Sequenciamento de ultima geracao na identificacao de inversoes e translocacoes
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Sequenciamento de última geração na identificação de inversões e translocações
Ana Barbara MouraCristiana Fuchs
Jessyca SouzaKellyanne Rangel
Patrícia Alves
Universidade Católica de BrasíliaCitogenéticaProf. Dr. Rinaldo Wellerson Pereira
Pró-Reitoria de Graduação
Principais variações cromossômicas (SNPs e SVs)
O genoma humano possui um diversificado leque de variações genômicas
SNPs - Polimorfismos de um único nucleotídeo
1998 - Um único par de bases do DNA. Um nucleotídeo é trocado por outro
qualquer.
Modificações em Éxons ou Íntrons
SNPs silenciosos – substituições sinônimas de códons
Não alteram a composição de aminoácidos da proteína resultante
Marcadores moleculares de predisposição do indivíduo a certos tipos de doenças dentre elas o
câncer, ou ainda como alvos terapêuticos no desenvolvimento de novas drogas
SVs - variações estruturais como inserções e deleções, rearranjos que podem ser
inversões e translocações
Mediadores de doenças e suscetibilidade a doenças que podem ser sistematicamente comparadas
O banco de dados de variantes genômicas (DGV)
Ferramentas de suporte para auxiliar técnicas moleculares e geneticistas, assim com diagnósticos
Armazena as sequências de ácidos nucleicos e
aminoácidos com suas anotações e algoritmos para
posterior análise desses dados 60.000 CNVs, 850 e 30 000
inversões identificado em indivíduos saudáveis.
Estudos de associação da doença genômica do câncer e
estudos evolutivos.
URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html
Metodologias de sequenciamento
Pirosequenciamento – Método rápido
O nucleotídeo adicionado a fita crescente de DNA é detectado diretamente
pela liberação e transformação de uma pirofosfato.
Quimiluminescência detectada
Roche diagnostic, Genome Sequencer 20 System
Cascata com a polimerização do DNA – liberação do ppi
taq polimerase
ppi é convertido em ATP
ATP sulfurilase
ATP fornece energia
Luciferase
Oxida Luciferina que emite luz
Próxima geração de sequenciamento (NGS)
Tecnologias de sequenciamento de nova geração
Sequenciamento de DNA em plataformas capazes de gerar informação sobre milhões de pares de bases em uma única corrida.Plataforma 454 FLX da Roche - combinação de reações enzimáticas com liberação de um pirofosfato, oriundo da adição de um desoxinucleotídeo à cadeia 250pb
Câmera CCD (charge-coupled device) acoplada ao sistema Solexa da Illumina - síntese usando DNA polimerase e nucleotídeos terminadores marcados com diferentes fluoróforos.
Clonagem in vitro dos fragmentos em uma plataforma sólida de vidro (PCR)Applied Biosystems (SOLiD Syste) - catalisada por uma DNA ligase. fragmentado em um sonicador em fragmentos de 60- 90pb, para as bibliotecas de tags únicas.
Alta eficiência e sensibilidade da plataforma analisa 320 amostras
Pirosequenciamento – Método rápido
Solexa da Illumina
Applied Biosystems (SOLiD Syste)
Como surgiu a próxima geração de sequenciamento (NGS)
Possibilidade a descoberta de variações estruturais na população humana
Expandir a base de dados destas variações para
ajudar a compreender os fatores genéticos atrás das várias
doenças.
Fornece novas tecnologias de sequenciamento de
alta cobertura, utilizando uma resolução muito maior.
Ampliação clonal é realizada por métodos baseados
em PCR, em vez de transformação bacteriana.
Metodologias NGS
Algoritmos baseados em densidade tag
Emparelhamento com o fim de
mapeamento (PEM)
Profundidade em cobertura (DOC)
Algoritmos baseados em densidade tag
A maioria dos algoritmos baseados em densidade tag supõem que a sequência de leituras finais são únicas, embora também possam ser aplicados a dados de pareamento final.
A estratégia geral destes algoritmos é a busca de regiões genômicas cuja marca de contagens são significativamente diferentes.
No entanto, estes algoritmos geralmente só conseguem detectar a dosagem de alteração de variações estruturais como indels e CNVs e não pode detectar variações estruturais de dosagem invariável, tais como inversões e translocaçõesdas contagens esperadas.
Emparelhamento com o fim de mapeamento (PEM)Emparelhamento no fim do mapeamento (PEM) são
técnicas baseadas na mineração de pares que têm sido usadas com sucesso para descobrir variantes estruturais, incluindo eventos de cópias invariáveis, em uma resolução muito maior do que os métodos baseados em arranjos.
As vantagens dos métodos baseados em PEM incluem a capacidade de detectar variações estruturais com dosagem invariável, maior sensibilidade para detectar menores variações estruturais, e a precisão da localização do ponto de interrupção.
Mas estes algoritmos têm poder limitado em detectar variações maiores que o tamanho de inserção.
Profundidade em cobertura (DOC)
A alta cobertura da próxima geração de sequenciamento permite identificar um tipo completamente diferente de assinatura, baseado na profundidade da cobertura (DOC).
Em contraste com a maioria das assinaturas PEM, assinaturas DOC pode ser usado para detectar grandes eventos, na verdade, o evento maior, mais forte é a assinatura.
No entanto, eles não são capazes de identificar pequenos eventos que as assinaturas PEM, mesmo com baixa cobertura, são capazes de detectar, pois eles também são muito mais pobres em localizar pontos de interrupção.
Aplicações das novas metodologia
Análise genômicaDetecções de SNPs, SVs Detecção de mutaçõesGenotipagem Identificação genética microbiana Ciências
forensesAnálise filogenética
CONCLUSÃOEm particular, quase metade do genoma humano consiste de
sequências repetitivas, mas as leituras das regiões ricas em repetir que alinham em vários locais são tipicamente ignorados.
Em vez de ignorar as leituras com alinhamentos múltiplos, é possível criar vários modelos para atribuir uma posição 'melhor' para essas leituras e usá-los para a descoberta de variações estruturais.
Por isso surgiu às novas metodologias de sequenciamento.
A medida que o conhecimento evoluiu, houve a necessidade de a tecnologia usada se adaptar á descoberta de translocações e inversões antes ignoradas.
A próxima geração de sequenciamento de demonstra promissora no estudo de genomas desconhecidos e na descoberta de atividades desconhecidas no genoma conhecido como o genoma humano.
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• 10 Bancos de Dados de Genomas. Luiz Fernando Bessa Seibel, Melissa Lemos e Sérgio Lifschit. Departamento de Informática Pontifícia Universidade Católica do Rio de Janeiro.
• 11 http://www.ibb.unesp.br/extensao/acidos_nucleicos/material_didatico/12_sequenciamento_DNA_metodos_e_principios.pdf