SEENED KLIINILISES MATERJALIS- MIKS JA KUIDAS UURIDA? kliinilise... · 2018. 3. 9. · 3. märts...
Transcript of SEENED KLIINILISES MATERJALIS- MIKS JA KUIDAS UURIDA? kliinilise... · 2018. 3. 9. · 3. märts...
Helle Järv
3. märts 2018
Eesti Bioanalüütikute Ühingu mikrobioloogia koolituspäev
SEENED KLIINILISES MATERJALIS-
MIKS JA KUIDAS UURIDA?
PATOGEENSED SEENED
bro
nh
/ tr
ahh
ea
karv
ad
koe
tükk
küü
ne
d
liikv
or
Liig
ese
-ve
de
lik
luu
üd
i
nah
k
röga
silm
asa
rvke
st
siin
us/
n
inaõ
õs
tup
eka
be
uri
in
veri
Aspergillusx x x x x x x x
Candidax x x x x x x x x x x x x
Cryptococcusx x x x x x x x x x
Dermatofüüdidx x x
FusariumX x x x x x x
MucormycosisX x x x x x
Kust me midagi otsime?
2
PATOGEENSED SEENED
• Materjali kogumise tehnika
• Materjali transport
• Söötmete valik
• Külvi tehnika
• Inkubeerimise temperatuur ja aeg, kaua külvi kasvatame
• Tulemuse interpreteerimine
Mis mõjutab uuringu edukust ja lõplikku vastust?
PATOGEENSED SEENED
Materjali transportb
ron
h/
trah
he
a
karv
ad
koe
tükk
küü
ne
d
liikv
or
Liig
ese
-ve
de
lik
luu
üd
i
nah
k
röga
silm
asa
rvke
st
siin
us/
nin
aõõ
s
tup
eka
be
uri
in
veri
Aeg ≤2h TT; >2 h 4◦C
≤72 hTT
≤15 min TT; >15min TT
≤72 hTT
≤2 h TT
≤2hTT
≤15 min TT; >15min TT
≤72 hTT
≤2h TT; >2 h 4◦C
≤15 min TT; >15min TT
≤2h TT; >2 h 4◦C
≤2h TT; >2 h 4◦C
≤2h TT; >2 h 4◦C
≤2 h
Tempera-tuur
TT TT TT TT TT TT TT TT TT TT TT TT TT TT
Märkused
Väg
a st
abiil
ne
;kü
lmu
tam
ine
Väg
a st
abiil
ne
;kü
lmu
tam
ine
Mit
te k
un
agi
külm
uta
da
Väg
a st
abiil
ne
;kü
lmu
tam
ine
Soo
vitu
sed
sõ
ltu
vad
ver
ekü
lvi
süst
eem
ist
TT- toatemperatuur Manual of clinical microbiology 11th Ed, Vol 2. 2015 ASM Press
PATOGEENSED SEENED
Clinical Infectious Diseases 2013
PATOGEENSED SEENED
Silm
Kõrv
Alumised hingamisteed
PATOGEENSED SEENED
Haruldased patogeenid
PATOGEENSED SEENED
Clinical Infectious Diseases 2013
Verekülv
PATOGEENSED SEENED
Kolme tüüpi uuringumaterjalid
• Kehavedelikud ja eritised - üldjuhul seente avastamiseks
kontsentreerime
• Tampoonid transportsöötmes
• Meditsiinilised instrumendid, kunstmaterjalid jms, millel uurime biofilmi
PATOGEENSED SEENED
Patsiendile ja arstile muutub kõik lihtsamaks – vedelsöötmega külvisüsteem
Laborile muutub kõik lihtsamaks: kahte tüüpi uuringumaterjalid –
vedelsööde ja jm kehavedelikud ning biofilmi uuringud
Vedelsöötmega transportsüsteemi eelised
• Sobib täisautomaat mikrobioloogia laboritele
WASP -Walk Away Specimen Processor
• Sobib automaatsetele värvimis-mikroskopeerimis
süsteemidele
• Sobib patogeenide DNA sekveneerimiseks
• Molekulaarsed testid (PCR-põhised) patogeenide
määramiseks
• Sobib mikrobioloogiliseks kultuuriks
Kas asi mis kõlbab kõigeks ei kõlba äkki
mitte millekski?
Patogeensed seened ja vedelsööde ???
Fontana et al. How the liquid based media can change the workflow in the Microbiology Laboratories. Advances in Microbiology 2013, 3, 504-510.
VEDELSÖÖTMEGA TRANSPORTSÜSTEEMID
Kas Copan ESwab v muu vedelsöötmega transportsüsteem sobib seente uuringuteks???
• Turul alates aastast 2008
• Uuringud seente suhtes puudusid kuni viimase ajani
Kas Copan ESwab v muu vedelsöötmega transportsüsteem sobib seente uuringuteks???
VEDELSÖÖTMEGA TRANSPORTSÜSTEEMID
Tulemused
• ESwab on sobiv transportsüsteem patogeensete seentele
• Stabiilne vähemalt 48 h toatemperatuuril ja +4◦C
• Kliinilise materjaliga uuringud puuduvad
Kas Copan ESwab v muu vedelsöötmega transportsüsteem sobib seente uuringuteks???
PATOGEENSED SEENED
Mikroskoopia
• Fluorestsents-mikroskoopia
+ KOH+optical brightner Calcofluor white v
Blankofluor™
• Faas-kontrast mikroskoopia
• Histoloogilised värvimismeetodid
PAS, H&E, Grocott
PATOGEENSED SEENED
Cryptococcus neoformans
• Kiiruuring nn. India ink v China ink + liikvor; visualiseerib seene polüsahhariidkapsli
• Calcoflour white
Mikroskoopia
PATOGEENSED SEENED
• Esmaskülv
Söötme valik sõltub külvatavast materjalist
Üldjuhul valitakse mittesteriilsete materjalide esmaskülviks antibiootikumiga sööde
Steriilsete materjalide korral ALATI kombineeritud antibiootikumita (1-2 söödet) ja antibiootikumiga sööde
Universaalne sööde: Saboraud dextrose agar
Dimorfsetele seentele sobib rohkem BHI (Brain Heart Infusion agar + sheep blood)
Söötme valik mikrobioloogiliseks külviks
PATOGEENSED SEENED
Selektiivne sööde: Chromagar Candida, Dermasel (Sabouraud agar + tsükloheksimiid), Mycosel (+Ph indikaator), õliga rikastatud SAB (lipofiilsetele Malassezia spp. pärmidele)
Selektiivne sööde on õigustatud esmaskülviks materjalidest, kust oodata mitut erinevat seeneliiki (uriin, ülemised hingamisteed – röga, siinus, kurk; tupekaabe); lihtsustab tunduvalt isoleerimist/identifitseerimist
Tsükloheksimiidiga söötmele ei tohi külvata materjale, millest otsitakse hallitusseeni.
Kasutatakse valdavalt ainult dermatofüütide selektiivseks kasvatamiseks
• Isoleerimine/identifitseerimine
Sööde valitakse vastavalt seenesugukonna v -perekonna ökoloogilisele nõudlusele – Maltextract agar, Potato dextrose agar, Corn meal agar, Oatmeal agar etc
Söötme valik mikrobioloogiliseks külviks
PATOGEENSED SEENED
• Petri tass vs suletud konteiner längagariga
Längagarit on soovitav kasutada kui potentsiaalselt võib tegu olla 3. ohuklassi patogeeniga
• Materjali külv nn. „bed side“ kui uuringumaterjali väga vähe (N: silma sarvkesta v klaaskeha uuring). Labor väljastab sobiva söötme raviasutusele ning selgitab inokuleerimise tehnikat
• Materjali töötlus enne külvi (segamine, tsentrifuugimine, sonikeerimine)
• Kirurgiliselt eemaldatud kunstmaterjalid, mida uuritakse seene-biofilmile: kraapida steriilsetes tingimustes materjali pinnalt uuringumaterjal mikroskoopiaks/külviks v „pesta“ läbi vedelsöötmega
• Külv seene avastamiseks – külvame võimalikult suures hulgas (100-200 μl söötmeplaadile) ja võimalikult kontsentreeritud materjali (liikvor, punktaat vms.)
• Külv seene hulga määramiseks – saame väga ligikaudse hinnangu, kas üldse on mõttekas
(NB! vedelsöötmega transportsüsteem)
Suundumus, et ei korreleeru v korreleerub nõrgalt olukorraga haiguskoldes ning pole vajalik; poolkvantitatiivne külvitehnika pigem erinevate liikide isoleerimise hõlbustamiseks
Külvi tehnika
PATOGEENSED SEENED
• Optimaalne temperatuur 30◦C
• Inkubeerimise aeg sõltub oodatavast patogeenist
Külvid Candida spp. avastamiseks – 72 h
Külve hinnatakse iga päev
Hallitusseente avastamiseks – 7 päeva
Külve hinnatakse iga päev
Dermatofüütide ja endeemsete dimorfsete seente avastamiseks – 3-6 nädalat
Külve hinnatakse iga 2-3 päeva järel esimesed 2 nädalat ning hiljem kord nädalas
Külvide inkubeerimise temperatuur ja aeg
PATOGEENSED SEENED
• Kõik seened samastada liigi tasemel (klassikaliste morfoloogiliste meetoditega, MALDI TOF, DNA sekveneerimine)
• Iga seen võib olla patogeen – kõik sõltub peremeesorganismist e patsiendist
• Kõik kliinilisest materjalist isoleeritud dermatofüüdid on patogeenid
• Kõiki teisi seeni kliinilises materjalis tuleb interpreteerida kooskõlas kliinilise leiuga;
hallitusseened pigem vastata kui mitte – raviarst uurib edasi…
• Meie teadmised patogeenidest täienevad iga päevaga
Külvide interpreteerimine
PATOGEENSED SEENED
Kuidas määrata seent? Vaata ja sa näed.
• Tee hea preparaat
• Kasuta binokulaarmikroskoopi
• Mõõda
PATOGEENSED SEENED
Diagnioosini jõudmine on meeskonnatöö
Seened on ilusad!
Emericella nidulans (Aspergillus nidulans)