Revista Mexicana de Ingeniería Química

ISSN: 1665-2738

amidiq@xanum.uam.mx

Universidad Autónoma Metropolitana

Unidad Iztapalapa

México

Quiroz-Vázquez, M.G.; Chávez-Montes, A.; González-Horta, A.

MARCAJE SELECTIVO DE LA PROTEÍNA ALFA-SINUCLEÍNA CON CLORURO DE

DANSILO EN EL EXTREMO N-TERMINAL

Revista Mexicana de Ingeniería Química, vol. 15, núm. 3, 2016, pp. 685-692

Universidad Autónoma Metropolitana Unidad Iztapalapa

Distrito Federal, México

Disponible en: http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=62048168001

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Vol. 15, No. 3 (2016) 685-692Revista Mexicana de Ingeniería Química

CONTENIDO

Volumen 8, número 3, 2009 / Volume 8, number 3, 2009

213 Derivation and application of the Stefan-Maxwell equations

(Desarrollo y aplicación de las ecuaciones de Stefan-Maxwell)

Stephen Whitaker

Biotecnología / Biotechnology

245 Modelado de la biodegradación en biorreactores de lodos de hidrocarburos totales del petróleo

intemperizados en suelos y sedimentos

(Biodegradation modeling of sludge bioreactors of total petroleum hydrocarbons weathering in soil

and sediments)

S.A. Medina-Moreno, S. Huerta-Ochoa, C.A. Lucho-Constantino, L. Aguilera-Vázquez, A. Jiménez-

González y M. Gutiérrez-Rojas

259 Crecimiento, sobrevivencia y adaptación de Bifidobacterium infantis a condiciones ácidas

(Growth, survival and adaptation of Bifidobacterium infantis to acidic conditions)

L. Mayorga-Reyes, P. Bustamante-Camilo, A. Gutiérrez-Nava, E. Barranco-Florido y A. Azaola-

Espinosa

265 Statistical approach to optimization of ethanol fermentation by Saccharomyces cerevisiae in the

presence of Valfor® zeolite NaA

(Optimización estadística de la fermentación etanólica de Saccharomyces cerevisiae en presencia de

zeolita Valfor® zeolite NaA)

G. Inei-Shizukawa, H. A. Velasco-Bedrán, G. F. Gutiérrez-López and H. Hernández-Sánchez

Ingeniería de procesos / Process engineering

271 Localización de una planta industrial: Revisión crítica y adecuación de los criterios empleados en

esta decisión

(Plant site selection: Critical review and adequation criteria used in this decision)

J.R. Medina, R.L. Romero y G.A. Pérez

MARCAJE SELECTIVO DE LA PROTEINA ALFA-SINUCLEINA CON CLORURODE DANSILO EN EL EXTREMO N-TERMINAL

SELECTIVE LABELING OF ALPHA-SYNUCLEIN WITH DANSYL CHLORIDE ATN-TERMINAL SEGMENT

M.G. Quiroz-Vazquez1, A. Chavez-Montes2, A. Gonzalez-Horta1*1Laboratorio de Ciencias Genomicas, FCB, Universidad Autonoma de Nuevo Leon. Av. Universidad s/n Cd. Universitaria

66451 Mexico.2Laboratorio de Quımica Analıtica, FCB, Universidad Autonoma de Nuevo Leon. Av. Universidad s/n Cd. Universitaria 66451

Mexico.Recibido 1 de Enero de 2016; Aceptado 26 de Junio de 2016

ResumenLa mayorıa de las proteınas poseen en su secuencia residuos de triptofano susceptibles de ser usados como fluoroforos parasu estudio por tecnicas espectroscopicas sin embargo, la alfa-sinucleına no tiene esta caracterıstica, por lo que es necesarioconstruir mutantes que contengan triptofanos en su secuencia o bien marcarla de manera extrınseca para poder contar consondas que permitan su analisis por espectroscopıa de fluorescencia. El objetivo del presente trabajo fue optimizar lascondiciones experimentales para el marcaje selectivo de la alfa-sinucleına con cloruro de dansilo, una sonda sensible a lapolaridad del entorno y que reacciona selectivamente con el grupo amino libre de las proteınas lo cual permitira caracterizarlas interacciones lıpido-proteına o proteına-proteına de la alfa-sinucleına nativa en complejos lipoproteicos.Palabras clave: alfa-sinucleına, espectroscopıa de fluorescencia, cloruro de dansilo.

AbstractMost proteins have tryptophan residues in their sequence that can be used as intrinsic fluorophores by spectroscopictechniques however, alpha-synuclein does not have this feature, so it is necessary to construct mutants that containtryptophan residues or label extrinsically the protein to allow its analysis by fluorescence spectroscopy. The aim of thisstudy was to optimize the experimental conditions for the selective labeling of alpha-synuclein with dansyl chloride, anenvironment sensitive probe that reacts selectively with free amino groups in proteins allowing characterization of lipid-protein interactions or protein-protein interactions of alpha-synuclein in lipoprotein complexes.Keywords: alpha-synuclein, fluorescence spectroscopy, dansyl chloride.

1 Introduccion

La alfa-sinucleına es una abundante proteınaneuronal que se localiza principalmente en lasterminales presinapticas y cuya union a membranasjuega un papel primordial en la formacion de fibrasde tipo amiloide. Estos agregados fibrilares definenvarias enfermedades del sistema nervioso, entre ellasla enfermedad de Parkinson (EP) (Rang, 2008).Descubrimientos geneticos relacionan el padecimientotemprano de esta enfermedad a la triplicacion del genque codifica para la alfa-sinucleına y a 3 mutacionespuntuales (A30P, E46K, A53T). Ya sea de origenesporadico o genetico, la enfermedad de Parkinsonno solo se asocia a la presencia de esta proteına sinoque tambien esta implicado su estado conformacional.

Mientras que la alfa-sinucleına soluble se caracterizapor tener una estructura desplegada in vitro, es laforma agregada (fibras amiloides) la que se encuentraen los cuerpos de Lewy y en las neuritas caracterısticosde la EP (Conway y col., 2000). Las interacciones conla membrana son de particular interes debido a que laproteına se localiza cerca de las vesıculas sinapticas yde la membrana mitocondrial in vivo. La capacidadde la alfa-sinucleına para asociarse con la membranase debe a su secuencia aminoacıdica. Es una proteınade 140 aminoacidos y 14.5 kDa de masa molecularque comprende 3 dominios distintos: un segmentoN-terminal cationico, una region central hidrofobicaconocida como NAC (por sus siglas en ingles non

* Autora para la correspondencia. E-mail: azucena.gonzalezhr@uanl.edu.mx

Publicado por la Academia Mexicana de Investigacion y Docencia en Ingenierıa Quımica A.C. 685

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amyloid beta component) y un segmento C-terminalde caracter acido. En el analisis estructural de la alfa-sinucleına puede observarse que cuenta con 2 residuosde fenilalanina y 4 tirosinas localizadas en distintasregiones: Phe4 y Tyr39 se localizan en la region N-terminal, Phe94 en la region NAC y Tyr125, Tyr133y Tyr136 en la region C-terminal (Bisaglia y col.,2009). No cuenta con residuos de triptofano en susecuencia. Dado que la tirosina es una sonda intrınsecainsensible a la polaridad del entorno, es necesarioconstruir mutantes que contengan triptofanos en susecuencia o bien marcar de manera extrınseca laproteına para poder contar con sondas que permitansu analisis por espectroscopıa de fluorescencia. Lacaracterizacion de las interacciones lıpido-proteına dela alfa-sinucleına por otras tecnicas como microscopıade epifluorescencia o resonancia de spin electronicoha requerido la introduccion de sondas extrınsecassin embargo, en todos los casos, ha sido necesario elempleo de la biologıa molecular para la introduccionde residuos de cisteına que permitan la union quımicade las sondas correspondientes o bien el cambioTyr39Trp. En este contexto, el objetivo del presentetrabajo fue el marcaje selectivo de la alfa-sinucleınacon cloruro de dansilo, una sonda sensible a lapolaridad del entorno y que reacciona selectivamentecon el grupo amino libre de las proteınas permitiendoası, la caracterizacion de la interaccion lıpido-proteınao proteına-proteına de la alfa-sinucleına nativa encomplejos lipoproteicos.

2 Parte experimental

2.1 Optimizacion de los parametrosexperimentales para el marcaje en elsegmento N-terminal de proteınas

Para optimizar los parametros experimentales delmarcaje de proteınas en el extremo amino terminal

fue necesario emplear una proteına con triptofanosen su secuencia con el fin de monitorearla porespectroscopıa de fluorescencia, para lo cual seempleo en la primera etapa de este trabajo la albuminabovina. Se ha reportado que a un pH entre 9 y 10.5 ladansilacion de proteınas ocurre favorablemente debidoal marcaje de la mayorıa de los aminoacidos, aminas,imidazoles y fenoles (Seiler y col., 1970). El clorurode dansilo es una sonda que reacciona con los gruposamino de acuerdo al Esquema 1.

Debido a que la derivatizacion con cloruro dedansilo implica que el grupo amino que participa enla reaccion este desprotonado, es necesario tener unpH ligeramente basico para que ocurra la reaccion.Se probaron 3 valores de pH para evaluar con cualse lograba una mayor incorporacion de la sondafluorescente al extremo N-terminal de la proteına.La reaccion de dansilacion se realizo a pH de 8.5,9.5 y 10.5. Se preparo una solucion stock decloruro de dansilo en dimetilformamida (DMF) a unaconcentracion de 1 mg/mL. Una vez disuelta la sonda,se anadieron 81 µL sobre una solucion de albuminapreparada a una concentracion 300 µM empleandobuffer CHES a los distintos pH a evaluar y se incubodurante 1.5 hr a 25º C en obscuridad y agitacionconstante. La reaccion se detuvo disminuyendo el pHen dos unidades.

2.2 Cromatografıa de exclusion molecular

Para eliminar el cloruro de dansilo no unido a laproteına se empleo una columna Superdex 200 conbuffer Hepes 10 mM NaCl 100 mM pH 7 comoeluyente recolectandose 90 fracciones. El perfilcromatografico se monitoreo midiendo la absorbanciaa 280 nm y 340 nm. Las fracciones correspondientesa la proteına dansilada se recolectaron y cuantificaronpor el metodo de Bradford.

Manuscrito sometido a la Revista Mexicana de Ingeniería Química 3

monitorearla por espectroscopía de fluorescencia, para lo cual se empleó en la primera 83 etapa de este trabajo la albúmina bovina. Se ha reportado que a un pH entre 9 y 10.5 la 84 dansilación de proteínas ocurre favorablemente debido al marcaje de la mayoría de los 85 aminoácidos, aminas, imidazoles y fenoles (Seiler {\it y col}., 1970). El cloruro de dansilo 86 es una sonda que reacciona con los grupos amino de acuerdo al siguiente esquema: 87 88

89

90

91

92 Esquema 1. Reacción del cloruro de dansilo con los residuos de lisina de una proteína 93 (adaptado de Levi y González-Flecha, 2003). 94

95 96 Debido a que la derivatización con cloruro de dansilo implica que el grupo amino que 97 participa en la reacción esté desprotonado, es necesario tener un pH ligeramente básico para 98 que ocurra la reacción. Se probaron 3 valores de pH para evaluar con cual se lograba una 99 mayor incorporación de la sonda fluorescente al extremo N-terminal de la proteína. La 100 reacción de dansilación se realizó a pH de 8.5, 9.5 y 10.5. Se preparó una solución stock de 101 cloruro de dansilo en dimetilformamida (DMF) a una concentración de 1 mg/mL. Una vez 102 disuelta la sonda, se añadieron 81 $\mu$L sobre una solución de albúmina preparada a una 103 concentración 300 $\mu$M empleando buffer CHES a los distintos pH a evaluar y se 104 incubó durante 1.5 hr a 25º C en oscurdad y agitación constante. La reacción se detuvo 105 disminuyendo el pH en dos unidades. 106 107 2.2. Cromatografía de exclusión molecular 108 109 Para eliminar el cloruro de dansilo no unido a la proteína se empleó una columna Superdex 110 200 con buffer Hepes 10 mM NaCl 100 mM pH 7 como eluyente recolectándose 90 111 fracciones. El perfil cromatográfico se monitoreó midiendo la absorbancia a 280 nm y 340 112 nm. Las fracciones correspondientes a la proteína dansilada se recolectaron y cuantificaron 113 por el método de Bradford. 114 115

2.3. Obtención de los espectros de emisión de fluorescencia de la proteína dansilada 116 117 Los espectros de emisión de fluorescencia de la proteína dansilada se obtuvieron en entorno 118 acuoso empleando un espectrofluorímetro Perkin Elmer LS-45. Los espectros se recogieron 119 a 25º C en una celda de 0.1 cm de paso óptico. La velocidad a la que se registraron los 120 espectros fue de 1 nm/s con un ancho de rendija de excitación y emisión de 10 nm. Los 121 espectros de fluorescencia de la proteína dansilada se obtuvieron utilizando una longitud de 122 onda de excitación de 340 nm. La concentración de proteína empleada en la celda 71.5 123 $\mu$g/mL en buffer Hepes 10 mM pH 7 NaCl 100 mM. 124

Esquema 1. Reaccion del cloruro de dansilo con los residuos de lisina de una proteına (adaptado de Levi y Gonzalez-Flecha, 2003).

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2.3 Obtencion de los espectros de emisionde fluorescencia de la proteınadansilada

Los espectros de emision de fluorescencia de laproteına dansilada se obtuvieron en entorno acuosoempleando un espectrofluorımetro Perkin Elmer LS-45. Los espectros se recogieron a 25º C en unacelda de 0.1 cm de paso optico. La velocidad a laque se registraron los espectros fue de 1 nm/s conun ancho de rendija de excitacion y emision de 10nm. Los espectros de fluorescencia de la proteınadansilada se obtuvieron utilizando una longitud deonda de excitacion de 340 nm. La concentracion deproteına empleada en la celda 71.5 µg/mL en bufferHepes 10 mM pH 7 NaCl 100 mM.

2.4 Marcaje del segmento N-terminal de laalfa-sinucleına con cloruro de dansilo

Se marcaron 1.5 mg/mL [22.7 µM] de alfa-sinucleınadisuelta en buffer CHES a pH 9.5 anadiendo 6 µLde cloruro de dansilo [1 mg/mL] en DMF incubandodurante 1.5hr a 25ºC en oscuridad y agitacionconstante. La reaccion se detuvo disminuyendo elpH en dos unidades. La eliminacion de la sonda nounida y los perfiles cromatograficos y electroforeticosse realizaron como se menciono anteriormente.

2.5 Obtencion del perfil electroforetico dela proteına marcada con cloruro dedansilo

El marcaje de la proteına se corroboro mediante suanalisis electroforetico en gel discontınuo empleandoel gel concentrante al 4% y el de corrimiento al 8%de acrilamida al 30%. La electroforesis se realizoen un sistema OWL P8DS (Thermo-scientific) y lasbandas se detectaron mediante tincion de coomassie.El marcaje fluorescente se corroboro mediante laexposicion del gel a luz UV previo a la tincion concoomassie.

3 Resultados y discusion

3.1 Optimizacion de las condiciones delmarcaje

Para encontrar las condiciones optimas de reaccionpara el marcaje de la alfa-sinucleına, una proteına queno cuenta con triptofanos en su estructura primaria,se empleo como proteına modelo la albumina, unaproteına capaz de ser monitoreada por espectroscopıade fluorescencia debido a la presencia de residuosde triptofano en su secuencia, los cuales generanespectros de emision con un pico maximo entornoa 340 nm una vez excitada la proteına a 280 nm(Lakowicz, 2006).

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171 172

173 Esquema 2. Valores de pKa para los grupos ionizables de la lisina (A) y el ácido aspártico (B) 174 presentes en la secuencia primaria de la albúmina sérica bovina. 175

176 177 178

179 Figura 1. Espectros de emisión de fluorescencia de la albúmina sérica bovina y la 180 albúmina dansilada registrados a una longitud de onda de excitación de 280 nm. Se 181 muestra el efecto del pH sobre la incorporación de cloruro de dansilo en el 182 extremo N-terminal de la albúmina. Albúmina sérica bovina sin marcar (l) y 183 albúmina dansilada empleando un pH de 10.5 (l), pH 9.5 (l) y pH 8.5 (¡). 184

185

Esquema 2. Valores de pKa para los grupos ionizables de la lisina (A) y el acido aspartico (B) presentes en lasecuencia primaria de la albumina serica bovina.

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173 Esquema 2. Valores de pKa para los grupos ionizables de la lisina (A) y el ácido aspártico (B) 174 presentes en la secuencia primaria de la albúmina sérica bovina. 175

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179 Figura 1. Espectros de emisión de fluorescencia de la albúmina sérica bovina y la 180 albúmina dansilada registrados a una longitud de onda de excitación de 280 nm. Se 181 muestra el efecto del pH sobre la incorporación de cloruro de dansilo en el 182 extremo N-terminal de la albúmina. Albúmina sérica bovina sin marcar (l) y 183 albúmina dansilada empleando un pH de 10.5 (l), pH 9.5 (l) y pH 8.5 (¡). 184

185

Figura 1. Espectros de emision de fluorescencia dela albumina serica bovina y la albumina dansiladaregistrados a una longitud de onda de excitacion de280 nm. Se muestra el efecto del pH sobre laincorporacion de cloruro de dansilo en el extremo N-terminal de la albumina. Albumina serica bovina sinmarcar (•) y albumina dansilada empleando un pH de10.5 (•), pH 9.5 (•) y pH 8.5 (o).

Dados los valores de pKa de los grupos ε-amino delos residuos de lisina y del residuo de acido aspartico(Esquema 2) correspondiente al residuo N-terminal dela secuencia primaria de la albumina (Peters, 1977),estos grupos se encuentran protonados a un pH neutro,no siendo reactivos para la dansilacion, por lo queel medio para que esta reaccion ocurra debe serligeramente basico. Ası pues, se eligieron 3 valoresde pH (8.5, 9.5 y 10.5) para realizar la dansilacion dela proteına y evaluar la cantidad de sonda incorporada.

En la Figura 1 se muestra la influencia del pHsobre la intensidad de fluorescencia debido a la

incorporacion del dansilo a la albumina. En la graficapuede observarse que, tanto la albumina sin marcarcomo el derivado dansilado a los tres valores depH probados, muestran un espectro de emision defluorescencia caracterıstico de los residuos aromaticoscon un maximo a 342 nm cuando se excitan a 280 nm.Puede observarse tambien, que la proteına dansiladapresenta un segundo pico atribuible a la emision defluorescencia del dansilo con un maximo a 473 nm(Lakowicz, 2006).

Dado que el dansilo es una sonda que no debe serexcitada a 280 nm y que la intensidad de fluorescenciade la banda disminuye conforme ocurre la dansilacion,puede decirse que algunos residuos aromaticos de laproteına en el estado excitado transfieren el excesode energıa a la sonda fluorescente debido a que elespectro de emision de los residuos aromaticos de laproteına y el espectro de absorcion del dansilo estancentrados a 340 nm. La transferencia de energıaentre fluorocromos solo es posible si la distancia quelos separa esta entre 1-10 nm (Wu y col., 1994).Esta distancia se encuentra dentro de las dimensionesque presenta la molecula de albumina (Ferrer ycol., Gonzalez-Flecha y col., 2003). El esquema3 representa el origen de la emision de las bandasobservadas en la Figura 1 cuando se excita la proteınadansilada a 280 nm.

Una vez realizado el marcaje proteico se procedioa la cuantificacion del mismo a partir de los espectrosde absorcion del dansilo en las muestras de proteınamarcada y determinando su concentracion mediante elcoeficiente de extinsion molar del dansilo a 340 nm (ε= 3370 M−1cm−1) (Levi y col., 2003). Conocido estevalor y calculando la cantidad de proteına mediante elmetodo de Bradford (Olson, 2016) se obtuvieron lassiguientes relaciones molares para los valores de pHevaluados:

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186 187 Dado que el dansilo es una sonda que no debe ser excitada a 280 nm y que la intensidad de 188 fluorescencia de la banda disminuye conforme ocurre la dansilación, puede decirse que 189 algunos residuos aromáticos de la proteína en el estado excitado transfieren el exceso de 190 energía a la sonda fluorescente debido a que el espectro de emisión de los residuos 191 aromáticos de la proteína y el espectro de absorción del dansilo están centrados a 340 nm. 192 La transferencia de energía entre fluorocromos sólo es posible si la distancia que los separa 193 está entre 1-10 nm (Wu {\it y col}., 1994). Esta distancia se encuentra dentro de las 194 dimensiones que presenta la molécula de albúmina (Ferrer {\it y col}., González-Flecha {\it 195 y col}., 2003). El esquema 3 representa el origen de la emisión de las bandas observadas en 196 la figura 1 cuando se excita la proteína dansilada a 280 nm. 197

198

199

200

201

202 Esquema 3. Mecanismo de transferencia de energía entre fluorocromos. 203 El cilindro representa la molécula de albúmina y la estrella representa el 204 dansilo unido a ella. Adaptado de Levi y González-Flecha 2003. 205

206

Una vez realizado el marcaje proteico se procedió a la cuantificación del mismo a partir de 207 los espectros de absorción del dansilo en las muestras de proteína marcada y determinando 208 su concentración mediante el coeficiente de extinsión molar del dansilo a 340 nm 209 ($\varepsilon$ = 3370 M$^{-1}$cm$^{-1}$) (Levi {\it y col}., 2003). Conocido este valor y 210 calculando la cantidad de proteína mediante el método de Bradford (Olson, 2016) se 211 obtuvieron las siguientes relaciones molares para los valores de pH evaluados: 212 213 214

Tabla 1. Marcaje proteico obtenido a los pH empleados 215 216

pH

Dansilo/proteína (relación molar)

Fluorescencia max (u.a.)

8.5 0.6 473 9.5 1 473

10.5 1.2 470 217

Los valores recogidos en la tabla 1 muestran que un pH de 9.5 resulta óptimo para la 218 dansilación de la albúmina en el extremo amino terminal, ya que bajo estas condiciones 219 sólo se ha incorporado una molécula de dansilo por cada molécula de albúmina, 220 preferentemente en el extremo N-terminal ya que el pI de los residuos de lisina es de 9.7 221 por lo que, al pH de 9.5 el grupo carboxilo estará desprotonado y el $\varepsilon$-amino 222

Esquema 3. Mecanismo de transferencia de energıa entre fluorocromos. El cilindro representa la molecula dealbumina y la estrella representa el dansilo unido a ella. Adaptado de Levi y Gonzalez-Flecha (2003).

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Tabla 1. Marcaje proteico obtenido a los pHempleados

pH Dansilo/proteına Fluorescencia max(relacion molar) (u.a.)

8.5 0.6 4739.5 1 473

10.5 1.2 470

Los valores recogidos en la tabla 1 muestran queun pH de 9.5 resulta optimo para la dansilacion dela albumina en el extremo amino terminal, ya quebajo estas condiciones solo se ha incorporado unamolecula de dansilo por cada molecula de albumina,preferentemente en el extremo N-terminal ya que el pIde los residuos de lisina es de 9.7 por lo que, al pHde 9.5 el grupo carboxilo estara desprotonado y el ε-amino de las lisinas protonado, no haciendo sensibleeste ultimo grupo a la dansilacion (Nelson y Cox,2009). La albumina serica bovina en su estructuraprimaria, cuenta con el acido aspartico como residuoN-terminal cuyo pI es de 6.87 por lo que a un pHde 9.5 tanto el grupo carboxilo como el grupo aminode este residuo estaran desprotonados sin embargo laincorporacion de la sonda solo sera en el extremoN-terminal de la proteına ya que el dansilo es unasonda que reacciona selectivamente con los gruposamino. A un pH de 8.5 se tendra desprotonadosolo cierto procentaje de grupos amino del residuode acido aspartico y completamente protonados losgrupos ε-amino de las lisinas. Mientras que, al pHde 10.5 se comienza el marcaje no solo en el extremoamino terminal de la albumina sino que comienza aincorporarse sonda tambien en los extremos ε-aminode las lisinas (pKa = 10.53), lo que supone quecontrolando de forma precisa el pH del medio dondese llevara a cabo la reaccion puede seleccionarseel tipo de residuo donde se producira el marcajefluorescente de una proteına. Resultados similareshan sido observados para el marcaje selectivo deotras proteınas como la SP-C del surfactante pulmonar(Plasencia y col., 2001) y el neuropeptido SustanciaP (SP) involucrado en varias funciones biologicas delsistema nervioso central y periferico (Ferrandiz y col.,1994). Una vez estandarizadas las condiciones dereaccion necesarias para la dansilacion de proteınas enel extremo N-terminal, se siguieron las condicionesdescritas en la Parte Experimental para obtener unapreparacion de alfa-sinucleına marcada en la aminaprimaria del extremo N-terminal con cloruro dedansilo.

3.2 Alfa-sinucleına dansilada

La alfa-sinucleına posee 16 grupos susceptibles deser modificados por el cloruro de dansilo, el grupoamino terminal de la proteına y los grupos ε-aminode las Lisinas 6, 10, 12, 21, 23, 32, 34, 43,45, 58, 60, 80, 96, 97 y 102 (Gonzalez-Horta,2015). Debido a que las lisinas de esta proteınaparticipan principalmente en la union con membranasmediante interacciones electrostaticas (Stockl y col.,2008), se optimizaron las condiciones de marcajepara modificar preferentemente solo al grupo amino-terminal y no alterar esta capacidad de interaccionde la proteına. La muestra fue para ello incubadacon cloruro de dansilo a un pH de 9.5 durante 1.5hra 25ºC aplicandose posteriormente a una columnade Superdex 200 para eliminar el dansilo libre queno se unio a la alfa-sinucleına (Mayolo-Deloisa ycol., 2012). En su estructura primaria, la alfa-sinucleına cuenta con una metionina como residuo N-terminal (pI=5.75) por lo que al pH de 9.5 solamenteestara desprotonado el grupo amino de este residuo(pka2 = 9.21), permitiendo la incorporacion de lasonda fluorescente sin que se vean afectados losresiduos ε-amino de las lisinas (pka3 =10.5), loscuales mantendran su caracter basico, importante paralas interacciones electrostaticas que establece la alfa-sinucleına al interactuar con bicapas fosfolipıdicas.

Manuscrito sometido a la Revista Mexicana de Ingeniería Química 8

con la sonda fluorescente mientras que el segundo pico corresponde al exceso de sonda que 270 no se unió a la proteína. Las fracciones de proteína marcada se recogieron y cuantificaron 271 para posteriormente realizar su espectro de emisión de fluorescencia. 272

273 Figura 2. Perfil de elución de una muestra de alfa-sinucleína tratada 274 con cloruro de dansilo en una columna cromatográfica Superdex 275 200. Los círculos negros corresponden a las medidas de absorbancia 276 a 280 nm y los blancos a la absorbancia a 340 nm. 277

278 279 En la Figura 3 se comparan los espectros de emisión de fluorescencia de la alfa-sinucleína 280 dansilada y de la sonda libre en buffer. El espectro de la proteína-dansilada presenta un 281 máximo de emisión en torno a 430 nm característico de un dansilo en entorno no polar 282 mientras que la sonda en buffer presenta un máximo entorno a 490 nm (Lacowicz, 2009). 283 En estudios realizados con otras proteínas dansiladas, se ha observado que cuando el 284 fluoróforo se inserta en regiones hidrofóbicas de la membrana se produce un cambio 285 cualitativo y cuantitativo importante en sus propiedades fluorescentes, que incluye en la 286 mayor parte de los casos, un incremento en el rendimiento cuántico de la emisión de 287 fluorescencia del dansilo, así como un desplazamiento significativo de las longitudes de 288 onda a las que se observa esa emisión a valores menores (desplazamiento al azul) 289 (Schüman {\it y col}., 1997; Pérez-Payá {\it y col}., 1997). El hecho de que el fluoróforo 290 unido a la alfa-sinucleína presente un máximo de emisión a menores longitudes de onda 291 sugiere que el dansilo está protegido del efecto apagador del agua, lo que podría ocurrir al 292 originarse la formación de agregados proteicos. 293 294

Figura 2. Perfil de elucion de una muestra de alfa-sinucleına tratada con cloruro de dansilo en unacolumna cromatografica Superdex 200. Los cırculosnegros corresponden a las medidas de absorbancia a280 nm y los blancos a la absorbancia a 340 nm.

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Figura 3. Espectros de emisión de fluorescencia de la alfa-sinucleína dansilada (22.7µM) 296 y del Cloruro de dansilo en buffer Hepes 10mM pH 7 conteniendo 100mM NaCl. La 297 fluorescencia se representa en unidades arbitrarias. 298

299

Yap {\it y col}., (2011) evaluaron los eventos que ocurren durante la formación de fibras 300 amiloides en el segmento N y C-terminales de la alfa-sinucleína elaborando para ello, 301 mutantes de cisteínas en diferentes posiciones (G7C, Y136C, V26C y L100C) y 302 posteriormente realizando la derivatización con cloruro de dansilo, una sonda sensible al 303 entorno. Estos autores encontraron que tras la agregación proteica, la fluorescencia del 304 dansilo presenta cambios drásticos y residuo específicos. Se observó que la intensidad de 305 fluorescencia global se incrementa entre 1.6 a 3 veces, presentándose además 306 desplazamientos espectrales hacia el azúl (menores longitudes de onda) entre 16 y 42 nm, 307 indicando que todos los sitios dansilados fueron secuestrados del entorno acuoso a un 308 ambiente más hidrofóbico. Estos autores demostraron que el dansilo localizado en el 309 residuo 7, residuo alejado del centro amiloideo (NAC), resultó más sensible que los 310 dansilos cercanos a la región NAC, pues presentó el mayor desplazamiento hacia menores 311 longitudes de onda. Cuando se monitoreó la fluorescencia del dansilo 7, éste presentó una 312 cinética de agregación temprana comparado con los dansilos localizados en los residuos 26 313 y 100, sugiriendo que la vía para la formación de amiloides, se desarrolla inicialmente a 314 partir de las regiones desordenadas N- y C-terminales seguido por los residuos localizados 315 en el centro hidrofóbico o NAC (Yap {\it y col}., 2011). Así pues, los espectros de emisión 316 de fluorescencia de la alfa-sinucleína dansilada obtenidos en este trabajo sugieren que la 317 proteína se encuentra en estado temprano de agregación ya que el tiempo promedio 318 encontrado por Yap y colaboradores para que esto ocurra son 22 horas aproximadamente, 319 lo cual se encuentra dentro del margen de tiempo empleado para el marcaje y el proceso 320 cromatográfico. 321 En la Figura 4 se presenta el análisis electroforético de una muestra de alfa-sinucleína 322 dansilada. La tinción con Coomassie muestra en los carriles 2 y 4 una banda con una 323 movilidad electroforética en torno a 15 kDa de peso molecular que corresponden al 324 monómero de alfa-sinucleína. Cuando el gel se observa en un transiluminador ultravioleta 325 aparece una banda fluorescente (carril 1) que coincide con la banda correspondiente a la 326 proteína. Esto demuestra que el tratamiento ha permitido la incorporación del fluoróforo a 327

Figura 3. Espectros de emision de fluorescencia de la alfa-sinucleına dansilada (22.7 µM) y del Cloruro de dansiloen buffer Hepes 10mM pH 7 conteniendo 100mM NaCl. La fluorescencia se representa en unidades arbitrarias.

Un procedimiento similar se utilizo para marcar elextremo amino-terminal de mutantes de cisteınasde la alfa-sinucleına empleando como sonda el5-(2-iodoacetil)amino-etil-amino-naftalen-1-acidosulfonico (Dns) con el fin de analizar los detallescineticos durante la formacion del amiloide (Yap ycol., 2011) y tambien para evaluar la interaccion de laalfa-sinucleına con la sinfilina, una proteına presenteen los cuerpos de Lewy caracterısticos de los pacientescon Parkinson (Yuan-Yuan y col., 2010). En la Figura2 se muestra el perfil de elucion de la alfa-sinucleınatratada con cloruro de dansilo tras medir la absorcionde las fracciones cromatograficas a 280 nm y 340nm. El primer pico corresponde a la alfa-sinucleınamarcada covalentemente con la sonda fluorescentemientras que el segundo pico corresponde al excesode sonda que no se unio a la proteına. Las fraccionesde proteına marcada se recogieron y cuantificaronpara posteriormente realizar su espectro de emision defluorescencia.

En la Figura 3 se comparan los espectrosde emision de fluorescencia de la alfa-sinucleınadansilada y de la sonda libre en buffer. El espectro dela proteına-dansilada presenta un maximo de emisionen torno a 430 nm caracterıstico de un dansilo enentorno no polar mientras que la sonda en bufferpresenta un maximo entorno a 490 nm (Lacowicz,2009). En estudios realizados con otras proteınasdansiladas, se ha observado que cuando el fluoroforose inserta en regiones hidrofobicas de la membrana

se produce un cambio cualitativo y cuantitativoimportante en sus propiedades fluorescentes, queincluye en la mayor parte de los casos, un incrementoen el rendimiento cuantico de la emision defluorescencia del dansilo, ası como un desplazamientosignificativo de las longitudes de onda a lasque se observa esa emision a valores menores(desplazamiento al azul) (Schuman y col., 1997;Perez-Paya y col., 1997). El hecho de que el fluoroforounido a la alfa-sinucleına presente un maximo deemision a menores longitudes de onda sugiere que eldansilo esta protegido del efecto apagador del agua,lo que podrıa ocurrir al originarse la formacion deagregados proteicos.

Yap y col., (2011) evaluaron los eventos queocurren durante la formacion de fibras amiloides enel segmento N y C-terminales de la alfa-sinucleınaelaborando para ello, mutantes de cisteınas endiferentes posiciones (G7C, Y136C, V26C y L100C)y posteriormente realizando la derivatizacion concloruro de dansilo, una sonda sensible al entorno.Estos autores encontraron que tras la agregacionproteica, la fluorescencia del dansilo presenta cambiosdrasticos y residuo especıficos. Se observo que laintensidad de fluorescencia global se incrementa entre1.6 a 3 veces, presentandose ademas desplazamientosespectrales hacia el azul (menores longitudes de onda)entre 16 y 42 nm, indicando que todos los sitiosdansilados fueron secuestrados del entorno acuosoa un ambiente mas hidrofobico. Estos autores

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demostraron que el dansilo localizado en el residuo 7,residuo alejado del centro amiloideo (NAC), resultomas sensible que los dansilos cercanos a la regionNAC, pues presento el mayor desplazamiento haciamenores longitudes de onda. Cuando se monitoreo lafluorescencia del dansilo 7, este presento una cineticade agregacion temprana comparado con los dansiloslocalizados en los residuos 26 y 100, sugiriendo quela vıa para la formacion de amiloides, se desarrollainicialmente a partir de las regiones desordenadas N-y C-terminales seguido por los residuos localizadosen el centro hidrofobico o NAC (Yap y col., 2011).Ası pues, los espectros de emision de fluorescencia dela alfa-sinucleına dansilada obtenidos en este trabajosugieren que la proteına se encuentra en estadotemprano de agregacion ya que el tiempo promedioencontrado por Yap y colaboradores para que estoocurra son 22 horas aproximadamente, lo cual seencuentra dentro del margen de tiempo empleado parael marcaje y el proceso cromatografico.

En la Figura 4 se presenta el analisiselectroforetico de una muestra de alfa-sinucleınadansilada. La tincion con Coomassie muestra enlos carriles 2 y 4 una banda con una movilidadelectroforetica en torno a 15 kDa de peso molecularque corresponden al monomero de alfa-sinucleına.

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la alfa-sinucleína. Nuevamente, el hecho de que el valor del peso molecular no se vea 328 alterado da idea de que el proceso de agregación se encuentra todavía en etapas muy 329 tempranas. 330 331

332 Figura 4. Electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes. 333 A) Fotografía del gel de electroforesis obtenida mendiante transiluminación con 334 lámpara ultravioleta previo a la tinción. Se muestra la alfa-sinucleína dansilada 335 (carril 1) y cloruro de dansilo usado como control (carril 2). B) Fotografía del gel de 336 electroforesis después de la tinción de Coomassie, el carril 1 corresponde a la alfa-337 sinucleína tratada con cloruro de dansilo y el carril 3 a la alfa-sinucleína control. En 338 ambos geles se muestra el marcador de peso molecular (PM). 339

340 341 4. Conclusión 342 343 El control fino del pH de la reacción permite optimizar el marcaje de la proteína alfa-344 sinucleína en una sola posición, selectivamente en el grupo amino-terminal. La sonda unida 345 covalentemente al extremo N-terminal de la alfa-sinucleína no se encuentra tan expuesta al 346 entorno acuoso como la sonda libre. Esta metodología permitirá el estudio de interacciones 347 lípido-proteína de la misma en complejos lipoproteicos, sin la necesidad de emplear la 348 biología molecular para obtener mutantes con buenas características espectroscópicas. Sin 349 embargo es importante considerar el tiempo de manejo de la muestra para evitar que 350 ocurran eventos tempranos de agregación. 351 352 353 5. Agradecimientos 354 355 Este trabajo fue realizado con el apoyo del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología bajo 356 el Proyecto No. C.B. 2014 236834. El primer autor agradece el apoyo del CONACYT por 357 la beca otorgada para la realización del trabajo de Tesis de Licenciatura bajo el convenio 358 22936. 359 360 361 362 363 364

Figura 4. Electroforesis en gel de poliacrilamida encondiciones desnaturalizantes. A) Fotografıa del gelde electroforesis obtenida mendiante transiluminacioncon lampara ultravioleta previo a la tincion. Semuestra la alfa-sinucleına dansilada (carril 1) y clorurode dansilo usado como control (carril 2). B) Fotografıadel gel de electroforesis despues de la tincion deCoomassie, el carril 1 corresponde a la alfa-sinucleınatratada con cloruro de dansilo y el carril 3 a la alfa-sinucleına control. En ambos geles se muestra elmarcador de peso molecular (PM).

Cuando el gel se observa en un transiluminadorultravioleta aparece una banda fluorescente (carril1) que coincide con la banda correspondiente a laproteına. Esto demuestra que el tratamiento hapermitido la incorporacion del fluoroforo a la alfa-sinucleına. Nuevamente, el hecho de que el valor delpeso molecular no se vea alterado da idea de que elproceso de agregacion se encuentra todavıa en etapasmuy tempranas.

ConclusionEl control fino del pH de la reaccion permite optimizarel marcaje de la proteına alfa-sinucleına en una solaposicion, selectivamente en el grupo amino-terminal.La sonda unida covalentemente al extremo N-terminalde la alfa-sinucleına no se encuentra tan expuesta alentorno acuoso como la sonda libre. Esta metodologıapermitira el estudio de interacciones lıpido-proteına dela misma en complejos lipoproteicos, sin la necesidadde emplear la biologıa molecular para obtenermutantes con buenas caracterısticas espectroscopicas.Sin embargo es importante considerar el tiempo demanejo de la muestra para evitar que ocurran eventostempranos de agregacion.

AgradecimientosEste trabajo fue realizado con el apoyo del ConsejoNacional de Ciencia y Tecnologıa bajo el ProyectoNo. C.B. 2014 236834. El primer autor agradece elapoyo del CONACYT por la beca otorgada para larealizacion del trabajo de Tesis de Licenciatura bajoel convenio 22936.

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