Schimmelpilzgift Patulin - Analyse in Fruchtsaft und ... · Schimmelpilzgift Patulin - Analyse in...
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Schimmelpilzgift Patulin -
Analyse in Fruchtsaft und -püree sowie Kindernahrung
mittels ACQUITY UPLC H-Class + Xevo TQ-XS
Gliederung
❙ Allgemeine Einführung
Mykotoxine - eine Übersicht
Patulin - strukturelle Grundlagen, Eigenschaften und Vorkommen,
Relevanz in Fruchtsäften und Pürees
❙ Rechtlicher Rahmen und Grenzwerte
❙ Analytik
Aufarbeitung und Messung (alte und aktuelle Methoden)
❙ Methodenergebnisse
Statistische Kenndaten, Chromatogramme, praktische Erfahrungen
❙ Messresultate
vergangene Untersuchungen im Überblick
❙ Fallbeispiel einer Höchstmengenüberschreitung
| Eschborn, 18. Juni 2019 | Franziska Spitzbarth 2
Mykotoxine
❙ Griechisch: myko = Pilz, lateinisch: toxicum = Gift
❙ Sekundäre Stoffwechselprodukte von Schimmelpilzen
❙ Der Grund warum diese Toxine gebildet werden
ist noch nicht vollständig geklärt
❙ Schimmelpilzbefall bedeutet nicht automatisch eine
Mykotoxin-Kontamination: die Bildung
hängt von mehreren Faktoren ab
❙ Die toxische Wirkung kann chronisch oder
akut sein
| Eschborn, 18. Juni 2019 | Franziska Spitzbarth 3
eine kurze Einführung
❙ Mehr als 400
toxikologische Pilz-
Metabolite bekannt
❙ schätzungsweise
aber mehr als 1000
existent
❙ In Lebensmitteln
sind etwa 30 von
Bedeutung
Übersicht wichtiger Mykotoxine
| Eschborn, 18. Juni 2019 | Franziska Spitzbarth 4
Quelle: Bundesinstitut für Risikobewertung
Mykotoxine Produzierende vorwiegend betroffene Toxische Wirkung / Effekte
Mikroorganismen Lebensmittel
Aflatoxine Aspergillus flavus, Nüsse, Erdnüsse, Pistazien, Getreide, leberschädigend, mutagen,
Aspergillus parasiticus Hirse, sekundär aus Milch kanzerogen, teratrogen
Citrinin Penicillium citrinum Gerste, Hafer, Mais, Reis, Walnüsse nierenschädigend, mutagen,
kanzerogen (?)
Cyclopiazonsäure Aspergillus flavus, Erdnüsse, Mais, Käse Neurotoxin
Penicillium cyclopium
Desoxynivalenol Fusarium graminearum, Weizen, Gerste, Mais, Roggen Neurotoxin, immunotoxisch,
(Vomitoxin) Fusarium culmorum kanzerogen (?)
Ergotalkaloide Claviceps purpurea Roggen, Weizen, Hafer Neurotoxin, Durchblutungsstörungen,
(Mutterkornalkaloide) kanzerogen
Fumonisine Fusarium verticolloides Mais und maishaltige Produkte Neurotoxin, leberschädigend,
lungenschädigend, kanzerogen (?)
Moniliformin Fusarium verticolloides Mais und maishaltige Produkte, herzschädigend, leberschädigend,
(moniliforme) Weizen (Getreide) nierenschädigend
Ochratoxin A Aspergillus ochraceus, Getreide, Bohnen, kanzerogen, teratogen, neurotoxisch,
Penicillium verrucosum grüne Kaffeebohnen nierenschädigend
Patulin Penicillium patulum, Äpfel, Birnen, Bohnen, Weizen kanzerogen, mutagen,
Aspergillus clavatus leberschädigend
Penicillinsäure Penicillium puberulum, Mais, Gerste, Bohnen neurotoxisch
Aspergillus ochraceus
Sterigmatocystin Aspergillus versicolor, Getreide, grüne Kaffeebohnen, teratogen hautreizend, kanzerogen (?)
Aspergillus nidulans Käse
T-2 Toxin / Fusarium sporotrichioides Mais, Gerste, Hafer, Hirse starkes Neurotoxin, hautreizend,
HT-2 Toxin Fusarium poae kanzerogen
Zearalenon Fusarium graminearum Getreide schleimhautreizend, östrogen, Unfrucht-
barkeit verursachend, kanzerogen (?)
Kontamination
Primär-
kontamination
Befall bereits beim Anbau der Pflanze
Im Endprodukt nicht sichtbar
Sekundär-
kontamination
Während der Lagerung, des Transports, oder der Weiter-verarbeitung
zu erkennen
Carry Over
Tiere verzehren kontaminierte Futtermittel – Belastung der Produkte
nicht zu erkennen
| Eschborn, 18. Juni 2019 | Franziska Spitzbarth 5
Handlungsempfehlungen
zur Verringerung der Mykotoxinbelastung
❙ Befall möglichst verhindern – nachträgliches
Detoxifizieren ist nicht praktikabel bzw. unmöglich
❙ Handeln bevor es zu spät ist prophylaktisch
❙ Optimale Lagerung / Nachbehandlung
| Eschborn, 18. Juni 2019 | Franziska Spitzbarth 6 Quelle: Bundesinstitut für Risikobewertung
| Eschborn, 18. Juni 2019 | Franziska Spitzbarth 7
Wer hat mich gesehen?
Formel: C7H6O4 Molmassse: 154,12 g/mol CAS-Nr.: 149-29-1 -> fünf-gliedriges, ungesättigtes Lacton -> weiß, kristallin -> 1941 erstmals isoliert -> genotoxisch -> hitzebeständig, säurestabil, alkaliempfindlich
Patulin
Patulin und die Apfelsaftproblematik
| Eschborn, 18. Juni 2019 | Franziska Spitzbarth 8
-> Lieblingssaft der Deutschen – durchschnittlich trinkt jeder 12-13 Liter pro Jahr
1,5 kg Äpfel 1 Liter Saft
-> durch Pasteurisieren wird der Saft haltbar gemacht
-> Es reichen geringe Mengen verschimmelter Äpfel, um eine große Menge Saft
zu kontaminieren:
waschen, verlesen,
mahlen, pressen, ggf.
zentrifugieren und filtern
1250 – 1500 kg Äpfel davon 1 kg
verfault
1000 Liter Saft enthalten
50 µg/kg Patulin
Art. 1 Abs. 1 VO (EWG) Nr. 315/93
Definition „Kontaminanten“
Art. 2 Abs. 1 VO (EWG) Nr. 315/93 Verkehrsverbot für Lebensmittel mit gesundheitsschädlichen
Kontaminanten in bedenklicher Konzentration
Art. 2 Abs. 2 VO (EWG) Nr. 315/93
Minimierungsgebot: ALATA- / ALARA- Prinzip
Art. 2 Abs. 3 VO (EWG) Nr. 315/93
Höchstmengen für bestimmte Kontaminaten
Abschnitt 2 Anhang VO (EG) Nr. 1881 / 2006
gemeinschaftsweite gültige Höchstmengen für Mykotoxine
Art. 3 Abs. 2 VO (EG) Nr. 1881 / 2006
Vermischungsverbot, Verbot der Verwendung als Zusatz
| Eschborn, 18. Juni 2019 | Franziska Spitzbarth 9
Rechtliche Grundlagen und Grenzwerte
Bestimmung mit HPLC und UV-Detektor
| Eschborn, 18. Juni 2019 | Franziska Spitzbarth 10
Typisches Chromatogramm von Apfelsaft mit etwa 13 µg/kg Patulin
Quelle: ASU (von 2010) nach § 64 LFGB L48.03-2
| Eschborn, 18. Juni 2019 | Franziska Spitzbarth 11
Analytik Probenaufarbeitung
Enzymvorbehandlung
bei trüben Saft
und Brei bzw. Mus
zentrifugieren
Dotieren der
Kalibrierung
ISTD-
Dotierung
schütteln
Rückstand aufnehmen
und überführen
Extraktion
verdünnen
abblasen
UHPLC-Methode
❙ Eluentensystem: A: H2O B: Methanol
❙ Fluss: 0,3 ml/min
❙ Injektionsvolumen: 10 µl
❙ Säule: CORTECS UPLC Shield RP18 + Vorsäule
2,1 x 50 mm; 1,6 µm
Säulentemperatur: 30 ºC
❙ Gradient
Laufzeit: 6 min
12
ACQUITY UPLC H-Class
Step Time
(min)
Flow rate
(ml/min)
%A %B Curve
1 Initial 0,300 95 5 Initial
2 1,00 0,300 95 5 6
3 2,00 0,300 5 95 6
4 4,00 0,300 5 95 6
5 5,00 0,300 95 5 6
| Eschborn, 18. Juni 2019 | Franziska Spitzbarth
MS-Methode
❙ Quellenparameter:
Ionization Mode: ESI negative
Capillary Voltage: 2,8 kV
Source Temperature: 150 ºC
Desolvation Temperature: 500 ºC
Cone Gas Flow: 150 l/h
Desolvation Gas Flow: 1000 l/h
❙ MS File:
13
Xevo TQ-XS (Triple Quadrupole)
| Eschborn, 18. Juni 2019 | Franziska Spitzbarth
Compound
Name
Parent
(m/z)
Daughter
(m/z)
Cone
(V)
Collision
(eV)
Patulin 152,99
108,89 10 8
80,90 10 12
52,97 10 12
Patulin-13C7 160,04
114,91 10 8
86,02 10 12
57,00 10 16
Validierungsergebnisse /
statistische Kennzahlen
Validierung folgender Parameter:
o Selektivität / Spezifität
o Arbeitsbereich / Kalibrierfunktion
o Präzision
o Richtigkeit
o Wiederfindungsrate
o Nachweis- / Bestimmungsgrenze
o Messunsicherheit
| Eschborn, 18. Juni 2019 | Franziska Spitzbarth 14
Compound name: Patulin
Correlation coefficient: r = 0.999766, r^2 = 0.999531
Calibration curve: 0.3219 * x + 0.0428976
Response type: Internal Std ( Ref 2 ), Area * ( IS Conc. / IS Area )
Curve type: Linear, Origin: Exclude, Weighting: 1/x, Axis trans: None
Conc-0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40
Re
sp
on
se
-0.00
0.20
0.40
0.60
0.80
1.00
Conc
Re
sid
ua
l
-2.00
-1.00
0.00
1.00
2.00
3.00
min0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75 2.00 2.25 2.50 2.75 3.00 3.25 3.50 3.75 4.00 4.25 4.50 4.75
%
0
100
F1:MRM of 5 channels,ES-
152.995 > 80.899
170816_Patulin_L2_01 Smooth(Mn,1x2)
Patulin Validierung 170816 Kali 14.00 KiNa Apfelsaft
1.357e+006Patulin
0.96
90037
1293.40
3.25
3.66
4.244.35 4.54
min
%
0
100
F1:MRM of 5 channels,ES-
152.995 > 108.889
170816_Patulin_L2_01 Smooth(Mn,1x2)
Patulin Validierung 170816 Kali 14.00 KiNa Apfelsaft
3.014e+006Patulin
0.95
200824
86
3.52
min0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75 2.00 2.25 2.50 2.75 3.00 3.25 3.50 3.75 4.00 4.25 4.50 4.75
%
0
100
F2:MRM of 5 channels,ES-
160.038 > 114.915
170816_Patulin_L2_01 Smooth(Mn,1x2)
Patulin Validierung 170816 Kali 14.00 KiNa Apfelsaft
6.743e+005Patulin 13C7
0.95
46737
1044
R2 = 0,9995
Residuen + 3 % / -2,5 %
Dreifachbestimmung
Messergebnisse 2014 - 2018
| Eschborn, 18. Juni 2019 | Franziska Spitzbarth 15
2014 2015 2016 2017 2018
> 50 µg/l 1 0 0 1 5
10 µg/l - 50 µg/l 5 10 7 3 2
bis 10 µg/l 6 20 22 18 22
n.n. / n.b. 19 5 6 16 8
0
5
10
15
20
25
30
35
40
An
za
hl d
er
Pro
be
n m
it
en
tsp
rech
en
de
m G
eh
alt
Patulin in Fruchtsaft und Püree - Untersuchungen 2014 - 2018
Messergebnisse Kindernahrung 2014 - 2018
| Eschborn, 18. Juni 2019 | Franziska Spitzbarth 16
2014 2015 2016 2017 2018
> LOQ 2 3 1 1 0
n.n. / n.b. 16 19 11 19 13
0
5
10
15
20
25
An
zah
l d
er
Pro
ben
mit
en
tsp
rech
en
dem
Geh
alt
Patulin Kindernahrung - Untersuchungen 2014 - 2018
Fallbeispiel
❙ Ausgangspunkt: Beschwerdeprobe Apfelsaft
sensorische und chemisch-analytische Untersuchung
❙ Ergebnis Patulinanalyse: Gehalt von 1425 µg/kg - Überschreitung des max. zulässigen
Höchstgehaltes (Absicherung in 3-fach Wiederholung)
Beurteilung als gesundheitsschädlich
❙ Weiteres Vorgehen: - Verfolgs- und Verdachtsproben werden auf Patulin untersucht
- Rückrufaktion der betroffenen Chargen
- Vor-Ort-Termin des Überwachungsamtes
- Gemeinsame Betriebskontrolle von Überwachungsamt und
Landesdirektion
❙ Ursache: erhöhte Kontamination wahrscheinlich durch schlechte
Rohware und unzureichende Kontrolle
❙ Maßnahmen: Betrieb überarbeitet Qualitätsmanagement – eigenveranlasste
Untersuchung jeder Charge Saft auf Patulin
| Eschborn, 18. Juni 2019 | Franziska Spitzbarth 17
Literaturquellen
Deutsche Landwirtschaftsgesellschaft (DLG e.V.), „DLG-Expertenwissen 2/2016: Mykotoxine im Fokus“,
Prof. Dr. H. J. Buckenhüskes, Frankfurt a. M., 2016
Bundesinstitut für Risikobewertung (BfR), „Schimmelpilzgifte in Lebensmitteln – So können Sie sich schützen“, Berlin
Bundesinstitut für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (BVL), Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren
(ASU), §64 Lebensmittel- und Futtermittelgesetzbuch (LFGB)
Reports on tasks for scientific cooperation, Report of experts participating in Task 3.2.8 "Assessment of dietary intake of
patulin by the population of EU member states“, Directorate-General Health and Consumer Protection, März 2002
Landesuntersuchungsanstalt für das Gesundheits- und Veterinärwesen Sachsen (LUA)
| Eschborn, 18. Juni 2019 | Franziska Spitzbarth 18
Bildnachweise
Folie 3
https://www.duda.news/serie/giftige-und-ungiftige-schimmelpilze/
https://www.laves.niedersachsen.de/startseite/lebensmittel/lebensmittelgruppen/nuesse/nuesse-auf-dem-pruefstand-92254.html
https://www.urgeschmack.de/ist-kaffee-gesund/
https://www.gr.ch/DE/institutionen/verwaltung/dvs/alt/aktuelles/Seiten/Mykotoxine-in-Mais--und-Reiserzeugnissen.aspx
https://deacademic.com/dic.nsf/dewiki/368958
Bundesinstitut für Risikobewertung (BfR), „Schimmelpilzgifte in Lebensmitteln – So können Sie sich schützen“, Berlin, Seite 3
Folie 6
https://www.getreidekonservieren.de/mykotoxine/
Folie 8
https://www.coopathome.ch/de/supermarkt/fr%C3%BCchte-gem%C3%BCse/fr%C3%BCchte/%C3%84pfel-birnen/naturaplan-bio-%C3%84pfel-gala-4-6-
st%C3%BCck-ca/p/3090520
https://de.dreamstime.com/lizenzfreies-stockfoto-glas-apfelsaft-image26444715
https://www.lebensmittellexikon.de/l0002330.php
https://www.augsburger-allgemeine.de/wissenschaft/Warum-Supermarkt-Aepfel-Allergikern-Probleme-bereiten-koennen-id52899796.html
https://www.kzgeurasier.de/giftig.html
https://www.heilpraxisnet.de/naturheilpraxis/unverstaendlicher-einsatz-tierischer-bestandteile-bei-der-apfelsaft-produktion-20160930204371
Folie 11
https://www.brigitte.de/rezepte/apfelsaft-selber-machen-so-gehts-ganz-leicht-11226294.html
https://www.hettich.ch/de/produkte/hettich-zentrifugen/mittel-zentrifugen/universal-320-320r
https://www.sigmaaldrich.com/analytical-chromatography/analytical-products.html?TablePage=17551559
| Eschborn, 18. Juni 2019 | Franziska Spitzbarth 19
| Eschborn, 18. Juni 2019 | Franziska Spitzbarth 20
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