Separação Cromatografica

Docente: João Salvador FernandesLab. de Tecnologia Electroquímica

Pavilhão de Minas, 2º AndarExt. 1964

2João Salvador – IST 2006

Separação Cromatográfica

envolve interacções entre um soluto numa fase móvel (eluente) e um leito fixo, constituído por uma matriz com ligandos que apresentam especial afinidade pelo soluto

a separação dos diversos componentes é feita com base nas diferentes afinidades dos solutos com o leito fixo

é também muito importante a razão entre as afinidades do eluente e dos solutos pelo leito fixo

quanto maior a afinidade de um dado soluto, maior será o seu tempo de retenção

neste caso utiliza-se uma resina (Q-Sepharose), constituída por agarose com ligandos de amina quaternária (com um N+) e temos apenas um soluto, o vermelho de fenol que, em meio alcalino (NaOH 1M = eluente) se apresenta vermelho e com duas cargas negativas.

3João Salvador – IST 2006

Bases Teóricas

Teoria do Movimento do SolutoPermite relacionar a velocidade média do soluto uu com a velocidade superficial vvss (vvss = = QQvv/A /A )

( ) ( )( ) CqKvu

spedpee

s

∆∆−−+−+=

.11..1 ρεεεεεem que εεee é a porosidade interparticular média (fracção de vazios entre partículas), εεpp é a porosidade intraparticular média (fracção de vazios dentro das partículas), KKdd é a fracção de poros acessível a um dado soluto, ∆∆qq é a quantidade de soluto adsorvido e ∆∆CC é a variação de concentração (ρρss é usada como correcção dimensional às unidades de ∆q e ∆C)

Por seu lado, uu está relacionada com o tempo de residência tempo de residência ttrr e com o comprimento da coluna L:

uLtr =

Pode, assim, calcularPode, assim, calcular--se o tempo de retense o tempo de retençção de um soluto com isotão de um soluto com isotéérmica rmica conhecidaconhecida

4João Salvador – IST 2006

Bases Teóricas

Equação de Van DeemterA altura equivalente a um prato teórico (HETP) é dada como a soma da contribuição dos três mecanismos responsáveis pelos efeitos de dispersão:

ii

vCvBAHETP ++=

A – Termo de difusão turbulenta (diferentes caminhos de escoamento)B – Termo de difusão longitudinal (“para a frente” ou “para trás”)C – Termo de transferência de massa (atraso devido à interacção com a fase estacionária)

Deve existir uma velocidade Deve existir uma velocidade óóptima que minimiza os efeitos ptima que minimiza os efeitos dos 3 mecanismos de dispersãodos 3 mecanismos de dispersão

5João Salvador – IST 2006

Bases Teóricas

Dispersão AxialDa análise dos efeitos da dispersão axial, obtém-se a seguinte equação para a concentração em soluto à saída da coluna:

( )⎥⎦

⎤⎢⎣

⎡ −−= 2

2'0

2exp

2 r

r

tttN

NCCπ

em que o primeiro factor multiplicativo corresponde à concentração máxima verificada, NN é o número de pratos teóricos da coluna e ttrr o tempo de retenção do soluto

ÉÉ notnotóória a semelhanria a semelhançça com a equaa com a equaçção de uma ão de uma gaussianagaussiana::

( ) ( )⎥⎦

⎤⎢⎣

⎡ −−= 2

2

max 2exp

σµxfxf

onde µµ é o valor médio e σσ o desvio padrão da distribuição

6João Salvador – IST 2006

Trabalho Laboratorial

Montagem a utilizar

7João Salvador – IST 2006

Trabalho Laboratorial

ProcedimentoTrabalhando a um dado caudal de eluente, injecta-se uma amostra de soluto e recolhem-se, durante um dado intervalo de tempo, amostras à saída da coluna;

fazem-se medidas para vários caudais de eluente

para cada caudal, mede-se o perfil de concentração do vermelho de fenol, que deverá apresentar-se como uma normal

a concentração é obtida por medidas de absorvância

para normalizar os perfis, representa-se A/Amax ( e não apenas A)

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Tratamento dos Resultados

0

1

t

A/Am

ax

Obtêm-se cromatogramas com andamento gaussiano (correspondente ao modelo de dispersão axial):

o tempo de retenção (tr) será dado como o tempo necessário para se atingir o máximo da curva

uma vez obtidos os 4 cromatogramas(para 4 diferentes caudais de eluente e, assim, 4 diferentes velocidades), pode fazer-se uma representação de tr em função de L/vs (c/ vs=Q/A) que deveráser linear, concluindo-se que para maiores velocidades se têm tempos de retenção menores (verificação da teoriado movimento do soluto)

tr

L/v

9João Salvador – IST 2006

Tratamento dos Resultados

um dos objectivos do trabalho é obter o nºde pratos teóricos da coluna, através de uma das expressões que relacionam N com tr e com a largura (W ou W1/2) do cromatograma

atendendo a que numa gaussiana se tem:

( ) ( )⎥⎦

⎤⎢⎣

⎡ −−= 2

2

max 2exp

σµxfxf

e que, neste caso, representando A/Amax:( )

⎥⎦

⎤⎢⎣

⎡ −−= 2

2

max 2exp/

r

r

tttNAA

então:

( )2σσ

µ

rr

r

tNNt

t

=⇒=

=

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Tratamento dos Resultados

a medida de σ é difícil de obter; uma forma é considerar a largura da banda, mas esta, em teoria, seria infinita

sabe-se, no entanto, que na gama de valores [µ-2σ,µ+2σ] se encontram 95.2% das probabilidades, o que corresponde a uma largura W=4σ.

( )

2

2

2

164

⎟⎠⎞

⎜⎝⎛==Wt

WtN rr

neste caso tem-se:

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Tratamento dos Resultados

Mesmo assim, obtenção de W continua a ser difícil. Uma forma mais simples resulta do conceito de largura a meia altura (W1/2) que, através de cálculos de probabilidades, se verifica estar relacionada da forma:

2

21

54.5 ⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛=

WtN r

que resulta de:

( ) ( )

2

21

2

21

2

21

2

221

max

54.5355.2

355.21774.121774.1

5.0ln215.0)( 2

2

⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛=⎟

⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛=⎟

⎠⎞

⎜⎝⎛=

=×=⇒±=

=−

−⇒==−

−

Wt

WttN

Wx

xefxf

rrr

x

σ

σσσµσµσ

µ

12João Salvador – IST 2006

Tratamento dos Resultados

Finalmente, o HETP obtém-se como L/NL/N (emque L é o comprimento do leito cromatográfico)

terá uma representação linear em função davelocidade (maiores velocidades ⇒ maioresHETP ⇒ colunas menos eficientes), de acordocom a eq. de Van Deemter.

vi

HETP