Selected Applications of Laser Scissors And

7/27/2019 Selected Applications of Laser Scissors And

1/22

C H A P TE R 2

Selected Applications of Laser Scissors andTweezers and New Applications in

Heart Research

K a r l O t t o G r e u l i c hLeibniz Institute for Age Research/Fritz Lipmann Institute, D-07745 Jena, Germany

I. Laser MicromanipulationEarly European Contributions

II. Laser Microinjection of Genetic Material into Plant Cells

A. Laser Transfection of Animal and Plant Cells

B. Survival of Laser-Treated Rapeseed Cells and Transient Laser

Transfection of the Glucuronidase Gene

C. Stable Incorporation into Rapeseed Cells and Recovery of Modified

Tobacco Plants

D. Transfection of Isolated Chloroplasts and Perforation of Chloroplasts

Inside Living Cells

III. Preparation of Plant Protoplast Membrane and Chromosome Segments

A. Preparation of the Protoplast Membrane in Root TipsB. Preparation of Chromosome Segment-Specific DNA Probes Using

Laser Scissors

IV. Laser-Induced Cell and Protoplast Fusion

V. Optical Tweezers Complement the Laser Microbeam

A. Combined Use of Laser Scissors and Tweezers to Isolate

Chromosome Segments

B. Trapping Lasers Can be Used as Scissors in Selected Plant Cells

C. Simulating Microgravity in the Alga Chara

VI. The Attack of a Natural Killer Cell on a Leukemia Cell

VII. Laser Microbeams and Optical Tweezers for Heart Research

A. The Role of Fibroblasts in Heart Mechanics and in Complications after

Heart InfarctionB. Chicken Embryo Heart Tissue as a Model to Study Wound Healing and

Coordination of Heart Beating by Calcium Waves

METHODS IN CELL BIOLOGY, VOL. 82 0091-679X/07 $35.00Copyright 2007, Elsevier Inc. All rights reserved. 59 DOI: 10.1016/S0091-679X(06)82002-9


2/22

C. Optomechanical Stimulation of a Single Cell Starts a Calcium Wave in

the Whole Tissue

D. Injuries Through Laser Microbeam Heal Within 18 h, However,

Form Scars

References

T hi s c on tr ib ut io n b ri dg es t he g ap f ro m e a rl y E ur o pe an c on tr ib u ti on s v ia l as e r

m ic r om an ip ul at io n t o r ec e nt w or k o n t he u se o f l as er m ic r ob ea ms a nd o pt ic a l

t w e e z e r s i n s t u d i e s o f b a s i c a s p e c t s o f h e a r t i n f a r c t i o n . L a s e r t r a n s f e c t i o n , p a r t i c u -

l a rl y o f p l an t c e ll s a n d t h ei r c h lo r op l as t s, a n d l a se r m i cr o d is s e ct i on o f c h r om o so m es

w i th s u bs e q ue n t g e n er a ti o n o f c h ro m os o me s e gm e nt - sp e c ifi c D N A l i br a ri e s a n d

l a se r -i n du c e d c e ll f u si o n a r e r e p or t e d. W i th o p ti c a l t w e ez e r s, m ic r o gr a vi t y c a n b e

s i m u l a t e d i n r o o t s o f t h e a l g a Chara. S u r p r i s i n g l y , m i c r o g r a v i t y r e d u c e s g r o w t h . I n

s om e p la nt c e ll s, C W l as e rs , i n p ri nc i pl e s ui te d p ri ma ri ly f or o pt ic a l t we e ze rs , c an b e

u s e d a s m i c r o b e a m . A l s o , i t i s s h o w n t h a t n a t u r a l k i l l e r c e l l s m o u n t a n a t t a c k o n

l e u k e m i a c e l l s e v e n i n t h e a b s e n c e o f s p e c i fi c i t y , j u s t i n d u c e d b y e x e r t i n g f o r c e w i t ho p ti c al t w ee z e rs . F i n a ll y , w i t h t h e h e l p o f a l a se r m i cr o b ea m , l e s io n s c a n b e i n du c ed

t o s t u d y w o u n d h e a l i n g a f t e r h e a r t i n f a r c t i o n . A m o d i fi c a t i o n o f o p t i c a l t w e e z e r s ,

t he e ry th r oc yt e- me di at ed f or c e a pp li ca ti on ( EM FA ) t e ch ni qu e c an b e u se d t o

i n du c e c a lc i u m w a v e s n o t o n ly i n t i ss u e r e c on s ti t ut e d f r om e x c it a bl e h e ar t m u sc l e

c e l l s b u t a l s o f r o m n o n e x c i t a b l e fi b r o b l a s t s .

I . L a s e r M i c r om a n i p ul a ti o n E a rl y E u r op e a n Co n tr ib u ti o n s

T h e e a rl y s t or y o f m i cr o m an i pu l at i on b y l i gh t , s t ar t in g w i th c o nv e nt i on a l l i gh t

a nd b e in g c om pl et e d u si ng l as er s i n t he 1 96 0s , h as b e en d is c us se d i n C ha pt er 1b y B er ns , t hi s v ol um e. H e c an b e s e en a s t he f at he r o f l as er s ci ss o rs , l as er m ic r o-

b e a m s , o r l a s e r s c a l p e l s , a s t h e y a r e t e r m e d a l m o s t s y n o n y m o u s l y , a l t h o u g h o t h e r s

h av e p ub li sh ed a f ew e ar li er p ap er s (Bessis e t al . , 1 96 2) , b ut d id n ot c on ti nu e

t o d e ve l op l a se r i r ra d ia t io n i n to a w o rk a bl e t o o l f o r t h e c e l l b i o l og i st . I n M i ch a el

B er ns fi rs t p ub li ca ti on s o n l as er m ic ro ma ni pu la ti on , h e r ep or te d o n t he

eVe c ts o f l as e r m ic r oi rr ad ia ti on o n c hr om os om es , a mo ng t he m i n Nature, in

1 96 9 (Berns et al . , 1 9 69 a ,b , c) , a nd a s e ar ly as 1 974 he p ub lis he d a fi rs t b ook

o n t h e B io l o g ic a l M i c r oi r r a di a t i on (B e r n s , 1 9 7 4) . A s ho rt v er si o n o f t hi s e ar ly

s to ry o f l as er m ic r oi rr ad ia ti on i s w el l a cc e ss ib le t o t he i nt er e st ed r e ad e r i n a n

a rt ic le w hi ch a pp e ar e d i n Science in 1981 (Berns et al . , 1 98 1; f ul l- te xt c op y

r e pr in te d i n t hi s b oo k) . S om e p ub li ca ti on s a pp ea re d v er y r ec e nt ly , s o h is w or kc o ve r s m or e t h an a t h ird of a ce ntury (B ot vi ni ck a nd B er ns , 2 00 5; N as ci me nt o

e t a l . , 2 0 06).

I n t he 1 97 0s , t he t ec hn iq ue r ea ch ed E ur op e, p ar ti cu la rl y w it h t he h el p o f

T h om a s a n d C h ri s to p h C r e me r . T h ey u s e d t h e t e ch n iq u e t o c o nfi r m t h e c l as s ic a l

60 K a r l O t t o G r e ul i c h


3/22

c o n c e p t o f c h r o m o s o m e t e r r i t o r i e s ( f o r a w e l l a c c e s s i b l e , t h o u g h n o t e a r l i e s t p a p e r ,

see Cremer e t a l . , 1 9 8 2) , l o n g b e f o r e t h e c h r o m o s o m e t e r r i t o r i e s w e r e v i s u a l i z e d b y

c h ro m os o me - sp e c ifi c D N A- p ai n ti n g p r ob e s. O n e o f t h ei r c o ll a bo r at i ve p a rt n er s

w ho u se d t he l as e r m ic r ob e am t o s tu dy Drosophila d e v e l op m e n t (Lohs-Schardin

e t a l . , 1 9 79) w as C hr i st in e N us sl ei n V ol lh ar d, a nd s he l at er w on t he 1 99 9 N ob el

p ri ze i n B io lo gy a nd M ed ic in e . F or s om e y ea rs , a ls o J ur g e n B e r e i te r - H ah n p i o -

n e e re d l a se r m i cr o b ea m s i n c e ll b i ol o gy (B e r e i te r - H a hn , 1 9 7 2) b u t t h e n d e d i c a t e d

h i s w o r k t o o t h e r s u b j e c t s .

I n 1 9 86 , t h e s e c on d t o ol f o r l a s e r m i cr o ma n ip u la t io n b y l i gh t w a s i n ve n te d b y

A r th u r A s hk i n (Ashkin e t a l . , 1 9 8 6) : t h e s i ng l e- b ea m o p ti c al t r ap o r o p ti c al t w ee -

z e r s o r l a s e r t w e e z e r s . N o t a b l y , t h i s s t o r y a l s o h a s a N o b e l p r i z e w i n n e r i n v o l v e d :

S t ev e C h u w h o w o n t h e 1 9 97 p h ys i cs p r iz e f o r h i gh - pr e c is i o n o p t i ca l t r ap p in g o f

a to ms a nd h e w as o ne o f t he a ut ho rs o f t he s e mi na l p ap er m en ti o ne d a bo ve . T he

p r es e n t c o n t r ib u ti o n d o es n o t p r i m a ri ly f o cu s o n t h e i s ol a te d u s e o f o p ti c a l t w e e -

z e r s , b u t r a t h e r i n t h e c o n t e x t o f c o m p l e t e m i c r o m a n i p u l a t i o n b y l i g h t . N e v e r t h e -

l es s, t he p io ne e ri ng w or k o f S te ve B lo ck s g ro up (Block et a l . , 1 98 9) s ho ul d b e

m en ti on ed . A b oo k d ev ot ed c om pl et e ly t o l as er t we e ze r s a pp e ar e d i n 1 99 8 a s

V ol um e 5 5 o f t he s er ie s M et ho ds i n C el l B io lo gy (S h e e t z, 1 9 9 8) o f w hi ch t hep r e s e n t b o o k i s V o l u m e 8 2 .

T h e m a r r i a g e o f t h e t w o t e c h n i q u e s a n d t h u s t h e p o s s i b i l i t y t o p e r f o r m c o m p l e t e

m ic ro sc op e m ic ro ma ni p ul at io n b y l ig ht w as fi rs t p ub li sh ed i n 1 98 9 (Greulich

e t a l., 1 98 9) . P ro ba bl y, s in c e i t a pp ea re d i n t he G er m an l an gu ag e , l it tl e n ot ic e

w as t ak en o f t hi s w or k p ar ti cu la rl y i n t he U ni te d S ta te s f or a n um be r o f y ea r s.

A r ou n d t h i s t i me , q u it e a n u mb e r o f t e ch n iq u es u s e fu l f o r t h e c e ll b i ol o gi s t h a v e

b e e n d e v e l o p e d i n E u r o p e . T h e fi r s t b o o k o n c o m p l e t e l a s e r m a n i p u l a t i o n b y l i g h t

a p p e a r e d a t t h e e n d o f 1 9 9 0 s ( G r e u l i c h , 1 9 9 9) . T h e r e a n d i n o t h e r c o n t r i b u t i o n s o f

t h e p r es e nt b o ok , e x pe r im e nt a l d e ta i ls o n t h e c o n st r uc t io n o f l a se r m i cr o be a ms

a nd o pt ic al t we ez er s c an b e f ou nd . T he f ol lo wi ng d es cr ip ti on i n t he p re se nt

c ha pt er w il l s um ma ri ze o nl y a pp li c at io ns r ep o rt ed i n p ar t o f e ar ly E ur op ea nw or k ( if n ot r ep or te d e ls ew he re i n t hi s b oo k) a nd w il l fi na ll y b ri dg e t he g ap

b et we en r ec e nt w or k o n t he u se o f t he l as er m ic r ob ea m a nd o pt ic al t we e ze rs t o

s t ud y s o me b a si c a s pe c t s o f h e ar t i n fa r c ti o n.

I I . L a se r M i cr o in j ec t i on o f G e ne t ic M a te r ia l i n to P l an t C e ll s

A . L a se r T ra n sf e ct i on o f A n im a l a n d P l an t C e ll s

W it h t he m an y t ec hn iq ue s a va il ab l e f or i nt ro du ci ng f or ei gn g en es i nt o c el ls ,

i t w ou ld n ot a pp ea r n ec e ss ar y t o i nt ro d uc e a n a dd it io n al t ec hn iq ue . H ow ev er ,

i n tr o du c t io n o f g e ne s i n to s e le c t ed i n di v id u al c e ll s i n s u sp e ns i o n i s s t il l d iY

cult.A d di t io n al l y, p l an t c e ll s a r e p a rt i cu l ar l y d iYc u lt t o t ra ns fe c t b ec au se t he y a re

s u rr o un d ed b y a r i gi d c e ll u lo s e w a ll . A l th o ug h w a ll s m a y b e r e mo v e d e n z y m at i -

c a ll y , n o t a l l t h e r e su l ti n g p r ot o pl a st s c a n b e r e ge n e ra t ed i n to p l an t s. T h er e fo r e ,

m a n y d iVe r e n t a p p r o a c h e s w e r e t a k e n t o i n t r o d u c e c l o n e d g e n e s i n t o w h o l e p l a n t s

2 . S e l e ct e d A p pl i c a ti o ns o f L a s e r S c i s s or s a n d T w e e z er s a n d N e w A p p l i c at i o ns i n H e a rt R e s e ar c h 61


4/22

o r c el ls . W it h t he s ma ll f oc us o f a l as er m ic ro b e am ( d ia m et e r l e ss t ha n 1 mm) , t he

c e ll w al l c an b e o pe n ed , m in im iz i ng d am ag e t o t he r e ma in d er o f t h e c el l (Weber

et a l ., 1 98 8, 1 989).

I n t e r es t i n g ly , t h e fi r s t e x p e r im e n t s u s i n g a l a s e r m i c r o b e a m t o t r a n s f e c t a n i m a l

cells were publish ed i n a ph ys ic s jo ur na l (Tsukakoshi et al ., 1984) . T h es e a ut h or s

(Kurata et al . , 1 98 6) a n d M ic h ae l B er n s g ro up (Tao et al . , 1 98 7) w e r e s u c c e s s f u l i n

t ra ns fe c ti ng a n um be r o f d iVe re nt c el l t yp es w it h d iVe re nt m at er ia ls ( se e a ls o

C h ap t e r 1 b y B e rn s , t h is v o lu m e ) . T r a n sf e c ti o n o f p l an t c e ll s w a s s u b s e qu e n tl y

p u bl i s h ed (Guo et al . , 1 9 95 ; W e be r et al . , 1 9 88) . L a s e r h o l e s i n m e m b r a n e s o f c e l l s o f

B r a s s ic a n a p u s or N i c ot i a n a t a b ac u m w e r e r e co r d ed o n v i d eo . A fl u or e s ce n t d y e w a s

t a k e n u p t h r o u g h l a s e r h o l e s i n t o p l a s m o l y z e d c e l l s f o r l e s s t h a n 5 s . W i t h i n c a . 5 s

a f te r i r ra d ia t io n t h ey w e re c l os e d (Weber e t a l . , 1 98 9) . H o we v e r, l o we r e d m e mb r an e

fl u i d i t y a t t e m p e r a t u r e s b e l o w 1 1C p r e v e n t e d t h e s e l f h e a l i n g o f l a s e r h o l e s . O b v i -

o us ly , t he o pe ni ng t im e o f a l as er h ol e c an b e m an ip ul at ed t o a f ar e xt en t b y a

s u i t a b l e c h o i c e o f t e m p e r a t u r e .

B . S u r v i v a l o f L a s e r- T r ea t e d R a p e s e e d C e l l s a n d T r a ns i e n t L a s e r T r a n sf e c t io n o f t h eGlucuronidase Gene

S u rv i va l o f c e ll s w a s s t u d ie d i n B . n a pu s. A f te r l a se r m i cr o pe r fo r a ti o n, 8 0 % o f

s in gl e c e ll s a nd 3 0% o f i mm at ur e p ol le n g ra in s s u rv iv ed . O ne d ay l at er , 4 0% o f

c e l ls a n d 2 5 3 0% o f p o ll e n g r a i ns w e re a l iv e a n d c o n t in u ed t o g r ow .

T he p ro to pl as m o f p la nt c el ls s hr in k i n h yp e rt on ic s ol ut io ns . W he n t he c e ll

m e m b r a n e o f B . n a p u s i s m i c r o p e r f o r a t e d b y a l a s e r m i c r o b e a m , t h e c e l l s i n c o r p o -

r a t e e x t r a c e l l u l a r m e d i u m u n t i l t h e y r e a c h t h e i r o r i g i n a l v o l u m e . T h i s eVe c t c a n b e

e x pl o it e d t o t r an s fe r m a te r ia l , f o r e x am p le f o re i gn D N A, f r om t h e e n vi r on m en t

i n t o t h e c y t o p l a s m .

A n u m b e r o f c o n s t r u c t s h a v e b e c o m e a v a i l a b l e t o m o n i t o r e x p r e s s i o n o f a g e n e

a f te r D N A t r a n s fe r i n to a c e ll . B a ct e ri a l g l u c ur o ni d as e ( G US ) w i th t h e 3 5 s p r o-m ot er o f C a u li fl o w er m o s ai c v i r us l en ds i ts e lf t o m ea su r e t he eYc ie n cy o f D NA

u p ta k e i n t o h i gh e r p l an t c e l ls . W h en i t i s e x pr e ss e d , t h e t r an s fe c t ed c e l l a d o p ts a

b l ue ( i nd i go ) c o l or , w h ic h a l lo w s d i re c t v i su a li z at i on o f t r an s ie n t e x pr e s si o n. I n

d e v e l op i n g e m b r yo s o f B . n a pu s, t he e xp re ss i on o f G US a nd i ts t im e c o ur se w as

f o ll o we d f o r 2 4 h a f te r l a se r t r ea t me n t. T h e e n z ym e a c ti v it y r e ac h e d a m a xi m um

a f t e r 9 6 h ( F i g . 1).

C . S t a b l e I n c o r p o r a t i o n i n t o R a p e s e e d C e l l s a n d R e c o v e r y o f M o d i fi e d T o b a c c o P l a n t s

S i ng l e c e ll s o f B . n a pu s w e r e u s e d t o s t ud y l a se r t r an s fe c t io n o f p l as m id D NA

i n to t h ei r g e no m e . C e l l s w e r e p l as m ol y ze d a n d s h ru n ke n t o 8 0 % o f t h ei r v o lu m ei n t h e p r e se n ce o f D N A c o nv e yi n g r e s i s ta n ce t o t h e a n ti b io t ic h y gr o my c in ( p RT

1 0 2 h p h ) . D u r i n g t h i s t i m e , e a c h c e l l r e c e i v e d o n e l a s e r p u l s e i n t o i t s c e l l w a l l a n d

p l as m a m e mb r an e . T h ro u gh t h e t e mp o r ar y o p en i ng i n t h e m e mb r a ne , D N A a n d

buVe r e nt er e d t he c yt op l as m o f t he c el ls s we ll in g t he m t o t he ir o ri gi na l v ol um e .



5/22

A p p r o xi m a t e ly 1 106 m ol ec ul es w er e i nc or po ra te d i nt o e ac h c el l a t a D NA

c o n c e n t r a t i o n o f 1 mg/ml . I n 1 h , 1 0 0 0 c e l l s c o u l d b e i r r a d i a t e d . A f t e r i r r a d i a t i o n o f

i n d i vi d u a l c e l l s $2 0 % o f t h e c e ll s w e re r e s is t an t t o t h e a n t i bi o ti c h y gr o my c in a n d

r e ta i ne d t h ei r r e si s ta n ce o v er m a ny c e ll g e ne r at i on s i n t h e a b se n c e o f s e le c ti o n.A p a rt i cu l ar l y a t tr a ct i ve a p pl i ca t io n o f l a se r t r an s fe c t io n i s t h e g e ne t ic m o di fi -

c at io n o f o nl y a f ew c e ll s i n a w ho le t is s ue . T hi s h as b ee n a ch ie ve d w it h r ap es ee d

e m br y os . T h e e m br y o i s i n a s o lu t io n c o n ta i ni n g t h e G U S g e n e d e sc r ib e d a b ov e .

I nd iv id u al c el ls o f t he e mb r yo a re t ar ge t ed a nd m ic ro p er fo ra te d w it h t he l as e r

m i c r o b e a m . T h e y t a k e u p a n d e x p r e s s t h e g e n e . T h i s c a n b e s e e n b y t h e d a r k c o l o r

t h e y a d o p t (F i g . 2).

S in c e t he f re q ue nc y o f p la nt r eg en e ra ti on f ro m s in gl e c e ll s o f N . t a ba c um is

k n o w n t o b e b e t t e r t h a n i n m o s t o t h e r p l a n t s p e c i e s , i n d i v i d u a l t o b a c c o c e l l s w e r e

u s ed i n t h e f o ll o wi n g e x p er i me n t t o c o mp a re f r e qu e n ci e s o f t r an s fo r ma t io n o b -

t ai ne d w it h a l as er m ic r ob ea m t o t ho se o bt ai ne d b y o th er m et ho ds . C el ls w er e

i r ra d ia t ed d u ri n g p l as m ol y si s . A f te r 7 d a ys o f c u lt u re , l a se r -t r e at e d a n d c o nt r ol

c ell s we re s ub je ct ed t o a l et ha l d os e o f t he a nti bi ot ic . Fr om a to ta l o f 4 72

i rr ad ia te d c e ll s, 2 f er t il e p la nt s w er e r eg en er at e d w hi ch h ad t he e n ti re h ph g en e

i n co r po r at e d i n to t h ei r g e no m e. A f r eq u en c y o f 4 . 2 103 b a se d o n c e l ls t r ea t ed

b y t h e l a s e r m i c r o b e a m w a s f o u n d . T h i s i s c o m p a r a b l e t o o t h e r eYc i e n t m e t h o ds

Expression (%)80

60

40

20

020 40 60 800 100

Time (h)

F ig . 1 T r an s ie n t e x pr e ss i on o f G U S i n e m br y os o f B . n a p us. P l as m id D N A w a s i n co r po r at e d i n toc e ll s b y l a se r i r ra d ia t io n . E xp r es s io n o f t h e r e po r te r g e ne w a s f o ll o we d o v er 4 d a ys b y h i st o ch e mi c al

s t ai n in g. T w en t y- f ou r h o ur s a f te r t h e u p t a ke o f D N A, a t o ta l o f 4 4% o f t h e e m br y os e x pr e ss e d t h e

m a r k e r g e n e . T h e i r n u m b e r i n c r e a s e d t o 5 7 % a n d 7 1 % , r e s p e c t i v e l y , a f t e r 2 a n d 4 d a y s o f c u l t u r e .



6/22

f o r t r a n sf o r m at i o n o f p r o t o pl a s t s ( Weber e t a l . , 1 9 9 0) . T h es e t o ba c co p l an t s c o n-

v ey ed t he h yg ro m yc in g en e t hr ou g h m ei os is i nt o w ho le p la nt s o f t he f ol lo wi ng

generation.

D . T r a n sf e c t io n o f I s o la t e d C h l o r o p la s t s a n d P e r f o r a t i o n o f C h l o ro p l a st s I n s i de L i v i ng C e l l s

W he n c h lo ro pl as ts , w i th a d ia me t er o f o nl y a f ew m ic r om e te r , h av e t o b e t ra ns -

f e c t e d , l a s e r m i c r o i n j e c t i o n i s p a r t i c u l a r l y u s e f u l . T y p i c a l l y , a s m a l l n u m b e r o f D N A

m o le c ul es a re p r es e nt i n o ne c h lo ro pl as t. P r ot ei ns c o de d b y t he c hl o ro pl as ts a re

s y n th e s iz e d u s in g a p r o ka r yo t i c m e c h a ni s m . I n t h e p r es e n t e x pe r i me n t , t h e m e m -

b r a ne o f i s o la t e d c h l or o p la s t s w a s o p e ne d w i th s i ng l e l a s er s h o ts . H o w ev e r , c o m pa r e dt o i r r a d i a t i n g c e l l w a l l s , t h e e n e r g y o f a l a s e r p u l s e h a d t o b e a t t e n u a t e d t o p r e v e n t

b u r st i ng o f t h e o r g an e ll e s . F u r th e r mo r e , t h e i n te g ri t y o f t h e e n t ir e c h l or o p la s t w a s

c r it ic a ll y d e pe n de n t o n e x ac t f oc u si ng o f t he l as e r. F or s c or in g a h i t o f t h e m e mb r an e ,

a v i s i b l e eVe c t o n t h e b r i g h t fi e l d i m a g e o f t h e c h l o r o p l a s t w a s r e c o r d e d .

P a rt ic u la r ly i nt er e st in g w as t he t r an s fe r o f m at e ri al f r om t he c yt op l as m i nt o a

c h l or o p la s t i n s i d e a l i vi n g c e l l (F i g . 3) . F or t ha t p u rp os e , t he l as e r m ic ro b ea m w as

f oc us ed o nt o s uc h a s in gl e c hl or op la st . T he m em br an e o f t he c hl or op la st w as

p e r f o r a t e d w i t h o u t d a m a g i n g t h e p l a s m a m e m b r a n e o f t h e c e l l a n d m a t e r i a l e n t e r e d

the chloroplast.

I n o r d e r t o t r a n s f e c t f o r e i g n g e n e s i n t o t h e c h l o r o p l a s t , i t w a s e s s e n t i a l t h a t t h e

l as er -i nd uc e d h ol e i n t he c hl or op la st m em br a ne b e s e al ed q ui ck ly a ft er l as e rt re at me n t. T he s ma ll d ia me te r o f t he l as er f oc u s ( le ss t ha n 1 mm ) a nd i ts s ma ll

d ep th o f fi eld m ak e it f ea sib le to a im t he l as er e xa ct ly at t he m em br an e o f

c h lo r op l as t s i n s i d e o f c e ll s . T h u s , t h e l i f e ti m e o f t h e l a s e r h o le s c o ul d b e s t ud i e d.

F r om i r ra d ia t io n o f c h lo r op l as t s i n si d e o f c e ll s o f B . n a pu s, a s eq ue n ce o f e ve nt s

F ig . 2 M i cr o in j ec t io n o f t h e G U S g e n e i n to s e le c te d c e ll s o f a r a pe s ee d p l an t e m br yo . C e ll s t h ate x p r e s s t h e g e n e a p p e a r d a r k ( i n d i g o ) , a s i n d i c a t e d b y t h e a r r o w .



7/22

w as r ec or de d o n v id eo a t 4 00 0 m a gn i fic a ti o n. T h e d a ta i n di c at e d t h at a l a se r

h ol e i n t he c hl or op l as t m em br a ne l as te d 1 .2 s o r l es s (Weber e t a l . , 1 9 89).

I I I. P r ep a ra t io n o f P l an t P ro t op l as t M e mb r an e a n d

Chromosome Segments

A . P r ep a ra t io n o f t h e P r ot o pl a st M e mb r an e i n R o ot T i ps

U n l i k e t h e c e l l m e m b r a n e i n a n i m a l c e l l s , t h e p l a s m a m e m b r a n e o f p l a n t c e l l s i s

n o t e a s il y a c ce s s ib l e t o e x pe r im e nt a l m a ni p ul a ti o n, s i nc e i t i s p r ot e c te d b y a r i gi d

c e l l w a l l . T h e u s u a l s t r a t e g y t o g e t a c c e s s t o t h e p l a s m a m e m b r a n e i s b y e n z y m a t i c

d i ge s ti o n. T h is m e an s , h o we v e r, t h e c e ll w i ll b e s u bj e c te d t o c o ns i de r ab l e s t re s s.

A ls o, l oc al r e mo va l o f t he c e ll w al l i s n ot p os si bl e. H er e , t h e l as er m ic r ob ea m c an b e

u se d l it er al ly a s a m ic r os ca lp el . T hi s m ic r os ca lp el c an , f or e xa mp le , b e u se d t o

p r ep a re p r ot o pl a st s f r e e o f c e l l w a l l s i n M e d ic a g o s a t i va (Kurkdjian e t a l . , 1 9 93).A ft er d is se c ti ng t he t ip s o f r oo t h ai rs , t he p ro to p la sm i s e xp e ll ed t hr ou gh t he

s m a l l h o l e i n t h e c e l l w a l l . W h e n a s uYc i e nt a m ou n t o f p r ot o pl a sm i s e x pe l le d , i t

a s su m es a s p he r ic a l s h a p e a n d c a n s e p a r at e i t se l f f r om t h e r o ot h a ir . B y s t ai n in g

w i t h t h e c e l l u l o s e - s p e c i fi c d y e T i n o p a l , i t c a n b e s h o w n t h a t t h e n e w l y f o r m e d p r o -

t o pl a st i s v i rt u al l y f r ee o f c e l l w a l l c o mp o n en t s. S u c h p r o t op l as t m a te r ia l m a y b e

b e tt e r s u it e d f o r p l an t m e mb r an e s t ud i es t h an p r ot o pl a st s o b ta i ne d b y e n z ym a ti c

d i g e s t i o n o f t h e c e l l w a l l , s i n c e t h e l a t t e r a l w a y s c o n t a i n s r e s i d u a l c e l l w a l l m a t e r i a l

a n d s i nc e t h e d i ge s t io n i t se l f s i gn i fic a nt l y m o di fi es t h e m e mb r an e p r op e rt i e s (F ig . 4).

B . P r e p ar a t i on o f C h r o mo s o m e S e g m e n t -S p e c i fic D N A P r o b e s U s i n g L a s e r S c i s s or s

F o r a l a r g e n u m b e r o f g e n e t i c d i s e a s e s , i t i s k n o w n i n w h i c h c y t o g e n e t i c r e g i o n

o f t he m et ap ha se c hr om os om es t he y a re l oc at ed . F or b as ic s tu di es a s w el l a s f or

d i a g n o s t i c p u r p o s e s , D N A p r o b e s o f t h o s e r e g i o n s a r e n e e d e d . O n e a p p r o a c h i s t o

A B C

F i g . 3 M i c r o i n j e c t i o n o f m a t e r i a l f r o m t h e c y t o p l a s m i n t o a c h l o r o p l a s t i n t h e i n t e r i o r o f a r a p e s e e dc e ll . T h e l a s e r i s d i re c t ed o n to s u ch a c h lo r op l as t ( A ). I n ( B ), a h o le i s v i si b le i n t h e c h lo r op l as t m e mb r an e .

T h e c h l o r o p l a s t t a k e s u p s o m e o f t h e c y t o p l a s m i c m a t e r i a l t h e r e b y s l i g h t l y i n c r e a s i n g i t s v o l u m e ( C ) .



8/22

c ut s uc h a r eg io n o ut o f t he m et ap ha se c hr om os om e, t o i so la te i t, t o r em ov e

histo n es a n d o t he r p r o t ei n s, a n d t o a m pl i fy t h e D N A o f t h e c h r o m os o me s e g m ent

b y a mi c ro c lo n in g t e c hn i qu e o r by P C R. M i cr o di s s ec t io n c an b e p er f orm ed w it h

ultra fi n e g l a ss t o o l s , s i m il a r a s t h e y a r e u s e d i n p a t c h- c l a m pi n g . H o w e v er , h a n d l in g

s u c h m i cro m e c h an i c t o ol s r e qu i r e s an e x t r e m el y s k il l e d e x p e r i me n t e r. T he r ef or e,o t he r t o o l s s u c h a s t h e t i p o f a n a t om i c f o r ce m i cr o sc o p e h a ve b e e n s u gg e st e d . T h e

m o s t p r o m is i n g t o o ls , h o w e ve r , a r e l a s er s c is s or s , s i n ce t h ey c a n b e u s e d i n n o r m al

m i c r o s c o p e s , t h a t i s , p r o t o c o l s f o r t h e p r e p a r a t i o n o f t h e c h r o m o s o m e s n e e d n o t t o

b e m o d i fi e d a s c o m p a r e d t o c o n v e n t i o n a l t e c h n i q u e s f o r m i c r o d i s s e c t i o n .

A s m e n t i on e d a b ov e , o n e o f s e ve r al t e ch n iq u e s s u ch a s t h e p o ly m e r a se c h a i n

react i on ( PC R )- ba se d a pp ro ac he s y i e ld in g a p oo l o f D N A p ro be s w i th a s iz e o f a

f ew h un dre d b as es i n l en gt h c an b e u se d f or D NA a mp li fic at io n. O t he rs s u ch a s

m i cr o c lo n in g i n to p h ag e v e c to r s g e ne r at e k i lo b as e -s i z ed D N A p r ob e s. T h e t e ch -

n i qu e s d e sc r ib e d b y Hadano et al . ( 19 91 ) a nd D ja ba li et al . ( 19 91 ) combine laser

m i c r o di s s e c ti o n a n d d iVe r e nt P C R t e c hn i qu e s .

A n e l e c t r o n m i c r o s c o p i c s t u d y s h o w s t h a t w i t h u n s t a i n e d c h r o m o s o m e s , a n N2

-l a se r m i cr o be a m w o rk s w i th g o od a c c ur a cy i n t h e s u b mi c ro m et e r r a ng e (Ponelies

e t a l . , 1 9 8 9) . F o r b e t t e r l o c a l i z a t i o n , o n e w o u l d l i k e t o w o r k w i t h b a n d e d c h r o m o -

s o m e s . H o w e v e r , t h e a b s o r p t i o n o f U V l i g h t i s h i g h l y i n c r e a s e d a n d l a s e r p u l s e s o f

c o m p a ra b l e p o w e r d e n s i ty d a m a ge t h e c h r o m os o m e s .

A

C D

B

Fig . 4 P r e p ar a t i on o f p l an t p r o to p l as t - l i ke m a t e ri a l i n r o o t h ai r s o f M . s at i va e. T he t ip o f th e ro oth a i r i s c u t w i t h t h e l a s e r m i c r ob e a m. T h e m e m b ra n e a n d t h e u n d e r l yi n g c y t o pl a s m a r e p u s h ed o u t o f

t h e r o o t h a i r , a n d t h e p l a s m a m e m b r a n e b e c o m e s a c c e s s i b l e f o r s t u d i e s s u c h a s p a t c h - c l a m p i n g .



9/22

T he g en e ra ti on o f c hr om os om e s eg me n t- sp e ci fic D NA l ib r ar ie s a ft er l as e r

m i cr o di s s ec t io n w a s p r e se n te d b y Ponelies et al . ( 1 98 9 ) for Drosophila chromo-

somes; Eckelt et al . ( 1 98 9 ) f or h um an c hr o mo so me N o. 7 ; a nd Lengauer et a l .

(1991) f o r t h e u s e o f t h e l i b r a r y f o r c h r o m o s o m e p a n t i n g . W i t h m i c r o c l o n i n g , o n l y

p ic o gr a ms o r e ve n f em to gr am s o f D NA i n n an ol it e r v ol um es a re a va il ab le a s

s t ar t in g m a te r i al . O n t h e a v er a ge , 1 0 0 5 00 r e co m bi n an t c l on e s ( 1 3 k b i n l e ng t h)

a re p ro du ce d i n p ha ge i ns er t io n v ec to r s s uc h a s L am bd a Z ap ( St ra ta ge n e) w it h

$1 0 0 m i cr o d is s e ct e d c h r om o so m e s e gm e nt s a s s t ar t in g m a te r ia l (Eckelt et al .,

1989).

I V. L a s er - I nd u c e d Ce l l a n d P r o top l a s t F u s i on

C e l l f u s i o n c a n c o m b i n e t h e g e n o m e s o f d iVe r e n t c e l l s a n d t h u s , u n d e r f a v o r a b l e

c i r c u ms t a n c es , c o m b in e p r o p e r ti e s o f t h e o r i g in a l c e l l s . E s s e n ti a l l y, t h e b i o l og i c a l

p u rp o se o f s e x i s t o a c hi e ve s u c h a c o mb i na t io n o f p r op e r ti e s o f t h e t w o p a re n ts .

I n v it r o c e ll f us io n i s t he b as is f or t he g en e ra ti on o f h y br id om a c e ll s. H er e, t he

a i m i s t o c o mb i ne t h e p o te n ti a l t o p r od u c e s p e c i fic a n ti b od i e s o f B l y mp h oc y te s ,which i n v i t r o h a ve o n ly v e ry s h or t s u rv i va l t i me s , w i th t h e l o ng e vi t y o f m y el o ma

c e l l s . I n a l m o s t a l l c a s e s , t h e f u s i o n i s a c h i e v e d i n a b u l k e x p e r i m e n t , t h a t i s , m i l l i o n s

o f c e l l s w i t h d iVe r e nt s p e ci fi c it i e s a r e f u s e d a n d t h e w a nt e d s p e c i fi ci t y i s s u b se q ue n t ly

s c re e ne d f or i n p r oc e du re t ak in g s ev e ra l m on th s . I f t he f us io n c ou ld b e a ch ie ve d

u n d er c o m pl e te m i c ro s c op i c c o n tr o l, o n e m i g ht fi r s t s e l e c t t h e s i ng l e B l y mp h oc y t e

w it h t he w an te d s pe ci fic it y a nd f us e t he l at te r w it h a m ye lo ma c el l u nd er v is ua l

c o n t r o l . S c r e e n i n g w o u l d t h e n n o l o n g e r b e r e q u i r e d .

A t m o d e r a t e p o w e r d e n s i t y , s u c h a l a s e r f u s i o n c a n b e i n d u c e d . I f t w o c e l l s a r e

i n c on ta ct w it h e ac h o th er , t he y m ay b e f us ed b y a s ho rt s er ie s o f l as er p ul se s

(Wiegand e t a l . , 1 9 8 7) . T h e c o n t a c t m a y b e e s t a b l i s h e d e i t h e r b y a d h e s i v e f o r c e s o r

d u e t o h i g h c e l l d e n s i t y o n a m i c r o s c o p e s l i d e o r b y s p e c i fi c c o u p l i n g v i a a b r i d g i n gm o l e c u l e s y s t e m s u c h a s a v i d i n / b i o t i n . S o f a r , p l a n t p r o t o p l a s t s a n d d iVe r e n t t y p e s

o f i m m u n e c e l l s h a v e b e e n f u s e d w i t h e a c h o t h e r . I n t h e l a t t e r c a s e , t h e c o n t a c t w a s

e n ha n ce d u s in g t h e o p ti c al t w ee z e rs , a n d t h er e by t h e f u si o n y i el d c o u ld b e s i gn i fi-

c an tl y i mp r ov ed . T he m ec ha n is m o f l as e r- in du c ed c e ll f us io n i s n ot y et c le ar ,

a l th o ug h i t a p pe a rs r e as o na b le t o a s su m e t h at s u rf a c e t e ns i on i s i m po r t an t .

T he f us io n o f p la nt c e ll p ro t op la st s i s m o re d iYc u lt s in c e, f o r e a c h t yp e o f p la nt

c e ll , d iVe r en t p hy s ic oc h em ic al c o nd it io ns a re r e qu ir ed a nd i t t ak e s s om e t im e t o

o pt im iz e t h em . P ar t ic u la r ly c r it ic a l i s t h e a dj us tm en t o f o s mo ti c p r es s ur e o f t h e

e n v ir o n me n t w h i c h i s q u i te o f te n a c h ie v e d b y t h e u s e o f m a nn i t ol . U s ua l l y, p r ot o -

p la s ts a re p r ep ar e d f r o m p la nt l ea ve s b y d i ge s ti on o f t h e c e ll w a ll w it h a s ui ta bl e

e nz y me c o ck ta il . T he p r ot o pl as ts a re t ra n sf er r ed o nt o a c o ve rs l id e a t h i gh c o nc e nt r a-t i on . I n d iv i du a l p a i r s o f p r ot o p la s ts s t i ck t o g et h e r d u e t o t h e h y d r o p ho b i ci t y o f t h e ir

m em br an e s. I f t h is i s n ot t he c a se , c o nt ac t c an b e e st ab li s he d b y p u sh in g p r ot op la st st s

t ow a rd e ac h o t he r w it h t he o p ti c al t we e ze r s. I n t h e l at t er c as e , p r ot op la st s c an b e

s e le c te d , f or e x am pl e a c co rd in g t o t he ir s iz e o r t he n um b er o f c h lo ro p la s ts . I n o r de r t o



10/22

i n d uc e p r o to p la s t f u s io n , t h e l a s er m i c ro b e am i s s l i gh t ly d e fo c u se d a n d d i re c t ed t o t h e

c o n t a c t a r e a b e t w e e n t w o p r o t o p l a s t s . U s u a l l y , s i n g l e p u l s e s o r s h o r t s e r i e s o f 1 0 2 0

p u ls e s a re s uYc ie n t t o i nd uc e t he f us io n w h ic h i s c o mp le t ed a ft e r a f ew s ec o nd s u p t o

h a l f a m i n u t e , d e p e n d i n g o n t e m p e r a t u r e a n d m a n n i t o l c o n c e n t r a t i o n ( F i g . 5).

T h e eYc i e n c y o f l a s e r - i n d u c e d c e l l f u s i o n c a n b e s i g n i fi c a n t l y i n c r e a s e d w h e n , i n

a dd it io n t o t he l as e r m ic r ob e am , o pt ic al t we e ze rs a re u se d t o p us h t he c e ll s t o b e

f u se d t o wa r d e a c h o t he r (Steubing e t a l . , 1 9 91).

V. O p ti c al Tw e e ze r s Co m p l em e n t th e L a s er M i c r ob e a m

A . C o mb i ne d U s e o f L a se r S c i ss o rs a n d Tw e ez e rs t o I s ol a te C h ro mo s om e S e gm e nt s

I n 1 98 9, t he l as e r m ic r ob e am w as c om bi ne d w it h o pt ic al t we e ze rs (Greulich

et al . , 1 98 9) . T ec h ni ca ll y, t hi s m ea nt o pt im iz at io n o f a ll o pt ic al e le m en ts w it h

r e s p e c t t o t h e U V a b l a t i o n w a v e l e n g t h o f t h e 3 3 7 - n m p u l s e d n i t r o g e n l a s e r a n d t h e

1 0 6 4 - n m N d : Y A G - t r a p p i n g l a s e r . O n e o f t h e fi r s t a p p l i c a t i o n s o f c o m p l e t e m i c r o -

m a ni p ul a ti o n b y l i gh t w a s t o c u t t i ps o f c h ro m os o me s w i th t h e l a s e r m i cr o be a m

( o pt i ca l s c is s or s ) a n d s u b se q ue n tl y t o t r an s p or t t h e c h ro m os o m e s e gm e nt s i n to a

g la ss c ap il la ry w he r e t he y c o ul d b e t ra ns f er re d f or f ur th e r u se i n, f or e xa mp le ,

c l o n i ng e x p e r im e n t s ( Seeger e t a l . , 1 9 91) (F ig . 6).

B . T r a p p i n g L a s e r s C a n b e U s e d a s S c i s s o r s i n S e l e c t e d P l a n t C e l l s

N ot a lw ay s a re t wo l as er s r e qu ir ed t o c om bi ne t he eVe c ts o f l a se r m i cr o be a ms

( s c i s s o r s ) a n d l a s e r t w e e z e r s (Holzinger e t a l . , 2 0 0 2) . I n p l a n t s s u c h a s Microasterias

denticularum or Pleurebterium tumidivium, w h ic h h a ve l a rg e a n d s e ns i ti v e n u c l e i,

F ig . 5 L e ft : f u si o n o f t w o r a pe s ee d p r ot o pl a st s a f te r a f e w l a se r p u ls e s ( 3 37 n m ) h a ve b e en d i re c te do n t o t h e c o n t a c t a r e a . T h e f u s i o n i s c o m p l e t e d a f t e r $2 m i n . A t h i r d a n d f o u r t h p r o t o p l a s t c a n b e a l s o

f u s e d t o t h e p r o d u c t o f t h e fi r s t f u s i o n p r o c e s s . R i g h t : f u s i o n o f t w o m o u s e m y e l o m a c e l l s . S i n c e t h e s e

a r e c e l l s , n o t p r o t o p l a s t s w h o s e c e l l w a l l w a s r e m o v e d , t h e f u s i o n p r o c e s s t a k e s 1 0 m i n o r m o r e . C e l l s o f

v e r y d iVe r e n t s i z e c a n b e f u s e d a s w e l l .



11/22

o ne s in gl e N d: YA G l as er c an p er fo rm b ot h t as ks . W he n t hi s l as er i s r un a t ap ow er o f 9 0 m W, i t c an b e u se d a s o pt ic al t we ez er s. F or e xa mp le , s ec re to ry

v e si c le s a c c um u la t e r e ve r s ib l y b y o p ti c al t r ap p in g w i th a d r am a ti c c h an g e o f c e l l

s ha pe . T he l at te r i s n ot r ev er s ib le , d e sp it e a c o mp le t e r e ve r si on o f t he v es ic l e

a cc um ul at io n. W he n t he s am e N d: YA G l as er i s r un a t a p ow er o f 1 80 mW ,

n a tu r al l y o c c u r ri n g m i gr a t io n s o f l a rg e n u c le i i n c e ll s o f b o t h p l a n ts a r e i r re v e rs -

i b ly i n hi b it e d w h en m ic r o tu b ul e t r ac k s a r e t a rg e te d w i th t h e l a se r a t t h is p o we r .

T hi s n ic el y s ho ws t ha t t he c ha ng e f ro m t ra pp in g eVe c t s t o m i c r o ma n i p ul a t i on

p r o c e e ds g r a d ua l l y.

C . S i mu l at i ng M i cr o gr a vi t y i n t h e A l ga Chara

T he a lg a Chara h a s s p ec ifi c t ub e -l ik e c e ll s, t he r hi z oi ds , w hi ch i t u s es t o s e ns e

g r a v i t y . U n d e r n o r m a l c o n d i t i o n s , t h e r h i z o i d s a l w a y s g r o w d o w n w a r d , t h a t i s , i n t o

t he d ir e ct io n o f h ig he r g ra vi ty . W hi le t he d e ta il ed m ec h an is m f or t hi s g ra vi tr o pi sm

A B

C D

F ig . 6 C o mp l et e p r ep a ra t io n o f a c h ro m os o me t i p w i th l a se r m i cr o be am a n d o p ti c al t w ee z er s .I n ( A C) , t he c hr om os om e t ip i s c ut oV i n t h re e s t ep s . B e t w ee n ( C ) a n d ( D ), t h e t i p i s t r an s po r te d

w i t h o p t i c a l t w e e z e r s t o a d iVe r e n t s i t e o n t h e m i c r o s c o pe s l i d e, w h e r e i t c a n b e f o u n d s e p a r at e d f r o m t h e

m a i n c h r o m o s o m e ( D , a r r o w ) . T h i s p r o c e s s c a n b e r e p e a t e d s e v e r a l t i m e s a n d t h e c h r o m o s o m e t i p s c a n

b e c o l l e c t e d a n d f u r t h e r u s e d f o r m i c r o c l o n i n g .



12/22

00:00 00:00 15:00 53:00

74:00 86:00 103:00 120:00

A B C D

E F G H

F i g . 7 ( A H ) S e r i e s o f m i c r o g r a p h s s h o w i n g a c h a n g e i n t h e d i r e c t i o n o f r h i z o i d g r o w t h i n d u c e d b yc o n t i n u o u s s t a t o l i t h d i s p l a c e m e n t w i t h o p t i c a l t w e e z e r s ( t h e e x a c t p o s i t i o n o f t h e o p t i c a l t r a p i s m a r k e d

b y t h e s m a l l H - s h ap e d c u r s or i n si d e t h e c e ll s ). ( A ) T i p r e gi o n o f t h e r h i z oi d j u st b e fo r e t h e o p ti c al -

t r ap p in g e x pe r im e nt . ( B ) L a te r al d i sp l ac e me n t o f t h e s t at o li t hs i n to a s t ab l e p o si t io n c l os e t o t h e

s i d e w al l . T h e p o s i ti o n o f t h e o p t i c a l t r a p r e m a in s u n c h a n g e d d u r i n g t h e e x p e ri m e n t . T h e arrow points

t o t h e t r a p p e d s t a t o l i t h s i n t h e l a s e r f o c u s . ( C H ) T h e c e l l r e a c t s b y a n e x t e n d e d g r o w t h o f t h e o p p o s i t e

c e l l w a l l fl a nk , r e su l ti n g i n a c h an g e i n g r ow t h d i re c ti o n. ( F H ) T h re e s t at o li t hs (arrow) h a ve e s ca p ed

t h e o p t i c al t r ap a f te r h a vi n g b e e n h e ld f o r a c e rt a in p e ri o d. N o te t h e t w o s t at o li t hs t h at s t il l r e ma i n i nt he o pt i ca l t r ap ( j us t a b ov e t h e arrow) . T i me i s g i ve n i n m i nu t es a n d s e c o nd s , s t a r ti n g a f t e r fi n al

r e p o s i t i o n i n g o f t h e s t a t o l i t h s , 5 5 0; s c a l e b a r 10 mm .



13/22

i s n ot k n ow n, t he r e a r e a t l ea s t s o m e h i n ts : c l o s e t o t he t ip s o f t he r h iz oi ds , d e ns e

structures, 12 mm i n d i a m e t e r , c a n b e r e c o g n i z e d . T h e s e s t r u c t u r e s , c a l l e d s t a t o l i t h s ,

a r e b a ri u m s u l fa t e s h o ws t h e m i cr o c ry s ta l s e n v el o pe d b y m e m br a ne s . O b v io u s ly ,

t h e y s e d i m e n t u n d e r t h e i n fl u e n c e o f g r a v i t y a n d c o n t r o l t h e d i r e c t i o n o f g r o w t h .

T h e y h a v e a h i g h e r r e f r a c t i v e i n d e x t h a n t h e e n v i r o n m e n t a n d t h u s c a n b e e a s i l y

c a u g h t a n d m o v e d b y o p t i c a l t w e e z e r s i n t h e i n t e r i o r o f l i v i n g r h i z o i d s ( Leitz e t a l .,

1995) . I t i s n o t o n l y p o s s i b l e t o m o v e o n e s t a t o l i t h b u t u p t o fi v e o f s u c h s t r u c t u r e s

c an b e c ol le c te d i n t he f oc us o f t he o pt ic al t we ez e rs a nd h e ld p er ma ne n tl y. T he

f o rc e r e qu i re d f o r d i sp l ac e me n t d e pe n d s o n t h e d i re c ti o n o f d i sp l ac e me n t , t h a t i s

i t i s r el ev an t i f t he d is pl ac em en t o cc ur s i n t he d ir ec ti on o f t he m ai n c el l b od y

( b as i pe t al ) , i n t h e o p po s it e d i re c t io n ( a cr o pe t al ) , o r p e rp e n di c ul a r t o t h e a x is o f

t h e t u b e - li k e r h i z oi d ( l a te r a l ) .

F i g u r e 7 s h o w s t h e m i c r o c r y s t a l s i n t h e t i p r e g i o n o f t h e a l g a a n d a l s o s h o w s t h e

c h an g e o f g r ow t h d i re c t io n i n du c e d b y t h e o p ti c al t w ee z e rs . C o nt r o l e x pe r im e nt s

i ll um in a ti ng t he s am e r eg io n b ut n ot r em ov in g t he c r ys t al s d o n ot c ha ng e t he

g r o w t h d i r e c t i o n , t h a t i s i n t h e p r e s e n t e x p e r i m e n t g r o w t h i s n o t s i m p l y aVe c t e d b y

a t he rm al eVe c t . A t t i me z e ro , t h e s t at o li t hs a r e i n t h ei r o r ig i na l p o s it i on , d e t er -

m in ed b y g ra vi ty . A t a ll o th er t im es , u p t o m or e t ha n 3 h, t he s ta to li th s a red is pl ac e d. T he r hi zo id s n o l on ge r g ro w t ow ar d g ra vi ty . T ha t i s a pp ro xi ma te l y

w h a t o n e h a d e x p e c t e d . I n o t h e r w o r d s , t h e h y p o t h e s i s t h a t t h e s t a t o l i t h s m e d i a t e

g r av i ty s e n si n g i s c o r re c t. M o re s u rp r is i ng i s t h e f a ct t h at n o t o n ly t h e d i re c t io n

b ut a ls o t he s pe ed o f g ro wt h i s c ha ng ed a nd t ha t t hi s eVe ct i s a lm os t a n o rd er

o f m a g ni t u d e . F ig ur e 8 s ho ws i n t he u pp e r p ar t t he a pi ca l d is pl ac e me nt o f t he

s t a t o l i t h s . T h e l o w e r p a r t , o n t h e s a m e t i m e s c a l e , g i v e s t h e g r o w t h r a t e o f t h e t i p .

N o t e t h a t i n t h i s r e p r e s e n t a t i o n t h e r e l a x e d p o s i t i o n o f t h e s t a t o l i t h s i s a t $13 mm.

K no w le dg e o n t he eVe c ts o f m ic ro gr av it y o n t he g ro wt h o f a lg ae h as a q ui te

p r ac t ic a l c o n se q u en c e . S i nc e a l ga e m a y b e c om e m a jo r s o u rc e o f n u tr i ti o n d u ri n g

l on g- te r m s pa ce m is si on s, i t i s e s se nt ia l t o k no w i n a dv an ce h ow t he y b e ha ve

u n de r m i cr o g ra v it y . C e r ta i nl y , c r uc i al e x pe r i me n ts c a n o n ly b e p e r fo r me d i n t r uem i cr o gr a vi t y, f o r e x am p le o n a s p ac e s t at i on . H o we v e r, p r e li m in a ry e x pe r im e nt s

c an b e p er fo rm ed e ar th bo u nd , u si ng o pt ic al t we e ze rs a t a f ra ct io n o f c os ts , a nd

t h us e x pe n s iv e e x pe r i me n ts i n s p ac e c a n b e s c he d ul e d m u ch m o re eYciently.

V I . T h e A t t a c k o f a N a t u r a l K i l l e r C e l l o n a L e u k e m i a C e l l

T h e f o ll o wi n g e x pe r im e nt (Seeger e t a l . , 1 9 91) d e sc ri be s h ow , w it h t he h el p o f

o pt ic al t we e ze rs , t he a tt ac k o f a c e ll f ro m t he h um an i mm un e s ys te m o n a c an ce r c e ll

c an b e o bs er ve d f ro m t he v er y fi r st s ec on ds a ft er c on ta ct h as b ee n e st ab li sh e d.

I m m u n e c e l l s s u c h a s c y t o t o x i c T l y m p h o c y t e s ( C T L s ) a n d n a t u r a l k i l l e r ( N K ) c e l l sc ir cu la te t hr ou g h t he b od y a nd c h ec k i f o th e r c e ll s s ho w, f or e xa mp le , s ig ns o f

c an c er . U su a ll y, c e ll s a re p r es en t in g p e pt id e s b o un d t o a m ol ec u le c l as s c a ll e d M H C I .

I f s uc h a p ep t id e i s u nf am il ia r t o t he C TL , t he l at te r a tt ac ks t he p re se n ti ng c el l.



14/22

18

16

14

12

10

8

6

4

2

20

0

3

2.5

2

1.5

1

0.5

3.5

0

Time (min:s)

0:0

0

1:0

0

2:0

0

3:0

0

4:0

0

5:0

0

5:3

0

6:0

0

6:3

0

7:0

0

8:3

0

7:3

0

9:3

0

10:3

0

11:3

0

12:3

0

13:3

0

14:3

0

15:3

0

Distance

from

rhizoid

apex

(mm

)

Averagegrow

thra

te(mm

/min)

Statolith complex(apical border)

Rhizoid growth

F i g . 8 A c r op e t a l d i s p l ac e m e n t o f t h e s t a t o l i t h c o m p l e x a n d eVe c t o n t i p g r o w th . A l l s t a t ol i th s w e red i s p l a c e d t o t h e e x t r e m e a p e s o f t h e r h i z o i d . O p t i c a l t r a p p i n g o c c u r r e d b e t w e e n 5 : 0 0 a n d 5 : 3 0 m i n ; l a s e r

p ow er w as 1 00 0 mW ( ab ou t 3 00 m W i n t he o bj ec t p la ne ). T he a ve ra ge g ro wt h r at e a nd t he m ea n

d i st a nc e o f t h e a p ic a l b o r d er o f t h e s t at o li t h c o mp l ex f r om t h e r h iz o id a p ex b e fo r e, d u ri n g, a n d a f t e r

s t a t ol i t h d i s p l a c e me n t b y o p t i c al t w e e z er s a r e g i v e n . T h e s t a n da r d e r r o r f o r t h e a v e r a g e g r o w t h r a t e i s

sm aller than0.3 mm / mi n . F o r t e ch n ic a l r e a so n s, t h e a c t u al g ro w th r a te a t 5 : 3 0 m i n c a n o n ly b e g i ve n a s

a r a n g e b e t w e e n 0 a n d 0 . 7 5 mm / m i n. N u m b er o f r h i z oi d s , n 10.



15/22

I f f or s om e r ea so n t he p re se nt in g c el l h as n o M HC I m ol ec ul e a t a ll , i t c an no t

p r e s e n t t h e p e p t i d e w h i c h m i g h t i n d i c a t e t h a t s o m e t h i n g i s w r o n g . I n t h a t c a s e , t h e

N K c el l t ak es o ve r t he t as k o f i mm un e s ur ve il la nc e a nd t hu s h el ps t o a vo id a

c a t a s t r o p h i c o u t c o m e f o r t h e w h o l e o r g a n i s m . I n o r d e r t o u n d e r s t a n d t h e p r o c e s s

o f r e c o g ni t i o n a n d a t t a ck , i n v i t r o e x pe r im e nt s w o ul d b e h e lp f ul , w h er e c o n ta c t i s

e s ta b li s he d a r ti fi ci a ll y a n d t h e p r oc e ss c a n b e o b se r ve d . P a r ti c ul a rl y i n te r e st i ng

i s t h e c o n t a c t b e t w e e n c y t o l y t i c eVe c t o r c e l l s s u c h a s C T L s o r N K c e l l s w i t h t a r g e t

c e l l s . T h e C T L t ar g e t c o n t a c t i s h i g h l y s p e c i fi c a n d g o v e rn e d b y c o m p l ex s u p r a m o -

l ec ul ar a ss oc ia ti on s b e tw ee n T c e ll r ec e pt or a nd C D 8 s ur fa ce m ol ec ul es o n t he

eVe ct or c e ll a nd m aj or h is to co mp a ti bi li ty c la ss I s ur fa c e m ol ec u le s c o mp le xe d

w it h p e pt id e s o n t he t ar ge t c e ll . W it h N K c e ll s , s im il ar m ec ha ni s ms h av e b ee n

s ug ge s te d . I n o rd er t o t es t s uc h w or ki n g h yp o th es es , i t i s h el pf ul t o h av e o th er

t e c h n i q u e s f o r e s t a b l i s h i n g c o n t a c t b e t w e e n N K c e l l a n d i t s t a r g e t c e l l .

T he s ta nd ar d a pp ro ac h i s t o m ix t he t wo t yp e s o f c el ls , c e nt ri fu ge t he m a t l ow

s pe ed a nd o bs er ve w ha t h ap pe ns a ft er t he c el ls h av e b ee n r es us pe nd ed a nd

p r ep a re d e i th e r f o r m i cr o s co p y o r f o r o t he r e x pe r im e nt s . T h is a p pr o ac h i s b l in d

f or t he fi rs t m in ut es a ft e r c o nt ac t b et we en t he t wo r e ac ti on p ar tn er s a nd t he re -

f o r e i t i s d iYc u lt t o s t ud y t h e m o st i m po r ta n t p h as e o f t h e a t ta c k. A l te r n at i ve l y,c on ta ct c an b e e st ab li sh e d b y t he u se o f m ic ro me c ha ni ca l t oo ls , b ut t hi s m ay

d am ag e t he N K c el ls a nd t hu s b lu r t he o ut co me o f t he e xp er im en t. H er e t he

o pt ic al t ra p c an e st ab l is h c on ta ct i n a n e as y a nd g en tl e w ay . W it h t he o pt ic a l

t we e ze rs , t he N K c e ll c an b e m ov ed t ow ar d i ts t ar ge t c e ll a nd e ve n t he n at ur al

c o nt a ct b e tw e e n b o t h c e ll s c a n b e i n cr e a se d . T h i s m a y h e l p t o t r ig g er t h e a c t i vi t y

o f t h e t a r g e t c e l l . D u r i n g t h i s t y p e o f e x p e r i m e n t , t h e y i e l d o f s u c c e s s f u l a t t a c k s o f

N K c e l l s o n e r y t h r o l e u k e m i a c e l l s w a s h i g h e r t h a n e x p e c t e d f r o m l i t e r a t u r e v a l u e s .

A n o bv io us e xp la na ti on i s t ha t t he N K a tt ac k o n t he t ar ge t c el ls h as a lr ea dy

s ta rt ed w he r ea s t he aYn it y o f r e co gn i zi ng m ol ec u le s i s n ot s uYc ie nt ly h ig h t o

t r ig g er a c ti v at i on . I n t h es e c a se s , f a ci l it a ti n g t h e c o nt a ct b y t h e o p ti c al t w ee z e rs

m a y s u p p or t a c ti v at i on e v e n i n t h os e c a se s w h er e s p ec i fic c o nt a ct i s n o t y e t f u ll yestablished. F i g u r e 9 s h o w s t h e N K c e l l ( s m a l l d a r k c e l l ) a t t a c k i n g t h e t a r g e t c e l l ,

w h ic h c h an g es i t s m o rp h o lo g y b y m e mb r an e b l eb b in g .

A d e ta il ed i ns pe ct i on o f m em br a ne b le bb in g s h ow s t ha t f or t he fi rs t 4 0 50 s

a ft er c on ta ct b et we en t he N K a nd c an ce r c el ls , n o c ha ng e i n m or ph ol og y i s

o bs er ve d. T hi s c an b e e xp la in ed b y b io ch em ic al a ct iv at io n p ro ce s se s t ha t t ak e

s om e t im e b ef or e t he c an ce r c e ll r ea ll y i s a tt ac ke d . I nt er e st in g ly , t he f ur th e r

p r o c e s s i s n o t c o n t i n u o u s b u t o s c i l l a t e s . A t p r e s e n t , t h i s o s c i l l a t i o n i s u n e x p l a i n e d .

A s p e cu l at i ve i n te r p re t at i on w o ul d b e t h at t h e a t ta c k ed c e l l r e ac t s b y r e pa i ri n g

d a ma g e a n d t h at t h e a t ta c ki n g c e l l i n cr e as e s i t s a t t e mp t s t o k i ll t h e c a n c e r c e l l . I f

t h i s i n t e r p r e t a t i o n t u r n s o u t t o b e r e a l i s t i c , i t w o u l d h a v e s i g n i fi c a n t c o n s e q u e n c e s

f o r t h e u n de r s ta n di n g o f i m mu n e s u rv e il l an c e o f c a n ce r s a n d m i gh t g i ve i n te r e st -i n g h i nt s f o r d e ve l op i n g c a n c e r t h er a pi e s ( t hi s c h ap t er h a s b e e n r e pr o d uc e d f r om

G r e u li c h , 1 9 9 9).



16/22

V I I. L a se r M i cr o be a ms a n d O p ti c al Tw e ez e rs f o r H e ar t R e se a rc h

A . T h e R o le o f F i br o bl a st s i n H e ar t M e ch a ni c s a n d i n C o mp l ic a ti o ns a f te r H e ar t I n fa r ct i on

H e re t h e u s e o f a l a se r m i c r ob e a m a n d o p ti c al t w ee z e rs f o r m i c ro m an i pu l at i on o f

h e a r t c e l l s a n d t i s s ue s i s i n t r o d u c e d (M on a je m ba s hi , 2 0 05 ; P e r ne r , 2 0 04) . W he r ea s

m o r e t h a n 8 0 % o f t h e m y o c a r d i a l m a s s c o n s i s t s o f h e a r t m u s c l e c e l l s ( c a r d i o m y o -

c y t e s ) , t h e y r e p r e s e n t o n l y 3 0 % o f t h e c e l l n u m b e r . A m o n g t h e n o n c a r d i o m y o c y t e s ,

fi b ro b la s ts c o ns t it u te a p r ed o mi n an t f r ac t io n . B y p r od u c in g e x tr a ce l lu l ar m a tr i x

c o m p o n e n t s , fi b r o b l a s t s a r e i n v o l v e d i n m a i n t a i n i n g t h e m e c h a n i c a l f r a m e w o r k f o r

c a r d i o m y o c y t e s . F u r t h e r m o r e , t h e y p l a y a n i m p o r t a n t r o l e i n t h e c o m p l e x p r o c e s s

o f w o un d h e al i ng o f t h e n e c ro t ic m y oc a r di u m f o ll o wi n g m y oc a rd i al i n fa r c ti o n.

T h is p r oc e s s i n cl u de s m ig r at i on a n d p r ol i fe r at i on o f fi b ro b la s ts i n to t h e i n fa r c t

z o n e a n d s y n th e s is o f n e w e x tr a c el l ul a r m a tr i x p r ot e in s . A l so t h is p r oc e ss r e su l ts

i n t r an s fo r ma t io n o f fi b ro b la s ts i n to a c ti n -e x pr e s si n g m y ofi b r ob l as t s, a p r o ce s s

t ha t i s r es po ns ib le f or w ou nd c o nt ra ct io n a nd m ed ia ti on o f s ca r f or ma ti on .

A B

C D

F i g . 9 A t t a c k o f a n N K c e l l o n a n e r y t h r o l e u k e m i a ( K 5 6 2 ) c e l l . T h e c o n t a c t i s g e n e r a t e d b y p u s h i n gt h e s m a ll N K c e l l s t o w a rd t h e l a r ge K 5 62 c e ll . I n t h e fi r s t m i n u te , n o eVe c t i s v i si b le . T h e m e mb r an e

b l eb b in g i n di c at e s i n c r ea s in g d a ma g e t o t h e K 5 6 2 c e ll . T h is i s n o t a n eVe c t o f t h e l a s e r, s i nc e s i mi l ar

t r e a t m e n t w i t h t h e l a s e r a l o n e d o e s n o t i n d u c e m e m b r a n e b l e b b i n g .



17/22

S uc h a fi br o bl as t s c ar i s a b ar ri e r f or i nc o mi ng c al ci um w av es t ha t o rg an iz e t he

c o o r d i n a t e d c o n t r a c t i o n o f t h e h e a r t . I n a d d i t i o n , a b n o r m a l p r o l i f e r a t i o n o f fi b r o -

b l as t s a n d d e p os i ti o n o f t h e e x tr a c el l ul a r m a tr i x p r ot e in c o ll a ge n ( i .e . , fi b ro s is ) a l te r

t he n or ma l c ar di ac a rc hi te c tu re a nd t he m ec ha n ic al b e ha vi or o f t he h e ar t. I t i s

g e ne r al l y a c ce p t ed t h at i n cr e a se d e x tr a c el l ul a r m a tr i x d e po s it i on c o nt r ib u t es t o

d i a s to l i c s t iVn e ss a n d t h at fi b ro s is p r om o te s v e nt r ic u la r d y s fu n ct i on . T h us , t h e

c o m p o s i t i o n a n d t h e m e c h a n i c a l p a r a m e t e r o f t h e s c a r a n d t h e m y o c a r d i u m m a y ,

t o a l a r g e e x t e n t , d e t e r m i n e t h e o u t c o m e o f m y o c a r d i a l i n f a r c t i o n .

A n o th e r c a u se o f m y oc a r di a l d y s fu n c ti o n i s r e l at e d t o i n c re a s ed p r e ss u r e- s tr e tc h

o f c a rd ia c m yo c yt e s a s a c o ns e qu e nc e o f m ec h an ic a l s tr e ss d e ri ve d f or i ns ta nc e

f r om h e m od y na m ic o v e rl o a d ( h y pe r t en s io n ) . M e c ha n i ca l s t r es s i s k n ow n t o i n du c e

cardiac hypertrophy and release of growth-promoting factors. Recent investigations

s ug ge s t t h at c a rd ia c fi b ro b la st s a ct a s m ec h an oe l ec tr ic t ra ns du c er s i n t he h e ar t.

M or e ov er , fi b ro bl as ts a re c o ns id e re d t o m od ul at e t he c o nt ra ct il e a c ti vi ty o f t he

m y oc a r di u m i n r e s po n s e t o m e c ha n i ca l c h a ng e s . T h e s e fi n d in g s e m p ha s iz e t h e i m -

p or ta nc e o f m e ch an ic a l i nfl u en c e o n m yo c ar d ia l a c ti vi ty . A m ul ti tu d e o f m et ho d s f or

m ec h an ic a l f or c e a pp l ic at io n e x is ts t o p r od uc e l oa ds o f d iVe r e nt m a gn i tu d e , f r e -

q u e n c y , a n d d u r a t i o n e i t h e r t o a c e l l p o p u l a t i o n o r t o a n i n d i v i d u a l c e l l . I n b u l k a p -p r oa ch e s, a g lo b al m ec h an ic a l s t re ss i s a pp li e d t o a l ar g e n um be r o f c e ll s, f or i ns t an c e

b y s t r e t c h i n g o f c e l l s g r o w n o n a fl e x i b l e s u b s t r a t e . H o w e v e r , o n l y s i n g l e - c e l l a s s a y s

a ll ow a d is ti nc ti on b e tw e en l oc a ll y r e st ri ct e d a nd m or e g lo b al eVe c ts . F or m os t s in gl e-

c e l l i n v e s ti g a ti o n s, m e t ho d s w e r e u s e d s u c h a s m i c ro e la s t ic m a pp i ng w i t h t h e f o r ce

c u r v e m o d e o f a n a t o m i c f o r c e m i c r o s c o p e o r w i t h m a g n e t i c fi e l d d e v i c e s .

O p ti c al t w ee z e rs a r e p a rt i cu l ar l y s u it a bl e f o r v a ri a bl e f o rc e a p pl i ca t io n o n t h e

s i n g le - c e l l l e v e l o r e v e n w i t h s u b c e l l u la r a c c u r a c y u n d e r m i c r o s c o pi c c o n t r ol . T h i s

t e c h n iq u e a l l ow s b r i g h t fi e l d m i c r o sc o p i c o b s e r v a t io n o f t h e m e c h an i c a l i n fl u e n c e

a n d s i mu l ta n eo u s ly p e rm i ts t h e i n ve s t ig a ti o n o f a d di t io n a l p a ra m et e rs s u ch a s

i n tr a ce l lu l ar c a lc i um . O p ti c al t w ee z e rs c a n b e e m pl o ye d t o c l ar i fy a n i n te r e st i ng

a sp ec t o f h ea rt i nf ar c ti on . H er e i t i s p er ti ne n t t o r ec al l t ha t t he h ea rt r e pr es e nt sa t is su e c on s is ti ng , a mo ng o th e rs , o f h e ar t m us cl e c e ll s. E ac h s in gl e c e ll i s a bl e

t o c on tr ac t, t ha t i s t o p um p i nd e pe n de n tl y. I n a h e ar t, i t i s n e ce ss ar y t ha t t he se

c on tr ac ti on s a re c oo rd in at ed . T hi s i s a ch ie ve d b y c al ci um w av es . H ow t hi s

w o rk s i n d e ta i l, p a rt i cu l ar l y a f te r e x te r n al s t im u la t io n , c a n b e i n ve s t ig a te d u s in g

o pt ic al t we e ze rs . O n t he o th er h an d , a l as er m ic r ob e am i s u se fu l t o s tu dy h ow

d am ag es i n h ea rt t is su e a re r ep ai re d a nd h ow s uc h a r ep ai r m ig ht aVe ct t he

o rg an iz at io n o f c al ci um r eg ul at io n o f h e ar t b ea ti ng . T hi s i s d is cu s se d i n t he

f o l l ow i n g s e c t i o ns .

B . C h ic k en E m br y o H e ar t T i ss u e a s a M o de l t o S t ud y Wo u nd H e al i ng a n d C o o r di n at i on o f

H e a r t B e a t i n g b y C a l ci u m Wa v e s

H e re , e x pe r im e n ts w i th c h ic k e n c a rd i om y oc y te s a r e d e sc r ib e d , s i nc e t h e l a tt e r

c an b e e as il y o bt ai ne d f ro m e gg s, w hi ch h av e b e en b re d f or a f ew d ay s. H ea rt -

l ik e t is su e c an b e r el at iv e ly e as il y r ec o ns ti tu t ed f ro m s e mi br e ed c h ic k en e gg s.



18/22

C er ta in ly , i t w ou ld b e b et te r t o u se h um an h ea rt t is su e, w hi ch i s h ow ev er n ot

a va il ab le l iv e f or s uc h e xp er im en ts , o r t is su e f ro m m ou se h e ar ts w hi ch i s a ls o

m or e d iYc u lt t o o b ta i n. T h e d e sc r ib e d e x pe r i me n ts a r e t h er e f or e a c o mp r om i se ,

w i th t h e a d va n ta g e o f e a sy a v ai l ab i li t y a n d t h e d i sa d va n ta g e t h at i t s r e s ul t s a n d

c o nc lu si on s c an b e u se d o nl y i n a l im it ed m an ne r a s a m od el f or h um an h ea rt a tt ac k.

C . O p to m ec h an i ca l S t im u la t io n o f a S i ng l e C e ll S t ar t s a C a lc i um Wa v e i n t h e W h ol e T i ss u e

T h e m e ch a n ic a l s t im u la t io n i s i n du c e d t h ro u gh o p ti c al t w ee z e rs , h o we v e r, n o t

d ir ec t ly . A n e r yt hr o cy te i s u se d a s a h an dl e t o t ra ns fe r t he f or c e. N ot e t ha t t he

e r yt h r oc y te h a s n o b i ol o gi c a l f u nc t io n i t h a d j u st t u rn e d o u t t h at s u it a bl y p r e-

t r e at e d e r yt h ro c y te s a r e g o od f o rc e t r an s mi t te r s . T h is t e c hn i qu e w a s t e rm e d b y

us Erythrocyte-Mediated Force Ap pl ic at io n ( EM FA ). F or m or e d e ta il s o f t he

E M FA t e ch n iq u e s e e Perner et a l . ( 2 00 4 ) o r, i n G er ma n, Monajembashi et a l .

(2005).

I f c a rd i om y oc y te s o f c h i ck e n e m br y os a r e r e c on s ti t ut e d i n to a t i ss u e- l ik e c e ll

l a y e r a n d a s i n g l e c e l l i n t h i s l a y e r i s o p t o m e c h a n i c a l l y s t i m u l a t e d b y E M F A , fi r s t

a c a l c i u m b u r s t i s s e t f r e e f r o m i n t r a c e l l u l a r c a l c i u m d e p o s i t s o f t h e d i r e c t l y t r e a t e dc e ll . T h is c a n b e m a de v i si b le t h ro u gh s u it a bl e c a lc i um - se n si t iv e fl u or e sc e n t d y es

( O r a n g e G r e e n 4 8 8 , B A P T A - 1 , A M ) . T h e i n c r e a s e o f c a l c i u m c o n c e n t r a t i o n i n t h e

d i re c t ly t r ea t ed c e ll aVe ct s i ts n ei gh bo r s s o t ha t w it hi n a f ew s e co n ds a c al ci um

w a ve s p re a ds o v er t h e e n t ir e t i ss u e. T h is r e gu l ar w a ve s t im u la t es a c o or d in a te d

b e at i ng o f a l l c e ll s t h at a r e r e a c h ed b y t h e c a l c iu m w a v e .

T h e e x p e r i m e n t i s e s p e c i a l l y i n t e r e s t i n g s i n c e i t w o r k s w i t h fi b r o b l a s t s . T h i s c e l l

t y pe i s g e n er a ll y a s su m ed n o t t o b e e x ci t ab l e f o r c a lc i um w a ve s , i n c o n tr a st w i th

c a r d io m y o c yt e s . I n F ig . 1 0, h ow ev er , i t c an b e c le ar ly o bs er ve d t ha t t hr ou gh

E MF A s t im u la t io n , a c a lc i um b u rs t i s i n du c e d i n t h e d i r e c tl y t r ea t ed c e ll . S u bs e -

q ue n tl y, a c al ci u m w av e r un s a cr os s t he e n ti re t is su e. A pp ar e nt ly , t he re e xi st s a

p h y s i c o c h e m i c a l c o n d i t i o n i n w h i c h fi b r o b l a s t t i s s u e , a n d t h u s p o t e n t i a l s c a r t i s s u e ,c a n b e m a de t r an s p ar e nt f o r c a lc i u m w a ve s . M ak i ng fi b ro b la s t s c ar s t r an s pa r en t f o r

c a l c i u m w a v e s g i v e s a n i n t e r e s t i n g p e r s p e c t i v e f o r d e v e l o p i n g d r u g s t h a t r e d u c e t h e

r i s k f o r d e a d l y c o m p l i c a t i o n s a f t e r a fi r s t h e a r t i n f a r c t i o n . E x p e r i m e n t s o f t h i s t y p e

m ay h e lp i n t h e h i gh - th r o ug h pu t s e ar c h f o r le a d s u b st a nc e s , w h ic h c a n s u bs e -

q u e n t l y b e u s e d i n a m o u s e m o d e l a n d c a n b e d e v e l o p e d l a t e r i n t o d r u g s f o r c l i n i c a l

t e s t s . A t t h e e n d , t h e r e w o u l d b e a m e d i c a t i o n t h a t w o u l d r e d u c e t h e r i s k o f d e a d l y

fibrillations.

D . I n ju r ie s T h ro u gh L a se r M i cr o be a m H e al W i th i n 1 8 h , H o we v er, F o rm S c ar s

N ot o nl y t he o pt ic al t we e ze rs a nd E MF A c an h e lp t o u nd er st an d p ro bl em sc on ne c te d w it h h ea r t a tt ac ks . T he l as er m ic r ob ea m a ls o c an b e u se d a s a n e xt re me ly

fi ne s ca lp e l t o i nfl ic t s el ec ti ve l es io n s i n h ea rt t is s ue a nd t o s tu dy t he h ea li ng p ro ce s s.

F ig ur e 1 1A ( le ft ) s ho ws t he t is su e d ir ec tl y a ft er i nj ur y. F i gu r e 1 1 B (right)

s ho ws t he s it u at io n a ft er 5 h . I t i s c le ar ly v is ib le h ow t he fi rs t c el ls g ro w i nt o t he



19/22

e mp ty a re a a nd s ta rt t o fi ll t he g ap . A ft er 1 8 h , t he g ap i s c lo se d (F i g. 1 1 C) . T h e

r e pl a ce d c e l ls a r e h o we v e r p r e do m in a nt l y d a rk , s p in d le - sh a pe d fi b ro b la s ts . I t

s ho ws o ne o f t he f ea re d s ca rs h as d ev el op e d. I t w ou ld b e b et te r i f t he p or ti on o f

c a r d i o m y o c y t e s o b s e r v e d i n t h e l e s i o n a r e a w o u l d b e m u c h h i g h e r , c o m p a r a b l e t o

t h e c o m p o s i t i o n o f h e a l t h y h e a r t t i s s u e . T h e g a p w o u l d b e c l o s e d c o m p l e t e l y w i t h

h e a r t - l i k e t i s s u e , t h a t i s a s c a r w o u l d n o t h a v e d e v e l o p e d a t a l l . S i n c e o u r m o d e l i s

a ga in , a s a bo ve , s ui ta bl e f or h ig h t hr ou gh p ut , i t a cc om mo da te s t he s e ar c h f or

s u b s t a n c e s t h a t b o o s t t h e g r o w t h o f c a r d i o m y o c y t e s . S u r p r i s i n g l y , s u c h a m o l e c u l e

e x i s t s : t h e i n s u l i n - l i k e g r o w t h f a c t o r , I G F 1 . M i c e o r p i g s , w h i c h h a d t h e g e n e f o r

I GF 1 i mp la nt ed i nt o t he ir g en om e, d o n ot d ev el op s ca rs a ft e r h e ar t i nj ur y a nd

A B

C D

F i g. 1 0 I n du c ti o n o f a c a lc i um w a ve i n a l a ye r o f fi b ro b la s ts . A n e r yt h ro c yt e ( c en t er , A ) i s p u sh e d

w i t h o p t i c a l t w e e z e r s o n t o a fi b r o b l a s t s . T h e e r y t h r o c y t e s o l e l y a c t s a s a h a n d l e , t h a t i s h a s n o b i o l o g i c a lf u n c t i o n . T h i s p r o c e s s s t a r t s t h e l i b e r a t i o n o f c a l c i u m i n t h e fi b r o b l a s t ( B ) , w h i c h s p r e a d s o v e r t h e w h o l e

c e ll ( C ), a n d fi n a ll y , a f t e r 2 3 s , c o up l es o v er t o n e ig h bo r in g c e l l s a n d s p re a ds o v er a w i de a r ea i n t h e

t i s s ue . T h e r e m a r k ab l e a s p e c t o f t h i s e x p e r i m en t , w h i c h w o r k s e v e n b e t t e r w i t h e x c i t ab l e h e a r t m u s c l e

c e l l s , i s t h a t i t i n d e e d d o e s w o r k w i t h n o n e x c i t a b l e fi b r o b l a s t s .



20/22

a ls o l iv e m uc h l on ge r t ha n c on tr ol a ni ma ls . C er ta in ly , s uc h a s tr at eg y i s n ot

a p pl i ca b le i n h u ma n s. T h er e fo r e , a l o ng s y st e ma t ic s e ar c h f o r s u it a bl e s u bs t an c e s

l i e s a h e a d .

A l t og e t he r , i n t h i s c h a p t er i t h a s b e e n d e m o n st r a te d t h a t a c o m bi n at i on o f l a s er

m i c ro b e am a n d o p t ic a l t w e ez e r s i s a m i c ro s c op y i n st r um e n t t h at i s m u l ti f un c t io n al

a n d v e rs at il e f or w id e v ar ie ty o f s t ud ie s a nd a pp li c at io ns i n b io lo gy a nd b io me d ic i ne .

Acknowledgments

I t ha nk a ll c ol le ag ue s w ho h av e c on tr ib ut ed w it h t he ir e xp er im en ts t o t hi s w or k a nd w ho m I

h o p e f u l l y h a v e c i t e d p r o p e r l y .

A B

C

50 mm

F i g. 1 1 I n ju r y i n d uc e d b y a l a se r m i cr o be a m t o h e ar t t i ss u e. L e ft ( A ): s e ve r in g o f t h e t i s s ue i s j u stc o m p l e t e d . T h e s t r a i g h t l i n e i n t h e c e n t e r o f t h e l e s i o n i s d a m a g e o f t h e c o v e r s l i d e , t h a t i s , a n u n w a n t e d

s i d e eVe c t . R i g h t ( B ) d a r k , s p i n d l e - l i k e fi b r o b l a s t s g r o w i n t o t h e l e s i o n . B o t t o m ( C ) : c l o s i n g t h e l e s i o n i s

c o m p l e t e . I n a d d i t i o n t o t h e fi b r o b l a s t s , a f e w b r i g h t h e a r t m u s c l e c e l l s a r e a l s o f o u n d . B u t a s a w h o l e , afi b r o b l a s t s c a r r e m a i n s a t t h e s i t e o f t h e l e s i o n .



21/22

References

A s h ki n , A . , D z i e d z i c , J . M . , B j o r k ho l m , J . E . , a n d C h u , S . ( 1 9 86 ) . O b s e r va t i o n o f a s i n gl e b e a m g r a d i e n t

t r a p f o r d i e l e c t r i c p a r t i c l e s . O p t . L e t t . 11, 288290.

B e re i te r -H a hn , J . ( 1 97 2 ). L a se r a l s M i kr o ma n ip u la t or i n B i ol o gi e u n d M e di z in . M i c r o sc . A c t a 71,

225241 and 72, 133.

B e rn s , M . W . ( 1 97 4) . B i ol o gi c al M ic r oi r ra d ia t io n . P r en t ic e H a ll S e ri e s o n B i ol o gi c al T e ch n iq ue s

E n g l e w o o d C l iVs , N e w J e r s e y .B e rn s , M . W . , A i s t , J . , E d wa r ds , J . , S t r a hs , K . , G i r t on , J . , M c N e il l , P . , R at t ne r , J . B . , K i t z es , M . ,

H a mm e r- W il s on , M . , L i aw , L . H . , S i em e ns , A . , K o on c e, M . , e t a l . ( 1 9 81 ) . L a s e r m i c r os u r ge r y i n

c e l l a n d d e v e lo p m e nt a l b i o l og y . Science 213, 505513.

B e rn s , M . W ., O l so n , R . S . , a n d R o u n ds , D . E . ( 1 96 9a ) . A r go n i o n l a se r m i cr o ir r ad i at i on o f n u cl e ol i .

J . C e l l B i o l . 43, 18211840.

B e rn s , M . W . , O l s o n, R . S . , a n d R o un d s, D . E . ( 1 96 9b ) . I n v i tr o p r o d uc t i o n o f c h r o mo s o ma l l e s i on s

u s i n g a n a r g o n l a s e r m i c r o b e a m . N a t u r e ( L o n d o n) 221, 7475.

B e r n s , M . W . , R o u n d s , D . E . , a n d O l s o n , R . S . ( 1 9 6 9 c ) . EVe c t s o f l a s e r m i c r o i rr a d i at i o n o n c h r o mo -

som es. E x p . C e l l . R e s . 56, 292298.

B e s s i s , M . , G i r e s , F . , M a y e r , G . , a n d N o m a r s k i , G . ( 1 9 6 2 ) . I r r a d i a t i o n d e s o r g a n i t e s c e l l u l a i r e s a l a i d e

d u n l as er a r ub is ( Ir ra di at io n o f c el lu la r o rg an is ms w it h a r ub y l as er ). C . R . A ca d. S ci . 255,

10101012.

B l oc k , S . M . , B l a i r, D . F . , a n d B e rg , H . C . ( 1 98 9 ). C o mp l ia n ce o f b a ct e ri a l fl a g e ll a m e as u re d w i th

o p t i c al t w e e z e rs . Nature 338, 514518.

B o t v in i c k , E . , a n d B e r n s , M . W . ( 2 0 05 ) . I n t e r n e t b a s e d r o b o ti c l a s er s c i s so r s a n d t w e e z e rs m i c r o sc o p y.

M i c r o s c . R e s . T e c h . 68, 6574.

C r e m er , T . , C r e m er , C . , B a u ma n n , H . , L u e d t k e , E . - K . , S p e r l i ng , K . , T e u b er , V . , a n d Z o r n , C . ( 1 9 82 ) .

R a b l s m o d e l o f t h e i n t e r p h a se c h r o mo s o me a r r an g e me n t t e s t e d i n C h i n es e h a m s t e r c e l l s b y p r e m a -

t u r e c h r o m o s o m e c o n d e n s a t i o n a n d l a s e r U V m i c r o b e a m e x p e r i m e n t s . H u m . G e n e t . 60, 4656.

D j ab a li , M . , N g u ye n , C . , B i un n o, I . , O o s t ra , B . A . , M a t te i , M . G . , I k e d a, J . E . , a n d J o rd a n, B . R .

( 1 9 9 1 ) . L a s e r m i c r o d i s s e c t i o n o f t h e f r a g i l e X r e g i o n : I d e n t i fi c a t i o n o f c o s m i d c l o n e s a n d o f c o n s e r v e d

s e q u e n c e s i n t h i s r e g i o n . Genomics 10, 10531060.

E ck el t, A ., P on el ie s, N ., B au tz , E . K . F ., M il le r, K ., H eu er , T ., T um m le r , B . , G r ze s ch i k, K . H . ,

W o lf r um , J . , a n d G r eu l ic h , K . O . ( 1 98 9) . M i cr o di s se c ti o n i n t h e s e ar c h f o r t h e m o le c ul a r b a si s

o f d i se a se : A c h ro m os o me s e gm e nt s p ec i fic m o le c ul a r l i br a ry . B e r. B u n se n ge s . P h y s. C h e m. 93,

14461453.

G r e u l i c h , K . O . ( 1 9 9 9 ) . M i c r o m a n i p u l a t i o n b y l i g h t i n b i o l o g y a n d m e d i c i n e . T h e l a s e r m i c r o b e a m a n do p t i c al t w e e z e rs . Birkhau s e r B a s e l 1300.

G r e u li c h , K . O . , B a u d e r , U . , M o n aj e m b as h i , S . , P o n e li e s , N . , S e e g er , S . , a n d W o l f r u m, J . ( 1 9 89 ) . U V

l a se r m i kr o st r ah l u n d o p ti s ch e p i nz e t te ( U V l a se r m i cr o be a m a n d o p ti c al t w ee z er s ). L a b o r P r a x . /

Labor 2000, 3642.

G u o , Y . , L i a n g , H . , a n d B e r n s , M . W . ( 1 9 9 5 ) . L a s e r - m e d i a t e d g e n e t r a n s f e r i n r i c e . P h y s . P l a n t . 1924.

H a d a n o , S . , W a t a n a b e , M . , Y o k i u , H . , K o g i , M . , K o n d o , I . , T s u c h i y a , H . , K a n a z a w a , I . , W a k a s a , K . ,

a n d I k ed a , J . ( 1 99 1 ). L a se r m i cr o di s se c ti o n a n d s i ng l e u n iq u e p r im e r P C R a l lo w g e ne r at i on o f

r e g i on a l c h r o m o s o me D N A c l o n e s f r o m a s i n gl e h u m an c h r o mo s o m e. Genomics 11, 364373.

H o lz i ng e r, A . , M o na j em b as h i, S . , G r eu l ic h , K . O . , a n d L ut z - M ei n d l , U . ( 2 0 02 ) . I m p a i r m en t o f c y t o -

s k el e to n d e pe n de n t v e si c le a n d o r ga n el l e t r an s lo c at i on i n g r ee n a l ga e : C o mb i ne d u s e o f a m i cr o -

f o c u s ed i n f r ar e d l a s e r a s m i c r ob e a m a n d o p t i c al t w e e z er s . J . M i c r o sc . 208, 7783.

K u ra t a, S . I . , T s uk a ko s hi , M ., K a su y a, T . , a n d I k aw a , Y . ( 1 98 6 ). L as e r m e th o d f o r eYc i e n t i n t r od u c -

t i o n o f f o r e i g n D N A i n t o c u l t u r e d t i s s u e c e l l s . E x p . C e l l R e s . 162, 372378.

K u r k d j i a n , A . , L e i t z , G . , M a n i g a u l t , P . , H a r i m , A . , a n d G r e u l i c h , K . O . ( 1 9 9 3 ) . N o n - e n z y m a t i c a c c e s s

t o t h e p l a s m a m e m b r a n e o f M e d i c a g o r o o t h a i r s b y l a s e r m i c r o s u r g e r y . J . C e l l S c i . 105, 263268.

L e i t z , G . , S c h n ep f , E . , a n d G r e u l i c h , K . O . ( 1 9 9 5 ) . M i c r o m an i p u la t i o n o f s t a t ol i t h s i n g r a vi t y s e n s i n g

C h a r a r h i z o i ds b y o p t i c al t w e e z er s . Planta 197(2), 278288.



22/22

L e n g au e r , C . , E c k e l t , A . , W e i t h , A . , E n d l i c h, N . , M i l l er , K . , L i c h t e r , P . , G r e u l i ch , K . O . , a n d C r e m e r, T .

( 1 9 91 ) . S e l e c t i v e s t a i n i n g o f a d e fi n ed c h r o mo s o ma l r e g i on b y i n s i t u h y b r id i z at i o n o f l i b r ar i e s f r o m

laser m icrodissected chrom osom es. C y t o g e ne t . C e l l G e n e t . 56, 2730.

L o h s - S c h a r d i n , M . , C r e m e r , C . , a n d N us s l e i n - V o l h a r d , C . ( 1 9 7 9 ) . A f a t e m a p f o r t h e l a r v a l e p i d e r m i s o f

D r o s o p hi l a m e l a n o ga s t e r: L o ca l iz e d c u ti c le eVe c ts f o ll o wi n g i r ra d ia t io n o f t h e b l as t od e rm w i th a n

ultraviolet laser m icrobeam . D e v . B i o l . 73, 239255.

M on aj em ba sh i, S ., P er ne r, B ., a nd G re ul ic h, K . O . ( 20 05 ). L ic ht a ls W er kz eu g i n d er Z el l- u nd

M o l e k u l a r b i o l o g i e : A n w e n d u n g e n i n d e r H e r z f o r s c h u n g ( l i g h t a s t o o l i n c e l l a n d m o l e c u l a r b i o l o g y :A p p l ic a t i on s i n h e a r t r e s e ar c h ) . BIOforum 9, 4041.

N a sc i me n to , J . , B o t v in i ck , E . L . , S h i , L . Z . , D u r r an t , B . , a n d B e r n s, M . W . ( 2 00 6 ). A n al y si s o f s p er m

m o t i l it y u s i n g o p t i c a l t w e e z e rs . J . B i o m e d . O p t . 11(4), 044001.

P e r n er , B . , M o n a j e m ba s h i, S . , R a p p, A . , W o l lw e b e r , L . , a n d G r e u l i c h, K . O . ( 2 0 04 ) . S i m u la t i o n o f h e a r t

i n fa r ct i on b y l a se r m i cr o be a m a n d i n du c ti o n o f a r ry t hm i as b y o p ti c al t w ee z er s . S P IE P r oc . 5514,

179188.

P o n e li e s , N . , B a u t z, E . K . F . , M o n a j e mb a s hi , S . , W o l f ru m , J . , a n d G r e u l i c h, K . O . ( 1 9 89 ) . T e l o m e r ic

s e q u e nc e s d e r i ve d f r o m l a s e r m i c r od i s s ec t e d p o l y te n e c h r o mo s o me s . Chromosoma 98, 351357.

S e e g e r , S . , M o n a j e m b a s h i , S . , H u t t e r , K . J . , F u t t e r m a n n , G . , W o l f r u m , J . , a n d G r e u l i c h , K . O . ( 1 9 9 1 ) .

A p p l i c a t i o n o f l a s e r o p t i c a l t w e e z e r s i n i m m u n o l o g y a n d m o l e c u l a r g e n e t i c s . Cytometry 12, 497504.

S h ee t z, M . P . ( e d. ) ( 1 99 8 ). L as e r t w ee z er s i n c e ll b i ol o gy . In Me t ho d s i n C e ll B i ol o gy , V o l. 5 5.

A c a d e m i c P r e s s , S a n D i e g o .

S t e u b i n g , R . W . , C h e n g , S . , W r i g h t , W . H . , N u m a j i r i , Y . , a n d B e r n s , M . W . ( 1 9 9 1 ) . L a s e r i n d u c e d c e l lf u s i o n i n c o m b i n a t i o n w i t h o p t i c a l t w e e z e r s : T h e l a s e r c e l l f u s i o n t r a p . Cytometry 12(6), 505510.

T ao , W ., W il ki ns on , J ., S ta nb ri dg e, E . J ., a nd B er ns , M . W . ( 19 87 ). D ir ec t g en e t ra ns fe r i nt o

h u ma n c u lt u re d c e ll s f a ci l it a te d b y l a se r m i cr o pu n ct u re o f t h e c e ll m e mb r an e s. P r oc . N a t l. A c ad .

S c i . U S A 84, 41804184.

T su k ak o sh i , M . , K u ra t a, S . , N o mi y a, Y . , I k a w a, Y . , a n d K a s u ya , T . ( 1 98 4 ). A n e w m e t h od o f D N A

t r a n s f e c t i o n b y l a s e r m i c r o b e a m c e l l s u r g e r y . A p p l . P h y s . B 35, 135140.

W e b er , G . , M o n aj e m b as h i , S . , G r e u li c h , K . O . , a n d W o l fr u m , J . ( 1 9 88 ) . I n j e c t i on o f D N A i n t o p l a n t

c e l l s u s i n g a U V l a s e r m i c r o b e a m . Naturwissenschaften 75, 3641.

W eb e r, G . , M o na j em b as h i, S . , G r eu l ic h , K . O . , a n d W o lf r um , J . ( 1 99 0 ). G e ne t i c c h an g es i n du c ed i n

h i g h e r p l a n t s b y a U V l a s e r m i c r o b e a m . I s r a e l J . B o t a n y 40, 115122.

W e b er , G . , M o n aj e m b as h i , S . , W o l f r u m , J . , a n d G r e u li c h , K . O . ( 1 9 8 9 ) . U p t a ke o f D N A i n c h l o r o p l as t s

of B r a s s ic a n a p u s ( L )

Selected Applications of Laser Scissors And

Documents

Transcript of Selected Applications of Laser Scissors And