTICALE

Tavolo da lavoro per la manipolazione delle

cellule, attrezzato da una cappa che

mantiene la sterilità dell’ambiente:

Filtro di lavoro HEPA

Filtro d’estrazione HEPA

FAN

aria contaminata

aria

sterileOperatore

camicie

guanti

mascherina

cell

High Efficiency Particulate Air

30%

70%

30%

Lampada UV

Accesa tra i periodi di attività

TIPI DI COLTURA CELLULARI

Colture primarie:

Cellule isolate dall’organismo

Conservano le proprietà funzionali delle cellule in vivo

Sopravivenza limitata a qualche ore

Colture secondarie:

derivano da colture primarie per divisione

Attività funzionale ridotta, de-differenziamento

vita limitata

Linee cellulari continue

cellule in continua proliferazione

cellule de-differenziate

proprietà pressoché costanti

durata illimitata

COLTURE CELLULARI PRIMARIE

Organismo (uomo, animale, pianta, embrione)

prelievo

tessuto (biopsia) o liquido

Dissezione (ferri)

Dissociazione

Selezione

Incubazione, Lieve agitazione

Enzimi proteolitici (tripsina, collagenasi …)

Chelanti del Ca2+

rottura della matrice extracellulare

distacco delle cellule

centrifugazione, gradienti di densità

adesione su uno substrato specifico

Cell sorter, microdissezione a laser

Coltura primaria

Isolamento,

frammentazione del tessuto

Microdissezione con laser

Fluorescent cell sorter

COLTURE CELLULARI SECONDARIE

La maggior parte delle cellule primarie possono

dividersi fino a raggiungimento della confluenza

(molte cellule tumorali e staminali vanno oltre)

Subcolture (passaggi)

Incubazione con tripsina-EDTA per qualche minuti

Agitazione meccanica

Ri-sospensione in medium di coltura

Semina

Colture secondarie

ESPRESSIONE DELLA TELOMERASI

Enzima che mantiene e stabilizza i telomeri, strutture che terminano i cromosomi

proteggendogli dalla degradazione progressiva che si verifica dopo ogni divisione

cellulare.

2008© J.F. DESAPHY

Dopo vari cicli di divisione, i telomeri di una cellula normale si consumano fino ad

impedire la replicazione del DNA. La cellula diventa senescente, perde la

capacita di dividersi.

Nelle cellule germinali, staminali, ed in numerosi cellule maligne, la sovra-

espressione della telomerasi mantiene i telomeri, permettendo la continua

divisione cellulare.

IMMORTALIZZAZIONE

LINEE CELLULARI CONTINUE

CONGELAMENTO / SCONGELAMENTO

�Le sub-colture di linee cellulari favoriscono l’insorgenza di mutagenesi spontanea ed

aberrazioni cromosomiche

�Il mantenimento di cellule in coltura costa e non serve durante periodi di inattività

� Il congelamento è necessario per - risparmiare spazio e costi

- limitare l’invecchiamento delle cellule

Incubazione con tripsin-EDTA

Ri-sospensione in un terreno specifico

(terreno di crescita, 30% siero, 1% DMSO)

Trasferimento in cryovials

Congelamento a -20°C

Conservazione a -180-190 °C

(azoto liquido o freezer)

Scongelamento rapido nel cryovial

(acqua calda del rubinetto)

Aggiunta di terreno di coltura

Centrifuga (1000 rpm, 5 min)

Semina

Eliminazione sovranatante

Ri-sospensione del pellet in terreno

Colture cellulari utilizzate nella Sezione di Farmacologia

Facoltà di Farmacia, Bari

Cellule muscolari scheletriche: test di tossicità

patch-clamp

citofluorescenza

Colture primarie

Cellule beta pancreatiche: patch-clamp

test di tossicità

Linee cellulari continue

HEK293 espressione eterologa di proteine

(human embryonic kidney cells) patch-clamp

test di tossicità

C2C12

(cellule satelliti muscolari murine) test di tossicità

patch-clamp

SH-SY5Y

(cellule di neuroblastoma umano) test di tossicità

patch-clamp

ESPRESSIONE ETEROLOGA DI PROTEINE

Permette di fare esprimere ad una linea cellulare la proteina che si vuole studiare

attraverso il trasferimento del gene codificante la proteina (trasfezione genica).

Cellule al 70% di confluenza

Plasmide contenente il cDNA

codificante la proteina

Incubazione

per qualche ore

Dopo 24 ore, le cellule

esprimono la proteina.

Dopo 3-4 giorni,

l’espressione cessa.

Trasfezione transitoriaIl gene penetra in cellula

ma non si integra nel genoma

Incubazione con antibiotico

Solo le cellule esprimenti

il gene di resistenza sopravvivono

Gene di resistenza ad un antibiotico

Selezione clonale

Isolamento di un clone

Il clone deriva

da una cellula unica.

Sono tutte uguali

alla cellula madre,

Esprimono tutte la proteina

Trasfezione

permanenteIl gene si è integrato

nel genoma della cellula

•• TrasfezioneTrasfezione mediante mediante DEAEDEAE--destranodestrano

•• TrasfezioneTrasfezione mediante calciomediante calcio--fosfatofosfato (il DNA penetra nel citoplasma (il DNA penetra nel citoplasma

per endocitosi e viene trasferito al nucleo)per endocitosi e viene trasferito al nucleo)

•• ElettroporazioneElettroporazione (impulsi elettrici ad alto voltaggio portano alla (impulsi elettrici ad alto voltaggio portano alla

formazione di pori in formazione di pori in nmnm nella membrana plasmatica che permettono nella membrana plasmatica che permettono

ll’’ingresso del DNA)ingresso del DNA)

•• TrasfezioneTrasfezione mediante liposomimediante liposomi (DNA ed RNA incapsulato in (DNA ed RNA incapsulato in

liposomi entrano nella membrana cellulare in seguito a fusione dliposomi entrano nella membrana cellulare in seguito a fusione delle elle

membrane)membrane)

•• Microiniezione Microiniezione (trasferimento diretto in vitro),(trasferimento diretto in vitro), bombardamento con bombardamento con

particelle metalliche microscopiche rivestite di DNA particelle metalliche microscopiche rivestite di DNA (in vivo)(in vivo)

•• Trasduzione Trasduzione impaccamento del DNA allimpaccamento del DNA all’’interno dei virus animaliinterno dei virus animali

ESPRESSIONE ETEROLOGA DI PROTEINE

Alcuni metodi di trasfezione

ESPRESSIONE ETEROLOGA DI CANALI IONICI

La linea cellulare non deve esprimere canali ionici endogeni simili al canale trasfettato

Permette di studiare canali ionici umani o animali, senza ricorrere a biopsie

Permette di studiare canali mutati (fabbricati in vitro mediante mutagenesi):

mutazioni “naturali”, responsabili di malattia nell’uomo:

cosa determina la mutazione ? (relazione genotipo/fenotipo)

la mutazione modifica l’azione dei farmaci ? (farmacogenetica)

mutazioni “non naturali”: come funziona il canale ? (biofisica molecolare)

come viene modulata ? (fisiologia)

dove si lega il farmaco ? (farmacologia molecolare)

nucleo

SINTESI PROTEICAPLASMIDE

gene reporter

gene del canaleCanali ionici

recettore di membrana

proteina fluorescente

Permette di individuare facilmente

sotto microscopio le cellule trasfettate

nucleo

SINTESI PROTEICAPLASMIDE

gene reporter

gene del canaleCanali ionici

recettore di membrana

proteina fluorescente

Permette di individuare facilmente

sotto microscopio le cellule trasfettate

FINE