Seminarios en Biotecnología y

Bioseguridad de OGMs

Agro-infiltración (expresión transitoria por

transformación de Agrobacterium)

Dra. Rocío Díaz de la Garza

ITESM

14 de noviembre de 2014

10:00 a 12:00 Hrs

Agro-infiltración

(expresión transitoria por transformación de Agrobacterium)

TRANSFORMACIÓN ESTABLE vs

TRANSITORIA EN PLANTAS UNA TRANSFORMACIÓN ESTABLE SIGNIFICA QUE ES HEREDABLE PARA QUE ESTO SUCEDA, EL ADN FORÁNEO DEBE DE INTEGRARSE AL GENOMA NUCLEAR O AL DEL CLOROPLASTO DE LAS CÉLULAS GERMINALES EN UNA TRANSFORMACIÓN TRANSITORIA EL ADN FORÁNEO NO SE INTEGRA AL GENOMA DE LA CÉLULA EN TODOS SUS TEJIDOS (ÓVULOS O POLEN)

¿PARA QUÉ TRANSFORMACIÓN TRANSITORIA

EN PLANTAS?

A. ADN (ácido desoxirribonucleico)

B. mARN (ácido ribonuleico mensajero)

C. tARN (transferencia) D. Ribosoma E. Proteína

TRANSCRIPCIÓN

TRADUCCIÓN

Las proteínas pueden ser estructurales o pueden ser enzimas (catalizadores biológicos) que generen compuestos de interés

DOGMA CENTRAL DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR

¿PARA QUÉ TRANSFORMACIÓN

TRANSITORIA EN PLANTAS?

Aún si el ADN no se integra al núcleo en todos los tejidos, éste puede leerse para generar proteínas de interés en la célula vegetal por un corto tiempo Estas proteínas por lo general son de alto valor (farmacia) También esta transformación es muy rápida (toma días expresar una proteína) y en el laboratorio es una técnica muy útil para estudiar múltiples aspectos de la biología vegetal desde el punto de vista científico

TRANSCRIPCIÓN

TRADUCCIÓN

TRANSFORMACIÓN VEGETAL

• DOS TÉCNICAS BÁSICAS

– AGROBACTERIUM (TUMEFACIENS o RHIZOGENES) • Transfiere el ADN a la célula vegetal y puede dar

transformantes estables o transientes dependiendo del método de transformación

– BIOBALÍSTICA • Utiliza micropartículas de oro o tugnsteno cubiertas

de ADN y las dispara al tejido vegetal • Genera transformantes estables cuando el ADN se

incorpora al genoma del núcleo o cloroplasto de la célula

AGROBACTERIUM TUMEFACIENS

• Bacteria fitopatógena que se encuentra usualmente en suelos y causa la enfermedad conocida como agalla de corona en las plantas

• Esta bacteria tiene la habilidad de transferir genes a las plantas para que éstas produzcan metabolitos que benefician a la bacteria

Agrobacterium tumefaciens

Agalla de corona

TRANSFERENCIA DE ADN DEL

AGROBACTERIUM A LA PLANTA

Los genes que normalmente transfiere son para que la planta genere compuestos que sirven de alimento al Agrobacterium y además genes que ocasionan un crecimiento indeterminado de la célula vegetal

USO DEL AGROBACTERIUM EN

BIOTECNOLOGÍA VEGETAL

Estos genes de la bacteria se cambian

por los de interés

Ti = Tumor- inducing plasmid

Así, el Agrobacterium le puede transferir a la célula vegetal genes de cualquier origen (vegetal, animal, bacteriano, etc.)

¿Cómo se genera una transformación

estable?

• A través de cultivo de tejidos in vitro – Se infectan tejidos de la planta con el Agrobacterium que

contiene nuestro gen de interés y otro de resistencia a un herbicida/antibiótico

– Se cultivan los tejidos in vitro y se induce la formación de una planta con el uso de fitohormonas

Planta resistente al herbicida/antibiótico Alta posibilidad de que esté transformada de manera estable (sus semillas serán transgénicas y generarán plantas transformadas también)

¿Cómo se genera una transformación

transitoria?

• También se utiliza Agrobacterium

• Pero no hay regeneración de una planta completa

• Se realiza por medio de infiltración del Agrobacterium a la célula vegetal

• Usualmente se utilizan vectores virales para tener más proteína acumulada en los tejidos de la planta

Chen et al., Adv Tech Biol Med 2013

USO DE VECTORES VIRALES

Las primeras transformaciones transitorias tomaron ventaja de la capacidad de los virus de viajar a través de la planta (movimiento sistémico) para que así se expresara el transgén en la planta entera

Gleba et al., Cur Op Plant Biotech 2007

COMPOSICIÓN GENÉTICA DE UN

VECTOR DE VIRUS COMPLETO

VIRUS DEL MOSAICO DEL TABACO (TMV siglas en inglés)

Vectores basados en el virus P - Promotor TMV Pol – RNA- dependiente RNA polimerasa para la producción del mensajero MP – Proteína de mobilidad GOI – Gen de interés CP – Proteína de la cápside T - terminador

Gleba et al, Cur Op Plant Biol 2004

Nota: estos virus utilizados son fitopatógenos, es decir no representan ningún riesgo para la salud

humana, sólo infectan plantas

TIENE LA CAPACIDAD DE REPLICARSE EN LA PLANTA Y FORMAR

PARTÍCULAS VIRALES

VECTORES VIRALES

• Las plantas se infectan ya desarrolladas con virus que expresan nuestro gen de interés

• Los virus se pueden mover sistémicamente a través de la planta – Se infecta una célula

vegetal

– El virus se mueve de célula a célula a través del plasmodesmata (canales de comunicación que existen en células vegetales)

Zhang et al., Plant Methods 2013

Virus del mosaico del narciso utilizado como vector para producir

antocianinas

VECTORES VIRALES

“DECONSTRUIDOS”

• La desventaja de utilizar virus completos es que la planta emplea muchos recursos en sintetizar las proteínas de la cápside viral

• Así, se empezaron a modificar estos vectores para que ya no la expresaran

Gleba et al, Cur Op Plant Biol 2004

X X

VECTORES VIRALES “DECONSTRUIDOS”

Marillonnet et al., Nat Biotech 2005

Aumentos en eficiencia de

transfección y en los niveles de expresión de la proteína verde fluorescente (GFP)

Marillonnet et al., Nat Biotech 2005

Además se han hecho otros cambios en la secuencia de los vectores para que tuviera mejor expresión de los genes en la célula vegetal

VECTORES DECONSTRUIDOS

PARA INFILTRACIÓN • magnICON® - Vectores producidos por Icon Genetics

(compañía alemana). Son los más utilizados para las “magninfecciones” con Agrobacterium. Este sistema está basado en el virus del mosaico del tabaco (TMV) y el virus X de la papa

• Sistema de replicación de ADN geminiviral. Está basado en el virus del mosaico enano amarillo del frijol (BeYDV)

• Sistema de replicación basado en el virus del mosaico del caupí (CPMV)

Vectores virales

deconstruídos

Chung et al., 2005

Estas mejoras han dado como resultado que se necesite menos concentración de Agrobacterium para infectar con mayor eficiencia la planta y una mayor expresión de las proteínas de interés

Más células transfectadas

DIFERENCIAS EN EXPRESIÓN DE VECTORES

VIRALES COMPLETOS Y DECONSTRUIDOS

Las partículas virales completas viajan a través del floema de la planta hacia tejidos jóvenes

Infectando con Agrobacterium que contiene los vectores deconstruidos (que inclujyen una proteína de movilidad), en una semana se cubre casi toda la superficie foliar

Gleba et al., Cur Op Plant Biotech 2007

AGROINFILTRACIÓN

Chen et al., Adv Tech Biol Med 2013

A nivel laboratorio se puede hacer con una jeringa A. Primero se realiza una pequeña herida en el envés de la hoja (en la figura

se muestran hojas de Nicotiana benthamiana de plantas de 6 semanas) B. Luego se agrega la solución del Agrobacterium tumefaciens ya

modificado con el vector viral y el gen de interés utilizando una jeringa sin aguja a través de la herida en los espacios intracelulares de la hoja

AGROINFILTRACIÓN DE PLANTA COMPLETA

UTILIZANDO VACÍO

Loh&Wayah, Asian Journal of Biotechnology, 2014

La aplicación del vacío fuerza la formación burbujas de aire fuera de los estomas, entonces cuando se libera, entra con mayor facilidad del Agrobacterium por los estomas (orificios en las plantas en donde se realiza el intercambio de gases)

Al sumergir toda la planta en una solución diluida del Agrobacterium, y aplicar vacío se busca que entren miles de células en todas las

hojas de la planta

EXPRESIÓN DE PROTEÍNA

FLUORESCENTE DESPUÉS DE

LA AGROINFILTRACIÓN

JERINGA

VACÍO

ASPERJADO DE SOLUCIÓN DE

AGROBACTERIUM

Chen et al., Adv Tech Biol Med 2013

ESCALAMIENTO

Gleba et al., Cur Op Plant Biotech 2007

COMPAÑÍAS PRODUCTORAS DE PROTEÍNAS

RECOMBINANTES EN PLANTAS

Produce vacunas y proteínas terapéuticas en plantas a través de la expresión transiente Prueba clínica fase II en vacuna contra la influenza H5N1 Va a empezar fase II en vacuna tetravalente contra H1N1, H3N2 y dos influenzas B

http://www.medicago.com/English/Technologies/medicago-technologies/default.aspx

COMPAÑÍAS

Chen et al., Adv Tech Biol Med 2013

ZMAPP – COCTEL DE ANTICUERPOS

MONOCLONALES CONTRA EL ÉBOLA PROTEÍNAS TERAPÉUTICAS DISEÑADAS POR MAPP BIOPHARMACEUTICAL, COMPAÑÍA QUE CONTRATÓ A KENTUCKY BIOPROCESSING PARA PRODUCIRLAS EN PLANTAS DE TABACO TRANSFORMADAS DE FORMA TRANSIENTE COMO RESPUESTA AL CONTAGIO DE TRABAJADORES ESTADOUNIDENSES Y ESPAÑOLES EN AFRICA, SE LES PROPORCIONÓ EL SUERO EXPERIMENTAL COMO TRATAMIENTO

OTRAS VACUNAS

Y PROTEÍNAS

TERAPÉUTICAS EN

DESARROLLO

Gleba et al., Curr Topics in Microbiology & Immunology 2013

ENSAYOS PRECLÍNICOS DE PROTEÍNAS GENERADAS EN

PLANTAS AGROINFILTRADAS CON VECTORES VIRALES

Gleba et al., Curr Topics in Microbiology & Immunology 2013

VENTAJAS DE LA PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS

TERAPÉUTICAS EN PLANTAS vs. CÉLULAS DE MAMÍFERO

COSTOS DE PRODUCCIÓN RENDIMIENTO RAPIDEZ EN EXPRESIÓN RAPIDEZ EN MANUFACTURA

Sistema de expresión Tiempo para obtener miligramos de anticuerpo

Tiempo para obtener gramos de anticuerpo

Cultivo de células de mamífero

2-6 meses 6-12 meses

Animales transgénicos > 12 meses > 12 meses

Plantas transgénicas estables

12 meses > 24 meses

Magnifection (expresión transitoria con magnICON®)

14 días 14-20 días *datos traducidos de PNAS 2006, 103:14645

AGROSPRAY

• Tecnología desarrollada por Nomad Bioscience GmbH, donde se asperja Agrobacterium con surfactantes (detergentes)

• Esta tecnología está en etapas tempranas, pero tiene gran potencial en agricultura y manufactura de biomateriales

• En agricultura se podría “reprogramar” transitoriamente un cultivo para ser resistente a plagas, a estrés abiótico o mejorar la producción de compuestos

• Las plantas no serían transgénicas y sólo se tendría que comprar el producto a asperjar

Chen et al., Adv Tech Biol Med 2013

Esta técnica de transformación transitoria está desarrollándose y representa un potencial para mejorar cultivos en

invernadero o en el campo. Se tendría que crear un marco regulatorio para liberar Agrobacterium transformado (en el

caso de asperjar en campo)

REGULACIÓN

• Todavía no existe un producto de expresión transitoria de plantas aprobado por alguna agencia regulatoria

• Hay discusiones preliminares en cómo regular estas plantas modificadas para su expresión transitoria y cómo manejar los productos de éstas

• Aun no existen guías claras sobre su regulación

• La agroinfiltración está considerada como una técnica nueva de mejoramiento vegetal en la mayoría de los foros

TALLER DE REGULACIÓN ORGANIZADO POR LA UNIÓN

EUROPEA 2012 (JRC- Joined Research Center)

PARTICIPARON DELEGACIONES DE ARGENTINA, AUSTRALIA, CANADÁ, JAPÓN, ESTADOS UNIDOS Y SUDÁFRICA

DEFINICIÓN - FAO

DINAMARCA

Agroinfiltración de flores: Puede llegar a

dar plantas transformadas

• Se utiliza en el laboratorio muy comunmente para transformar Arabidopsis, la planta modelo

• En otras plantas es difícil utilizar esta técnica

• Se transforman células germinales y las semillas pueden llevar el transgén

Arabidopsis thaliana — photo by Vijay Singh

Procedimiento

Zang et al., Nat Protocols 2006

Se sumergen las plantas con inflorescencias en medio con Agrobacterium diluido (se puede aplicar vacío) Se dejan desarrollar y se colectan las semillas Además del transgén de interés se añade un gen de resistencia para poder seleccionar las semillas transgénicas, que son las que germinan y sobreviven No son necesarios los vectores virales

CONCLUSIONES

La transformación transitoria de plantas con vectores de base viral es capaz de producir proteínas de alto valor en grandes cantidades y en corto tiempo

En Norteamérica y Europa se han logrado desarrollos pre-comerciales importantes, los cuales incluyen pruebas de proteínas terapéuticas y vacunas en humanos en fase I

La tecnología está a poco tiempo de tener productos aprobados por las agencias regulatorias

Variantes de la transformación transitoria por agroinfiltración se están probando para mejorar agronómicamente plantas bajo cultivo protegido y en campo abierto

Es necesario un marco regulatorio basado en un análisis de bioseguridad que permita el desarrollo de estas tecnologías en el país

¡Gracias!