Schlussbericht - cleaner-production.de · validation of Methylosinus and Methylocystis species, and...

Forschungsbericht Förderkennzeichen 02WS181A MAL GmbH

Seite 1 von 62

Schlussbericht

Forschungsprojekt

Verbundvorhaben: Labor- und halbtechnischeUntersuchungen zur Entwicklung eines Algenreaktors fürdie Anreicherung von Methan in Biogasen der anaeroben

Klärschlammfaulung, Teil I

Förderkennzeichen 02WS181A

Ausführende Stelle: MALMikrobiologisch-analytisches Labor GmbHJahnsdorfer Straße 709366 Stollberg

Projektleiter: Dr. Dr. sc. K. Trommler

Telefon: 037296 16111Fax: 037296 16165E-Mail: [email protected]

Projektdauer: 01. Aug. 2001 bis 31. Juli 2003,verlängert bis 30. Juni 2005

___________ __________________________Ort, Datum Dr. Dr. sc. K. Trommler


Seite 2 von 62

Das diesem Bericht zugrunde liegende Vorhaben wurde mit Mitteln des Bundesministeriums fürBildung und Forschung unter dem Förderkennzeichen 02WS181A gefördert. Die Verantwortung fürden Inhalt dieser Veröffentlichung liegt beim Autor.


Seite 3 von 62

Inhaltsverzeichnis

1 Aufgabenstellung ............................................................................................................ 52 Voraussetzungen, unter denen das Vorhaben durchgeführt wurde............................ 63 Planung und Ablauf des Vorhabens .............................................................................. 64 Wissenschaftlicher und technischer Stand, an den angeknüpft wurde ...................... 64.1 Bekannte Verfahren und Schutzrechte, die für die Durchführung des Vorhabens benutzt

wurden .............................................................................................................................. 64.2 Verwendete Fachliteratur................................................................................................... 75 Zusammenarbeit mit anderen Stellen ............................................................................ 86 Ergebnisse und Verwertbarkeit der Ergebnisse............................................................ 96.1 Schaffung eines funktionstüchtigen Reaktorsystems zur Prüfung der Verwertbarkeit von

Biogas für die Mikroalgenproduktion.................................................................................. 96.1.1 Prinzip ............................................................................................................................... 96.1.2 Getestete Röhrenreaktorsysteme...................................................................................... 96.1.3 Aufbau eines speziellen Blasenreaktorsystems ............................................................... 116.1.4 Verwertung...................................................................................................................... 116.2 Auswahl geeigneter Mikroalgenspezies für die Anzucht unter Verwendung von Biogas .. 126.2.1 Vorstellung der getesteten Mikroalgenspezies................................................................. 126.2.2 Ermittlung der optimalen Kultivierungsbedingungen ........................................................ 156.2.3 Untersuchungen zum Vergleich der CO2-Verwertung durch verschiedene Algenspezies 186.2.4 Auswahl der geeigneten Spezies..................................................................................... 196.3 Anzucht der ausgewählten Mikroalgenspezies unter Verwendung von Biogas im

speziellen Blasenreaktorsystem ...................................................................................... 206.3.1 Eingesetzte Gase ............................................................................................................ 206.3.2 Aufbau eines Testsystems zur Ermittlung der Bioverträglichkeit von Abfallgasen............ 216.3.3 Anzucht von Chlorella vulgaris......................................................................................... 246.3.4 Anzucht von Chlamydomonas reinhardtii......................................................................... 296.4 Möglichkeiten zur Verwertung der Biomasse................................................................... 316.4.1 Analytik der untersuchten Mikroalgen hinsichtlich verwertbarer Inhaltsstoffe................... 316.4.1.1 Einleitung ........................................................................................................................ 316.4.1.2 Photometrische Bestimmung des Pigmentgehaltes in der Flüssigkultur .......................... 316.4.1.3 Analytik der Carotinoide .................................................................................................. 336.4.1.3.1 Entwicklung einer Methode zur quantitativen Bestimmung von Astaxanthin .................... 336.4.1.3.2 Entwicklung einer Methode zur quantitativen Bestimmung von Lutein und -Carotin....... 386.4.1.3.3 Entwicklung einer In-Prozess-Kontrolle (IPC) für die Akkumulation von Astaxanthin ....... 396.4.1.3.4 Carotinoid-Gehalte in Haematococcus pluvialis............................................................... 406.4.1.4 Analyse des Proteingehaltes ........................................................................................... 426.4.1.4.1 Methoden ........................................................................................................................ 426.4.1.4.2 Ergebnisse der Ermittlung des Proteingehaltes über den Gesamtstickstoff-Gehalt.......... 426.4.1.4.3 Ergebnisse der Bestimmung des Proteingehaltes nach LOWRY ....................................... 426.4.1.5 Identifizierung und Quantifizierung von Fettsäuren.......................................................... 436.4.1.5.1 Methode .......................................................................................................................... 436.4.1.5.2 Fettsäurespektren in Abhängigkeit von der Kultivierungsdauer........................................ 436.4.1.5.3 Fettsäurezusammensetzung der Mikroalgen ................................................................... 446.4.1.6 HPLC-Analytik von Vitaminen und deren Zersetzungsprodukten..................................... 456.4.1.7 Zusammenfassung.......................................................................................................... 476.4.2 Nutzung als Düngemittel.................................................................................................. 47


Seite 4 von 62

6.4.3 Rückgewinnung von Phosphat ........................................................................................ 506.4.3.1 Anzucht von Mikroalgen unter Verwendung von Abwasser ............................................. 506.4.3.2 Eliminierung von Phosphat aus Abwässern durch Mikroalgen und dessen biologische

Akkumluation................................................................................................................... 506.4.3.3 Zusammenfassung.......................................................................................................... 526.4.4 Vergärung der Algenbiomasse ........................................................................................ 526.4.5 Verwertung...................................................................................................................... 536.5 Möglichkeiten zur Verwertung des gereinigten Gases ..................................................... 546.5.1 Eignung des gereinigten Gases für den Antrieb von Motoren .......................................... 546.5.2 Eignung des gereinigten Gases für die Anzucht methanverwertender Bakterien ............. 556.5.2.1 Einleitung ........................................................................................................................ 556.5.2.2 Wachstumsversuche zum Vergleich der Eignung verschiedener Gase ........................... 576.5.2.3 Methanverbrauch zum Aufbau von Biomasse.................................................................. 586.5.2.4 Zusammenfassung.......................................................................................................... 596.5.3 Weitere Verwertungsmöglichkeiten ................................................................................. 596.6 Fugataufbereitung und Nutzung als Nährstoffe................................................................ 596.7 Bemessungsparameter für ein scale-up .......................................................................... 607 Bekannt gewordener Fortschritt auf dem Gebiet des Vorhabens.............................. 628 Erfolgte oder geplante Veröffentlichungen ................................................................. 62


Seite 5 von 62

Teil I – Formales

1 Aufgabenstellung

Aus dem ursprünglichen Projektantrag der energy of nature Projektgesellschaft für umwelt-technische Anlagensysteme Leipzig mbh (EON) gingen die im Folgenden genanntenZielstellungen hervor:

Entwicklung eines Verfahrens auf der Grundlage eines Patents [1] von EON imlabortechnischen Maßstab und einer Anlage zur biologischen Trennung von Biogas in Methanund Kohlendioxid mit dem Ziel der Annäherung des Brennwertes und der Qualität desBiogases an die von Erdgas sowie die Nutzung des CO2 zum photosynthetischen Aufbauenergiereicher Algenbiomasse

Untersuchung der Eignung des gereinigten Biogases für den Betrieb von Erdgasmotoren inKfz, die Einspeisung in Gasleitungen oder für Erdgas-BHKWs

Untersuchung des Effektes der „biologischen Gaswäsche“ auf die Reduzierung vonSiliciumverbindungen und die weitergehende H2S-Reduzierung im Biogas

Untersuchung der Verwertungsalternativen der produzierten Biomasse

- Rückführung der Biomasse in die Faulungsanlage zur Erhöhung des Inputs

- Verwertung als Futtermittel/Dünger

- Extraktion von algenbürtigen Wertstoffen

Gewinnung der für den Aufbau der Algenbiomasse benötigten Nährstoffe aus dem bei derEntwässerung des Gärrückstandes anfallenden Fugat

Prüfung der rechtlichen und technischen Lage für die stoffliche Verwertung der Algenbiomasse

Verfahrensentwicklung im labor- und halbtechnischen Maßstab mit folgenden Zielen

- grundsätzlicher Nachweis des Verfahrensablaufes

- Ermittlung der optimalen Randbedingungen

- Bemessungsparameter und Auslegung für eine Pilotanlage

Von der MAL GmbH wurden die Aufgaben im Verlauf der Bearbeitung folgendermaßen präzisiert:

Entwicklung eines kommerziell verwertbaren Verfahren-/Anlagensystems zur Produktion vonBiomasse unter Verwertung von Biogas im Labormaßstab

Erzeugung von höherwertigerer Biomasse aus Biogas

Entwicklung von Produkten bzw. Prüfung der Verwertbarkeit in den Bereichen funktionelleLebens-/Futtermittel bzw. Grundstoffe für die Pharmaindustrie

Biogasreinigung mittels Mikroalgen zur Erzeugung eines direkt verwertbaren Biogases

Umwandlung von Sonnenenergie in elektrische Energie und Wärmeenergie über dieZwischenschritte Biogas und Biomasse

Rückführung der Abfallbiomasse in den Biogaskreislauf

Reduzierung der unmittelbaren Kohlendioxidemission


Seite 6 von 62

2 Voraussetzungen, unter denen das Vorhaben durchgeführt wurde

Wie bereits im Abschnitt 1 erwähnt, wurde das Vorhaben ursprünglich von der energy of natureProjektgesellschaft für umwelttechnische Anlagensysteme Leipzig mbh (EON) beantragt. Nach derInsolvenz des genannten Unternehmens wurden alle Rechte und Pflichten des anfänglichenZuwendungsempfängers EON von der MAL Mikrobiologisch-analytisches Labor GmbHübernommen.

3 Planung und Ablauf des Vorhabens

Für das Vorhaben war ursprünglich eine Laufzeit vom 01. Aug. 2001 bis zum 31. Juli 2003vorgesehen. Vom Projektträger wurde eine Verlängerung des Bewilligungszeitraumes über den31. Juli 2003 hinaus bis zum 31. Dez. 2004 bzw. bis zum 30. Juni 2005 genehmigt. In demgenannten Zeitraum wurden die vorgestellten Aufgabenstellungen zielgerichtet verfolgt.

4 Wissenschaftlicher und technischer Stand, an den angeknüpft wurde

4.1 Bekannte Verfahren und Schutzrechte, die für die Durchführung des Vorhabensbenutzt wurden

Die Durchführung des Vorhabens erfolgte auf der Grundlage einer Patentschrift [1] desursprünglichen Antragstellers EON. Darin wurde ein Verfahren zur photobiologischen Trennungvon kohlendioxid- und methanhaltigen Gasgemischen beschrieben. Das Verfahren beinhaltet „eineVorrichtung, die aus einem mit einer Lichtquelle versehenen und an die Gasleitung desBiogasreaktors angeschlossenen Assimilator, in dem Algenbiomasse Kohlendioxid aus einemGemisch brennbarer Gase aufnimmt, einem gegen Lichteinwirkung abgeschirmten Dissimilator, indem die Algenbiomasse das Kohlendioxid wieder abgibt, und einem Photosynthesereaktorbesteht, der mit dem Kohlendioxid versorgt wird, wobei Assimilator und Dissimilator durchRohrleitungen, die dem Transport der Algenbiomasse dienen, verbunden sind und der Dissimilatormit dem Photosynthesereaktor durch eine Rohrleitung zur Entnahme von Algenbiomasseverbunden ist“. Diese Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ergab sich aus dervermuteten Eigenschaft von Algen, unter Stressbedingungen Kohlendioxid gasförmigaufzunehmen, in der Zelle zu speichern und unter veränderten Bedingungen gasförmig wiederfreizusetzen. Im Laufe der Projektbearbeitung durch die MAL GmbH wurde festgestellt, dass dieseAnnahme experimentell nicht realisierbar war. In Abstimmung mit dem Projektträger wurdenjedoch weitere, ebenfalls in der Patentschrift genannte Ansatzpunkte untersucht:

photobiologische Trennung von kohlendioxid- und methanhaltigen Gasgemischen, indem dasKohlendioxid aus dem Gasgemisch von Algenkulturen in geschlossenen Systemen unterLichteinwirkung aufgenommen und durch Photosynthese in Algenbiomasse und Sauerstoffumgewandelt wird

wenigstens teilweise Zuführung des Gasgemisches nach Abtrennung von Kohlendioxid zueinem Verbrennungsprozess

wenigstens teilweise Nutzung des Gasgemisches nach Abtrennung von Kohlendioxid zurKultivierung von methanotrophen Mikroorganismen

Verwendung der photosynthetisch aufgebauten Algenbiomasse zur

- Ernährung von nicht photosynthetisch aktiven Organismen

- Extraktion von Wertstoffen und anaerobe Vergärung der Extraktionsrückstände

- Vergärung zwecks Umsetzung zu Biogas


Seite 7 von 62

4.2 Verwendete Fachliteratur

[1] Patentanmeldung 197 21 280.8-43Verfahren und Vorrichtung zur photobiologischen Trennung von Kohlendioxid- undmethanhaltigen Gasgemischen, 1997

[2] Streble, H., Krauter, D.: Das Leben im Wassertropfen, 9. Auflage, Franckh-KosmosVerlag-GmbH & Co, Stuttgart, 2002

[3] Borowitzka, M., Borowitzka, L.: Microalgal biotechnology, Univsity Press, Cambridge,1988

[4] Jander, F.: Massenkultur von Mikroalgen mit pharmazeutisch nutzbaren Inhaltsstoffenunter Verwendung von CO2 und NaHCO3 gewonnen aus den Abgasen einesBlockheizkraftwerkes, Dissertation, Christian-Albrechts-Universität Kiel, 2001

[5] Boussiba, S., Bing, W., Yuan, J.-P., Zarka, A., Chen, F.: Changes in pigment profile inthe green alga Haematococcus pluvialis exposed to environmental stresses,Biotechnology Letters 21 (1999) 601-604

[6] Campbell, N. A. (Dt. Übers. hrsg. von Markl, J.): Biologie, Spektrum AkademischerVerlag GmbH, Heidelberg, Berlin, Oxford, 1997

[7] www.expasy.org/cgi-bin, verfügbar im Dezember 2004

[8] IGV GmbH: Jahresbericht 1997/98; www.igv-gmbh.de, verfügbar Juni 2004

[9] Kohl, J. G., Nicklisch, A.: Ökophysiologie der Algen; Akademieverlag Berlin, 1988

[10] Die Photosynthese und ihre Umweltfaktoren; verfügbar im Dezember 2005http://www.vobs.at/bio/botanik/b-photosynthese-2.htm

[11] Bericht zum AiF-Projekt FKV 0374103J8 Algenverwertung, August 2001

[12] Schulze, C.: Gewinnung und Identifizierung von nutzbaren Verbindungen aus denNährlösungen und Biomassen von Mikroalgen, Dissertation, Christian-Albrechts-Universität Kiel, 2000

[13] Margie Thomason Cyanotech Corporation BioAstin/NatuRoseTM Technical Bulletin:HPLC and spectrophotometric analysis of carotenoids from Haematococcus algaepowder

[14] Kromidas, S.: Handbuch Validierung in der Analytik, Verlag Wiley-VCH, Weinheim, 2000

[15] Gong, X., Chen, F.: Optimization of culture medium for growth Haematococcus pluvialis,Journal of Applied Phycology 9 (1997) 437-444

[16] Norm EN 25663:1993: Bestimmung des KJELDAHL–Stickstoffs (Verfahren nachAufschluss mit Selen), Stand: September 1993

[17] Bitterlich, C.: Diplomarbeit; TU Bergakademie Freiberg, 2004

[18] Lottspeich, F., Zorbas, H.: Bioanalytik, Spektrum-Verlag, Berlin Heidelberg, 1998


Seite 8 von 62

[19] Schlee, D. , Kleber, H.-P.: Wörterbücher der Biologie – Biotechnologie, Gustav FischerVerlag Jena, 1991

[20] Tokusoglu, Ö., Ünal, M.K.: Biomass Nutrient Profiles of three Microalgae: Spirulinaplatensis, Chlorella vulgaris and Isochrysis galbana, Journal of Food Science 68 [4] 2003

[21] www.wegbegleiter.menetekel.de, verfügbar Juni 2004

[22] www.wellness-paket.de, verfügbar Juli 2004

[23] www.mlur.brandenburg.de, verfügbar im Januar 2005

[24] Schlegel, H.G.: Allgemeine Mikrobiologie, Thieme Verlag Stuttgart, 1992

[25] Wise, M.G., McArthur, J.V., Shimkets, L.J.: Methylosarcina fibrata gen. nov., sp. nov. andMethylosarcina quisquillarum sp. nov., novel type I methanotrophs, International Journalof Systematic and Evolutionary Microbiology 51 (2001) 611-621

[26] Whittenbury, R., Phillips, K.C., Wilkinson, J.F.: Enrichment, isolation and someproperties of methane-utilizing bacteria, J. Gen. Microb. 61 (1970b) 205-218

[27] www.ukncc.co.uk, verfügbar im Oktober 2004

[28] Bowman, J.P., Sly, L.I., Nichols, P.D., Hayward, A.C.: Revised taxonomy of themethanotrophs: description of Methylobacter gen. nov., emendation of Methylococcus,validation of Methylosinus and Methylocystis species, and a proposal that the familyMethylococcaceae includes only the group I methanotrophs, International Journal ofsystematic Bacteriology 43 [4] (1993) 735-753

[29] Woitas, K.: Diplomarbeit, Friedrich-Schiller-Universität Jena, 2005

[30] Fachagentur Nachwachsende Rohstoffe e.V. (Hrsg.): Biogasgewinnung und -nutzung,Leipzig, 2004

[31] Krieg, A., Fischer, T.: Verbesserung der Rentabilität von landwirtschaftlichen Betriebendurch die energetische Nutzung von Biogas, verfügbar im Dezember 2005[30] Fachagentur Nachwachsende Rohstoffe e.V. (Hrsg.): Biogasgewinnung und -nutzung, Leipzig, 2004

5 Zusammenarbeit mit anderen Stellen

Das Projekt wurde in Kooperation mit der TU Dresden, Institut für Siedlungs- undIndustriewasserwirtschaft bearbeitet.


Seite 9 von 62

Teil II – Ergebnisse

6 Ergebnisse und Verwertbarkeit der Ergebnisse

6.1 Schaffung eines funktionstüchtigen Reaktorsystems zur Prüfung derVerwertbarkeit von Biogas für die Mikroalgenproduktion

6.1.1 Prinzip

Das Grundprinzip des Systems beruht auf der Verstoffwechslung des im Biogas enthaltenenKohlendioxids durch die Algen unter Aufbau von Biomasse. Das gereinigte Gas enthält einen starkreduzierten CO2- und einen vergleichsweise erhöhten Methananteil. Die Abbildung 1 verdeutlichtdieses Prinzip.

Algenanlage

Biogas(50-60 % Methan,30-40 % Kohlendioxid)

Nährstoff eAlgenbiomasse

Ergebnis der CO2-Elimination:

2-6% CO2 im Abgasstrom-

Licht

Lichtreaktion:Speicherung der Lichtenergie Bildung v on energiereichenStoffen (ATP, NADP) Entstehung v on Sauerstoff

Dunkelreaktion:Reduktion v on KohlendioxidBildung v on Glucose(Biomasse)

Abbildung 1: Prinzip des Systems zur Prüfung der Verwertbarkeit von Biogas für die Mikroalgenproduktion

6.1.2 Getestete Röhrenreaktorsysteme

Es wurden verschiedene Reaktorbasissysteme getestet. Bei den Röhrenreaktorsystemen handeltees sich um offene Systeme ohne Gaskreislauf. Die Abbildungen 2 und 3 zeigen beispielhaft einenAnlagentyp mit senkrechten Röhren und doppelter Gasreinigung sowie die dazu gehörigenanlagenspezifischen Daten. Die Abbildung 4 zeigt ein Reaktorsystem mit waagerechten Röhren.Weitere Angaben zum Aufbau der getesteten Röhrenreaktorsysteme werden im Folgendenzusammengefasst.

Beleuchtung

In jedem Anlagentyp betrug die erzielte Beleuchtungsstärke an den Glasröhren ca.100 µmol/(m2*s).

Messsysteme

Die Anlagen enthielten Sensoren zur Überwachung des pH-Wertes, der CO2-, CH4- und O2-Gehalte, der elektrischen Leitfähigkeit und der Temperatur.

Vorrichtung zur Abtrennung der Algen

Die erzeugte Biomasse wurde mittels eines Separators, der als Bypass in Form einesSedimentationstrichters mit Ablasseinrichtung an der unteren Seite und mit regelbarem Zuflussgeschalten war, abgetrennt.

Gasspeicher

Als Gasspeicher wurde ein Gasbeutel verwendet.


Seite 10 von 62

Senkrechte Röhren, doppelte Gasreinigung

Volumen 16 l

Durchflussgeschwindigkeit: Schläuche 1,7 m/s; Glasröhren 0,2 m/s

Beleuchtung: 3 x Osram Fluora 30 W; 2x Osram Basic 30 W

Abbildung 2: Schema einer getesteten Versuchsanlage und anlagenspezifische Daten

Abbildung 3: Fotografie der getesteten Versuchsanlage mit senkrechten Röhren

Pumpe

Separator

Leuc

htst

offr

öhre

n

Gaszufuhr

Gla

sröh

ren

Gaszufuhr, Entgasung


Seite 11 von 62

Abbildung 4: Fotografie einer getesteten Versuchsanlage mit waagerechten Röhren

6.1.3 Aufbau eines speziellen Blasenreaktorsystems

Bei einem Vergleich der Reaktorsysteme Röhren- und Blasenreaktor wurde deutlich, dass imBlasenreaktor höhere maximale Zellzahlen erzielt werden konnten. Dieses Reaktorsystem wurdedaher weiter ausgebaut.Da die Inhalte dieses Abschnitts vertraulich sind, kann hier nicht auf Einzelheiten eingegangenwerden. Dem Projektträger liegt ein Schlussbericht mit allen Details vor.

6.1.4 Verwertung

An dem im Rahmen des Projektes entwickelten speziellen Blasenreaktorsystem besteht Interessevon Seiten der IGV Institut für Getreideverarbeitung GmbH.Unter der Voraussetzung, dass sich mit diesem Reaktorsystem ein Gas mit einem Methangehaltvon ca. 96 Vol.-% erzielen lässt, besteht ebenfalls Interesse durch die Schmack Biogas AG.Die BiLaCon Institut für Biotechnologie, Laboranalytik und Consulting GmbH hat Interesse an derVerwertung der Ergebnisse unter energetischen Gesichtspunkten. Aktuelle Gespräche mit einemEnergieunternehmen finden diesbezüglich statt.


Seite 12 von 62

6.2 Auswahl geeigneter Mikroalgenspezies für die Anzucht unter Verwendung vonBiogas

6.2.1 Vorstellung der getesteten Mikroalgenspezies

In die Projektarbeit wurde eine Reihe von Mikroalgenspezies einbezogen, welche aufgrund ihrereinfachen Kultivierbarkeit oder wegen interessanter Zellinhaltsstoffe ausgewählt wurden. DieseSpezies sollen im Folgenden kurz vorgestellt werden.

Chlorella vulgaris

Chlorella vulgaris ist eine einzellige, unbewegliche Mikroalge. Sie gehört der Klasse derChlorophyceae und der Ordnung der Volvocales an. Ihr Zelldurchmesser variiert zwischen 5 und10 µm. Charakteristische Baumerkmale sind der glockenförmige Chloroplast, die großenexzentrischen Vakuolen, die differenzierte Zellwand und die dünne Plasmamembran [2].Diese Grünalge vermehrt sich asexuell mithilfe von Autosporen. Unter optimalenWachstumsbedingungen dauert die einfache Reproduktion 16-20 Stunden.Chlorella vulgaris ist durch ihren hohen Chlorophyll- und Proteingehalt besonders interessant [3].Außerdem wurde ihre Anzucht unter Nutzung von CO2 aus den Abgasen einesBlockheizkraftwerkes als Kohlenstoffquelle beschrieben [4].Chlorella vulgaris ist sehr robust und zeigt hohe Wachstumsleistungen bei einfachenKultivierungsbedingungen.

Abbildung 5: Lichtmikroskopische Aufnahme von Chlorella vulgaris (Maßstab 1:600)

Haematococcus pluvialis

Die einzellige Grünalge Haematococcus pluvialis gehört der Klasse der Chlorophyceae und derOrdnung der Volvocales an. Die vegetativen Haematococcus-Zellen sind in der Regel begeißeltund haben einen Zelldurchmesser von 5 bis 10 µm. Haematococcus pluvialis kann jedoch alsgeißellose Zyste ungünstige Lebensbedingungen (Stickstoffmangelmedium, Lichtstress-bedingungen oder extreme hohe Temperaturen) überdauern. Während dieser Zeit nimmt dasVolumen der Zellen zu und es kommt zur Anreicherung größerer Mengen Astaxanthin. DiesesKetocarotinoid ist wegen seiner antioxidativen Eigenschaften Gegenstand der medizinischenForschung und somit auch von großem wirtschaftlichen Interesse. Die Astaxanthinproduktion wirdals Schutzmechanismus vor zu hohen Lichtintensitäten und freien Sauerstoffradikalen angesehen.Der Farbstoff Astaxanthin ist für die Pigmentierung wild lebender und gezüchteter mariner Tierewie Lachse, Krabben und Hummer verantwortlich. Er kann jedoch von ihnen nicht selbstsynthetisiert werden, sondern wird über die Nahrung, wie z. B. Mikroalgen, aufgenommen, dabeigilt Haematococcus pluvialis als wichtigste natürliche Astaxanthinquelle [5].


Seite 13 von 62

Abbildung 6: Zellen von Haematococcus pluvialis im vegetativen Stadium (links) sind grün gefärbt, zu Beginn derStressphase (rechts) ist in Folge der Astaxanthinproduktion eine beginnende Rotfärbung zu erkennen.

Anabaena variabilis

Anabaena variabilis gehört zur Klasse der Cyanophyceae oder Blaualgen, der OrdnungOcsillatoriales und bildet zusammen mit den Bakterien einen Teil der Prokaryonten. Sie besiedeltSüßwasser. Diese Blaualge bildet lange Ketten unterschiedlicher Größe aus 50 bis 2000Einzelzellen (Durchmesser einer Einzelzelle ca. 2 µm). Diese Verkettung ermöglicht sogar eineArbeitsteilung zwischen spezialisierten Zellen (z. B. Heterocysten zur Stickstofffixierung). DaGeißeln fehlen, erfolgt die Fortbewegung gleitend [6].

Abbildung 7: Lichtmikroskopische Aufnahme von Anabaena variabilis (Maßstab 1:200)

Chlamydomonas reinhardtii

Chlamydomonas reinhardtii lebt im Süßwasser und zählt zu den einfachsten Vertretern derChlorophyten. Ihre Zellen sind fast kugelig und bis zu 20 µm groß. Die zweigeißeligen(biflagellaten) Einzeller zeigen sowohl eine asexuelle Reproduktion als auch eine sexuelle (vorallem bei Stressbedingungen: Nahrungsmangel, Trockenheit usw.) [6]. Diese einzellige Grünalgebesitzt einen ausgeprägten photosynthetischen Apparat, der dem höherer Pflanzen ähnelt.Chlamydomonas reinhardtii dient häufig als Modell-Organismus zum Studium desStärkehaushaltes von photosynthetisch aktiven Organismen [7]. Im Gegensatz zu den höherenPflanzen scheint der Stärke-Stoffwechsel weniger komplex zu sein. Auch hier ist die Algenanzuchteinfach und unter geeigneten Bedingungen können sich hohe Wachstumsraten einstellen.


Seite 14 von 62

Abbildung 8: Lichtmikroskopische Aufnahme von Chlamydomonas reinhardtii (Maßstab 1:400)

Isochrysis spec.

Die marine Mikroalge Isochrysis spec. gehört zur Klasse der Haptophyceae (den „Goldalgen“nahestehend) und ist 4-8 µm groß. Isochrysis-Arten sind aufgrund ihres außerordentlich hohenGehaltes an mehrfach ungesättigten Fettsäuren von Interesse. Besonders den -3-Fettsäuren, wieDocosahexaensäure (DHA) und Eicosapentaensäure (EPA) werden günstige biologischeWirkungen zugeschrieben. Sie sind Bausteine bedeutender lokaler Botenstoffe, z. B.Prostaglandine, Leukotriene und Thromboxane. Diese Substanzen haben eine Herz-Kreislaufstabilisierende, cholesterinsenkende und entzündungshemmende Wirkung [8].

Abbildung 9: Lichtmikroskopische Aufnahme von Isochrysis spec. (Maßstab 1:400)


Seite 15 von 62

6.2.2 Ermittlung der optimalen Kultivierungsbedingungen

Chlorella vulgaris, Chlamydomonas reinhardtii, Anabaena variabilis und Isochrysis spec.

Um einen optimalen Biomassezuwachs der Spezies Chlorella vulgaris, Chlamydomonasreinhardtii, Anabaena variabilis und Isochrysis spec. zu gewährleisten, wurden die von ihnengeforderten optimalen Kultivierungsbedingungen ermittelt. Die getesteten Bedingungen umfasstendas Nährmedium, die Lichtintensität einschließlich Hell-Dunkel-Rhythmen und den bevorzugtenpH-Bereich. Versuche bezüglich der Temperatur wurden nicht gesondert durchgeführt, da indiversen Literaturstellen 20 bis 30 °C (Mesophilie) für die genannten Spezies alsTemperaturoptimum empfohlen werden und diese Temperaturen bei jedem Versuch im Laborbedingt durch die Raumtemperatur gewährleistet waren. Nur bei Kultivierungsversuchen im Freienunterlagen die Algensuspensionen größeren Temperaturschwankungen bedingt durch dennatürlichen Tagesrhythmus.

Die im Rahmen der Untersuchungen als günstig ermittelten Kultivierungsbedingungen fasst dieTabelle 1 zusammen. Die Tabelle 2 zeigt die Zusammensetzung der verwendeten Nährmedien.

Spezies Chlorella vulgarisChlamydomonas

reinhardtiiAnabaenavariabilis

Isochrysis spec.

Nährmedium Chlorella-Nährlösung

KUHL KUHLSWES

(Seewasser-Erdextrakt-Salze)

pH-Wert 6 bis 7Einstellung nicht

notwendigEinstellung nicht

notwendig8 (Einstellung

nicht notwendig)

Temperatur 25 °C 25 °C 25 °C25 °C (wächstauch bei 8 °C)

Lichtintensität(bei Dauerlicht)

180 bis 250µmol/(m2*s)

180 µmol/(m2*s)180 bis 250µmol/(m2*s)

60 µmol/(m2*s)

Hell-Dunkel-Rhythmus

Dauerlicht bzw.16 h/8 h

Dauerlicht bzw.16 h/8 h

Dauerlicht12 h/12 h (bei 120

µmol/(m2*s))

Tabelle 1: Ermittelte Kultivierungsbedingungen der Spezies Chlorella vulgaris, Chlamydomonas reinhardtii,Anabaena variabilis und Isochrysis spec.


Seite 16 von 62

Verbindungen Chlorella-Nährlösung KUHL-Nährlösung1 ½ SWES-Medium1

MakronährstoffeKNO3 0,500 g/l 1,011 g/l 0,200 g/lNaH2PO4*H2O 0,621 g/lNa2HPO4*2H2O 0,089 g/lMgSO4*7H2O 0,500 g/l 0,247 g/l 0,020 g/lCaCl2*2H2O 0,015 g/lKH2PO4 0,340 g/lFeSO4 0,014 g/l 0,069 g/l 0,0035 g/lHarnstoff (CH4N2O)NaClK2HPO4 0,020 g/lMeersalz 15,925 g/lBodenextrakt 30 mlMikronährstoffeH3BO3 0,057 mg/l 0,061 mg/l 0,05 mg/lMnCl2*4H2OMnSO4*H2O 0,169 mg/l 0,01 mg/lMoO3

ZnSO4*7H2O 0,740 mg/l 0,287 mg/l 0,005 mg/lCuSO4*5H2O 0,236 mg/l 0,0025 mg/l 0,025 µg/lCo(NO3)2*6H2O 0,005 mg/lNa2MoO4*2H2O 0,005 mg/l(NH4)6Mo7O24*4H2O 0,092 mg/l 0,0124 mg/lCoSO4*7H2O 0,238 mg/lMgSO4*4H2O 4,100 mg/lEDTA 4 mg/lKOHCitronensäure

Tabelle 2: Zusammensetzung der eingesetzten Nährmedien

Heamatococcus pluvialis

Die Kultivierung der Mikroalge Haematococcus pluvialis erfolgte in zwei Phasen in2,5-l-Blasenreaktoren. Während der ersten Phase, der Anzuchtphase, wurde der pH-Wert desMediums automatisch über die CO2-Regelstation konstant auf pH = 7 gehalten. Die Temperaturdes Ansatzes sollte nicht über 18 bis 20 °C liegen, optimal aber bei weniger als 14 °C. DieBeleuchtungsstärke wird mit 60 bis 100 µmol/(m2*s) (400-700 nm) empfohlen.Zur Überwachung des Wachstums wurde täglich unter sterilen Bedingungen eine repräsentativeProbe entnommen und mikroskopisch mittels einer Fuchs-Rosenthal-Zählkammer die Zellzahlermittelt.Nach dem Erreichen der stationären Phase (nach ca. 10 Tagen bzw. bei einer Zellzahl vonca. 5 bis 7*105 Zellen/ml) wurde die Stressphase bzw. der Reifeprozess eingeleitet. Hierzu wurdedie im Anzuchtreaktor erzeugte Algenmasse aufkonzentriert, von der stickstoffhaltigen Nährlösunggetrennt und dann für die Beimpfung des Stressreaktors verwendet. Das Stressmedium iststickstoffarm. Der pH-Wert wurde weiterhin automatisch über die CO2-Regelstation konstant aufpH = 7 gehalten.

1 Nährlösung ist zu autoklavieren


Seite 17 von 62

Die Temperatur des Ansatzes sollte in der Stressphase zwischen 25 und 30 °C liegen, was mitdem Einbau eines Heizers realisiert wurde. Die Beleuchtungsstärke wurde durch Installationzweier Spezialleuchten auf ca. 250 µmol/m2s erhöht.Nach etwa zweitägigem Zellwachstum beginnt die Phase, in der die Algenzellen Astaxanthinakkumulieren.

Die Zusammensetzungen der verwendeten Nährmedien zeigen die Tabellen 3 bis 5.

Stammlösung NährstoffStammlösung

[g/l]Gebrauchslösung

[ml/l]1 Harnstoff (CH4ON2) 36 52 MgSO4 * 7 H2O 15 53 H3BO3 11,42 14 NaCl 5 55 CaCl2 * 2 H2O 5 56 K2HPO4 * 3 H2O 19,6 5

Hauptelemente

7 KH2PO4 35 5Co(NO3)2*6 H2O 0,49ZnSO4 * 7 H2O 8,82MnCl2 * 4 H2O 1,44

MoO3 0,71Spurenelemente 8

CuSO4 * 5 H2O 1,57

1

EDTA 50EDTA-KOH-Lösung

9KOH 31

1

FeSO4 * 7 H2O 5Eisen-Lösung 10

Citronensäure 51

Tabelle 3: Zusammensetzung des Mediums zur Kultivierung von Haematococcus pluvialis

Das Nährmedium wird aus 10 Stammlösungen (Zusammensetzung siehe Tabelle 3) hergestellt.Der pH-Wert der einzelnen Stammlösungen muss vor dem Autoklavieren (120 °C, 15 min) aufpH = 7 eingestellt werden.Zur Aufbewahrung der Stammlösungen wird eine Temperatur von 4 °C bei Dunkelheitvorgeschrieben. Die Haltbarkeit dieser Stammlösungen beträgt 6 Monate.

Zur Herstellung der zu verwendenden Nährstofflösung werden die in der TabellenspalteGebrauchslösung aufgeführten Mengen der einzelnen Stammlösungen in einen 1000-ml-Maßkolben pipettiert und mit Reinstwasser aufgefüllt. Anschließend wird die fertige Nährlösung bei120 °C autoklaviert.

Stammlösung NährstoffStammlösung

[g/100 ml]Gebrauchslösung

[ml/250ml]1 K2HPO4 0,1 20

Hauptelemente2 MgSO4 * 7H2O 0,1 20

Spurenelemente 3 Mikronährstofflösung 5

Tabelle 4: Zusammensetzung des Mediums zur Stressung von Haematococcus pluvialis


Seite 18 von 62

Stammlösung [g/100 ml] GebrauchslösungDestilliertes Wasser 986 mlLösung 12

ZnSO4 * 7H2O 0,1 1 mlMnSO4 * 4H2O 0,1 2 mlH3BO3 0,2 5 mlNa2 MoO4 * 2H2O 0,02 5 mlCuSO4 * 5H2O 0,0005 1 mlLösung 23

FeSO4 * 7H2O 0,7 g

Tabelle 5: Zusammensetzung der Mikronährstofflösung des Mediums zur Stressung von Haematococcus pluvialis.Die Lösungen 1 und 2 sind getrennt herzustellen, zu autoklavieren und anschließend zu vereinigen.

6.2.3 Untersuchungen zum Vergleich der CO2-Verwertung durch verschiedene Algenspezies

Die für den Großteil der Experimente im Rahmen des Projektes eingesetzte Mikroalge Chlorellavulgaris sollte hinsichtlich ihrer CO2-Verwertung mit weiteren Algenspezies verglichen werden.Dazu wurden die Grünalge Chlamydomonas reinhardtii und das Cyanobakterium Anabaenavariabilis ausgewählt, denen laut Literatur [9] eine besonders gute CO2-Verwertung bescheinigtwird.Der Versuchsaufbau wurde so realisiert, dass in einen kleinen Blasenreaktor eineAlgensuspension definierten Volumens und definierter Zellzahl (ca. 2,2*106 Zellen/ml) eingebrachtwurde. Das System wurde luftdicht verschlossen, die ständige Durchmischung derAlgensuspension erfolgte durch Schütteln. Eine definierte Menge an CO2 wurde mit einer Spritzevon unten in den Reaktor eingebracht. Vor dem Einbringen des Gases in das System wurdenjeweils die aktuelle Zellzahl/ml von Chlorella vulgaris und Chlamydomonas reinhardtii bzw. dieExtinktion von Anabaena variabilis bestimmt und der pH-Wert und die Uhrzeit notiert. Nach derZugabe von CO2 wurden die Veränderung des pH-Wertes registriert und die Zeit bis zumErreichen des entsprechenden Ausgangs-pH-Wertes. Danach erfolgte erneut die Bestimmung derZellzahl/ml bzw. die Messung der Extinktion. Dieses Vorgehen wurde mehrmals wiederholt.Die Kultivierungsbedingungen waren für alle Spezies gleich. Die Abbildung 10 zeigt dieWachstumskurven der drei Mikroalgen bezogen auf das verbrauchte CO2 in ml/h.Ausgehend von der Abbildung 10 ist sehr deutlich zu erkennen, dass Chlorella vulgaris dasdargebotene CO2 am effektivsten mittels Photosynthese in Biomasse umwandelte. Trotz der etwasungewöhnlichen Kultivierungsbedingungen (Schütteln) erreichte diese Mikroalge einevergleichsweise hohe Zellzahl von 3,4*107 Zellen/ml nach nur fünf Tagen. Mit zunehmenderZellzahl in der exponentiellen Phase stieg zudem der Verbrauch an CO2 durch Chlorella vulgarispro Zeiteinheit. Das Experiment wurde nach 5 Tagen beendet, da die Zellen abstarben.Das Cyanobakterium Anabaena variabilis erreichte nach 5 Tagen eine Extinktion von E620 = 0,4,das entspricht einer Zellzahl in der Größenordnung von 2,5*107 Zellen/ml. Dabei verbrauchteAnabaena variabilis vor allem gegen Ende des Versuchszeitraumes deutlich mehr CO2 proZeiteinheit als Chlorella vulgaris.Chlamydomonas reinhardtii wies unter den gegebenen Bedingungen einen vergleichsweise hohenCO2-Verbrauch auf, akkumulierte dabei aber kaum Biomasse. Das Biomassewachstum war jedoch– ausgehend von einer ähnlichen Startzellzahl – dem aus anderen Versuchen vergleichbar. DerVersuch lief hier nur über 3 Tage, da die Zellen dann bereits abstarben. Es ist noch nicht bekannt,was mit dem verbrauchten CO2 passiert, wenn es offensichtlich nicht zum Aufbau von Biomasseverwertet wird. Es ist denkbar, dass diese Mikroalge einen Teil des CO2 speichert ohne es zuverstoffwechseln.

2 886 ml Wasser + angegebene Nährsalze3 100 ml Wasser + angegebene Nährsalze


Seite 19 von 62

Dies würde einem Gedanken aus dem ursprünglichen Antrag für dieses Projekt der energy ofnature Projektgesellschaft für umwelttechnische Anlagensysteme Leipzig bmH entsprechen. Darinwurde von der Fähigkeit von Algen, unter Stressbedingungen CO2 in den Zellen einzulagern undbei Änderung der Bedingungen gasförmig wieder abzugeben, ausgegangen.

0,00E+00

5,00E+06

1,00E+07

1,50E+07

2,00E+07

2,50E+07

3,00E+07

3,50E+07

4,00E+07

0 1 2 3 4 5

CO2-Verbrauch [ml/h]

Zel

lzah

l/ml

0,000,050,100,150,200,250,300,350,40

0,45

Ext

inkt

ion

(62

0 n

m)

Chlorella vulgaris Chlamydomonas reinhardtii Anabaena variabilis

Abbildung 10: Vergleich des Biomassewachstums der einzelnen Mikroalgenspezies in Bezug zur CO2-Verwertung

Zusammenfassend zeigte dieses orientierende Experiment, dass Chlorella vulgaris dasdargebotene CO2 am besten in Biomasse umsetzte. Für Untersuchungen, die sowohl auf eineVerwertung von CO2 durch Mikroalgen als auch auf die Bildung von verwertbarer Biomasseabzielen, ist Chlorella vulgaris somit am besten geeignet. Anabaena variabilis undChlamydomonas reinhardtii verwerteten vergleichsweise mehr CO2 als Chlorella vulgaris, dabeiakkumulierte aber vor allem Chlamydomonas reinhardtii deutlich weniger Biomasse. Im Hinblickauf die CO2-Elimination ohne das Ziel einer hohen Biomasseausbeute wären somitChlamydomonas reinhardtii oder Anabaena variabilis zu bevorzugen.

6.2.4 Auswahl der geeigneten Spezies

Abgeleitet aus den vorgestellten Daten und Erkenntnissen wurden für die Prüfung derVerwertbarkeit von Biogas für die Mikroalgenproduktion in einem speziellen Blasenreaktorsystemdie Spezies Chlorella vulgaris und Chlamydomonas reinhardtii ausgewählt. Beide Mikroalgenlassen sich einfach kultivieren, zudem erwies sich vor allem Chlorella vulgaris als robustgegenüber schwankenden Kultivierungsbedingungen und ist wegen seiner in der Literaturbeschriebenen ausgewogenen Zusammensetzung an Nährstoffen interessant. Bezüglich einermöglichen Verwertung der Biomasse bzw. eines wertvollen Inhaltsstoffes wurde die GrünalgeHaematococcus pluvialis in die Untersuchungen einbezogen. Die Kultivierung dieser Mikroalgeerfolgte bisher nicht im speziellen Blasenreaktor unter Verwendung von Biogas, sondern in einemherkömmlichen Blasenreaktorsystem unter Nutzung von reinem CO2. Ein Prinzipnachweis derKultivierbarkeit von Haematococcus pluvialis mit (entschwefeltem) Biogas wurde erbracht. Dabeiwurden maximale Zellzahlen von ca. 6,3*105 Zellen/ml erreicht.


Seite 20 von 62

6.3 Anzucht der ausgewählten Mikroalgenspezies unter Verwendung von Biogas imspeziellen Blasenreaktorsystem

6.3.1 Eingesetzte Gase

Natürliches Biogas (Biogasreaktor MAL GmbH)

Das im laboreigenen Faulgasreaktor produzierte Biogas wird in Gasbeuteln aufgefangen oderdirekt dem Blasenreaktorsystem zugeführt. Täglich wird dem Faulgasreaktor ein definiertesVolumen an Primärschlamm (Gülle) inklusive einer kleinen Menge Altbrot zugefüttert, wobei demReaktor dieselbe Menge an Volumen wieder entzogen wird. Zur Kontrolle werden der pH-Wert undder Trockengehalt dieses Faulschlamms gemessen, da bestimmte Milieubedingungen gegebensein müssen. Die Temperatur sollte bei ca. 37 °C liegen. Weiterhin benötigen methanbildendeBakterien einen pH-neutralen Bereich von ca. 6,8.

Synthetisches Biogas (Gasflasche)

Aufgrund des hohen Aufwandes zur Gewinnung von natürlichem Biogas in Bezug zur benötigtenMenge für verschiedene Versuche, wurde als „Ersatz“synthetisches Biogas in einer Gasflascheerworben. Der Vorteil dieses Gases liegt darin, dass während einer längeren Versuchsdauerimmer die gleiche Zusammensetzung an Inhaltsstoffen gewährleistet werden kann.

Die Zusammensetzung der eingesetzten Gase wird in der Tabelle 6 zusammengefasst.

KomponenteGehalt [Vol.-%]

in natürlichem BiogasGehalt [Vol.-%]

in synthetischem BiogasCH4 57 55CO2 35 32O2 1 2N2 3 5

H2S 0,025 1H2 n.a.4 n.a.

H2O n.a. n.a.

Tabelle 6: Vergleich der eingesetzten Biogase

Wie aus der Tabelle 6 hervor geht, weist das synthetische Biogas einen vergleichsweise hohenH2S-Gehalt auf. Schwefelwasserstoff erwies sich für die Anzucht von Algen alswachstumshemmende Komponente (s. Abschnitt 6.3.2) und wurde durch das Vorschalten einerGasreinigungsmasse aus dem Gas entfernt. Diese bereits großtechnisch erprobte, pelletierteGasreinigungsmasse FerroSorp® S basiert auf Eisenhydroxid, welches den Schwefelwasserstoffchemisch bindet und auf diese Weise aus dem Gas entfernt. Das im eigenen Labor produzierteBiogas schwankte hinsichtlich seiner Zusammensetzung wie die Abbildung 11 zeigt.

4 nicht analysiert


Seite 21 von 62

Abbildung 11: Methan- und Kohlendioxid-Gehalte in natürlichem Biogas aus dem laboreigenen Faulgasreaktor

6.3.2 Aufbau eines Testsystems zur Ermittlung der Bioverträglichkeit von Abfallgasen

Prinzip des Testsystems

Zur Ermittlung der Bioverträglichkeit von drei Abfallgasen (synthetisches Biogas, entschwefeltessynthetisches Biogas und natürliches Biogas aus dem Faulgasreaktor im MAL-Labor) durchMikroalgen wurde ein Testsystem aufgebaut. Das Ziel der Untersuchungen bestand zum einendarin, die Verwertung des in den Gasen enthaltenen CO2 im Vergleich zu reinem CO2 im Hinblickauf den Biomassezuwachs zu testen. Dabei ist derzeit nicht bekannt, ob neben dem CO2-Dargebotweitere limitierende Faktoren für das Algenwachstum in diesem Versuchsaufbau existieren unddas Ergebnis beeinflussen. Zum anderen soll das System als Grundlage für ein ökotoxikologischesTestsystem zur Ermittlung der Bioverträglichkeit von Gasen dienen. Ein solches Testsystemerweitert das Dienstleistungsangebot der MAL GmbH.Da der konkrete Aufbau dieses Testsystems vertraulich ist, kann hier nicht auf Einzelheiteneingegangen werden. Dem Projektträger liegt ein Schlussbericht mit allen Details vor.

25,0

30,0

35,0

40,0

45,0

50,0

55,0

60,0

10.01.200500:00

10.01.200512:00

11.01.200500:00

11.01.200512:00

12.01.200500:00

12.01.200512:00

13.01.200500:00

13.01.200512:00

Messzeitpunkt [Datum, Uhrzeit]

Vo

l-%

Methan Kohlendioxid

Biogasreaktor fürBiomassenachschub

geöffnet

Biogasreaktor fürBiomassenachschub

geöffnet


Seite 22 von 62

Ergebnisse der Versuche zur Ermittlung der Bioverträglichkeit von Abfallgasen

Zur Durchführung der Versuche wurden folgende Mikroalgen als Testorganismen eingesetzt:Chlorella vulgaris, Chlamydomonas reinhardtii, Anabaena variabilis und Isochrysis spec.Wie die Abbildung 12 zeigt, war Chlorella vulgaris in der Lage das CO2 aus dem natürlichen unddem entschwefelten synthetischen Biogas nahezu genau so gut zu verwerten wie reines CO2. DieWachstumskurven der drei genannten Begasungsarten ähneln sich, wobei die maximal erreichteZellzahl von 7,3*107 Zellen/ml an Tag 12 bei Begasung mit reinem CO2 um nur 6 % höher lag alsbei der Kultivierung mit Biogas aus dem Faulschlammreaktor (6,9*107 Zellen/ml). Ein deutlichesWachstumsdefizit verzeichnete die Kultivierung mittels synthetischem Biogas mit einer erreichtenZellzahl von 1,2*107 Zellen/ml. Ursache hierfür kann der erhöhte Anteil an Schwefelwasserstoff imGasgemisch sein, da nach Entfernung des H2S ein Biomassewachstum ähnlich dem mit reinemCO2 erreicht wurde. Trotz des im synthetischen Biogas enthaltenen CO2 hemmte also dervorhandene Schwefelwasserstoff das Algenwachstum. Dieses Phänomen wurde auch bei denanderen untersuchten Mikroalgenspezies beobachtet.

0,00E+00

1,00E+07

2,00E+07

3,00E+07

4,00E+07

5,00E+07

6,00E+07

7,00E+07

8,00E+07

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

Zeit [d]

Zel

lzah

l/ml

nat. Biogas synth. Biogas CO2 H2S-freies synth. Biogas

Abbildung 12: Wachstumskurven von Chlorella vulgaris bei der Kultivierung mit verschiedenen CO2-haltigen Gasen

Bei der Kultivierung von Chlamydomonas reinhardtii mit verschiedenen Gasen wurde das besteErgebnis mit natürlichem Biogas erreicht (Abbildung 13). Die maximal erzielte Zellzahl lag bei1,8*107 Zellen/ml. Bei der Anzucht mit reinem CO2 wurden ca. 1,4*107 Zellen/ml erreicht. Dernegative Einfluss des Schwefelwasserstoffanteils im synthetischen Biogas war auch auf dasWachstum von Chlamydomonas reinhardtii anhand der erreichten Zellzahlen deutlich erkennbar.Die maximale Zellzahl lag bei nur 8*106 Zellen/ml.


Seite 23 von 62

0,00E+00

5,00E+06

1,00E+07

1,50E+07

2,00E+07

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Zeit [d]

Zel

lzah

l/ml


Abbildung 13: Wachstumskurven von Chlamydomonas reinhardtii bei der Kultivierung mit verschiedenen CO2-haltigenGasen

Das Cyanobakterium Anabaena variabilis konnte das in natürlichem und entschwefeltemsynthetischen Biogas enthaltene CO2 ebenso gut verwerten wie reines CO2 (Abbildung 14). DerVerlauf des Wachstums wurde in diesem Fall nicht über die Bestimmung der Zellzahl durchgeführt,da Anabaena variabilis in langen Zellketten vorkommt, die inhomogen in der Kultivierungslösungverteilt sind. Der Biomassezuwachs wurde über die Bestimmung der Extinktion (620 nm) verfolgt.Die maximale Extinktion wurde bei der Kultivierung von Anabaena variabilis mit reinem CO2 erzielt,wobei ein Wert von E620 = 0,61 erreicht wurde.Auch bei diesem Kultivierungsversuch war die Verträglichkeit gegenüber schwefelwasser-stoffhaltigem Gas nicht gegeben. Die maximal erreichbare Zelldichte konnte durch einegemessene Extinktion von E620 = 0,37 wiedergegeben werden, wobei der negative Effekt desSchwefelwasserstoffs nicht so deutlich ausfällt wie bei der Kultivierung von Chlorella vulgaris bzw.Chlamydomonas reinhardtii.

0,000

0,100

0,200

0,300

0,400

0,500

0,600

0,700

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Zeit [d]

Ext

inkt

ion

(62

0 n

m)


Abbildung 14: Wachstumskurven von Anabaena variabilis bei der Kultivierung mit verschiedenen CO2-haltigen Gasen


Seite 24 von 62

Für die marine Mikroalge Isochrysis spec. wurde festgestellt, dass reines CO2 und CO2 ausnatürlichem Biogas am besten verwertet werden (Abbildung 15). Für diese beiden Gase konntenZellzahlen von 5*107 Zellen/ml erzielt werden.Ein ähnliches Ergebnis ist auch für die Kultivierung mit entschwefeltem synthetischen Biogasanzunehmen. Bis zum Kultivierungstag 19, an welchem dieses Reaktorsystem wegen einestechnischen Problems ausfiel, entsprach der Kurvenverlauf jenem von CO2 und natürlichemBiogas. Aus diesem Grund wurde auf einen ähnlichen weiteren Verlauf bei unverändertenReaktionsbedingungen geschlossen. Erstaunlich war die Verträglichkeit von Isochrysis spec.gegenüber der Zufuhr von ungereinigtem synthetischen Biogas aus der Gasflasche mit erhöhtemSchwefelwasserstoffanteil. Diese Mikroalge zeigte im Gegensatz zu den drei anderen Spezies hierein vergleichsweise gutes Wachstum und es konnte eine maximale Zellzahl von 4*107 Zellen/mlerzielt werden.

0,00E+00

1,00E+07

2,00E+07

3,00E+07

4,00E+07

5,00E+07

6,00E+07

0 5 10 15 20 25

Zeit [d]

Zel

lzah

l/ml


Abbildung 15: Wachstumskurven von Isochrysis spec. bei der Kultivierung mit verschiedenen CO2-haltigen Gasen

Zusammenfassend kann gesagt werden, dass die untersuchten Mikroalgen in der Lage waren dasCO2 aus den getesteten Abfallgasen zu verwerten. Dabei wurden z. T. sogar im Vergleich zureinem CO2 höhere Zellzahlen erreicht. Es wurde aber auch erkannt, dass AbfallgaseKomponenten enthalten können, die das Algenwachstum hemmen, obwohl CO2 dargeboten wird.Im konkreten Fall war Schwefelwasserstoff eine das Algenwachstum negativ beeinflussendeKomponente. Nach dessen vorheriger Abtrennung erwies sich das Gas für die Kultivierung alsgeeignet. Daraus abgeleitet ist es möglich, den Versuchsaufbau als Grundlage für den Aufbaueines ökotoxikologischen Testsystems zur Ermittlung der Bioverträglichkeit von Gasen zu nutzen.

6.3.3 Anzucht von Chlorella vulgaris

Die folgenden Kenndaten wurden im Rahmen der Anzucht von Chlorella vulgaris im speziellenBlasenreaktorsystem gewonnen.


Seite 25 von 62

Gasqualität

Die Tabelle 7 zeigt die Zusammensetzung von entschwefeltem synthetischen Biogas nach derVerwertung des CO2 durch die Mikroalge Chlorella vulgaris.

Komponente Gehalt [Vol.-%] in gereinigtem synthetischen BiogasCH4 53CO2 2O2 30N2 10

H2S n.a.H2 n.a.

H2O n.a.

Tabelle 7: Zusammensetzung von gereinigtem synthetischen Biogas

Der CO2-Gehalt von ca. 35 % im Ausgangsgas (siehe Tabelle 4) verringerte sich durch dieGasreinigung im Photobioreaktor auf etwa 2 %. Infolge der Photosyntheseaktivität der Mikroalgenwurde Sauerstoff gebildet. Der Methangehalt ist im Vergleich zum Ausgangsgas nahezuunverändert. Der Stickstoffgehalt hat sich um Vergleich zum Ausgangsgas etwas erhöht, wobeinicht auszuschließen ist, dass der Eintrag während der Probenahme erfolgte. Die CO2-Eliminierung konnte im Vergleich zum Röhrenreaktorsystem verbessert werden. Dort wurde nacheinfacher Gasreinigung eine Abnahme des Ausgangs-CO2-Gehaltes von 36 % auf 10 bis 15 %ermittelt, nach doppelter Gasreinigung wurden im Abgasstrom CO2-Gehalte von 2 bis 6 % erzielt.

CO2-Verwertung und resultierendes Algenwachstum und Biomasseertrag

In den Tabellen 8 und 9 sind wichtige Kenndaten des speziellen Reaktorsystemszusammengestellt. Die ermittelten Daten beziehen sich jeweils auf die angegebeneKultivierungsdauer.

Basisdaten Ausbeuteberechnung 1Kultivierungsdauer [d] 7 Masse einer Zelle [g] 3,65*10-11

Biogasverbrauch [l] 8,5 Biomassezuwachs [g] 5,35

Anteil CO2 Input [%] 36Biomasseausbeute bezogen aufTheorie [%]

85

Anteil CO2 Output [%] 3 Ausbeuteberechnung 2Zellzuwachs [Zellen/ml] 5,86*107 Trockenmasse [g/l] 1,6Anlagenvolumen [ml] 2500 Biomassezuwachs [g] 4

Biomasse theoretisch [g]5 6,31Biomasseausbeute bezogen aufTheorie [%]

63

Tabelle 8: Reaktorkenndaten bei Verwendung von synthetischem Biogas

5 berechnet auf der Basis der Reaktionsgleichung der Photosynthese und unter der Annahme, dass zwischen dem

infolge Photosynthese gebildeten Kohlenstoff und der Gesamtmenge der gebildeten organischen Stoffe ein Faktor von1,8 besteht [10] sowie unter Verwendung des tatsächlichen CO2-Verbrauchs


Seite 26 von 62




66

Anteil CO2 Output [%] 3 Ausbeuteberechnung 2Zellzuwachs [Zellen/ml] 6,81*107 Trockenmasse [g/l] 2,2Anlagenvolumen [ml] 2500 Biomassezuwachs [g] 5,5

Biomasse theoretisch [g] 9,06Biomasseausbeute bezogen aufTheorie [%]

61

Tabelle 9: Reaktorkenndaten bei Verwendung von natürlichem Biogas

Aus den Tabellen 8 und 9 ist ersichtlich, dass im speziellen Blasenreaktorsystem - unterBerücksichtigung von möglichen Ungenauigkeiten bei der ermittelten Masse einer Zelle bzw. derbestimmten Trockenmasse - Biomasseausbeuten im Bereich von 60 bis 85 % bezogen auf dietheoretische Ausbeute erzielt wurden. Bei einem Vergleich der mit den getesteten Gasen erzieltenAusbeuten konnte nur bei der Ausbeuteberechnung unter Zugrundelegung der Zellmassen einUnterschied festgestellt werden. Dabei wurde unter Verwendung des synthetischen Biogases einehöhere Ausbeute ermittelt. Nach Ermittlung der Ausbeuten unter Nutzung der bestimmtenTrockenmassen wurde kein gravierender Unterschied zwischen den verwendeten Gasenfestgestellt. Nach seiner Entschwefelung eignete sich das synthetische Biogas – wie bereits imKapitel 6.3.2 beschrieben – somit ebenso gut wie natürliches Biogas zur Anzucht von Mikroalgen.

Es wurden für beide untersuchte Biogase maximale Zellzahlen von 1,0*108 Zellen/ml im Reaktorerzielt. Das stellt im Vergleich zum Röhrenreaktorsystem eine deutliche Verbesserung dar. Dortwurden für Chlorella vulgaris in einem ähnlichen Kultivierungszeitraum nur maximale Zellzahlenvon 2 bis 3*107 Zellen/ml erzielt.

Untersuchungen zur Bestimmung eines optimalen Erntezyklus für die Gewinnung von Biomasse

Der Schlüssel für eine optimale Biomasseproduktion ist die möglichst lange Aufrechterhaltung derexponentiellen Wachstumsphase der Kultur. Die durchgeführten Untersuchungen speziellenBlasenreaktorsystem zeigten zu Beginn eine exponentielle Wachstumsphase der Algenkultur ineinem Bereich von 3,0*107 Zellen/ml bis 8,0*107 Zellen/ml (siehe blaue Wachstumskurve inAbbildung 16). Während der ersten Anzucht der Algen im Photobioreaktor benötigten diese einegewisse Zeit um sich an die Lebensbedingungen anzupassen, des Weiteren kam es durchzwischenzeitlich vorgenommene Umbauarbeiten am Reaktor zu einem Absinken der Zellzahl(Abbildung 16). Um eine hohe Produktivität in der Gewinnung von Biomasse zu erreichen undeinen stabilen Zyklus zu etablieren, wurde für die Ernten zunächst jeweils die Hälfte derAlgensuspension entnommen und durch Nährlösung ersetzt. Dabei kam es zu einer zunehmendenErhöhung der Zellzahl bei zunehmender Häufigkeit der Erntezyklen. Daraufhin wurde derErntezyklus umgestaltet. Es wurde jeweils soviel Algensuspension entnommen, dass immerwieder eine Ausgangszellzahl von ca. 1,0*107 Zellen/ml resultierte (Abbildung 17).


Seite 27 von 62

Abbildung 16: Verlauf der Zellzahl im speziellen Blasenreaktorsystem und Markierung der Erntezeitpunkte der Biomasse

Abbildung 17: Verlauf der Zellzahl im speziellen Blasenreaktorsystem und Markierung der Erntezeitpunkte der Biomassenach Umgestaltung des Erntezyklus

Aus der Abbildung 17 ist deutlich ein konstant schnelles Wachstum der Algenpopulationausgehend von einer Startzellzahl von ca. 1,0*107 Zellen/ml im Reaktorsystem festzustellen. DieErnte erfolgte jeweils dann, wenn das Erreichen der stationären Wachstumsphase erkannt wurde.Die Kultivierungsdauer bis zum Erreichen der maximalen Zellzahl im Reaktor lag in der Mehrzahlder Kultivierungen bei ca. 9 Tagen. Nach dieser Dauer konnten etwa 90 % des Reaktorinhalts füreine Weiterverarbeitung geerntet werden. Durch die Umstellung des Erntezyklus konnte eineProduktivitätssteigerung erreicht werden.

0,00E+00

2,00E+07

4,00E+07

6,00E+07

8,00E+07

1,00E+08

1,20E+08

30.09.200400:00

10.10.200400:00

20.10.200400:00

30.10.200400:00

09.11.200400:00

19.11.200400:00

29.11.200400:00

09.12.200400:00


Zel

lzah

l/ml

Ernte

Entnahmevon 400 ml

Ernte

Ernte

Ernte

Gasumstellung

0,00E+00

2,00E+07

4,00E+07

6,00E+07

8,00E+07

1,00E+08

1,20E+08

29.11.200400:00

04.12.200400:00

09.12.200400:00

14.12.200400:00

19.12.200400:00

24.12.200400:00

29.12.200400:00

03.01.200500:00

08.01.200500:00


Zel

lzah

l/ml

Ernte Ernte Ernte

Gasumstellung

Ernte


Seite 28 von 62

In der Abbildung 18 wird die erreichte Produktivität der einzelnen Kultivierungen vergleichenddargestellt. Aus den Abbildungen 16 und 17 ging bereits hervor, dass die Ernte der Biomasse nichtimmer zum Zeitpunkt der maximalen Zellzahl erfolgte, sondern z. T. erst nachdem die Bestimmungder Zellzahl einen Abfall gegenüber dem Vortag ergab. Deshalb wurde in der Abbildung 18 nebender tatsächlich erreichten Biomasseproduktion pro Tag auch die maximal erreichbare täglicheBiomasseproduktion unter Annahme der Ernte am Tag der höchsten Zellzahl aufgezeigt. Nochhöhere Erträge hätten erzielt werden können, wenn durch die Ernte immer eine Verdünnung dermaximalen Zellzahl auf exakt 1,0*107 Zellen/ml gelungen wäre. Auch dies ist in der Abbildung 18dargestellt.

0,000

0,200

0,400

0,600

0,800

1,000

1,200

1,400

1 2 3 4 5 6 7 8

Anzucht

gee

rnte

te B

iom

asse

in g

/d

geerntete Biomasse in g/d Biomasse in g/d mit maximal erreichter Zellzahl potenziell möglich bei maximaler Ausnutzung

Umstellung des Erntezyklus

Abbildung 18: Steigerung der Produktivität der Biomasseproduktion durch Umstellung des Erntezyklus

Die Steigerung der Ernteerträge durch die Umstellung des Erntezyklus wird noch einmal in derTabelle 10 verdeutlicht. Daraus ist ersichtlich, dass bezogen auf die durchschnittlich erreichteBiomasse im 1. Erntezyklus eine Produktivitätssteigerung um ca. 150 % erreicht wurde.

Erntezyklus 1(Entnahme eines konstanten Volumens)

Erntezyklus 2(Startzellzahl 1*107 Zellen/ml)

Biomasse [g/d] % Biomasse [g/d] %0,136 61 0,279 1250,104 46 0,561 2520,252 113 0,607 2710,399 179 0,791 355

Mittelwert 0,223 100 0,560 252

Tabelle 10: Steigerung der Ernteerträge durch die Umstellung des Erntezyklus


Seite 29 von 62

6.3.4 Anzucht von Chlamydomonas reinhardtii

Gasqualität

Die Tabelle 11 stellt die Zusammensetzung von laboreigenem natürlichen Biogas vor und nach derVerwertung des CO2 durch die Mikroalge Chlamydomonas reinhardtii gegenüber.

KomponenteGehalt [Vol.-%]

in natürlichem BiogasGehalt [Vol.-%]

in gereinigtem natürlichen BiogasCH4 45 40CO2 37 13O2 3 22N2 14 20H2S nicht analysiert nicht analysiertH2 nicht analysiert nicht analysiertH2O nicht analysiert nicht analysiert

Tabelle 11: Zusammensetzung von natürlichem Biogas vor und nach der Reinigung durch die MikroalgeChlamydomonas reinhardtii

Der CO2-Gehalt von ca. 37 % im Ausgangsgas verringerte sich durch die Gasreinigung imPhotobioreaktor auf etwa 13 %. Das ist im Vergleich zur Reinigung mit Chlorella vulgaris (etwa2 %) ein deutlich schlechteres Ergebnis. Auffällig ist im Vergleich zu Tabelle 4 auch der hoheStickstoffgehalt im Ausgangsgas. Es wird nicht ausgeschlossen, dass dieser hohe Gehalt aufeinen Probenahmefehler zurückzuführen ist, der sich gleichermaßen im Stickstoffgehalt desgereinigten Biogases widerspiegelt.Im Gegensatz zur Biogasreinigung mit Chlorella vulgaris fiel auf, dass der CO2-Gehalt hier stetiganstieg. Das unterschiedliche Verhalten von Chlorella vulgaris und Chlamydomonas reinhardtii inBezug auf die Verwertung von CO2 war bereits im Abschnitt 6.2.3 beobachtet worden.

CO2-Verwertung und resultierendes Algenwachstum und Biomasseertrag

In der Tabelle 12 sind wichtige Kenndaten des speziellen Blasenreaktorsystemszusammengestellt. Die ermittelten Daten beziehen sich jeweils auf die angegebeneKultivierungsdauer.




111

Anteil CO2 Output [%] 13 Ausbeuteberechnung 2Zellzuwachs [Zellen/ml] 1,07*107 Trockenmasse [g/l] 3,1Anlagenvolumen [ml] 2500 Biomassezuwachs [g] 7,75

Biomasse theoretisch [g] 8,50Biomasseausbeute bezogen aufTheorie [%]

103

Tabelle 12: Reaktorkenndaten bei Verwendung von natürlichem Biogas


Seite 30 von 62

Bezogen auf die theoretische Ausbeute wurde im speziellen Blasenreaktorsystem mitChlamydomonas reinhardtii die Tendenz einer höheren Biomasseausbeute im Vergleich zuChlorella vulgaris festgestellt. Dieses Ergebnis unterscheidet sich von der Erkenntnis aus demAbschnitt 6.2.3, wonach Chlamydomonas reinhardtii das dargebotene CO2 schlechter als Chlorellavulgaris in Biomasse umsetzt. Dabei ist jedoch zu berücksichtigen, dass die Versuche im Abschnitt6.2.3 in einem anderen Reaktorsystem durchgeführt wurden. Die berechneten Ausbeuten vonknapp über 100 % sind unter Berücksichtigung der methodisch und verfahrensbedingtenSchwankungen zu sehen.

Es wurden für beide untersuchte Biogase maximale Zellzahlen von 2,0*107 Zellen/ml im Reaktorerzielt.


Seite 31 von 62

6.4 Möglichkeiten zur Verwertung der Biomasse

6.4.1 Analytik der untersuchten Mikroalgen hinsichtlich verwertbarer Inhaltsstoffe

6.4.1.1 Einleitung

Im Rahmen des Projektes wurde ein Programm erarbeitet und erprobt, das eine grundlegendeAnalytik wichtiger Zellinhaltsstoffe ermöglicht. Wichtige Untersuchungsparameter waren dabei z. B.der Chlorophyll- und der Proteingehalt sowie die Zusammensetzung des Fettsäurespektrums. DieÄnderung der Zusammensetzung in Abhängigkeit von der Kultivierung der Mikroalgen sollteaufgezeigt werden. Darüber hinaus wurden auch Methoden zur Analytik von speziellenZellinhaltsstoffen entwickelt, die für einzelne Algenspezies spezifisch sind. Dabei stand im Rahmender Untersuchung der Mikroalge Haematococcus pluvialis die Astaxanthinanalytik imZusammenhang mit den Kultivierungsbedingungen (Anzucht, Wachstum, Milieuänderung, Ernte)im Vordergrund. Sie umfasste die Entwicklung zum einen einer validen HPLC-Methode zurBestimmung des Astaxanthingehaltes und zum anderen einer prozessanalytischenphotometrischen Methode zur Überwachung der Akkumulation dieses Carotinoides während desReifeprozesses.

6.4.1.2 Photometrische Bestimmung des Pigmentgehaltes in der Flüssigkultur

Die photometrische Bestimmung des Pigmentgehaltes ist eine Summenmethode. In einemMethodenvergleich wurde zunächst geprüft, welches Extraktionsverfahren zur Bestimmung desPigmentgehaltes zweckmäßig für die Algenmatrix ist. Dabei wurde festgestellt, dass derAufschluss mit siedendem Methanol die beste Methode zur Bestimmung des Pigmentgehaltes inAlgenlösungen ist. Die Vorgehensweise wird nachfolgend zusammengefasst.

Zur quantitativen Ermittlung des Pigmentgehaltes wird die Mikroalgenlösung in ein Reagenzglasüberführt und 10 min lang zentrifugiert. Der Rückstand (Pellet) wird in Methanol aufgenommen undin siedendem Methanol extrahiert. Die Extinktion der zentrifugierten methanolischenPigmentfraktion wird bei 452 nm, 652 nm, 665 nm und 750 nm gegen Methanol gemessen [11].Mithilfe der nachfolgenden Gleichungen werden der Chlorophyll- und der Carotinoidgehaltberechnet.

Chl a [µg/ml methanolischer Extrakt] = 16,29 (E665-E750) - 8,54 (E652-E750)

Chl b [µg/ml methanolischer Extrakt] = 30,66 (E652-E750) - 13,68 (E665-E750)

Chl a+b [µg/ml methanolischer Extrakt] = 22,12 (E652-E750) - 2,61 (E665-E750)

Carotinoide [µg/ml methanolischer Extrakt] = 4,2 E452-0,0264 [Chl a] - 0,496 [Chl b]

Der Pigmentgehalt der Algensuspensionen ist von der Spezies selbst, der Zellgröße und von derZellzahl pro Milliliter abhängig. Aus diesem Grund werden bei den im Folgenden genanntenPigmentgehalten stets die Zellzahlen angegeben um die Pigmentgehalte vergleichen zu können.Die Pigmentgehalte wurden stets mehrfach bestimmt (Tabelle 13).


Seite 32 von 62

Chlorella vulgaris 1,87*107 Zellen/ml MW STABW VK [%] Anteil [%]

Chl a [µg/ml] 4,94 6,13 4,94 5,37 5,57 5,76 5,45 0,47 8,6 55

Chl b [µg/ml] 2,30 2,63 2,31 2,87 2,66 2,60 2,56 0,22 8,6 26

Chl a+b [µg/ml] 7,24 8,76 7,25 8,24 8,23 8,36 8,01 0,63 7,9 -

Car [µg/ml] 1,78 1,90 1,82 1,85 1,80 1,83 1,83 0,04 2,2 19

Pigment 9,84

Isochrysis spec. 9,5*106 Zellen/ml MW STABW VK [%] Anteil [%]

Chl a [µg/ml] 3,00 3,16 3,13 3,23 3,61 3,63 3,29 0,26 7,9 55

Chl b [µg/ml] 0,16 0,12 0,14 0,16 0,11 0,15 0,14 0,02 14,3 2

Chl a+b [µg/ml] 3,16 3,28 3,27 3,38 3,73 3,78 3,43 0,26 7,6 -

Car [µg/ml] 2,49 2,45 2,45 2,65 2,75 2,82 2,60 0,16 6,2 43

Pigment 6,03

Chlamydomonas reinhardtii 4,25*106 Zellen/ml MW STABW VK [%] Anteil [%]

Chl a [µg/ml] 5,74 5,40 5,61 5,59 6,07 4,83 5,54 0,41 7,4 58

Chl b [µg/ml] 2,51 2,75 2,62 2,68 2,74 2,29 2,60 0,17 6,5 27

Chl a+b [µg/ml] 8,25 8,15 8,23 8,27 8,82 7,12 8,14 0,55 6,8 -

Car [µg/ml] 1,23 1,18 1,3 1,41 1,65 1,33 1,35 0,17 12,6 14

Pigment 9,49

Anabaena variabilis MW STABW VK [%] Anteil [%]

Chl a [µg/ml] 10,00 8,44 7,41 8,62 1,30 15,1 71

Chl b [µg/ml] 10,48 0,52 0,54 0,51 0,03 5,9 4

Chl a+b [µg/ml] 10,48 8,96 6,87 8,77 1,81 20,6 -

Car [µg/ml] 2,97 2,15 3,97 3,03 0,91 30,0 25

Pigment 12,16

Tabelle 13: Pigmentgehalte der Mikroalgen Chlorella vulgaris, Isochrysis spec., Chlamydomonas reinhardtii undAnabaena variabilis

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Chlorophyll a Chlorophyll b Carotinoide

rela

tive

r A

nte

il [%

]

Chlorella vulgaris Chlamydomonas reinhardtii

Isochrysis spec. Anabaena variabilis

Abbildung 19: Relative Pigmentverteilung in den untersuchten Mikroalgen


Seite 33 von 62

Die Chlorophyllgehalte (Chlorophyll a und b) der Chlorella vulgaris- und Chlamydomonasreinhardtii-Suspensionen unterschieden sich kaum, es wurden jeweils etwa 8 µg/ml ermittelt, dasmacht über 80 % des Gesamtpigmentgehaltes aus. Wie in der Abbildung 19 deutlich zu erkennenist, ähnelt sich die Zusammensetzung aus Chlorophyll a und b bei den beiden Algenarten sehr.Unter Berücksichtigung der niedrigeren Zellzahlen bei ähnlichem Zellaufbau hat Chlamydomonasreinhardtii den höheren absoluten Pigmentgehalt.Isochrysis spec. hatte den niedrigsten Chlorophyllgehalt der untersuchten Mikroalgen.Die Pigmentgehalte von Anabaena variabilis lassen sich nur mithilfe der relativen Anteile mitanderen vergleichen, da aufgrund der langen Ketten keine Zellzahl pro Milliliter angegeben werdenkann, sondern das Wachstum durch photometrische Bestimmungen überwacht wird. Diecharakteristische Verteilung von Chlorophyll a und b in Cyanobakterien ist eindeutig gezeigt(Abbildung 19). So ist Chlorophyll a in Blaualgen wie Anabaena variabilis das Hauptpigment,während Grünalgen zusätzlich größere Anteile anderer Chlorophyllarten aufweisen [12].Der relative Anteil an Carotinoiden (Abbildung 19) war in Isochrysis spec. am höchsten, währendChlamydomonas reinhardtii den niedrigsten Carotinoidgehalt der untersuchten Algenarten aufwies.Da es sich bei dieser photometrischen Methode um eine Summenmethode handelt, kann zwischenden einzelnen Carotinoiden wie Lutein, Astaxanthin und ß-Carotin nicht differenziert werden. Somitwar die Entwicklung einer Methode (HPLC-Methode) erforderlich, die den Nachweis der einzelnenAnteile ermöglicht.

6.4.1.3 Analytik der Carotinoide

6.4.1.3.1 Entwicklung einer Methode zur quantitativen Bestimmung von Astaxanthin

Die quantitative Bestimmung des Carotinoides Astaxanthin erfolgte wie nachfolgend beschrieben.Dabei waren auch hier zunächst Untersuchungen zur Ermittlung der geeignetenProbenvorbereitung vorausgegangen.

Extraktion

Es wird getrocknete, homogene Algenbiomasse in ein Zentrifugengefäß eingewogen.Anschließend werden DMSO und Glasperlen zugegeben.Das Zentrifugengefäß wird in ein vorgeheiztes Wasserbad gestellt, während der Inkubation wirdmehrfach gevortext.Es wird zentrifugiert, um das Zellmaterial abzutrennen. Das Zentrifugat wird abgenommen und ineinem Maßkolben gesammelt.Der Rückstand (Pellet) wird in Aceton resuspendiert, gevortext und anschließend erneutzentrifugiert. Der Überstand wird abgenommen.Die Extraktion mit Aceton wird so oft wiederholt, bis die Extinktion des Überstandes bei 474 nmgegen Aceton gemessen kleiner 0,1 ist.Die gesammelten Zentrifugate werden vereinigt und mit Aceton aufgefüllt. Die carotinoidhaltigeLösung wird erneut zentrifugiert, um mögliche Partikel vollständig abzutrennen.Die Extinktion der partikelreinen Lösung wird gegen Aceton bei 474 nm gemessen. Wenn diesezwischen 0,75 und 1,25 liegt, ist der Ansatz für die nachfolgende Hydrolyse verwendbar, sonstsind weitere Verdünnungen notwendig. Typisch ist eine 1 : 5 Verdünnung mit Aceton.


Seite 34 von 62

Hydrolyse (Aufspaltung der Carotinoidesterbindungen)

Für die anschließende HPLC-Analyse des Probenextraktes ist eine Hydrolyse erforderlich. Ineinem verschließbaren Reagenzglas wird der Extrakt mit Tris-HCl-Puffer (pH = 7) versetzt und imverschlossenen Reagenzglas in einem Wasserbad inkubiert.Es wird Cholesterolesterase-Stammlösung (Pseudomonas flourescens) [Fa. SIGMA]zugegeben. Das Reagenzglas wird in ein temperiertes Wasserbad gestellt und mehrmalsvorsichtig geschwenkt.Anschließend werden Na2SO4 und Petrolether zugegeben und gevortext, so dass die freienCarotinoide in die Petroletherphase übergehen.Dieser Ansatz wird zentrifugiert und die Petroletherphase in ein zum Abdampfen geeignetes Gefäßabgetrennt. Die wässrige Phase wird mit Petrolether erschöpfend extrahiert. AllePetroletherphasen werden vereinigt und das Lösungsmittel wird mit Stickstoff abgeblasen.Der Rückstand wird in mobiler Phase aufgenommen und unverdünnt mittels HPLC analysiert [13].

HPLC-Analytik

Die Prüfung der Algenbiomasse auf den Gehalt an Astaxanthin erfolgte mittels HPLC-Analyse. DieHPLC-Apparatur besteht aus einer Knauer WellChrom Ministar Pumpe K-1001 mit einemAutosampler K-3800 und einem KNAUER WellChrom DAD K-2800.Die Extrakte werden über eine Trennsäule bei 25 °C getrennt. Die Detektion erfolgt bei einerWellenlänge von 474 nm. Der Astaxanthinpeak im Chromatogramm wird durch einen Vergleich derRetentionszeit mit dem Astaxanthinstandard (Fa. SIGMA) identifiziert.

Kalibration

Zur Herstellung einer Astaxanthin-Stammlösung werden ca. 3,0 mg Astaxanthin (Fa. SIGMA) ineinen 10-ml-Maßkolben genau eingewogen, in Chloroform gelöst und mit Chloroform bis zur Markeaufgefüllt. 1 ml der so erhaltenen Stammlösung wird in einen 10-ml-Maßkolben pipettiert und mit n-Hexan zur Marke aufgefüllt (verdünnte Stammlösung). Die Standardlösungen werden mit n-Hexanaus der verdünnten Stammlösung wie nachfolgend beschrieben (Tabelle 14) arbeitstäglich frischhergestellt.

Volumen der verdünnten Stammlösung Astaxanthin[ml]

Gesamtvolumen[ml]

Standard 1 0,2 10Standard 2 0,4 10Standard 3 0,6 10Standard 4 0,8 10Standard 5 1,0 10Standard 6 1,2 10Standard 7 1,4 10Standard 8 1,6 10

Tabelle 14: Herstellung der Astaxanthin-Standardlösungen


Seite 35 von 62

Die Extinktion jeder einzelnen Standardlösung wird bei einer Wellenlänge von 474 nm gegen n-Hexan gemessen. Aus diesen Messwerten werden die Konzentrationen an Astaxanthin in denStandardlösungen nach Gleichung 1 berechnet. Aufgrund der unbekannten Stabilität desAstaxanthin-Gehaltes in der Referenzsubstanz war die arbeitstägliche Berechnung derAstaxanthin-Konzentration aus den ermittelten Extinktionen erforderlich.

2100

10000474Ec nAstaxanthi

cAstaxanthin Astaxanthin-Konzentration in µg/mlE474 gemessene Extinktion der Astaxanthin-Standardlösung2100 Extinktionskoeffizient einer 1%igen Astaxanthin-Lösung in Hexan, gemessen

in einer Schichtdicke von 1 cm bei 474 nm10000 Verdünnungsfaktor

Gleichung 1: Emittlung der Astaxanthin-Konzentration [13]

Die Standardlösungen wurden mittels HPLC analysiert. Aus den Peakflächen von Astaxanthin imChromatogramm und den über die Extinktion E474 ermittelten Konzentrationen wurde eineKalibierkurve erstellt.Der Gehalt an Astaxanthin in den Probenlösungen wurde aus der ermittelten Peakfläche vonAstaxanthin im Chromatogramm mithilfe der ermittelten Kalibrationsgleichung errechnet. UnterBerücksichtigung der Einwaage und der Verdünnungen der Probenlösungen wurde der Gehalt anAstaxanthin in der Algenbiomasse berechnet.

Prüfung der Validität

Die beschriebene HPLC-Methode zur Bestimmung des Astaxanthingehaltes in Algenbiomassewurde auf ihre Validität geprüft. Kriterien für die Prüfung der Validität der Methode waren diePrüfung der Spezifität, der Linearität, der Präzision und der Richtigkeit.

Prüfung auf Eignung des SystemsDas System ist zur Bestimmung von Astaxanthin in Algenbiomasse geeignet, wenn

1. Astaxanthin im HPLC-Chromatogramm der Probenlösung zur gleichen Retentionszeit eluiertwie der Astaxanthin-Standard,

2. neben einer ausreichenden Präzision der Messungen auch eine lineare Abhängigkeit zwischender Astaxanthin-Konzentration (Standard) und der HPLC-Peakfläche besteht.

Abbildung 20: HPLC-Chromatogramm der Astaxanthin-Standardlösung

Abbildung 21: HPLC-Chromatogramm der Probenlösung


Seite 36 von 62

Abbildung 22: HPLC-Chromatogramm der mit Astaxanthin dotierten Probenlösung

Wie in den drei Chromatogrammen (Abbildungen 20 bis 22) deutlich erkennbar ist, eluiertAstaxanthin stets zur selben Retentionszeit, somit sind Störungen, die durch Matrixbestandteileverursacht werden könnten, ausgeschlossen.

Linearität/Präzision

Die Prüfung auf Linearität erfolgte mit den bereits beschriebenen Kalibrationsstandards. Diesewurden mittels HPLC analysiert. Die bei 474 nm gemessenen Extinktionen, die darausberechneten Konzentrationen an Astaxanthin in den Standardlösungen und die gemessenenHPLC-Peakflächen sind in der Tabelle 15 beispielhaft dargestellt.

Standard E474 Astaxanthin [µg/ml] berechnet Peakfläche

1 0,0612 0,291 1165592 0,2008 0,956 3612353 0,2927 1,394 5441374 0,4615 2,198 8416325 0,6368 3,032 11101296 0,7144 3,402 13061037 0,8299 3,952 15424858 0,9771 4,653 1803413

Tabelle 15: Kalibrationsstandards zur Prüfung der Linearität der Methode

Die Abbildung 23 zeigt die lineare Abhängigkeit der Analysensignale (HPLC-Peakfläche) von derKonzentration an Astaxanthin bei einer Wellenlänge von 474 nm.

y = 386716x - 4865,1

R2 = 0,99920

500000

1000000

1500000

2000000

0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0

µg/ml Astaxantin

Flä

che

Abbildung 23: Kalibrationsfunktion des Astaxanthin-Standards


Seite 37 von 62

Statistische Daten:(ermittelt mittels Rechenprogramm LABQUANT)

Reststandardabweichung (Sy): 17756

Verfahrensstandardabweichung (Sxo): 0,046

Verfahrensvariationskoeffizient (Vxo): 1,84 %

Linearitätstest (nach MANDEL): Linearität bestätigt

Nachweisgrenze: 0,17 µg/ml Astaxanthin

Bestimmungsgrenze: 0,58 µg/ml Astaxanthin

Die Linearität der Abhängigkeit der Signalintensität (Peakfläche) von der Astaxanthin-Konzentration konnte über den gesamten Bereich von 0,3 bis 4,7 µg/ml nachgewiesen werden.

Die Standardlösungen mit einer Astaxanthin-Konzentration von 3,03 µg/ml wurden zur Ermittlungder Präzision sechsfach analysiert. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 16 dargestellt.

Standard-lösung

VolumenStammlösung [ml]

Gesamt-volumen [ml]

KonzentrationAstaxanthin

[µg/ml]

HPLC-Peakfläche

5a 1,0 10 3,03 1132648

5b 1,0 10 3,03 1114125

5c 1,0 10 3,03 1102939

5d 1,0 10 3,03 1103002

5e 1,0 10 3,03 1102449

5f 1,0 10 3,03 1105611

Mittelwert 1110129

Standardabweichung 11874

Vertrauensbereich ( = 0,05) 12463

Variationskoeffizient [%] 1,07

Tabelle 16: Kalibrationsstandards zur Ermittlung der Präzision der Methode

Die gemessenen Peakflächen waren normalverteilt (Test nach DAVID) und ausreißerfrei (Test nachGRUBBS). Nach KROMIDAS [14] sollte der Variationskoeffizient einer Analysenmethode, die zurGehaltsbestimmung im Spezifikationsbereich von 90 bis 110 % eingesetzt wird, maximal 6,25 %betragen. Die Präzision der Methode zur Bestimmung der Fläche des Astaxanthin-Peaks mittelsHPLC war mit einem Variationskoeffizienten von 1,07 % ausreichend hoch.Unter diesen Gesichtspunkten ist die HPLC-Methode zur Bestimmung von Astaxanthin inAlgenbiomasse geeignet.

Matrixbezogene Prüfung der Methode

Zusätzlich zu der beschriebenen Prüfung der Validität der HPLC-Analytik wurde die Methode zurBestimmung des Gehaltes an Astaxanthin einschließlich des Extraktionsverfahrens auf Linearität,Präzision und Richtigkeit überprüft.Die Bestimmung von Astaxanthin in Algenbiomasse sollte im Konzentrationsbereich von 70 bis130 % der im Probenextrakt vorliegenden Astaxanthinkonzentration geprüft werden.Dazu wurde die Linearität der Methode in zwei Schritten geprüft. Einerseits wurde die Einwaageder Algenbiomasse im Bereich von 70 bis 130 % der Soll-Einwaage von 25 mg variiert,andererseits wurde der Probenextrakt vor der Hydrolyse unterschiedlich verdünnt.


Seite 38 von 62

Die Präzision der Methode wurde aus den bei unterschiedlichen Einwaagen ermitteltenAstaxanthin-Gehalten berechnet. Es wurden folgende Ergebnisse erzielt:

Die berechneten Gehalte an Astaxanthin für die einzelnen Analysenlösungen waren jeweilsnormalverteilt (Test nach DAVID), ausreißerfrei (Test nach GRUBBS) und wiesen keinen Trendauf (Test nach NEUMANN).Die Linearität der Methode konnte einerseits über den gesamten Arbeitsbereich von70 bis 130 % der Solleinwaage an getrockneter Algenbiomasse (17,5 bis 32,5 mg) undandererseits über den gesamten Bereich der unterschiedlichen Verdünnungen des Extraktesvor der Hydrolyse nachgewiesen werden.Nach KROMIDAS [14] sollte der Variationskoeffizient einer Analysenmethode, die zurGehaltsbestimmung im Spezifikationsbereich von 90 bis 110 % eingesetzt wird, maximal6,25 % betragen. Die Präzision der Methode zur Bestimmung des Gehaltes an Astaxanthinaus Algenbiomasse war demzufolge ausreichend hoch.

Des Weiteren wurden zur Prüfung der Richtigkeit der Methode Wiederfindungsversuchedurchgeführt, wobei eine durchschnittliche Wiederfindungsrate an Astaxanthin von 104,6 % desErwartungswertes ermittelt wurde.

In Zusammenfassung aller Ergebnisse lässt sich feststellen:Der Zusammenhang zwischen dem Analysensignal (HPLC-Peakfläche) und der Konzentrationan Astaxanthin war im gesamten Arbeitsbereich linear.Die durch Mehrfachbestimmung erhaltenen HPLC-Peakflächenwerte bzw. die Astaxanthin-Gehalte der getrockneten Algenbiomasse waren ausreichend präzise.Die Winderfindungsrate lag im Bereich von 95 bis 105 % des Erwartungswertes.Die hier beschriebene Analysenmethode ist für die Bestimmung des Astaxanthin-Gehaltes ingetrockneter Algenbiomasse geeignet.

6.4.1.3.2 Entwicklung einer Methode zur quantitativen Bestimmung von Lutein und -Carotin

Neben Astaxanthin sind Lutein (Xanthophyll) und ß-Carotin als weitere Carotinoide vonbesonderem Interesse. Sie wurden aufgrund ihrer biologischen Bedeutung ausgewählt. Ziel wares, diese Verbindungen möglichst mit dem bereits beschriebenen HPLC-Trennverfahren qualitativund quantitativ zu bestimmen. Dabei wurden die Systemeignung, die Linearität und die Richtigkeit(Elemente der Validitätsprüfung) geprüft.Die Abbildung 24 zeigt beispielhaft ein HPLC-Chromatogramm eines Standard-Mix ausStammlösungen von Lutein, Astaxanthin und ß-Carotin. Zuerst eluiert ß-Carotin (RT = 2,1 min),dann Astaxanthin (RT = 10,7 min) und schließlich Lutein (RT = 16,5 min). In diesemChromatogramm sind als x-Achse die Retentionszeit in Minuten, als y-Achse die Wellenlänge imBereich zwischen 400 und 500 nm und als z-Achse die Signalintensität in mAU aufgetragen.


Seite 39 von 62

Abbildung 24: HPLC-Chromatogramm des Standard-Mix

Die Prüfung der Validität der Methode soll hier nicht detailliert dargestellt werden. Die Ergebnissedieser Prüfung lauten zusammengefasst wie folgt:

Die Standard-Substanzen wurden selektiv getrennt.Der Zusammenhang zwischen dem Analysensignal (HPLC-Peakfläche) und der Konzentrationan Lutein und ß-Carotin war im gesamten Arbeitsbereich von 1,1 bis 8,0 µg/ml linear.Die Winderfindungsrate lag im Bereich von 95 bis 105 % des Erwartungswertes. DieWiederfindungsrate an Lutein betrug 97,2 % und die an ß-Carotin 97,3 %.

6.4.1.3.3 Entwicklung einer In-Prozess-Kontrolle (IPC) für die Akkumulation von Astaxanthin

Das Ziel dieser Teilaufgabe war die Einführung einer photometrischen Schnellmethode zurAnalyse von Astaxanthin. Der Gehalt an Astaxanthin sollte in Abhängigkeit von der Zeit mit einerschnell durchführbaren Methode analysiert werden können, um so den „richtigen Erntezeitpunkt“zu erkennen.Für die In-Prozess-Kontrolle der Akkumulation von Astaxanthin in Haematococcus pluvialis-Zellenwird die im Abschnitt 6.4.1.3.1 beschriebene Methode der Extraktion mit DMSO und Aceton ohneHydrolyse verwendet. Nach Einleitung der Stressphase wird täglich eine repräsentative Probe von10 ml Algenlösung entnommen und wie beschrieben aufgearbeitet. Charakteristisch fürCarotinoide (Astaxanthin, Lutein usw.) ist ein Absorptionsmaximum bei einer Wellenlänge von474 nm. Die Extinktion bei 670 nm spiegelt den Chlorophyllanteil wider. Die Extinktionen werdengegen einen Blindwert DMSO/Aceton (1:5) gemessen. Zur Überprüfung dieserprozessanalytischen Bestimmungsmethode wurde der Astaxantingehalt mittels HPLC bestimmt.Zu berücksichtigen ist, dass der prozessanalytisch bestimmte Astaxanthigehalt nur der Kontrolledient, da bei einer Wellenlänge von 474 nm auch andere Carotinoide absorbieren.Das Verhältnis der gemessenen Extinktionen bei 474 nm und 670 nm diente in der IPC-Methodeals Maß für den Astaxanthin-Gehalt. Dieses Verhältnis wurde in der Abbildung 25 mit den mittelsHPLC ermittelten Ergebnissen verglichen.


Seite 40 von 62

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

1 2 3 4 5 6 7 8

Stressdauer (Tage)

Ver

hältn

is E

474/E

670

0

0,5

1

1,5

2

2,5

Ast

axan

thin

geha

lt [%

]

E(474 nm)/E(670 nm) HPLC

Abbildung 25: Verlauf der Verhältnisse von E474 (Carotinoide) und E670 (Chlorophyll) in Abhängigkeit von derStressdauer. Vergleich mit den mittels HPLC ermittelten Astaxanthin-Gehalten

Unabhängig von der Analysenmethode ist in der Abbildung 25 der gleiche Verlauf erkennbar. DieMesswerte steigen bis zum 6. Tag der Reifung kontinuierlich an und sinken erst ab dem 7. Tagwieder ab. Somit konnte eine optimale Reifungszeit für die Astaxanthinproduktion von 5 bis 6Tagen abgeleitet werden. Sobald diese Zeit überschritten ist, überwiegt das Zellsterben gegenüberder Astaxanthinbildung.Die in der Abbildung 26 gezeigten Extrakte verdeutlichen noch einmal visuell den Farbumschlagvon grünen vegetativen zu roten gestressten Haematococcus pluvialis-Zellen während desReifungsprozesses.

Abbildung 26: Farbverlauf der Algenextrakte in Abhängigkeit von der Reifungszeit (linker Extrakt = Tag 0, rechter Extrakt= Tag 7)

6.4.1.3.4 Carotinoid-Gehalte in Haematococcus pluvialis

AstaxanthinEs wurden je zwei Ansätze von drei verschiedenen Algenbiomassen wie im Abschnitt 6.4.1.3.1beschrieben aufgearbeitet und mittels HPLC analysiert:

getrocknete, pulverisierte Algenbiomasse der Fa. TAGIS TROPICAL MARIN,getrocknete, pulverisierte Algenbiomasse der Fa. SUBITEC undgetrocknete, pulverisierte Algenbiomasse der MAL GMBH.


Seite 41 von 62

HerkunftErmittelter

Astaxanthin-Gehalt [% TS]Herstellerangabe des

Astaxanthin-Gehaltes [% TS]

TAGIS TROPICAL MARIN 1,4-1,5 1,5-2,0SUBITEC 4,2-4,3 3,08MAL GMBH 2,2-2,6 -

Tabelle 17: Astaxanthin-Gehalte der Mikroalge Haematococcus pluvialis

Im Vergleich zur Literatur [15], in der Astaxanthin-Gehalte von ca. 2 % beschrieben sind, weisendie bei der MAL GMBH gezüchteten Algen den entsprechenden Gehalt auf. Die Algenbiomasse derFa. TAGIS TROPICAL MARIN hat den geringsten Anteil an Astaxanthin von den drei untersuchtenProben und liegt knapp unterhalb des vom Hersteller angegebenen Astaxanthin-Gehaltes.Die höchsten Werte hinsichtlich des prozentualen Anteils an Astaxanthin in der Algenbiomassewurden mit einer von der Fa. SUBITEC bezogenen Algenbiomasse erzielt. Der ermittelteAstaxanthin-Gehalt lag mit ca. 4,2 % deutlich über dem vom Hersteller ausgewiesenen Wert. Daeine valide Methode zur Bestimmung des Astaxanthin-Gehaltes in Algenbiomasse eingesetztwurde, ist davon auszugehen, dass die ermittelten Gehalte an Astaxanthin richtig sind.Die stark abweichenden Astaxanthin-Gehalte der verschiedenen untersuchten Algenbiomassender Mikroalge Haematococcus pluvialis sind wahrscheinlich auf unterschiedlicheKultivierungsbedingungen zurückzuführen.

Lutein und -Carotin

Beispielhaft wurden vier aufkonzentrierte Ansätze einer Algenbiomasse der Fa. TAGIS TROPICALMARIN wie im Abschnitt 6.4.1.3.2 beschrieben aufgearbeitet und mittels HPLC analysiert.In der Tabelle 18 sind die ermittelten Pigmentgehalte dargestellt.

AlgenLutein[% TS]

ß-Carotin[% TS]

Probe 1 0,053 0,050Probe 2 0,047 0,044Probe 3 0,055 0,048Probe 4 0,051 0,045

Mittelwert 0,052 Mittelwert 0,047Standardabweichung 0,003 Standardabweichung 0,003Variationskoeffizient [%] 5,77 Variationskoeffizient [%] 6,38Vertrauensbereich( = 0,05)

0,005Vertrauensbereich( = 0,05)

0,005

Tabelle 18: Carotinoid-Gehalte in Haematococcus pluvialis

Der Lutein- bzw. ß-Carotin-Gehalt von Haemaotcoccus pluvialis liegt bei jeweils ca. 0,05 % TS. ImVergleich zu den ermittelten Astaxanthinwerten der Algenbiomasse der Fa. TAGIS TROPICAL MARINvon etwa 1,4 bis 1,5 % spielen Lutein und ß-Carotin nur eine untergeordnete Rolle bei denCarotinoiden in der Mikroalge Haematococcus pluvialis.Entsprechend der Literatur [5] liegt der Astaxanthin-Gehalt in Haemaotcoccus pluvialis bei 99 %des Gesamtcarotinoid-Gehaltes. Alle anderen Carotinoide sind nur in Kleinstmengen(< 1 %) enthalten. Die ermittelten Lutein- bzw. ß-Carotin-Gehalte der Algenbiomasse der Fa. TAGISTROPICAL MARIN entsprechen ca. 3 % des gesamten Carotinoidgehaltes und bestätigen die in derLiteratur genannte Größenordnung.


Seite 42 von 62

6.4.1.4 Analyse des Proteingehaltes

6.4.1.4.1 Methoden

Bestimmung des Gesamtstickstoff-Gehaltes

Die Ermittlung des Gesamtstickstoff-Gehaltes erfolgte in Anlehnung an [16] und dient derBestimmung des Gesamtgehaltes an Stickstoff. Die Stickstoffverbindungen der Probe werdendurch säurehydrolytischen Aufschluss vollständig in Ammonium-Ionen überführt, die photometrischbestimmt werden. Die detaillierte Durchführung wurde in [17] beschrieben. Da der Stickstoffgehaltvon Proteinen ungefähr 16 % beträgt, kann durch Multiplikation des Stickstoffgehaltes mit demFaktor 6,25 die Proteinmenge rückgerechnet werden [18].

Proteinbestimmung nach LOWRY

Die Durchführung der Methode zur Bestimmung des Proteingehaltes nach LOWRY wurde in [17]ausführlich beschrieben.

6.4.1.4.2 Ergebnisse der Ermittlung des Proteingehaltes über den Gesamtstickstoff-Gehalt

Es wurden jeweils mindestens zwei verschiedene Proben einer Algenart in Doppelbestimmunguntersucht. Die Proteingehalte der untersuchten Mikroalgen sind in der Tabelle 19 angegeben.

Mikroalge Proteingehalt [%] Literaturwerte [%]Chlorella vulgaris 38,0 45 bis 55 [19]Haematococcus pluvialis 20,3 keine AngabeAnabaena variabilis 47,1 55 bis 65 [19]Chlamydomonas reinhardtii 30,2 keine AngabeIsochrysis spec. 30,4 27 [20]

Tabelle 19: Proteingehalte der untersuchten Mikroalgen

Die Proteingehalte von Anabaena variabilis (ca. 47 %) und Chlorella vulgaris (ca. 38 %) lagenunter den in der Literatur beschriebenen Werten. Diese Unterschiede könnten auf verschiedeneKultivierungsbedingungen zurückzuführen sein.Der Literaturwert des Proteingehaltes in Isochrysis spec. (27 %) wurde bestätigt. Ein ähnlicherProteinanteil war auch in Chlamydomonas reinhardtii (ca. 30 %) enthalten. Den geringstenProteingehalt wies Haematococcus pluvialis mit lediglich 20 % auf.

6.4.1.4.3 Ergebnisse der Bestimmung des Proteingehaltes nach LOWRY

Aufgrund der Eigenfärbung der Untersuchungslösung wurden mit dieser Methode keineauswertbaren Ergebnisse erzielt. Die Extinktionsdifferenz zwischen den grünen Ansätzen derAlgenbiomassen und den Standardlösungen aus Rinderserumalbumin bei einer Wellenlänge von750 nm war zu gering. Eine Möglichkeit diese Methode trotzdem für die Untersuchung vonProteingehalten in Algenbiomasse zugänglich zu machen, wäre das Standardadditionsverfahren.Dieses Verfahren ist eine besondere Form der Kalibration und soll garantieren, dassMatrixeinflüsse weitestgehend ausgeschaltet werden können. Die zu untersuchende Probe wirdmit definierten Konzentrationen an Protein aufgestockt und aus dem Messwert für dieursprüngliche Probe und den Werten für die aufgestockten Proben kann dann die unbekannteProteinkonzentration ermittelt werden. Diese Variante wurde jedoch nicht weiter verfolgt, da mit derBestimmung des Proteingehaltes nach KJELDAHL (Gesamtstickstoff-Gehalt) eine geeigneteMethode vorhanden war.


Seite 43 von 62

6.4.1.5 Identifizierung und Quantifizierung von Fettsäuren

6.4.1.5.1 Methode

Die Fettsäuren werden aus der Algenbiomasse durch einen Säureaufschluss freigesetzt unddanach werden die durch Umesterung mit Trimethylsulfoniumhydroxid (TMSH) hergestelltenFettsäuremethylester gaschromatographisch getrennt. Im Rahmen von Voruntersuchungenwurden die Möglichkeiten zur Probenvorbereitung überprüft. Dabei wurden u. a. zweiExtraktionsverfahren nach dem Säureaufschluss verglichen, die Stabilität der Fettsäuremethylesteruntersucht und die mögliche Minimaleinwaage für die Analyse ermittelt.Die Analysen wurden mit einem Gaschromatographen HP 5890 Series II durchgeführt. ZurTrennung der Fettsäuremethylester wurde eine spezifische Kapillar-Säule verwendet. DasTrägergas war Stickstoff und das Injektionsvolumen betrug 1 µl. Die Injektortemperatur betrug250 °C. Der Detektor, ein Flammenionisationsdetektor (FID), hatte eine Temperatur von 290 °C.Durch den Vergleich der Retentionszeiten der Fettsäuremethylester im Chromatogramm der Probemit denen der Standardsubstanzen werden die Fettsäuremethylester identifiziert. DieFettsäurezusammensetzung wird mithilfe der 100-%-Flächenmethode berechnet. Dazu werdenalle relevanten Peakflächen summiert und danach einzelne Peakflächen durch diePeakflächensumme dividiert und mit 100 % multipziert.

6.4.1.5.2 Fettsäurespektren in Abhängigkeit von der Kultivierungsdauer

Untersuchungen zur Abhängigkeit des Fettsäurespektrums von der Kultivierungsdauer wurden anden Spezies Isochrysis spec., Chlamydomonas reinhardtii und Anabaena variabilis durchgeführt.In der Abbildung 27 sind drei Fettsäurespektren von Isochrysis spec. dargestellt. Die Mikroalgenwurden zu verschiedenen Zeitpunkten (nach 21, 29 und 41 Tagen) geerntet.


Seite 44 von 62

0

5

10

15

20

25

30

35

C 8:0

C 10:0

C 12:0

C 14:0

C 16:0

C 18:0

C 18:1

C 18:2

C 18:3

C 20:0

C 20:4

C 20:5

C 22:0

C 22:6

Fettsäuren

% F

läch

enan

teil

21 d

29 d

41 d

Abbildung 27: Fettsäurespektrum von Isochrysis spec. in Abhängigkeit vom Erntezeitpunkt

Wie in der Abbildung 27 zu erkennen ist, nahm der Anteil an mehrfach ungesättigten Fettsäurenmit zunehmender Kultivierungsdauer zu. So stieg der Anteil an DHA (C22:6) innerhalb von 20Tagen auf das Doppelte (17 %) an. Die Gehalte an Myristin- (C14:0), Palmitin- (C16:0), Stearin-(C18:0) und Ölsäure (C18:1) sanken mit zunehmender Wachstumsdauer.Im Falle von Chlamydomonas reinhardtii und Anabaena variabilis wurden Kulturen nach 4 Tagenbzw. 10 Tagen bezüglich ihres Fettsäurespektrums untersucht. Am auffälligsten war dabei beibeiden Spezies die Verdopplung der Summe der GC-Flächen nach 10 Tagen im Vergleich zu 4Tagen. Die Verschiebung des Fettsäurespektrums hin zu langkettigen, mehrfach ungesättigtenFettsäuren mit zunehmender Kultivierungsdauer war nicht so deutlich zu erkennen wie beiIsochrysis spec. Lediglich der Gehalt an Linolsäure (C18:2) und Linolensäure (C18:3) nahm mitder Kultivierungsdauer zu. In beiden untersuchten Mikroalgen stieg der Anteil von C18:2 von 9 auf14 %. Der Gehalt von C18:3 nahm in Anabaena variabilis um 2 % zu, während er sich inChlamydomonas reinhardtii von 10 auf 20 % innerhalb von sechs Wachstumstagen verdoppelte.Eine Ursache könnte die kürzere Kultivierungsdauer von 4 bzw. 10 Tagen im Vergleich zuIsochrysis spec. (21-41 Tage) sein.In der Mikroalge Chlamydomonas reinhardtii betrug der Anteil an Palmitinsäure unabhängig vonder Wachstumsphase etwa 50 % der untersuchten Fettsäuren. Im Cyanobakterium Anabaenavariabilis lag der Anteil sogar über 65 %. im Vergleich dazu lag der Anteil an Palmitinsäure inIsochrysis spec. in Abhängigkeit von der Kultivierungsdauer zwischen 17 und 22 %.

6.4.1.5.3 Fettsäurezusammensetzung der Mikroalgen

Bakterien können anhand ihrer Fettsäurezusammensetzung („Fingerprint“) identifiziert werden.Auch Algen weisen ein typisches Fettsäurespektrum auf. Somit besteht die Möglichkeit anhand derSpektren Veränderungen, z. B. Verunreinigungen (Bakterien) zu erkennen.Die Mikroalge Isochrysis spec. ist aufgrund ihres hohen Gehaltes an -3-Fettsäuren (> 10 %), wieEicosapentaensäure (EPA) und Docosahexaensäure (DHA), als Nahrungsadditiv im Gespräch.Auch Haematococcus pluvialis zeichnet sich durch eine Reihe von langkettigen ungesättigtenFettsäuren aus, deren prozentuale Anteile aber unter 10 % lagen.Anabaena variabilis, Chlorella vulgaris und Chlamydomonas reinhardtii beinhalteten nur sehrgeringe Anteile an längerkettigen Fettsäuren (> C18).Sehr auffällig war der hohe Anteil an Ölsäure (C18:1) in Chlorella vulgaris, mit 48 % lag er mehrals doppelt so hoch wie in Isochrysis spec.Die Abbildung 28 zeigt die Fettsäurespektren der untersuchten Mikroalgen im Vergleich.


Seite 45 von 62

0

10

20

30

40

50

C 12:0

C 14:0

C 16:0

C 18:0

C 18:1

C 18:2

C 18:3

C 20:0

C 20:4

C 20:5

C 22:0

C 22:6

% F

läch

enan

teil

Anabaena variabilis Chlamydononas reinhardtii

Chlorella vulgaris Haemaotococcus pluvialis

Isochrysis spec.

Abbildung 28: Fettsäurespektren der Mikroalgen

Im menschlichen Körper kann durch Kettenverlängerung (Enzymeinwirkung) aus -Linolensäuredie EPA, welche eine wesentlich höhere biologische Wirksamkeit besitzt, gebildet werden, jedochist diese Umwandlung außerordentlich verlustreich [21].Das optimale Verhältnis von -6-Fettsäuren (Linol- und Arachidonsäure) zu -3-Fettsäuren (EPA,DHA und Linolensäure) im Körper wäre 3:1, tatsächlich liegt es jedoch bei 20:1 [22].Nahrungsergänzungsmittel aus Mikroalgen könnten somit dieses Verhältnis in die richtige Richtungverschieben. Wie in Tabelle 20 deutlich wird, liegt das Verhältnis -6/ -3 in der Algenbiomasse beiden fünf untersuchten Arten zwischen 0,2:1 und 4,3:1. Isochrysis spec. und Chlamydomonasreinhardtii wären dabei im Hinblick auf die Fettsäurezusammensetzung der untersuchtenMikroalgen am besten als Nahrungsadditiv geeignet. Chlorella vulgaris hat den geringsten Anteilan ungesättigten Fettsäuren und weist außerdem ein Verhältnis über 3:1 auf. Somit ist Chlorellavulgaris weniger wegen der Fettsäurezusammensetzung als wegen ihres sehr hohen Protein- undPigmentgehaltes interessant.

Chlorellavulgaris

Haematococcuspluvialis

Isochrysisspec.

Chlamydomonasreinhardtii

Anabaenavariabilis

-6-Fettsäuren 17,7 30,3 6,7 10,0 14,5-3-Fettsäuren 4,1 25,4 29,3 44,8 29,0

-6 und -3 21,8 45,7 36,0 44,8 43,5

-6/ -3 4,3:1 1,2:1 0,2:1 0,2:1 0,5:1

Tabelle 20: Anteile der mehrfach ungesättigten Fettsäuren in Mikroalgen

6.4.1.6 HPLC-Analytik von Vitaminen und deren Zersetzungsprodukten

Mikroalgen enthalten Vitamine in Konzentrationen, die für die menschliche Ernährung bedeutsamsein könnten. Die MAL GmbH verfügt über valide Methoden zur quantitativen Bestimmung vonVitaminen. Auf deren Basis und mithilfe einer Vitaminmischung wurde eine Methode zurBestimmung der Abbau- und Zersetzungsprodukte von Vitaminen erarbeitet und auf Validitätgeprüft.Die in der Literatur beschriebenen Abbau- und Zersetzungsprodukte der relevanten Vitaminewurden in Voruntersuchungen hinsichtlich der kleinsten nachweisbaren Konzentrationen geprüft.


Seite 46 von 62

Es wurden die in der Tabelle 21 aufgeführten Abbau- und Zersetzungsprodukte für die Prüfung derValidität der Methode ausgewählt.

Abbau- undZersetzungsprodukt

VitaminDetektions-wellenlänge

Retentionszeit

4-Methyl-5-thiazolethanol Vitamin B1 250 nm 14,0 minThiochrom Vitamin B1 375 nm 15,2 minFurfural Vitamin C 265 nm 17,5 minFuran-2-carbonsäure Vitamin C 250 nm 16,9 minNicotinsäure Vitamin B3 265 nm 5,3 minLumichrom Vitamin B2 250 nm 27,3 minLumiflavin Vitamin B2 265 nm 26,6 min

Tabelle 21: Ausgewählte Abbau- und Zersetzungsprodukte zur Prüfung der Validität der Methode

Als Referenzsubstanzen der bekannten Abbau- und Zersetzungsprodukte wurden Substanzen derFa. ACROS ORGANICS und der Fa. SIGMA-ALDRICH verwendet.Die Prüfung auf Validität wurde an einer Vitaminmischung, die 8 Vitamine in verschiedenenKonzentrationen enthielt, durchgeführt.

Die Ergebnisse der Prüfung der Validität der Methode fasst die Tabelle 22 zusammen.

VerbindungNachweis-

grenze

Nachweisgrenzebezogen auf

Algenbiomasse

Bestimm-ungsgrenze

LinearitätPrä-

zision

Wieder-findungs-

rate

4-Methyl-5-thiazolethanol

0,34 µg/ml 3,4 ppm 1,20 µg/ml bestätigt 2,88 % 100,1 %

Thiochrom 0,26 µg/ml 2,6 ppm 0,91 µg/ml bestätigt 2,58 % 98,7 %

Furfural 0,41 µg/ml 4,1 ppm 1,43 µg/ml bestätigt 1,49 % 99,5 %

Furan-2-carbonsäure

1,13 µg/ml 11,3 ppm 3,82 µg/ml bestätigt 4,75 % 98,4 %

Nicotinsäure 0,76 µg/ml 7,6 ppm 2,58 µg/ml bestätigt 4,39 % 98,8 %

Lumichrom 0,37 µg/ml 3,7 ppm 1,28 µg/ml bestätigt 3,72 % 99,6 %

Lumiflavin 0,24 µg/ml 2,4 ppm 0,83 µg/ml bestätigt 2,37 % 98,8 %

Tabelle 22: Übersicht der Ergebnisse zur Prüfung der Validität der Methode zur Bestimmung von Abbau- undZerfallsprodukten von Vitaminen

Zusätzlich zu der bereits vorhandenen Methode für die Analytik der Vitamine existiert somit nunauch eine valide Methode für die Identifizierung und Quantifizierung von Abbau- undZersetzungsprodukten. Das ermöglicht weiterführende Untersuchungen zur Bestimmung vonVitaminen und deren Abbauprodukten in Algenbiomasse, die bisher jedoch noch nichtdurchgeführt wurden.


Seite 47 von 62

6.4.1.7 Zusammenfassung

Mit dem Ziel interessante Wirkstoffe aus Mikroalgen zu identifizieren und zu quantifizieren wurdenim Rahmen des Projektes Methoden zur Analytik von Zellinhaltsstoffen entwickelt und bezüglichihrer Validität geprüft. Aufgrund der erzielten Ergebnisse kann die MAL GmbH zukünftig folgendeUntersuchungen zur Charakterisierung von Mikroalgen anbieten:

Chlorophylle lassen sich schnell und mit ausreichender Genauigkeit nach einer Extraktion insiedendem Methanol photometrisch bestimmen.Carotinoide, die als pharmazeutische Wirkstoffe zum Einsatz kommen können, sindAstaxanthin, ß-Carotin und Lutein. Sie werden nach aufwändiger Probenvorbereitung mit einervaliden HPLC-Methode identifiziert und quantifiziert.Zur Überwachung der Astaxanthin-Akkumulation in Haematococcus pluvialis wurde eineMethode zur In-Prozess-Kontrolle entwickelt.Die Proteinbestimmung erfolgt nach KJELDAHL, dabei wird der Gehalt an Stickstoff nach einemsäurehydrolytischen Aufschluss photometrisch bestimmt und daraus durch Multiplikation miteinem Faktor (6,25) der Rohproteingehalt berechnet.Die Fettsäureanalytik erfolgt gaschromatographisch nach einem säurehydrolytischenAufschluss.Zur Analyse von Vitaminen und deren Abbau- und Zerfallsprodukten existiert eine valideHPLC-Methode.

Anhand der zahlreichen Experimente ergaben sich folgende Gesichtspunkte hinsichtlich derkommerziellen Nutzung von Algeninhaltsstoffen bezogen auf die untersuchten Algenspezies:

Chlorella vulgaris zeichnete sich sowohl durch einen sehr hohen Chlorophyll- (8 µg/ml) alsauch durch einen hohen Proteingehalt (ca. 40 % TS) aus. Aus diesen Gründen wird sie bereitsals Nahrungsadditiv verwendet.Haematococcus pluvialis akkumuliert unter Stressbedingungen große Mengen Astaxanthin(Kultivierung in der MAL GmbH: 2 bis 3 % TS). Aufgrund der antioxidativen Wirkung diesesKetocarotinoids wird ein Einsatz auf medizinischem Gebiet diskutiert.Isochrysis spec. zeichnet sich durch ihr besonderes Fettsäurespektrum aus. Die biologischhochwirksamen -3-Fettsäuren DHA und EPA wiesen einen Anteil von fast 20 % desgesamten Fettsäureanteils auf.

Die große biologische Variabilität, die bei der Analytik von Zellinhaltsstoffen beobachtet werdenkonnte, ist zum großen Teil auf unterschiedliche Kultivierungsbedingungen zurückzuführen. Durchgezielte Milieubedingungen, Wachstumsraten, Erntezeitpunkte usw. können verschiedeneSubstanzen bevorzugt akkumuliert werden. Diese wirtschaftlich wichtigen technologischenProduktionsbedingungen sollten weiter untersucht werden, da optimale WachstumsbedingungenVoraussetzung für qualitativ hochwertige Mikroalgen sind.

6.4.2 Nutzung als Düngemittel

Algenbiomasse ist reich an Mineralstoffen und sollte sich daher als Düngemittel eignen. Diegetrocknete Biomasse von Chlorella vulgaris, Chlamydomonas reinhardtii und Anabaena variabiliswurde hinsichtlich ihrer düngemittelrelevanten Inhaltsstoffe sowie ihres Gehaltes an Schadstoffenanalysiert. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 23 und 24 dargestellt. Dabei ist anhand derUntersuchungsergebnisse von je 2 unterschiedlichen Kultivierungsansätzen der Algen zuerkennen, dass die Zusammensetzung der Algenbiomassen schwanken kann. Im Vergleich zuorganischen Düngemitteln wiesen die untersuchten Algenbiomassen deutlich höhereNährstoffgehalte auf. Hinsichtlich der Gehalte an Schadstoffen erfüllten die Algenbiomassen diegesetzlichen Anforderungen gemäß Bioabfallverordnung, welche u. a. die Aufbringung vonBioabfällen auf Flächen regelt.


Seite 48 von 62

Gehalt [mg/kg]Chlorella vulgaris

Gehalt [mg/kg]Chlamydomonas

reinhardtii

Gehalt [mg/kg]Anabaena variabilisNährstoff

Gehalt[mg/kg]

Wirtschafts-dünger6 1. Analyse 2. Analyse 1. Analyse 2. Analyse 1. Analyse 2. Analyse

P2O5 4.100 33.000 26.000 26.000 41.000 66.000 64.000Gesamt-Stickstoff

6.100 33.000 36.000 25.000 28.000 41.000 43.000

K2O 4.600 25.000 21.000 22.000 22.000 45.000 28.000

CaOnicht

aufgeführt8.000

nichtanalysiert

3.000nicht

analysiert3.000

nichtanalysiert

MgO 1.400 13.000 12.000 9.000 10.000 16.000 15.000

Tabelle 23: Ergebnisse der Analyse von Algenbiomassen hinsichtlich düngemittelrelevanter Inhaltsstoffe

SchwermetallGehalt [mg/kg]

Chlorellavulgaris

Gehalt [mg/kg]Chlamydomonas

reinhardtii

Gehalt [mg/kg]Anabaenavariabilis

Grenzwert7

[mg/kg]

Blei 5 7 <5 100Cadmium <0,5 <0,5 <0,5 1

Chrom 0,6 <0,5 12 70Kupfer 34 6 6 70Nickel 4 <1 9 35

Quecksilber <0,2 <0,2 <0,2 0,7Zink 150 41 21 300

Tabelle 24: Ergebnisse der Schwermetallanalyse an Algenbiomassen

Nach der Bestimmung der Gehalte an düngemittelrelevanten Inhaltsstoffen wurden an denAlgenbiomassen Pflanzenverträglichkeitstests zur Ermittlung der Düngewirkung durchgeführt. ZumVergleich wurde ein handelsüblicher Volldünger („Blau“ Mineralischer NPK-Dünger mitMagnesium, Beckmann & Brehm GmbH) mitgeführt. Die Angabe der Wachstumssteigerung erfolgtin Bezug zu einer ungedüngten Kontrolle. Die Zugabemengen an Algenbiomassen bzw. Dünger zuje 50 g Einheitserde mit je 20 Samen Sommergerste wurden zum einen auf der Grundlage einerDüngeempfehlung auf die jeweiligen Nährstoffgehalte abgestimmt berechnet. Zum anderenwurden je 3 gleiche Zugabemengen pro Biomasse bzw. Dünger gewählt. Die Ergebnisse derPflanzenverträglichkeitstests zeigen die Abbildungen 29 und 30.Aus der Abbildung 29 geht hervor, dass der Volldünger unabhängig von der Zugabemenge diegrößte Wachstumssteigerung hervorrief. Zusätzlich wurde beobachtet, dass nur beim Volldüngermit steigender Zugabekonzentration auch eine deutlich zunehmende Wachstumssteigerung zuverzeichnen ist. Die Algenbiomassen förderten bei der geringsten Zugabekonzentration(0,1 g/50 g) das Pflanzenwachstum ähnlich gut wie der Volldünger. Die Erhöhung derZugabemengen (0,2 bzw. 0,3 g/50 g) führte im Vergleich zum Volldünger aber zu keiner auffallendverbesserten Wachstumsförderung. Dabei ist zu berücksichtigen, dass der Volldünger eineMischung von Nährstoffen darstellt, während die Algenbiomassen neben den Nährstoffen weitereKomponenten wie z. B. Kohlenstoff enthalten. Es wurden daher auch Versuche durchgeführt, indenen die Zugabemengen an die Nährstoffgehalte angepasst wurden. Innerhalb der getestetenAlgenbiomassen zeigte Chlamydomonas reinhardtii die geringste Düngewirkung.

6 mittlere Nährstoffgehalte in organischen Düngemitteln [23]7 laut Bioabfallverordnung


Seite 49 von 62

Abbildung 29: Abhängigkeit der Wachstumssteigerung gegenüber der Kontrolle von der Zugabekonzentration derAlgenbiomassen bzw. des Düngers

Beim Vergleich der Daten in der Abbildung 30 fällt auf, dass nach Abstimmung der Zugabemengenauf den jeweiligen Nährstoffgehalt die Düngewirkung des Volldüngers denen der Algenbiomassennicht so deutlich überlegen ist. Dennoch führte auch hier der Volldünger zum besten Ergebnis undbenötigte dabei die geringste Zugabemenge. Unter den getesteten Algenbiomassen kamChlamydomonas reinhardtii dem Volldünger am nächsten, erforderte aber auch die höchsteZugabemenge.

Abbildung 30: Vergleich der Wachstumsförderung durch Algenbiomassen bzw. Volldünger mit Zugabemengen bezogenauf eine Düngeempfehlung

0,0

50,0

100,0

150,0

200,0

250,0

300,0

350,0

0,1 g/50 g 0,2 g/50 g 0,3 g/50 g

Zugabekonzentration

Wac

hst

um

geg

enü

ber

der

Ko

ntr

olle

[%

]

Chlorella vulgaris Chlamydomonas reinhardtii Anabaena variabilis Volldünger

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

0,09 g/ 50 g 0,17 g/ 50 g 0,26 g/ 50 g 0,33 g/ 50 g

Volldünger Anabaenavariabilis

Chlorella vulgaris Chlamydomonasreinhardtii

Algenart mit der dazugehörigen Zugabemenge

Wac

hstu

m g

egen

über

der

Kon

trol

le [%

]


Seite 50 von 62

6.4.36.4.4 Rückgewinnung von Phosphat

6.4.4.1 Anzucht von Mikroalgen unter Verwendung von Abwasser

Für die Anzucht von Mikroalgen in Abwasser wurde mit der Mikroalge Chlamydomonas reinhardtiigearbeitet. Diese Spezies hatte sich bei Vorversuchen im Vergleich von drei ausgewähltenMikroalgen (Chlorella vulgaris, Chlamydomonas reinhardtii, Anabaena variabilis) während derAnzucht in künstlichem Abwasser als am robustesten erwiesen. Chlamydomonas reinhardtii wurdedaraufhin parallel unter Verwendung einer optimierten Nährlösung und eines kommunalenAbwassers über unterschiedlich lange Zeiträume in Blasenreaktoren angezüchtet. Dabei wurdeneben dem „normalen“Abwasser ein mit zusätzlichem Phosphat dotiertes Abwasser verwendet.Die Abbildung 31 zeigt den Verlauf der Zellzahl während der Kultivierung.

0,00E+00

5,00E+05

1,00E+06

1,50E+06

2,00E+06

2,50E+06

3,00E+06

3,50E+06

4,00E+06

4,50E+06

5,00E+06

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Kultivierungsdauer [d]

Zel

lzah

l/ml

Nährlösung

Abwasser

Abwasser dot iert

Abbildung 31: Verlauf der Zellzahl während der Kultivierung von Chlamydomonas reinhardtii unterVerwendung einer optimierten Nährlösung, Abwasser und mit Phosphat dotiertem Abwasser

Die Darstellung zeigt, dass Chlamydomonas reinhardtii für eine Kultivierung unter Nutzung vonAbwasser als Nährstoffquelle geeignet ist. Im Vergleich zur Anzucht mit Nährlösung ist zwar eineAdaptionsphase zu verzeichnen, jedoch ist der Unterschied als gering gegenüber dem Optimumeinzuschätzen. Da in diesem Zusammenhang die Produktion der größtmöglichen Menge anBiomasse jedoch eher nicht im Vordergrund steht, sondern vielmehr die Eliminierung vonPhosphat aus der Lösung, ist dies nicht unbedingt ein Nachteil.

6.4.4.2 Eliminierung von Phosphat aus Abwässern durch Mikroalgen und dessen biologischeAkkumluation

Im Rahmen der oben beschriebenen Versuche zur Anzucht von Chlamydomonas reinhardtii inAbwasser wurde die Phosphatelimination in den Kultivierungslösungen ermittelt. Die Phosphat-gehalte in der Nährlösung und im Abwasser wurden jeweils zu Beginn und am Ende desKultivierungszeitraumes bestimmt. Die Ansätze wurden über unterschiedliche Zeiträume kultiviert.Das Abwasser wurde zusätzlich mit Phosphat dotiert, wobei der Phosphatgehalt des dotiertenAbwassers etwa das 3fache des Gehaltes der Nährlösung sowie ca. das 80fache des Gehaltesdes nicht-dotierten Abwassers betrug. Ergebnisse dieser Experimente sind in den Abbildungen 32und 33 dargestellt.


Seite 51 von 62

0

50

100

150

200

250

300

350

400

Nährlösung 1 Abwasser 1 Nährlösung 2 Abwasser 2 Abwasser dot.

Ph

osp

hat

aufn

ahm

e [m

g/l]

Abbildung 32: Phosphataufnahme durch Chlamydomonas reinhardtii während der Kultivierung in Blasenreaktorendargestellt als Phosphatelimination aus der Nährlösung bzw. dem Abwasser

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Nährlösung 1 Abwasser 1 Nährlösung 2 Abwasser 2 Abwasser dot.

Ph

osp

hat

aufn

ahm

e [%

]

Abbildung 33: Phosphataufnahme durch Chlamydomonas reinhardtii während der Kultivierung in Blasenreaktorendargestellt als prozentuale Phosphatelimination aus der Nährlösung bzw. dem Abwasser

Chlamydomonas reinhardtii ist in der Lage, hohe Phosphatwerte aufzunehmen. Bezogen auf dieAbsolutwerte an Phosphat wurde der höchste Anteil aus dem dotierten Abwasser entfernt. DerPhosphatgehalt des (nicht-dotierten) Abwassers sank auf ca. 80 % des Ausgangswertes.Betrachtet man die Abnahme des Phosphatgehaltes prozentual, wurden somit im Abwasser diebesten Ergebnisse erzielt. Es ist jedoch auch der Biomassegehalt der Kultivierungslösungen zuberücksichtigen. Für die Ansätze 2 wurden die Biomassegehalte experimentell ermittelt und dieAbnahme des Phosphatgehaltes im Zusammenhang dazu betrachtet. Die Ergebnisse zeigt dieTabelle 25.


Seite 52 von 62

Nährlösung Abwasser Abwasser dotiertBiomassegehalt [g/l] 0,39 0,36 1,80P-Aufnahme/Biomasse [mmol/g] 2,2 0,4 2,1PO4

3--Aufnahme/Biomasse [mg/g] 205 38 197

Tabelle 25: Vergleich der P-Aufnahme bezogen auf die Biomasse in den Ansätzen

Es wird deutlich, dass die Verfahrensführung einen erheblichen Einfluss auf dasPhosphataufnahmeverhalten der Biomasse hat. Die Werte lassen eine Spanne von 38 mg/gBiotrockenmasse bis 205 mg/g Biotrockenmasse erkennen. Es wurden somit Phosphatgehalte vonbis zu 20 % der Biotrockenmasse erzielt. Weitere Verbesserungen sind realistisch.Bezogen auf die Biomasse war die P-Aufnahme in den Ansätzen mit den hohen Phosphatgehalten(Nährlösung und dotiertes Abwasser) deutlich besser als im nicht-dotierten Abwasser. DerBiomassegehalt im Abwasser war dem in der Nährlösung vergleichbar. Durch den viel geringerenPhosphatgehalt im Abwasser erfolgte jedoch absolut betrachtet keine so hohe P-Verwertung wie inder Nährlösung. Wie bereits weiter oben erwähnt, war die P-Reduktion im Abwasser prozentualgesehen aber am höchsten.

Im Hinblick auf eine mögliche Nutzung von Mikroalgen zur Eliminierung und Rückgewinnung vonPhosphat aus Abwässern spielt die Freisetzung des im Klärschlamm vorliegenden Phosphats einewesentliche Rolle. Zu dieser Problematik wurden erste Untersuchungen angestellt.


Bisherige Versuche bewiesen das Vorhandensein einer abwassertauglichen Algenpopulation inder MAL GmbH und ihre Eignung für die Phosphatanreicherung bzw. Phosphatelimination beigleichzeitiger Schadstoffabtrennung sowie die Möglichkeit einer biokatalytischen Phosphat-freisetzung aus Klärschlamm. Es wurden bereits Phosphatgehalte von bis zu 20 % der Biomasseerreicht.Die Ergebnisse verdeutlichen die prinzipielle Verwertungsmöglichkeit von Mikroalgen zurEliminierung und Rückgewinnung von Phosphat aus Abwässern. Dabei kann eine simultaneReinigung von Abfallgasen erfolgen.

6.4.5 Vergärung der Algenbiomasse

Im Hinblick auf eine mögliche Rückführung der Algenbiomasse in den Biogaskreislauf wurdenorientierende Untersuchungen zur Bestimmung des Faulverhaltens gemäß DIN 38414 Teil 8durchgeführt. Dabei wurde festgestellt, dass die Biomassen von Chlorella vulgaris bzw.Chlamydomonas reinhardtii im Vergleich zu Primärschlamm ein fast drei Mal bzw. nahezu doppeltso hohes Ergebnis der spezifischen Faulgasproduktion aufwiesen. Im Vergleich zu Brotmasse, dieim laboreigenen Biogasreaktor u. a. als Substrat eingesetzt wurde, lagen die Werte für diespezifische Faulgasproduktion von Chlorella vulgaris etwa doppelt so hoch, im Falle vonChlamydomonas reinhardtii waren sie nahezu gleich. Die Ergebnisse dieser orientierendenUntersuchung unterscheiden sich tendenziell vom Befund des Projektpartners TU Dresden,wonach für eine Algenbiomasse aus einer kommerziellen Algenproduktionsanlage im Vergleich zueinem sogenannten Rücklaufschlamm etwas geringere Gasausbeuten ermittelt wurden. Zuberücksichtigen ist dabei, dass die Bedingungen der Versuche in der MAL GmbH und der TUDresden nicht unmittelbar vergleichbar sind.


Seite 53 von 62

6.4.6 Verwertung

Abgeleitet aus der Kultivierung von Algenbiomasse unter Nutzung von Biogas und den erzieltenUntersuchungsergebnissen können folgende Verwertungsmöglichkeiten genannt werden:

Im Rahmen der Untersuchung der Mikroalgen hinsichtlich verwertbarer Inhaltsstoffe wurdenMethoden zur Analytik von Zellinhaltsstoffen entwickelt und bezüglich ihrer Validität geprüft.Die MAL GmbH konnte damit ihr Dienstleistungsspektrum deutlich erweitern.

Die untersuchten Mikroalgen besitzen wertvolle Inhaltsstoffe. Besonders hervorzuheben istdabei das Carotinoid Astaxanthin in Haematococcus pluvialis. Die erfolgreiche Kultivierungdieser Mikroalge ist mit dem Ergebnis von 2 bis 3 % Astaxanthin bezogen auf dieAlgentrockenmasse gelungen.

In den untersuchten Mikroalgen wurden düngemittelrelevante Inhaltsstoffe nachgewiesen.Zudem erfüllten die Algenbiomassen hinsichtlich der Gehalte an Schadstoffen die gesetzlichenAnforderungen gemäß Bioabfallverordnung. Im Rahmen von Pflanzenverträglichkeitsstestswurde gezeigt, dass die Algenbiomassen das Pflanzenwachstum ähnlich gut wie einVolldünger fördern konnten.

Die MAL GmbH verfügt über eine abwassertaugliche Algenpopulation mit der Eignung zurEliminierung und Rückgewinnung von Phosphat aus Abwässern.

Die Rückführung der Algenbiomasse in den Biogaskreislauf erscheint aufgrund der erzieltenorientierenden Ergebnisse möglich und sinnvoll.


Seite 54 von 62

6.5 Möglichkeiten zur Verwertung des gereinigten Gases

6.5.1 Eignung des gereinigten Gases für den Antrieb von Motoren

Biogas aus Klärschlämmen und anderen Substraten hat lediglich einen Methangehalt von ca.60 %, eine hohe Feuchtigkeit, einen hohen CO2-Anteil (ca. 30 %) sowie Beimengungen von CO,H2, H2S oder auch Siloxanen. Das Gas kann nicht ohne weitere Aufreinigung als Energieträger inden denkbaren Systemen wie Gasmotor oder Brennstoffzelle eingesetzt werden. Eine Alternativebietet der bereits im 19. Jahrhundert erfundene Stirling-Motor. Hierbei findet die Verbrennungaußerhalb der Arbeitskammer der Zylinderkolben statt. Durch die Verbrennung wird dem imZylinder enthaltenen Gasgemisch thermische Energie zugeführt. Aufgrund dieser Energie dehntsich das Gas aus und verrichtet am Kolben Arbeit. Das Gas wird nun abgekühlt und zieht sichwieder zusammen. Der Kolben kann wieder in seine Ausgangsstellung zurückkehren. Derelektrische Wirkungsgrad eines solchen Motors war in der Vergangenheit geringer als der vonherkömmlichen Gasmotoren, wenn beide mit Erdgas betrieben wurden. Neue technologischeFortschritte ermöglichen zur Zeit vergleichbare Wirkungsgrade. Ein Nachteil von Gasmotoren istdie Verringerung ihrer Standzeit auf 1/3 bei der Verwendung von Brenngasen mit Spuren vonSiloxan. Dies kann mittels Stirling-Motor umgangen werden.Für die Untersuchungen wurde auf ein funktionsfähiges Modell eines Stirling-Motorszurückgegriffen. Ein Bunsenbrenner wurde umgebaut, um eine Verbrennung der unterschiedlichenGase zu ermöglichen. Zusätzlich zu den aufbereiteten Biogasen wurden die Ausgangsgase sowieErdgas untersucht. Die Abbildung 34 zeigt die Ergebnisse dieser Untersuchungen. Die durch dieVerbrennung von Erdgas erreichten Motordrehzahlen wurden auf 100 % normiert.

Abbildung 34: Untersuchungen zum Einsatz der Biogase zum Antrieb eines Stirling-Motors

Aus der Abbildung 34 geht hervor, dass keines der untersuchten Gase an das Erdgas heranreichte. Synthetisches und natürliches Biogas erreichten etwa 70 % der mittels Erdgas erzieltenDrehzahlen. Noch schlechter schnitt das gereinigte synthetische Biogas ab, hierbei wurden nur ca.50 % der entsprechenden Erdgas-Drehzahlen erreicht. In weiteren Versuchen konnte vorerstbestätigt werden, dass das gereinigte Biogas am schlechtesten abschneidet.

0%

20%

40%

60%

80%

100%

120%

0 1 2 3 4 5 6

Zeit [min]

Mo

tord

reh

zah

l [%

] b

ezo

gen

au

f E

rdg

as

Erdgas synthetisches Biogas

natürliches Biogas gereinigtes synthetisches Biogas


Seite 55 von 62

Dabei ist jedoch zu berücksichtigen, dass bei der aktuellen Versuchsanordnung durch denBunsenbrenner zusätzlich Luft aus der Umgebung angesaugt wird, welche das sauerstoffhaltigegereinigte Biogas „verdünnt“.

6.5.2 Eignung des gereinigten Gases für die Anzucht methanverwertender Bakterien

6.5.2.1 Einleitung

Zur Prüfung der Eignung des gereinigten Gases zur Anzucht methanotropher Mikroorganismenwurden die Spezies Methylosarcina quisquillarum und Methylomonas methanica auf der Basisverschiedener Gase kultiviert. Die zu vergleichenden Gase waren

Erdgas

natürliches Biogas

entschwefeltes natürliches Biogas

synthetisches Biogas

entschwefeltes synthetisches Biogas und

gereinigtes Biogas (BiLaGas).

Anhand des Bakterienwachstums sollte eine Aussage über die Verträglichkeit der Gase getroffenwerden.

Die methanotrophen Mikroorganismen sind auf die Verwertung von C1-Verbindungen spezialisiertund können keine längerkettigen Kohlenwasserstoffe abbauen [24]. Sie bilden zusammen mit denBakterien bzw. Hefen, die Methanol, methylierte Amine, Formaldehyd, Formiat und Dimethyletherverwerten können, die Gruppe der methylotrophen Mikroorganismen. Innerhalb dermethanotrophen Mikroorganismen, die aufgrund ihres Zellwandaufbaus den gramnegativenBakterien zugeordnet werden, werden verschiedene Gruppen unterschieden. Sie werden u.a.anhand ihrer intrazellulären Membranstrukturen und ihrer Art der Formaldehydfixierung in Typ I-und Typ II-methanotrophe Bakterien gegliedert. Die methanotrophen Mikroorganismen vom Typ I,zu denen auch die in dieser Arbeit untersuchten Spezies gehören, besitzen thylakoidartigeintrazelluläre Membranstrukturen und fixieren Formaldehyd mit Hilfe desRibulose-Mono-Phosphat-Weges [25].

Methylosarcina quisquillarum wurde erstmals 1998 aus dem Boden des Athens-Clarke CountyMunicipal Landfill in Athens (Georgia, USA) isoliert. Bei der Kultivierung in Flüssigkultur neigtdieser Mikroorganismus leicht zur Bildung von Aggregaten (sarcina-ähnliche Pakete), welche voneiner diffusen Schleimschicht umgeben werden. Als Sarcinen werden Zellformen bezeichnet, dieauftreten, wenn aus kugelförmigen Bakterien durch Zellteilungen platten- oder paketähnlicheGebilde (Sarcinen) entstehen [24]. Die beobachtete Zellmorphologie variiert außerdem sehr starkund wird als pleomorph bezeichnet. Nach entsprechend langer Kultivierung bilden sichhitzesensitive Zysten aus. Einzelne Zellen, Tetraden oder Diplokokken besitzen ein polaresFlagellum (selten auch zwei) und sind sehr beweglich. Das Temperaturoptimum für das Wachstumdieser Spezies liegt zwischen 22 und 32 °C. Der Mikroorganismus kann in einem pH-Bereich von5,5 bis 9,0 kultiviert werden. Beim Wachstum auf NMS-Agar entstehen runde leicht bräunlicheKolonien (Abbildung 35) [25].


Seite 56 von 62

Abbildung 35: Kolonien von M. quisquillarum, 400fache Vergrößerung

Methylomonas methanica ist wahrscheinlich der erste beschriebene methanotropheMikroorganismus. Er wurde 1906 von Söhngen aus Pflanzenmaterial isoliert und als Bacillusmethanicus bezeichnet. 1909 wurde der Name von Orla-Jensen in Methanomonas methanicageändert. Dworkin und Foster isolierten 1956 ein ähnliches Bakterium von der WasserpflanzeElodea spec. und nannten es Pseudomonas methanica. Whittenbury et al. [26] isolierten 1970mehr als 100 verschiedene methanotrophe Spezies aus unterschiedlichsten Habitaten (Boden,Wasser, Schlamm), teilten sie in fünf Genera ein und ordneten diese den Gruppen Typ I- oder TypII-methanotropher Mikroorganismen zu.Die stäbchenförmigen, mitunter auch kokkoiden Zellen von Methylomonas methanica besitzen einpolares Flagellum und bilden hitzesensitive Zysten aus. Die optimale Wachstumstemperatur liegtzwischen 25 und 30 °C [27]. Das pH-Optimum befindet sich im Bereich zwischen 5,0 und 9,0. DieBakterien enthalten Poly-ß-Hydroxybuttersäure-Einschlüsse und Carotinoide. Bei der Kultivierungauf NMS-Agar wachsen rosa-pigmentierte Kolonien (Abbildung 36) [28].

Abbildung 36: Kolonien von M. methanica, 400fache Vergrößerung


Seite 57 von 62

6.5.2.2 Wachstumsversuche zum Vergleich der Eignung verschiedener Gase

In den durchgeführten Versuchen sollte das Wachstum der methanotrophen Mikroorganismenunter Verwendung verschiedener Gase und in Abhängigkeit von der Methankonzentrationuntersucht werden. Die verwendeten Methankonzentrationen betrugen 10, 25 und 50 Vol.-%. Dassdabei aufgrund der gasdicht verschlossenen Kultivierungsgefäße auch andere wichtigeGaskomponenten (zum Beispiel der O2-Gehalt) in ihrer Konzentration beeinflusst wurden, wurde inKauf genommen. Mit BiLaGas konnte der Versuch mit 50 Vol.-% CH4 nicht durchgeführt werden,da aufgrund des CH4-Gehaltes von <50 Vol.-% mehr Gas hätte injiziert werden müssen, alsüberhaupt Atmosphäre im Kultivierungsgefäß zur Verfügung stand.

Die Abbildung 37 zeigt beispielhaft das Ergebnis eines Wachstumsversuches. Die Kurvenrepräsentieren jeweils die Mittelwerte der gemessenen OD600 von 5fach-Ansätzen.

Abbildung 37: Vergleich des Wachstums von Methylosarcina quisquillarum mit entschwefeltem natürlichen Biogas

In der Tabelle 26 wurden die Ergebnisse der Wachstumsversuche hinsichtlich der ermitteltenTendenz des optimalen Methangehaltes zusammengefasst.

Tendenz bezüglich der optimalen CH4-KonzentrationGas

Methylosarcina quisquillarum Methylomonas methanicaErdgas 25 > 50 > 10 25 > 10 > 50natürliches Biogas 25 > 10 > 50 25 > 10 > 50entschwefeltes natürlichesBiogas

25 > 10 > 50 25 > 10 > 50

synthetisches Biogas 10 > 25 > 50 25 > 10 > 50entschwefeltes synthetischesBiogas

25 > 50 > 10 25 > 10 > 50

BiLaGas 25 > 10 25 > 10

Tabelle 26: Auswertung der Wachstumsversuche bezüglich der optimalen Methankonzentration für die Kultivierungvon Methylosarcina quisquillarum und Methylomonas methanica

Aus der Tabelle 26 geht hervor, dass in nahezu allen Fällen eine Methankonzentration von 25 Vol.-%am besten für das Wachstum von Methylosarcina quisquillarum und Methylomonas methanicageeignet war. In den Ansätzen mit 10 Vol.-% bzw. 50 Vol.-% CH4 werden die zu geringeMethankonzentration bzw. der vergleichsweise zu geringe Sauerstoffanteil als limitierendeFaktoren angesehen. Im Wachstumsversuch mit synthetischem Biogas und Methylosarcinaquisquillarum wurde eine Methankonzentration von 10 Vol.-% als günstig ermittelt.

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

1 6 11 16 21

Zeit (d)

OD

600

10 Vol.-% CH417 Vol.-% O2

25 Vol.-% CH412 Vol.-% O2

50 Vol.-% CH43 Vol.-% O2


Seite 58 von 62

Dieses Ergebnis wurde als Hinweis darauf gewertet, dass – wie bereits bei der Anzucht derMikroalgen beobachtet – der relativ hohe H2S-Anteil das Wachstum hemmt. Der Anteil an H2S warim 25 Vol.-%-Ansatz doppelt und im 50 Vol.-%-Ansatz viermal so hoch wie im 10 Vol.-%-Ansatz.Bei einem Vergleich der Biomasseausbeuten aus der Anzucht mit der jeweils als optimalermittelten Methankonzentration wurde festgestellt, dass beide Spezies bei der Kultivierung mitdem entschwefelten Biogas höhere Biomasseausbeuten lieferten als mit dem unbehandelten Gas(Abbildung 38).

Die Abbildung 38 zeigt einen Vergleich der Biomasseausbeuten beider Spezies aus der Anzuchtmit den jeweils als optimal ermittelten Methankonzentrationen aller untersuchten Gase. DerVergleich kann dabei immer nur innerhalb einer Spezies erfolgen. Methylosarcina quisquillarumließ sich dieser Graphik zufolge am besten mit Erdgas, entschwefeltem synthetischen Biogas undBiLaGas kultivieren. Bei Methylomonas methanica führten BiLaGas, entschwefeltes synthetischesBiogas und Erdgas zu den höchsten Biomasseausbeuten. Das Wachstum mit denschwefelhaltigen Biogasen war bei beiden Mikroorganismen schlechter als mit den entschwefeltenVarianten.

Abbildung 38: Zusammenfassung der in den Wachstumsversuchen erreichten maximalen Zelldichten

6.5.2.3 Methanverbrauch zum Aufbau von Biomasse

Die methanotrophen Mikroorganismen wurden hinsichtlich ihres relativen Methanverbrauchs ineiner definierten Zeitspanne untersucht. Anhand der Bakterientrockenmassen und derMethangehalte am Beginn und am Ende des Kultivierungszeitraumes wurde der Methanverbrauchzum Aufbau von 1 g Trockenmasse berechnet. Danach betrug der Verbrauch für Methylosarcinaquisquillarum ca. 0,7 l CH4/g Trockenmasse und für Methylomonas methanica2 l CH4/g Trockenmasse. Diese ermittelten Werte lagen im Bereich der anhand der bekanntenStoffwechselwege von methanotrophen Mikroorganismen theoretisch errechnetenCH4-Verbrauchswerte von 0,56 l/g bis 3,2 l/g gebildeter Trockenmasse (die ermitteltenVergleichswerte waren abhängig von der Vorgehensweise bei der Berechnung) [29].

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

Erd

gas

natü

rlich

esB

ioga

s

ents

chw

efel

tes

natü

rlich

esB

ioga

s

synt

hetis

ches

Bio

gas

ents

chw

efel

tes

synt

hetis

ches

Bio

gas

BiL

aGas

OD

600

Methylosarcinaquisquillarum

Methylomonasmethanica


Seite 59 von 62

Der CH4-Verbrauch von Methylomonas methanica für die Produktion von 1 g Trockenmasse warsomit zwei- bis dreimal höher ist als der von Methylosarcina quisquillarum. Bezüglich derVerwertung von CH4 ohne das Ziel einer Gewinnung von speziellen Inhaltsstoffen wäre somitMethylomonas methanica der Vorzug zu geben. Liegt das Hauptaugenmerk der Kultivierungjedoch in der Gewinnung von Biomasse, Proteinen oder bestimmten Zellinhaltsstoffen, so wäreMethylosarcina quisquillarum dafür besser geeignet.


Das durch die Mikroalgen gereinigte Biogas (BiLaGas) eignete sich sehr gut zur Anzuchtmethanverwertender Bakterien. Der Vorteil des BiLaGases bestand dabei vor allem darin, dass esneben Methan auch Sauerstoff enthält, den die methanotrophen Organismen ebenfalls benötigen.In Abhängigkeit vom Hauptziel der Kultivierung – Methanverwertung oder Produktion vonBiomasse – wäre entweder Methylomonas methanica oder Methylosarcina quisquillarum derVorzug zu geben.

6.5.3 Weitere Verwertungsmöglichkeiten

Zusätzlich zu den genannten Verwertungsmöglichkeiten ist der Einsatz von BiLaGas als Schweiß-und Brenngas denkbar. Bei der Verwendung als Schweißgas könnte die Zuführung von Sauerstoffgespart werden, da das Gas bereits O2 enthält. Voraussetzung für diese Anwendung wäre diePrüfung des Gases hinsichtlich seines Verhaltens unter Druck. Für den Einsatz von BiLaGas alsSchweißgas besteht Interesse von Seiten der COMPART Umwelttechnik GmbH.

6.6 Fugataufbereitung und Nutzung als Nährstoffe

Für die Nährstoffversorgung der Algenbiomasse sollte das bei der Entwässerung derGärrückstände anfallende Fugat geprüft werden. Dazu wurde dieses hinsichtlich seinerNährstoffzusammensetzung untersucht. Tabelle 27 zeigt eine Gegenüberstellung der für dieAnzucht von Chlorella vulgaris erforderlichen Nährstoffzusammensetzung und denentsprechenden Gehalt im Fugat.


Seite 60 von 62

VerbindungenSoll-Konzentration

[mg/l]Konzentration im Fugat

[mg/l]Nitrat-N 69,23 <2Ammonium-N 0,006 756Kjeldahl-N - 789Sulfat 168 7,00Phosphat 237 17,57Bor 0,010 6,90Eisen 2,813 1,06Kalium 291 102Kobalt 0,050 0,005Kupfer 0,060 0,006Magnesium 49,87 2,24Mangan 1,085 0,048Molybdän 0,043 0,010Zink 0,168 0,029

Tabelle 27: Vergleich der Gehalte der erforderlichen Nährstoffe für die Anzucht von Chlorella vulgaris im Medium undim Fugat

Nahezu alle notwendigen Nährstoffe sind im Fugat in deutlich geringerer Konzentration alserforderlich enthalten. Für die Stickstoffversorgung ist anstelle von Nitrat-N eine sehr hoheKonzentration von Ammonium-N sowie ein hoher Gehalt an organisch gebundenem Stickstoff zuverzeichnen. Das Fugat müsste vor seiner Verwendung als Nährlösung also zunächst um ca. daszehnfache verdünnt werden und anschließend die übrigen Nährstoffe zudotiert werden. DieserAufwand rechtfertigt die Verwendung von Fugat als Nährlösung nicht. In Voruntersuchungenkonnte außerdem festgestellt werden, dass bei Verwendung von Fugat als alleinigerNährstoffquelle bzw. in einer Verdünnung von 1:2 mit spezieller Algennährlösung eine Hemmungdes Algenwachstums von >100% verursacht wurde.

6.7 Bemessungsparameter für ein scale-up

Im Rahmen der experimentellen Arbeiten konnten für eine Kombination eines Biogasreaktors mitdem speziellen Blasenreaktorsystem Kenndaten ermittelt werden, welche unter Berücksichtigungbestimmter Parameter die Auslegung einer Anlage im Pilotmaßstab erlauben. Ein Parameter, derfür ein scale-up des Photobioreaktors eventuell gesondert betrachtet werden muss, ist dieLichtverteilung in der Algenkultur.

Zur Veranschaulichung der Stoff- und Energiebilanzen wurde ein Auslegungsbeispiel für einePilotanlage theoretisch bestimmt. Ausgehend von einer gegebenen Biogasproduktion von800 m3/d und unter Berücksichtigung von experimentell ermittelten Kenndaten wurde dieAuslegung für einen an die Biogasanlage anzuschließenden Photobioreaktor berechnet.

Die Ergebnisse sind in der Tabelle 28 dargestellt.


Seite 61 von 62

Kenndaten als BerechnungsgrundlageVBiogasreaktor Labormaßstab [l] 10VPhotobioreaktor Labormaßstab [l] 2,5Vverbrauchtes Biogas [l/d] 2,6Vumgewälztes Gas [l/min] 0,03Anteil CH4 im Biogas [Vol.-%] 55CO2-Reduktion im Biogas [%] >90Biomassezuwachs im Photobioreaktor [g/l*d] 0,5Biogasproduktion Algen [l/kg oTS] 330Heizwert CH4 [kJ/mN

3] 35.790

Kenndaten Stromerzeugung mittels BHKWWirkungsgradelektrisch 0,35WirkungsgradGesamt 0,85

Energiebedarfelektrisch Photobioreaktor8

Durchmischung [kWh/d] ca. 1.230Eindicker [kWh/d] ca. 26Transport [kWh/d] ca. 0,5

Energiebedarf Biogasreaktorelektrisch [kWh/d] ca. 110thermisch [kWh/d] ca. 1.200

Berechnete DatenVproduziertes Biogas im Biogasreaktor [l/d] 800.000mbenötigte Biomasse Biogasreaktor [g/d] ca. 2.400.000VPhotobioreaktor [l] ca. 770.000mproduzierte Algenbiomasse Photobioreaktor [g/d] ca. 385.000

EnergiebilanzBruttoenergie (bezogen auf das produzierte Biogas und unterBerücksichtigung des CH4-Gehaltes und des Heizwertes) [kJ/d]

ca. 15.750.000

freigesetzte Energieelektrisch durch Verstromung [kWh/d] ca. 1.530Energiebedarfelektrisch Photobioreaktor [kWh/d] ca. 1.260Energiebedarfelektrisch Biogasreaktor [kWh/d] ca. 110frei nutzbare Energieelektrisch Gesamtsystem9 [kWh/d] ca. 160freigesetzte Energiethermisch durch Verstromung [kWh/d] ca. 2.190Energiebedarfthermisch Biogasreaktor [kWh/d] ca. 1.200frei nutzbare Energiethermisch Gesamtsystem [kWh/d] ca. 990

Tabelle 28: Beispiel für die Dimensionierung einer möglichen Pilotanlage

Ausgehend von den als Berechnungsgrundlage verwendeten Kenndaten und unter der Annahmeeiner täglichen Biogasproduktion von 800 m3 wurde zunächst zur Erzeugung dieser Biogasmengeeine Biomasse von ca. 2,4 t ermittelt. Für einen anzuschließenden Photobioreaktor wurde einbenötigtes Volumen von ca. 770 m3 berechnet. Dieser Photobioreaktor produziert in Abhängigkeitvom zugrundegelegten Biomassenzuwachs in diesem Berechnungsbeispiel eine Algenbiomassevon etwa 0,39 t pro Tag.

8 bezogen auf eine tägliche Biogasproduktion im Biogasreaktor von 800 m³9 das Gesamtsystem besteht aus dem Biogasreaktor und dem Photobioreaktor


Seite 62 von 62

Unter der Annahme eines bestimmten Energiebedarfs für den Betrieb des Photobioreaktors unddes Biogasreaktors sowie der Verwertung des erzeugten und durch die Algen gereinigten Gasesdurch Kraft-Wärme-Kopplung in einem Blockheizkraftwerk wurde eine Energiebilanz aufgestellt.

Vor allem in Abhängigkeit von den technischen Kenndaten der für den Betrieb desPhotobioreaktors benötigten Pumpe kann das Ergebnis dieser Energiebilanz stark schwanken.Eine geeignete Pumpe wird benötigt, um die Algensuspension im Photobioreaktor in Bewegung zuhalten. Der Energiebedarf für einen Eindicker und für den Transport der Biomasse wurde in dieBetrachtungen mit einbezogen, da davon ausgegangen wird, dass die erzeugte Biomasse in denBiogasreaktor zurückgeführt wird. Dazu ist die „Eindickung“der Algenbiomasse auf einen für dieVergärung organischer Substrate in Fermentern üblichen Wert notwendig. Bei der Betrachtungwurde des Weiteren davon ausgegangen, dass der Photobioreaktor unter Nutzung von Tageslichtbetrieben wird.

Hinsichtlich des Energiebedarfs des Biogasreaktors wurde zugrundegelegt, dass für den Betriebeiner Biogasanlage Strom in einer Höhe von ca. 2,5 % des Heizwertes im Biogas benötigt wird,während zum Erwärmen des Substrates sowie zum Ausgleich von Wärmeverlusten etwa 27 % desHeizwertes notwendig sind [31].

Ausgehend von den genannten Überlegungen wurden unter den angenommenen Bedingungen„Energieüberschüsse“von ca. 160 kWh/d bezogen auf elektrische Energie und etwa 990 kWh/dbezogen auf thermische Energie erzielt.

7 Bekannt gewordener Fortschritt auf dem Gebiet des Vorhabens

Die Fachagentur Nachwachsende Rohstoffe e. V. (FNR) förderte ein Projekt der Schmack BiogasAG und der rent a scientist GmbH mit dem Teilziel der Reduzierung der hohen CO2-Anteile inBiogas mit Hilfe von Mikroalgen. Dazu sollten die Algen in einem dem Fermenter der Biogasanlagenachgeschalteten Photobioreaktor unter Ausnutzung von Sonnenenergie zur Fixierung vonKohlendioxid genutzt werden.

Der Versuch einer Kontaktaufnahme mit der FNR hat durch uns stattgefunden. Seitens der FNRwar keine Aufgeschlossenheit zu spüren. Auf Initiative der rent a scientist GmbH kam es imNovember 2005 zu einem Treffen zwischen rent a scientist, Schmack und MAL. Dabei wurden imRahmen dessen, was preisgegeben werden kann, bisherige Erfahrungen und Ergebnisseausgetauscht. Es wurde festgestellt, dass die Zielstellung und auch die Umsetzung innerhalb derbeiden Projekte verschieden waren. Die von der MAL GmbH erreichten Ergebnisse werden durchdas FNR-Projekt nicht beeinträchtigt. Eine künftige Zusammenarbeit zwischen den genanntenFirmen und der MAL GmbH soll auf den gemeinsamen Erfahrungen aufbauen und zu neuenErkenntnissen führen.

8 Erfolgte oder geplante Veröffentlichungen

Das im Abschnitt 6.1.3 vorgestellte gasdichte Blasenreaktorsystem wurde schutzrechtlichgesichert. Darüber hinaus erfolgten bisher keine Veröffentlichungen zu den Ergebnissen desProjektes.

Schlussbericht - cleaner-production.de · validation of Methylosinus and Methylocystis species, and...

Documents

Transcript of Schlussbericht - cleaner-production.de · validation of Methylosinus and Methylocystis species, and...