Equipamiento para cultivos celulares y Equipamiento para cultivos celulares y sus aplicaciones en investigación sus aplicaciones en investigación

médicamédica

Dra. Cristina TouriñoDepto. Básico de Medicina

SEMINARIO DE INGENEIRÍA BIOMÉDICA 20115 DE ABRIL DE 2011

C. Touriño - 2011

Cultivos celulares

• Tipos celulares• Biología del

cultivo

¿Qué podemos cultivar?

¿Donde?¿Como?

¿Problemas?• Contaminación• Bioseguridad

• Laboratorio/Equipos• Técnicas de

manipulación

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Un poco de historia…

Roux (1885) - embrión de pollo en solución salina Harrison (1907) - médula espinal embrionaria de anfibios Burrows y Carrel (1910) - plasma de pollo para explantes Rous y Jones (1916) - tripsina en disociación tisular

…. Los cultivos como una mezcla de arte y ciencia

Años 40 : ANTIBIÓTICOS

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… los antibióticos y el avance técnico permiten grandes avances en la tecnología del cultivo celular...

1948 Earle y col.- línea celular L 1952 Gry y col. - primera linea celular continua HeLa 1954 Levi-Montalcini -factor de crecimiento nervioso* 1955 Eagle - definición de requerimientos nutricionales 1961 Hayflick - empleo de antibióticos anti-microbianos 1965 Ham - medio libre de suero 1969 Augusti / Sacco - linea neurobl., lineas diferenc. 1975 Kohler /Milstein - anticuerpos monoclonales* 1976 Sato - requerimientos hormonales de los cultivo...

… que son la base de la técnica de cultivo celular actual

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APLICACIONES

Virología: cultivo de virus, vacunas Investigación del cáncer Inmunología (ACMo) Genética (análisis genómico) Ingeniería de proteínas (IFN, Insulina, etc) Estudio de interacción y señalización celular Aplicaciones diagnósticas (citogenética) Farmacología (toxicidad a drogas) Terapéuticas (terapia celular, trasplante, medicina regenerativa) Aplicaciones industriales y agronómicas Otras

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DEFINICIÓN

Conjunto de métodos y técnicas,

Mantenimiento in vitro de células (animales y vegetales) -> tejidos u órganos,

Preservando y manteniendo sus propiedades fisiológicas, metabólicas y genéticas.

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VALIDEZ como modelo de función fisiológica in vivo:

CRITICA: – < relación célula-célula– interacción matriz-célula alterado -> biomateriales

Falta de estructura tridimencional Medio hormonal y nutricional alterado

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CULTIVO CELULAR vs MODELO ANIMAL

control preciso y fino del medio ambiente caracterización y homogeneidad de la muestra economía (de producto, de tejido,…) motivaciones éticas

manipulación especial (contaminación/asepsia) cantidad / costo económico inestabilidad (identificar pasaje) validez del modelo in vitro

Ventajas

Desventajas

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CLASIFICACION

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OBTENCIÓN DE UN CULTIVO

Disgregación enzimáticaDisgregación mecánica

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CLASIFICACION CULTIVOS CELULARES

Cultivos primarios– Directamente de tejido animal o celular

Cultivos extendidos– Multipasajes -> Estirpe o línea celular -> finito

Cultivos establecidos– Transformado (Línea celular continua)

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Evolución hipotética de un cultivo celular

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CLASIFICACIÓN

• Adherentes o en monocapa• En suspensión

• Medios líquidos• Medios semisólidos• Superficies tratadas• Soportes especiales• Feeder layers

por capacidad de anclaje (adherencia)

por medio de soporte

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Curvas de proliferación

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Secuencia de desadhesión (tripsinización) de fibroblastos dérmicos humanos mantenidos como línea primaria. Las primeras imágenes se han obtenido cada 2 segundos .

Tiempo transcurrido: 2 mn

Disgregación enzimática

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Ejemplos de

cultivos celulares

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Aislamiento del epitelio de la conjuntiva humano

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Aislamiento fibroblastos esclerales humanos

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Aislamiento del epitelio pigmentario de la retina humana

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Aislamiento de células endoteliales de la aorta bovina

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Cultivo de células endoteliales de la aorta bovina

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Cultivo de células endoteliales de cordón umbilical

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Cultivo de células de piel humana

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Cultivo de hepatocitos de rata

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Cultivo de precursores mesenquimales de tejido adiposo humano

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Células estromales mesenquimales (MSC)

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CFU-GM D14CFU-GM D14

CFU-Geo D18CFU-Geo D18

CFU-M D14CFU-M D14

CFU-E D10CFU-E D10

BFU-Em D16BFU-Em D16BFU-Em D14BFU-Em D14

BFU-Ei D18BFU-Ei D18BFU-Ei D17BFU-Ei D17

Células hematopoyéticas: CFC o CFU

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1. El ambiente (Bioseguridad)- Laboratorio - Equipos

2. El medio de cultivo- Fase sólida- Fase gaseosa- Fase líquida/semisólida

3. Técnicas de cultivo

Condiciones del cultivo celular

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Equipos

1) CABINAS DE FLUJO LAMINAR

2) INCUBADORAS o ESTUFAS DE CO2,

3) TANQUES DE N2 LÍQUIDO, FREEZER –20 , -80 °C, BAÑOS TERMOSTATIZADOS

4) EQUIPOS DE ESTERILIZACIÓN: autoclave, unidades de filtración

5) MICROSCOPIOS

6) CENTRIFUGA

7) Contadores de células, Balanzas, pH-metros, pipeteadores

8) OTROS: Citómetro de flujo, Equipos de selección celular, etc-

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¿Son necesarias las normas de bioseguridad?

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Normas de bioseguridad

BioseguridadBioseguridad

Medioambiente

Cu

ltiv

o c

elu

lar

Operador

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Requerimientos del cultivo celular¿Para qué?

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Criterios del nivel de bioseguridad en los laboratorios

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Clasificación de los agentes biológicosR.D. 664/1997 protección de los trabajadores contra los riesgos

relacionados con la exposición a agentes biológicos durante el trabajo

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Células eucariotas: tiempo

duplicación >24hs. Bacterias

y levaduras crecen más

rápido

Protección del producto: Contaminación

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Tipo de Contaminantes

Bacterias

Bacterias intracelulares: Mycoplasmas

Virus: herpes y parainfluenza

Esporas hongos y Levaduras

Protozoarios: si se trabaja en el laboratorio

Línea celular: contaminación cruzada

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Fuentes de Contaminación

Técnica aséptica incorrecta

Soluciones y/o medios

Material vidrio, pipetas, etc.

Área de trabajo no estéril

Problemas en la cámara de flujo (chequear c/6meses)

Muestras de tejido

Líneas celulares

Incubadoras de CO2 (agua de humidificación, superficies internas, ventilador) y baño

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Valoración pH de rojo Fenol

Detección de la contaminacióndel producto

Cambio pH medio cultivo

Turbidez medio

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Detección de la contaminación

Visualización directa al M.O: 100X levaduras y hongos y

400X bacterias

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¿Cómo se evita la contaminación?

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Técnica Aséptica - Esterilidad

Asegura barrera entre los microorganismos del ambiente y el cultivo

Laboratorio de cultivo:

Área tranquila del laboratorio

Laboratorio separado de área preparación y lavado de material

Alejado de laboratorios de microbiología y bioterio

Área manipulación estéril: sólo utilizar para cultivo

cuarto separado

evitar tránsito

flujo laminar

Luz UV

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Técnica Aséptica - Esterilidad

Superficie trabajo

- Limpiar con alcohol 70 antes y después de trabajar

- Despejada

- Evitar derrames líquidos

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Técnica Aséptica - Esterilidad

Higiene personal

- Limpieza de manos y aplicar alcohol 70

- Guantes estériles: desinfección frecuente.

- Gorros/tapaboca: no son necesarios en flujo laminar _ si en precuarto cultivo (tunicas, zapatones, gorros)

Manipulación estéril

- Alcohol 70 a productos que ingresen al flujo laminar

- Frascos con roscas. Evitar tapones

- No trasvasar líquidos de un frasco a otro

- Evitar derrames de líquidos

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Técnica Aséptica - Esterilidad

Pipeteado

- Medidas convenientes

- Evitar contacto entre pipeta y borde frascos

AlgodónPipeteador

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Material trabajo estéril

Filtros de 0.2 μm

Esterilización

- Autoclave

- Gas

- Radiación

Técnica Aséptica - Esterilidad

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Técnica Aséptica - Esterilidad

Limpieza laboratorio de cultivo en forma regular

Mensualmente:

- Incubadora de CO2, baño, heladeras, etc.

- Con antisépticos no tóxicos: Cloruro de benzalconio

- Incubadoras de CO2: ciclos esterilización altas temperaturas

Control de equipos:

- Incubadora de CO2, baño, heladeras, etc.

- Cámaras de flujo laminares: cambio y control de filtros y cuantificación de

partículas

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Cámara Flujo Laminar

Ambiente protegido polvo y contaminación por flujo constante de

aire filtrado que pasa por superficie de trabajo

El aire es filtrado por filtros HEPA: capacidad de retención del

99,999% de las partículas >0,2 micrómetros

2 tipos: horizontal y vertical

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Flujo Laminar

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Cámara Flujo Laminar

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Flujo Horizontal

Filtro HEPA

Aire no recircula

Buena protección cultivos y reactivos

Mala protección operador

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Flujo Horizontal

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Flujo Vertical

Aire puede recircular o ser expulsado completamente

Mayor seguridad para operador

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Flujo Vertical

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Seguridad Biológica

Cámara flujo laminar Clase II

- Para trabajar con materiales potencialmente peligrosos:

- radioisótopos

- mutágenos

- células transformadas humanas, etc

Cámara flujo laminar Clase III: mayor nivel de protección del

personal y el ambiente

- Manipulación de patógenos humanos conocidos

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Seguridad Biológica

CLASE Aire entrada Aire salida Recirculación aire Protección

productoProtección

frontal

INo es filtrado (refleja aire laboratorio)

1 HEPA No No Abierto/ cerrado

IIFiltro HEPA 1 HEPA

A: 70% recirculaB: 30% recirculaC: 100% aire eliminado

BuenaProtección

frontal. Cortina aire

III Filtro HEPA 2 HEPA Si Buena

Totalmente cerrada. Guantes

anexadosCámara bajo

presión negativa

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Seguridad Biológica

Cámara flujo laminar Clase I:

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Seguridad Biológica

Cámara flujo laminar Clase II:

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Seguridad Biológica

Cámara flujo laminar Clase III

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Condiciones ambientales cultivo celular

Sustratos

Condiciones ambientales del cultivo celular:1. Fase gaseosa

2. Propiedades físicas

3. Propiedades fisiológicas

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Sustratos

La mayoría de líneas celulares animales y cultivos primarios son anclaje dependientes y requieren estar adheridos a una superficie para sobrevivir y replicarse.

- Vidrio- Plástico descartable- Microcarriers- Superficies tratadas- Feeder layers

- Matricies tridimensionales- Sust. no adhesivos- Fibras huecas- Sust. cultivos de órganos - Biorreactores

Sustrato: dispositivo donde se colocan las células de modo directo.

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Vidrio fue el sustrato inicialmente utilizado. Es de bajo costo, de fácil limpieza y esterilización y sus propiedades ópticas facilitan la observación al microscopio.

Sustratos

Plástico descartable es el que más se utiliza hoy en día. El más empleado es el poliestireno que es hidrofóbico por lo que debe ser tratado con irradiación gamma, descargas eléctricas o agentes químicos para tornarlo hidrofílico. También cloruro de polivinilo (PVC), policarbonato y teflon entre otros.

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Recipientes

Frascos de Roux o frascos T

25cm2

75cm2

150cm2

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Recipientes

Placas Petri Multiplacas

Roller bottles Lab Tek

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Recipientes

Para cultivo de grandes cantidades de células

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Microsoportes o microcarriers son soportes plásticos esféricos de tamaño variable (100-300u) y de diferentes materiales según el fabricante (poliestireno, sephadex, poliacrilamida, colágeno, gelatina). Las células crecen adheridas a la superficie de las esferas que se mantienen en suspensión en recipientes con agitación.

MICROCARRIERS

Proporcionan la máxima relación superficie de

sustrato con volumen de medio de cultivo.

Sustratos: Microsoportes

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Superficies tratadas con el medio de crecimiento de otro cultivo o recubiertas con proteínas de matriz extracelular (fibronectina, colágeno) mejoran la adhesión y el crecimiento de muchas líneas celulares. Otros tratamientos : adición de gelatina y poli-D-lisina.

Sustratos especiales

Sustratos no adhesivos se utilizan cuando no se desea que las células se adhieran, geles de agar, agarosa o en metilcelulosa de alta viscosidad.

Feeder layers sustratos constituidos por una monocapa de células vivas irradiadas o tratadas con mitomicina C para evitar su proliferación. Una de las más empleadas: fibrobastos de ratón 3T3 irradiados.

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Colonia de stem cells embrionarias humanas sobre feeder layer de fibroblastos de ratón.

Feeder layers

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Fibras huecas se utilizan para cultivos histotípicos y son un conjunto de haces microcapilares huecos y permeables que permiten la difusión de gases y nutrientes. Las células se concentran y aumenta la densidad celular, en los intersticios de las fibras huecas. Es el sistema mas empleado para la producción de anticuerpos monoclonales a partir de hibridomas.

Sustratos especiales

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Matrices tridimensionales son sustratos donde las células penetran estableciendo una distribución tridimensional, recreando in vitro contactos célula-célula y célula-matriz. Se utilizan para cultivos histotípicos y organotípicos. Geles de colágeno, esponjas de celulosa sola o recubierta de colágeno, esponjas de gelatina (gelofam), etc.

Sustratos especiales

Sustratos para cultivos de órganos que son grillas de metal, filtros miliporo o geles. El cultivo se lleva a cabo en una interfase medio de cultivo/aire para lograr la correcta difusión de gases.

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Condiciones ambientales cultivo celular

Sustratos

Condiciones ambientales del cultivo celular:1. Fase gaseosa

2. Propiedades físicas

3. Propiedades fisiológicas

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Condiciones ambientales del Cultivo Celular: Fase gaseosa

- O2

Para la mayor parte de los cultivos celulares el requerimiento de oxígeno es cubierto con la tensión atmosférica (20%).

- CO2

Involucra la concentración CO2 disuelto y de iones HCO3- y por tanto

afecta el pH.

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Incubadora o estufa de CO2

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Incubadora o estufa de CO2

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pHSistema bufferOsmolalidadTemperaturaViscosidad

Tensión superficial

Condiciones ambientales del Cultivo Celular: Propiedades físicas y fisiológicas

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Propiedades físicas del cultivo: pH y sistema buffer

El pH óptimo de crecimiento para la mayoría de tipos celulares es 7.4.

El medio de cultivo debe estar tamponado, a fin de evitar cambios bruscos de pH. Se utiliza habitualmente como indicador de pH rojo fenol (rojo a pH 7.4)

Debido a su bajo costo y toxicidad el tampón bicarbonato es la solución tamponadora más usada a pesar de su escasa capacidad tamponadora a pH fisiológico. Requiere el aporte de CO2 (5-10%)

H2O + CO2 <=> H2CO3 <=> H+ + HCO3-

Para establecer pH: importan los niveles de bicarbonato sódico del medio y la tensión de CO2 del ambiente. Cada medio tiene una concentración recomendada de bicarbonato y tensión de CO2. Usualmente se requiere el aporte de 5-10% de CO2. Una alternativa: suplementar con piruvato para incrementar la producción de CO2 endógeno.

HEPES (10-20mM) es la solución tamponadora de elección por su elevada capacidad tamponadora en el rango 7.2 a 7.6, pero es más caro y posee cierto grado de toxicidad.

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Propiedades físicas del cultivo: Osmolalidad

La mayoría de las células en cultivo presentan una amplia tolerancia frente a variaciones del tenor osmótico del medio, creciendo bien en el rango de 260 a 320 mOsm/kg.

Las incubadoras con humidificación evitan la evaporación de agua del medio de cultivo. De lo contrario aumentaría la concentración de solutos y por tanto la osmolalidad lo que generaría daño celular.

Los cambios en la formulación del medio por ej. la adición de HEPES pueden afectar la osmolalidad del cultivo.

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Propiedades físicas del cultivo Temperatura

Tiene gran influencia en la tasa de crecimiento de las células. Temperatura óptima: 37ºC

La temperatura afecta la solubilidad del CO2 (aumenta a temperaturas bajas) y por tanto el pH. Habitualmente se ajusta el pH del medio 0.2 unidades por debajo del óptimo, a temperatura ambiente.

Células en cultivo pueden sobrevivir algunos días a 4ºC y pueden ser congeladas a –196 ºC, pueden tolerar más de 2ºC por encima de lo normal (39,5ºC) por algunas horas, pero se mueren rápidamente a 40ºC o más.

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Propiedades físicas del cultivo Viscosidad

Está dada fundamentalmente por el agregado de suero y tiene poca influencia sobre el crecimiento celular.

Importante para evitar el daño celular en cultivos que se crecen con agitación (menor daño a más viscosidad).

Se puede incrementar la viscosidad, en cultivos en agitación o

cuando se utilizan medios libres de suero, añadiendo al medio carboxi-metil-celulosa o polivinilpirrolidona.

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Propiedades físicas del cultivo Tensión superficial

En general se mantiene baja.

Es crítica en cultivos en suspensión donde además puede ser necesario burbujear O2 y/o CO2 que genera burbujas que desnaturalizan proteínas, dificultan el intercambio gaseoso y aumentan el riesgo de contaminación.

Pueden utilizarse agentes antiespumantes.

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Medios de cultivoCondiciones fisiológicas

Hace referencia a la composición del medio nutriente.

Medios definidos: si se conoce la cantidad de c/u de sus componentes de acuerdo a su formulación. La definición de un medio se pierde por el agregado de suero porque se desconoce la concentración real de c/u de sus componentes.

Soluciones salinas equilibradas (BSS).

Aminoácidos

Vitaminas

Glucosa

Otros suplementos orgánicos

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Medios comúnmente utilizados:

Medio Basal de Eagle (BME)

Medio Mínimo Esencial de Eagle (MEM).

R.P.M.I. 1640.

Medio MEM modificado por Dulbeco (DMEM) y otros.

Modificación de Iscove del medio DMEM (IMDM).

McCoy 5A.

Medio L-15 de Leibovitz.

Medio F-10 de Ham.

Medio F-12 de Ham.

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Sueros

Si bien actualmente se utilizan medios libres de suero para el crecimiento de determinados tipos de cultivos, la mayoría requiere de la adición de suero para crecer y proliferar adecuadamente.

Los tipos de suero empleados son:

– suero de ternera ("calf serum", CF)

– suero bovino fetal ("fetal bovine serum", FBS)

– suero de caballo ("horse serum", HS)

– suero humano ("human serum", HuS).

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Antibióticos y antifúngicos

Fueron introducidos originalmente en los medios de cultivo para reducir la frecuencia de contaminación

El uso de los flujos laminares y el trabajo en condiciones asépticas hace innecesario su empleo en forma rutinaria

Se utilizan en cultivos primarios o en experimentos largos realizados a gran escala.

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Mantenimiento del cultivo celular

Necesidad de subcultivar se debe a que el cultivo crece y agota todo el sustrato. En cada subcultivo el cultivo puede dividirse a la mitad, un tercio, un cuarto, etc.

Cultivo primario

1er subcultivo Cultivo

secundario

2o subcultivo Línea celular

finita

continua

Involucra el recambio periódico de medio de cultivo y la realización de subcultivos o pasajes.

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Tener en cuenta:

Descenso del pH del medio (viraje de color del indicador rojo fenol)

Concentración celular elevada

Tipo celular en cultivo, por ej. fibroblastos normales (dejan de dividirse) vs células transformadas (se deterioran rápidamente)

Morfología celular: gránulos alrededor del núcleo, vacuolas citoplasmáticas, pérdida de adherencia, redondeamiento.

Recambio del medio de cultivo

Indicadores también de reactivos inadecuados, elementos tóxicos,

contaminación o senescencia

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Biorreactores son sistemas de cultivo complejo. Recipientes capacidad variable (3-40 lts) contienen el cultivo y además realizan el control de T, pH, O2 y CO2, sistema de agitación, etc. Cuentan con sistemas de perfusión por bombas y sistemas de recuperación de células. El biorreactor se controla y regula mediante módulos electrónicos.

BIORREACTORES

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Salas blancas

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Salas blancas

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Clasificación europea

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Clasificación USA

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Criopreservación celular

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Criopreservación - ventajas

Congelar alícuotas de células para luego utilizarlas

Menos trabajo

Población homogénea: evita envejecimiento y evolución celular

Detención de reacciones BQ (< -130°C)

Stock trabajo

Stock de siembra/Stock inicial de la línea celular

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Descenso temperatura

Descenso lento a 1°C/min

Cambios intra y extracelulares:

- 0 a -20°C - formación cristales extracelulares - aumento concentración solutos - deshidratación celular

- -50 a -70°C - transferencia rápida a nitrógeno líquido

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Mecanismos de injuria celular durante congelación

Criopreservación

Congelación lenta (1°C/min)

Sustancia criopreservante:

Evita la formación de cristales

DMSO – Glicerol

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Congelación1. Preparación de una suspensión

celular en fase log. 5X106-2X107/ml

2. Resuspensión en solución de congelación (criopreservantes)

3. Congelación gradual

4. Almacenamiento en nitrógeno líquido sumergidos o en la fase gaseosa

5. Registrar

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Equipo de descenso de temperatura programado

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Nitrógeno: fase líquida -196°Cfase gaseosa -190 a -193°C

Freezer -80°C (enlentece metabolismo celular pero no se detiene)

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Extraer criotubo de nitrógeno

Registrar

H2O a 37°C

Diluir células lentamente en

medio

Incubar por 24 hs

Remplazar medio por

medio fresco

Descongelación

Rápida: 60 a 90 seg. a 37°C

Diluir en medio lentamente

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Otros equipos

1) CABINAS DE FLUJO LAMINAR

2) INCUBADORAS o ESTUFAS DE CO2,

3) TANQUES DE N2 LÍQUIDO, FREEZER –20 , -80 °C, BAÑOS TERMOSTATIZADOS

4) EQUIPOS DE ESTERILIZACIÓN: autoclave, unidades de filtración

5) MICROSCOPIOS

6) CENTRIFUGA

7) Contadores de células, Balanzas, pH-metros, pipeteadores

8) OTROS: Citómetro de flujo, Equipos de selección celular, etc-

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MICROSCOPIO INVERTIDO CON CONTRASTE DE FASE

Permite estudiar células vivas en cultivo

Diferencias en: índices de refracción grosor/ densidad celular

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Contadores celulares

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Equipos de centrifugación

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Centrifugación

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Colecta de hemocomponentes por aféresis

PACIENTEPACIENTESeparación celular&

Colección

Bolsa Bolsa dede

ColectaColectaACAC

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Fuerza G

Cinturón de la centrífuga

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Equipos de selección celular

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EQUIPOS DE SEPARACIÓN CELULAR EQUIPOS DE SEPARACIÓN CELULAR INMUNOMAGNÉTICA DE USO CLÍNICOINMUNOMAGNÉTICA DE USO CLÍNICO

Isolex 300i CliniMACS

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Citómetro de flujo

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C. Touriño - 2011

Gracias !!