HỘI ĐO LƯỜNG VIỆT NAM(VINAMET)

SẮC KÝ KHÍ(GAS CHROMATOGRAPHY)

Hà Nội, 2005

- 1 -

Lời nói đầu

Ngày nay, hầu hết các phòng thí nghiệm tại Việt Nam đều được trang bịhệ thống sắc ký khí (GC) trong nghiên cứu cũng như phân tích thường ngày.

Với ưu điểm là một kỹ thuật rất nhạy và chọn lọc, GC ngày càng giữ vai tròquan trọng trong các lĩnh vực khoa học. Trước đây đã có một số sách đề cập vềSắc ký như: Sắc ký lớp mỏng, Các phương pháp sắc ký,... Song có rất ít hướngdẫn tiếng Việt chỉ đề cập về sắc ký khí. Vì vậy, chúng tôi soạn thảo hướng dẫnnày với hi vọng thảo luận lý thuyết cơ bản Sắc ký khí, các thành phần của hệthống và kỹ thuật thực nghiệm nhằm giúp người đọc có cái nhìn khái quát hơn

về Sắc ký khí. Đồng thời chúng tôi cũng trình bày nguyên lý hoạt động của mộtsố đầu dò thường được dùng trong Sắc ký khí.

Hi vọng hướng dẫn này sẽ giúp các bạn làm việc thường ngày với các hệ thốngsắc ký khí hiểu rõ hơn về thiết bị của mình nhằm hạn chế những sai phạm tình

cờ nguy hại đến hệ thống, khắc phục được một số lỗi cơ bản, lựa chọn cột thíchhợp với ứng dụng thực tế, tối ưu hóa một số thông số cơ bản phân tích, kiểmsoát được các yếu tố ảnh hưởng cơ bản tới hệ thống.

Tài liệu do các chuyên gia đo lường của Hội Đo lường Việt Nam phối hợp vớiTrung tâm Kỹ thuật III, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng biên soạn.

- 2 -

MỤC LỤC

Trang

Lời nói đầu ................................................................................................................................................................................. 1

Mục lục ........................................................................................................................................................................................... 2

Chương 1 – LÝ THUYẾT CƠ BẢN .......................................................................................................... 5

1.1 Khái quát ....................................................................................................................................................................... 5

1.1.1 Nguyên lý .................................................................................................................................................. 5

1.1.2 Sắc ký đồ ................................................................................................................................................... 7

1.1.3 Cơ chế tách các hợp chất ...................................................................................................... 7

1.2 Các tham số cơ bản ........................................................................................................................................... 8

1.2.1 Hệ số lưu .................................................................................................................................................... 8

1.2.2 Độ chọn lọc () ................................................................................................................................... 9

1.2.3 Độ phân giải cột (R) ..................................................................................................................... 10

1.3 Các phép đo định lượng hiệu năng cột ..................................................................................... 11

1.3.1 Số đĩa lý thuyết (N) ....................................................................................................................... 12

1.3.2 Chiều cao đĩa lý thuyết............................................................................................................. 13

Chương 2 – KHÍ MANG .......................................................................................................................................... 14

Chương 3 – KỸ THUẬT LẤY MẪU VÀ TIÊM ....................................................................... 17

3.1 Các kỹ thuật tiêm................................................................................................................................................. 17

3.1.1 Kỹ thuật tiêm “on-column” ............................................................................................... 18

3.1.2 Tiêm chia/không chia ................................................................................................................ 18

3.1.3 Hóa hơi chương trình nhiệt (kỹ thuật PTV) ................................................. 18

3.2 Các kỹ thuật lấy mẫu ...................................................................................................................................... 19

3.2.1 Lấy mẫu headspace...................................................................................................................... 19

3.2.2 Bẫy và thanh lọc............................................................................................................................... 19

3.2.3 Giải hấp nhiệt...................................................................................................................................... 19

3.2.4 Nhiệt phân ............................................................................................................................................... 20

3.2.5 Tạo dẫn xuất......................................................................................................................................... 20

- 3 -

Chương 4 – CỘT SẮC KÝ..................................................................................................................................... 23

4.1 Pha tĩnh ............................................................................................................................................................................ 23

4.2 Mô tả cột ......................................................................................................................................................................... 26

4.3 Lựa chọn cột............................................................................................................................................................... 26

4.4 Thay thế cột mao quản .................................................................................................................................29

4.4.1 Kiểm tra bằng mắt tất cả các khía cạnh của hệ thống ..................... 29

4.4.2 Chuẩn bị cột để cài đặt............................................................................................................ 29

4.4.3 Nối cột và xác nhận dòng...................................................................................................... 29

4.4.4 Kiểm tra rò rỉ ...................................................................................................................................... 30

4.4.5 Đặt thời gian chết, hoạt hóa và hiệu chỉnh ..................................................... 30

Chương 5 – CHƯƠNG TRÌNH NHIỆT ĐỘ VÀ LÒ CỘT............................................ 31

Chương 6 – ĐẦU DÒ .................................................................................................................................................... 33

6.1 Đầu dò ion hóa ngọn lửa (FID)........................................................................................................ 33

6.1.1 Nguyên tắc hoạt động................................................................................................................ 33

6.1.2 Tính chất ................................................................................................................................................... 34

6.2 Đầu dò bắt giữ điện tử (ECD)........................................................................................................... 34

6.2.1 Nguyên tắc hoạt động................................................................................................................ 34

6.2.2 Tính chất ................................................................................................................................................... 35

6.3 Đầu dò khối phổ (MS)....................................................................................................................................36

6.3.1 Nguyên tắc hoạt động................................................................................................................ 37

6.3.2 Giao diện ................................................................................................................................................... 38

6.3.3 Ion hóa và tách ..................................................................................................................................38

6.3.4 Một số kỹ thuật ion hóa thông dụng trong sắc ký khí ghép

khối phổ ...................................................................................................................................................... 39

6.3.5 Phát hiện ................................................................................................................................................... 40

6.3.6 Tính chất ................................................................................................................................................... 40

6.3.7 Theo dõi ion được chọn (SIM) ....................................................................................... 41

6.3.8 Nhận danh mũi trọng lượng phân tử..................................................................... 42

- 4 -

6.3.9 Phổ đồ khối lượng.......................................................................................................................... 43

6.4 Đầu dò dẫn nhiệt (TCD).............................................................................................................................. 43

6.4.1 Nguyên tắc hoạt động................................................................................................................ 43

6.4.2 Tính chất ................................................................................................................................................... 44

6.5 Đầu dò quang hóa ngọn lửa (FPD) ................................................................................................ 45

6.5.1 Nguyên tắc hoạt động................................................................................................................ 45

6.5.2 Tính chất ................................................................................................................................................... 45

6.6 Đầu dò Nitơ-Phốtpho (NPD).................................................................................................................. 47

6.6.1 Nguyên tắc hoạt động................................................................................................................ 47

6.6.2 Tính chất ................................................................................................................................................... 47

Chương 7 – XỬ LÝ DỮ LIỆU......................................................................................................................... 49

Chương 8 – CÁC PHÉP KIỂM TRA, HIỆU CHUẨN VÀ CHUẨN ............... 52

8.1 Kiểm tra và hiệu chuẩn đầu dò .......................................................................................................... 52

8.2 Chuẩn hóa ...................................................................................................................................................................52

8.2.1 Chuẩn kiểm tra hệ thống ...................................................................................................... 52

8.2.2 Chuẩn hiệu chuẩn cột ............................................................................................................... 53

8.2.3 Phương pháp ngoại chuẩn (đường chuẩn) ..................................................... 53

8.2.4 Phương pháp nội chuẩn ......................................................................................................... 53

8.2.5 Kiểm soát chất lượng ................................................................................................................. 56

Chương 9 – GIẢI QUYẾT VẤN ĐỀ........................................................................................................ 57

9.1 Dạng mũi bất thường ...................................................................................................................................... 58

9.2 Mũi tạp ............................................................................................................................................................................. 59

9.3 Đường nền ....................................................................................................................................................................60

9.4 Mũi cắt cụt ...................................................................................................................................................................61

Chương 10 – CÁC THÍ NGHIỆM SẮC KÝ KHÍ ...................................................................62

Chương 11 – HƯỚNG DẪN TÌM THÔNG TIN ...................................................................... 66

Chương 12 – KẾT LUẬN ........................................................................................................................................ 68

- 5 -

Chương 1 – LÝ THUYẾT CƠ BẢN

1.1 KHÁI QUÁT

Sắc ký khí là gì?

Sắc ký khí là một trong những kỹ thuật phân tích dụng cụ rất thông dụng và

mạnh thường dùng trong phân tích. Trường hợp lý tưởng, kỹ thuật này có thểcung cấp thông tin định tính và định lượng về từng cấu tử trong mẫu thử.

Sắc ký khí liên quan đến quá trình tách các chất khác nhau trong cùng một mẫura khỏi nhau. Chính điều này cho phép người phân tích dễ dàng nhận danh(định tính) và đo (định lượng) từng cấu tử trong mẫu. Hợp chất được tách chủyếu bởi sự khác nhau trong cấu trúc và tính bay hơi của chúng. Điều này hạnchế cho một số hợp chất và mẫu không thực hiện trực tiếp trên GC do tính chấthóa lý của chúng.

Loại hợp chất phù hợp để phân tích bằng sắc ký khí?

Những hợp chất dễ bay hơi có nhiệt độ bốc hơi dưới 350 oC – 400 oC và tất cảhoặc một phần của phân tử hợp chất phải ở trạng thái khí dưới 350 oC – 400 oC.

Một yêu cầu nữa là hợp chất phải chịu được nhiệt độ cao và nhanh chóng đượcchuyển vào pha hơi mà không bị phân hủy hoặc phản ứng với các hợp chấtkhác. Như vậy, các hợp chất vô cơ không phù hợp cho phân tích GC. Một sốhợp chất cơ kim có thể phân tích bằng GC bởi chứa hàm lượng hữu cơ cao.Hầu hết các hợp chất hữu cơ phù hợp để phân tích bằng GC nhưng có một sốngoại trừ như một số hợp chất sinh học và dược liệu bị phân hủy ở nhiệt độ sắcký khí, hợp chất khác phản ứng với các vật liệu dùng trong GC và cột.

1.1.1 Nguyên lý

Mẫu thường được đưa vào cột sắc ký dưới dạng hơi. Độ tan của mỗi cấu tửtrong pha khí đi vào cột phụ thuộc vào áp suất hơi của chính cấu tử đó và áp

suất hơi của chúng lại là hàm của nhiệt độ cột, ái lực giữa cấu tử đó và pha tĩnh.Sự khác nhau về áp suất hơi làm cho các phân tử của mỗi cấu tử phân tán giữapha tĩnh và pha khí động . Thực tế khi các phân tử di chuyển nhanh chóng liên

tục giữa 2 pha, chính sự khác nhau về thời gian định cư trong mỗi pha mà nó

ảnh hưởng tới sự phân tán. Mỗi lần phân tử đi vào pha khí, nó được cuốn vềphía đầu dò bởi dòng khí mang. Do đó các hợp chất có tính chất hóa và lý khác

nhau sẽ đến đầu dò tại các thời điểm khác nhau. Pha tĩnh có thể là chất rắn hoặc

- 6 -

phủ chất lỏng trên một sườn rắn trơ tạo nên hai dạng sắc ký khí tương ứng làsắc ký rắn khí (GSC) và sắc ký lỏng khí (GLC).

Hệ thống sắc ký khí gồm 6 phần chính: Nguồn cung cấp khí và bộ kiểm soátdòng, buồng tiêm, cột, lò cột, đầu dò và thiết bị ghi đo như trong hình 1

Hình 1 - Hệ thống sắc ký khí

• Nguồn cung cấp khí và bộ kiểm soát dòng

Các khí có độ tinh khiết rất cao được cung cấp bởi bình khí nén hoặc máy sinhkhí. Van điều áp trên bình khí nén hoặc máy sinh khí kiểm soát lượng khí đivào GC. Bộ kiểm soát dòng và van điều áp trong GC kiểm soát lưu lượng dòng

của các loại khí khác nhau một khi chúng vào thiết bị.

• Buồng tiêm

Buồng tiêm là nơi bốc hơi dung dịch mẫu và đưa dòng hơi mẫu vào cột nhờdòng khí mang. Buồng tiêm được gia nhiệt tới 100 oC-300 oC, nên bất cứ thành

phần mẫu bay hơi nào cũng đều được chuyển nhanh chóng vào thể hơi. Khímang trộn với phần hơi này của mẫu thử và mang hơi mẫu vào cột.

• Lò cột và cột

Lò cột là nơi chứa cột sắc ký và kiểm soát nhiệt độ (đẳng nhiệt hay chươngtrình nhiệt).

Cột là một ống gồm 3 lớp: lớp vỏ bảo vệ, ống xung silic và pha tĩnh. Cột đóngvai trò trực tiếp trong quá trình tách làm giàu một hợp chất. Điều này đặc biệt

- 7 -

quan trọng khi phân tích định lượng (sẽ được đề cập kỹ trong phần cột sắc ký ởchương 4)

• Đầu dò

Đầu dò là thiết bị tương tác với các hợp chất dựa trên một số tính chất hoá lý đểsinh ra tín hiệu điện. Nó được dùng để phát hiện sự hiện diện của một hợp chất.Vậy tùy thuộc vào tính chất của hợp chất cần phân tích mà người phân tích phảichọn loại đầu dò phù hợp cho hợp chất đó (sẽ được đề cập kỹ trong phần đầudò ở chương 6).

• Thiết bị ghi đo

Tại đây, tín hiệu tương ứng của đầu dò được ghi đo và chuyển vào máy tính đểtính toán cho sắc ký đồ và lưu trữ dữ liệu.

1.1.2 Sắc ký đồ

Sắc ký đồ là một dạng đồ thị gồm 2 trục, trục hoành biểu diễn thời gian lưu củahợp chất, trục tung biểu diễn tín hiệu tương ứng của đầu dò. Khi lý tưởng, mỗimũi ứng trên sắc ký đồ tương ứng với một hợp chất ra khỏi cột. Tuy nhiên,

thực tế thường có sự trùng chập mũi do một số hợp chất có cùng thời gian lưu.Đây là vấn đề nan giải mà đầu dò khối phổ có thể giải quyết dễ dàng vấn đềnày (sẽ nói kỹ trong chương 6)

1.1.3 Cơ chế tách các hợp chất

Cột làm việc ra sao ? Điều gì xảy ra bên trong cột ? Làm thế nào các hợp chấtdi chuyển qua cột ? Tại sao hợp chất này nằm trong cột lâu hơn hợp chất khác?Làm thế nào để mẫu đi vào cột ? Đây là một trong số những câu hỏi cơ bảnthường được đặt ra cho sắc ký khí.

Quá trình tách mẫu thành từng cấu tử (từng hợp chất) riêng biệt bằng cột sắc kýkhí mao quản có thể được mô tả bằng khái niệm rất đơn giản như sau: Mẫu thửchứa hỗn hợp các hợp chất đi vào cột và được gom ở đầu cột. Sau đó các phântử của mỗi hợp chất bắt đầu di chuyển xuống cột ở tốc độ khác nhau. Các phântử di chuyển nhanh nhất đạt tới cuối cột đầu tiên, đi vào đầu dò sẽ cho tín hiệutương ứng với mũi đầu tiên trong sắc ký đồ. Các hợp chất di chuyển nhanh kếcận tiếp tục di chuyển tới đầu dò và quá trình này tiếp diễn cho tới khi tất cảcác hợp chất được cột giữ lại đi ra khỏi cột. Bởi vì mỗi hợp chất ra khỏi cột ởmỗi thời điểm khác nhau nên chúng được tách rời khỏi nhau. Vậy bất cứ hợp

- 8 -

chất nào đi qua cột ở cùng tốc độ sẽ không được tách rời khỏi nhau và chúng có

cùng thời gian lưu.

1.2 CÁC THAM SỐ CƠ BẢN

1.2.1 Hệ số lưu

Bởi vì tất cả các hợp chất tiêu tốn cùng một thời gian trong pha động. Hệ số lưuk cho biết thời gian một hợp chất nằm trong pha tĩnh bao lâu so với hợp chấtkhác. Sự lưu giữ của hợp chất gia tăng khi giá trị k tăng. Nếu k = 0 thì ta nói là

hợp chất không bị lưu giữ.

Hình 2 - Hệ số lưu

Hệ số lưu (xem hình 2) mô tả khả năng lưu giữ chất tan của pha tĩnh

Phương trình 1

k = tR - tM / tM

Trong đó:

tR: thời gian lưu của chất tan

tM: thời gian của mũi không bị giữ lại hay thời gian chết của cột

Ở dây thời gian lưu của chất tan tR là thời gian hợp chất nằm trong cột. Nó bằngtổng thời gian hợp chất trong pha động và pha tĩnh. Thời gian lưu lệ thuộc vào

cột, nhiệt độ cột và vận tốc tuyến tính khí mang. Do trong GC luôn có nhữngthay đổi nhỏ nên thời gian lưu có khuynh hướng trôi giạt theo thời gian từ lần

- 9 -

chạy này đến lần chạy khác. Cần chú ý là khi cột càng cũ thì thời gian lưu củamột hợp chất tương ứng trên cột đó ngày càng ngắn lại theo thời gian sử dụng.

Các hợp chất vào cột chỉ khi chúng trong pha động (khí mang). Do đó tại mộtnhiệt độ cột và vận tốc tuyến tính khí mang cố định, mỗi hợp chất tốn cùng thờigian trong pha động. Thời gian trong pha động được xác định bằng cách tiêm

một hợp chất không bị lưu lại vào hệ thống sắc ký khí và đo thời gian lưu củanó. Thời gian lưu này được gọi là thời gian chết của cột và biểu thị là tM hoặcto.

Bởi vì mỗi hợp chất tiêu tốn cùng thời gian trong pha động, sự khác nhau trongthời gian lưu là do bởi sự khác nhau thời gian tiêu tốn trong pha tĩnh. Nếu lấythời gian lưu của một hợp chất (mũi) trừ thời gian chết của cột (tM) ta sẽ cóđược thời gian tiêu tốn thật sự của một hợp chất trong pha tĩnh, giá trị này đượcgọi là thời gian lưu hiệu chỉnh (tR) hay thời gian lưu của chất tan.

Chất tan nằm trong pha tĩnh càng lâu thì nó càng có thể dễ được tách ra khỏicác cấu tử có cùng độ bay hơi hơn. Trong sắc ký khí, hệ số lưu có thể đượcthay đổi bằng cách thay đổi pha tĩnh hoặc nhiệt độ của cột.

1.2.2 Độ chọn lọc (α)

Hệ số chọn lọc (α) cho 2 cấu tử cho biết mức độ chúng sẽ tách như thế nào trên

một cột nào đó. Xem hình 3, hệ số chọn lọc được định nghĩa như trong phươngtrình 2.

Hình 3 - Hệ số chọn lọc

- 10 -

Phương trình 2

α = (tR)B - tM / (tR)A - tM

Trong đó:

(tR)B : thời gian lưu của cấu tử B được lưu giữ mạnh hơn

(tR)A : thời gian lưu của cấu tử A được lưu giữ kém hơn

tM : thời gian chết

• Khi α = 1, về mặt lý thuyết hai cấu tử không thể tách rời nhau đượctrên cột được thử

• Khi α > 1, về mặt lý thuyết hai cấu tử có thể tách nhau hoàn toàn

nhưng điều này còn phụ thuộc vào độ phân giải hoặc độ hoàn hảo củacột.

1.2.3 Độ phân giải cột (R)

Độ phân giải (R) của cột là thước đo định lượng về khả năng của cột tách haicấu tử ra khỏi nhau trong một hỗn hợp.

Hình 4 - Độ phân giải của cột

Xem hình 4, độ phân giải được định nghĩa như trong phương trình 3:

Phương trình 3

R = 2 ×[(tR)B – (tR)A] / WA+ WB

Trong đó:

(tR)B: thời gian lưu của cấu tử B được lưu giữ mạnh hơn

- 11 -

(tR)A: thời gian lưu của cấu tử A được lưu giữ kém hơn

WA: bề rộng mũi của cấu tử A tại đường nền (bề rộng đáy của A)

WB: bề rộng mũi của cấu tử B tại đường nền (bề rộng đáy của B)

• Nếu R< 1, các mũi trùng trập lên nhau.

• Nếu R ≥ 1, các mũi tách ra khỏi nhau. Thực tế phải có R ≥ 1,5 để haimũi tách hoàn toàn.

Ngoài ra, độ phân giải thường được biểu diễn ở dạng phần trăm. Hai mũi táchhoàn toàn khí % độ phân giải bằng 100. Khi %R nhỏ hơn 100 thì 2 mũi trùng

chập lên nhau.

1.3 CÁC PHÉP ĐO ĐỊNH LƯỢNG HIỆU NĂNG CỘT

Trong hình 2, 3 và 4, các mũi đã được phóng đại để minh họa cấu tử đi ra khỏicột như là một dải chất. Điều này xuất hiện là do mỗi phân tử của cấu tử có mộtđường phân tán duy nhất qua pha khí và pha lỏng. Do đó các phân tử giải hấpra khỏi cột tại những thời gian lưu hơi khác nhau. Hiệu ứng này không chỉ bịảnh hưởng bởi tương tác hóa học của cấu tử và pha tĩnh mà còn phụ thuộcnhiều vào kích cỡ của cột như chiều dài cột, đường kính trong và cỡ hạt hoặcbề dày lớp phim pha tĩnh. Hiệu ứng bành rộng mũi tăng tỷ lệ với thời gian cấutử nằm trong cột, điều này giải thích tại sao trong một sắc ký đồ các mũi giảihấp sau bị bành rộng hơn và thấp hơn những mũi ra khỏi cột trước.

Từ nhận xét trên ta thấy rõ khả năng của cột để tách các cấu tử có cùng giảihấp ra liên quan đến mũi hoặc cấu tử bành rộng khi nó qua cột như thế nào (đâychính là hiệu năng của cột). Các nhà phân tích dùng mô hình đĩa trong sắc kýđể đo hiệu năng của cột; số đĩa lý thuyết càng lớn thì hiệu năng của cột càng

cao .

Hình 5 - Biểu diễn cột như một dãy đĩa lý thuyết

- 12 -

Điều này so sánh quá trình sắc ký với sự chưng cất và định lượng hiệu năng củacột theo số đĩa lý thuyết. Bằng cách so sánh này, chúng ta có thể dễ dàng hiểukỹ thuật sắc ký khí hơn nhiều so với các kỹ thuật sắc ký khác. Hình 5 minh họacột như một dãy đĩa lý thuyết.

Ví dụ dưới các điều kiện thiết lập trước, các cấu tử hydrocabon của dầu giảihấp ra khỏi cột sắc ký theo thứ tự điểm sôi (nhiệt độ sôi) của chúng - các cấutử ra khỏi cột sắc ký khi nhiệt độ của cột được gia tăng tương tự như quá trình

trong cột chưng cất.

1.3.1 Số đĩa lý thuyết (N)

Hình 6 - Minh họa phép đo hiệu năng cột

Trong đó

tR: thời gian lưu

W1/2: độ rộng mũi tại 50% chiều cao của nó

W: độ rộng mũi tại đường nền

Từ hình 6, số đĩa lý thuyết (N) là:

Phương trình 4

N = 5,54 × (tR / W1/ 2)2 = 16 × (TR /W)2

Trong thực tế, tùy vào mục đích cần phân tích mà ta dùng các cột có chiều dài

(L) khác nhau do đó người ta thường biểu diễn hiệu năng của cột như là số đĩalý thuyết trên một mét.

- 13 -

1.3.2 Chiều cao đĩa lý thuyết

Một đại lượng nữa thường được dùng để biểu diễn hiệu năng cột là chiều caođĩa lý thuyết (H) hoặc chiều cao tương đương của một đĩa lý thuyết (HETP).

Phương trình 5

HETP = L/N

Chú ý:

Giá trị HETP sẽ cực tiểu khi hiệu năng của cột đạt được tốt nhất. Giá trị N và

HETP sẽ thay đổi theo thời gian khi cột cũ đi và kém hiệu năng (điều này giảithích tại sao thời gian lưu của một hợp chất trên cùng một cột sắc ký có khuynhhướng giảm dần theo thời gian cột được sử dụng). Nhà phân tích có thể dùng

các tham số này như là thước đo định lượng để xác định khi nào cột không còn

“phù hợp với mục đích” nữa và cần phải thay.

- 14 -

Chương 2 – KHÍ MANG

Khí mang tạo nên pha động trong hệ thống sắc ký khí. Trong suốt quá trình sắcký, các phân tử hợp phần từ mẫu trao đổi liên tục giữa pha tĩnh và pha động.Mỗi lần các phân tử này vào pha khí, chúng được mang đi và bị cuốn về phíađầu dò bởi dòng khí mang.

Hình 7 - Quá trình sắc ký trong cột nhồi

Bởi vì dòng khí mang là một biến số quan trọng để kiểm soát thời gian lưu củacác thành phần có trong mẫu thử, toàn bộ phép phân tích và thay đổi hoàn toàn

thời gian phân tích mẫu thử – khi dòng khí mang tăng gấp đôi thì thời gian lưucủa tất cả các cấu tử trong cột tăng gấp đôi và ngược lại.

Khi xây dựng một phương pháp sắc ký mới, người phân tích cần phải tối ưudòng khí mang tương ứng với mỗi cột để đạt độ phân giải sắc ký tốt nhất. Tốcđộ dòng khí mang cho độ phân giải tốt nhất (HETP cực tiểu) có thể được xácđịnh bằng thí nghiệm đơn giản hoặc theo đồ thị Van-Deeter.

Van-Deemter đã vẽ đồ thị cho 3 khí mang khác nhau trong cột mao quản như ởhình 8.

- 15 -

Hình 8 - HETP của cột theo vận tốc tuyến tính trung bình cho 3 khí

Đồ thị cho thấy đường của khí nitơ có độ dốc cao và cho độ phân giải tốt nhấtđối với khí này ứng với dải hẹp ở tốc độ dòng thấp (vận tốc tuyến tính trungbình đối với cột mao quản). Ngược lại đường của hêli và hyđrô tương đối bằngphẳng và độ phân giải tốt nhất đạt ở tốc độ dòng cao hơn nhiều. Tốc độ dòng

cao hơn nghĩa là phép phân tích thực hiện nhanh hơn và như vậy có lợi nhiềukhi dùng các khí này thay vì dùng nitơ. Hyđrô là một khí mang lý tưởng nhưnglại không an toàn do dễ gây cháy nổ, nên hầu hết các nhà sắc ký dùng hêli làm

khí mang. Khi dùng phép phân tích có độ phân giải thấp (dùng cột nhồi), đườngvan-Deemter cho các khí này tương tự nhau và lợi ích không đáng kể khi dùng

hêli hoặc hyđrô. Trong trường hợp này việc lựa chọn loại khí mang phụ thuộcvào tính sẵn có (dễ mua), an toàn, giá thành hoặc khả năng tương thích củachúng với đầu dò đang được sử dụng.

Yêu cầu kỹ thuật

Tất cả các khí được dùng trong phân tích sắc ký khí cần phải có độ tinh khiếtrất cao và phải được bắt giữ loại bỏ mức vết của hơi nước, oxy và các

hydrocarbon nhiễm bẩn ra khỏi khí trước khi đi vào thiết bị. Oxy là một chấtnhiễm bẩn rất quan trọng cần phải được loại bỏ bởi vì nó gia tăng sự hủy hoại

cột (phá hỏng cột) và cũng có thể gây ra những trục trặc với những đầu dò nhạynhư đầu dò bắt giữ điện tử (ECD) và đầu dò khối phổ (MSD). Các chất nhiễmbẩn có thể được loại bỏ bằng cách cho dòng khí đi qua các ống chất hấp phụ.Người ta thường dùng các chất hấp phụ có màu để người phân tích có thể dễdàng kiểm tra khi chất hấp phụ hết khả năng hấp phụ.

- 16 -

Khí được cung cấp trong các bình khí ở áp suất cao không giống như trongHPLC, không có yêu cầu cho các bơm để dễ dàng di chuyển pha động qua thiếtbị. Áp của bình khí nén được điều áp chính xác để đảm bảo áp suất không đổi ởđầu cột. Bộ kiểm soát dòng khối đảm bảo rằng tốc độ dòng khí cài đặt ban đầuluôn không đổi trong suốt quá trình phân tích và không bị ảnh hưởng bởi nhiệtđộ của lò cột. Điều này đảm bảo cho thời gian lưu lặp lại tốt nhất.

Khuyến nghị

• Quy định các khí dùng trong phân tích sắc ký khí là trách nhiệm của ngườisử dụng. Luôn dùng các khí mang có độ tinh khiết cao, thường là99.995% hoặc cao hơn và chú ý các khuyến cáo kỹ thuật của hãng sảnxuất thiết bị và nhà cung cấp khí.

• Tuân theo hướng dẫn của hãng sản xuất và nhà cung cấp để lựa chọn hệthống hiệu quả nhất nhằm loại bỏ chất nhiễm bẩn từ các khí.

• Kiểm tra thường xuyên đảm bảo các thành phần bẫy khí được sử dụngđang làm việc hiệu quả và thay thế các ống chất hấp phụ dùng để bẫy cácchất nhiễm bẩn bất cứ khi nào cần thiết.

• Ngăn ngừa không khí đi vào dòng khí của thiết bị bằng cách kiểm tra sựrò rỉ ở tất cả các cổ nối và điểm nối trong hệ thống chuyển khí. Điều này

không chỉ quan trọng khi cài đặt hệ thống thiết bị ban đầu mà còn cả khi tathay thế cột hoặc đầu dò.

• Luôn kiểm tra lượng khí dự trữ đủ cho thiết bị chạy qua đêm và nhữngngày nghỉ cuối tuần hoặc những ngày lễ.

- 17 -

Chương 3 - KỸ THUẬT LẤY MẪU VÀ TIÊM

3.1 CÁC KỸ THUẬT TIÊM

Chức năng của buồng tiêm là đưa phần mẫu đại diện như một dải hẹp vào cộtsắc ký. Vì hầu hết các mẫu được phân tích bằng sắc ký khí ở dạng lỏng nên đặcđiểm thiết yếu của giai đoạn tiêm là mẫu và dung môi được bốc hơi trước khiđạt tới cột. Để thực hiện thành công, các buồng tiêm được trang bị bộ gia nhiệtcó thể kiểm soát được để kiểm soát nhiệt độ của vùng buồng tiêm tới giá trị cài

đặt trước.

Hình 9 - Sơ đồ buồng tiêm cột nhồi

Một trong những buồng tiêm đầu tiên đơn giản nhất được phát triển cho hệthống cột nhồi được minh họa như trong hình 9. Mẫu được tiêm trực tiếp quavách ngăn (septum) vào trên nút chận bông thủy tinh nằm tại đầu cột. Vùng cộtnày ở nhiệt độ cao và ngay tại thời điểm tiêm, mẫu được bốc hơi nhanh chóng

- 18 -

chuyển vào pha hơi và được dòng khí mang đẩy đi xuống về hướng cột phântích.

3.1.1 Kỹ thuật tiêm “on-column”

Thiết kế buồng tiêm cột nhồi là một ví dụ của tiêm “on-column”, ở đây toàn bộmẫu đi qua cột sắc ký. Tiêm “on-column” cũng có thể thực hiện với cột maoquản nhưng ở đây mẫu thường được tiêm vào cột lạnh. Sau đó, chương trình

nhiệt độ được kích hoạt để tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình tách và giải hấpcác thành phần của mẫu. Kỹ thuật “on-column” lạnh này phù hợp nhất cho cácmẫu chứa các thành phần không bền hoặc các thành phần có dải bốc hơi rộng.Để tránh hiện tượng quá tải và hình thành giọt nhỏ ở đầu cột mao quản, thể tíchtiêm thường được giữ khá nhỏ (0,3 µl). Do vậy giới hạn phát hiện thườngtương đối cao và kỹ thuật này không thích hợp cho phân tích vết. Với kỹ thuậttiêm này có thể dùng để định lượng.

3.1.2 Tiêm chia/không chia

Đây là hệ thống buồng tiêm phổ biến dùng với các cột mao quản và có hai kiểuvận hành, chia và không chia.

Kiểu chia - Chỉ một phần nhỏ mẫu được đưa vào cột, phần còn lại được dẫnvào đường thải theo tỷ lệ chia đặt trước. Tỷ lệ chia cao đảm bảo cột không bịquá tải với mẫu ở giai đoạn bắt đầu phân tích. Sự phân biệt đối xử có thể xảy racho một vài mẫu, gây bất lợi cho các thành phần của mẫu có nhiệt độ sôi caohơn. Để định lượng chính xác, các điều kiện tiêm và dung môi phải được lựachọn cẩn thận và kiểm soát chính xác.

Kiểu không chia - Mẫu được tiêm vào buồng tiêm nóng nhưng cột ban đầuđược giữ ở nhiệt từ 15oC đến 30oC thấp hơn nhiệt độ sôi của dung môi để giảmthiểu hiệu ứng phân biệt dung môi. Các kỹ thuật tập trung nhiệt và dung môi có

thể được dùng để làm giàu mẫu thành một dải hẹp nằm ở đầu cột. Kỹ thuật này

hữu dụng để xác định các chất phân tích không bay hơi trong các dung môi cónhiệt độ sôi thấp ở nồng độ rất thấp. Thường thể tích mẫu từ 1µl tới 2 µl đượctiêm vào buồng tiêm đã được gia nhiệt.

3.1.3 Hóa hơi chương trình nhiệt độ (kỹ thuật PTV)

Buồng tiêm này có các đặc điểm vạn năng, có thể hoạt động trong kiểu nónghoặc lạnh, chia hoặc không chia, đưa mẫu tổng hoặc loại bỏ dung môi. Nhữngưu điểm và nhược điểm của mỗi kỹ thuật đã được đề cập rồi nhưng sử dụngthiết bị chương trình nhiệt độ sẽ giúp duy trì các điều kiện tối ưu để tiêm mẫu

- 19 -

thành công, ví như để tập trung nhiệt. Nhiệt độ của buồng tiêm có thể đượcchương trình hoá làm cho nhiệt độ lò cột thay đổi. Trong kỹ thuật “on-column”thời gian lưu của các cấu tử có thể được kiểm soát để đảm bảo độ lặp lại cho hệsố phân tán 0,1% tới 0,5%. Đây là đặc điểm rất quan trọng khi các cấu tử đượcđịnh danh chỉ dùng thời gian lưu của chúng.

3.2 CÁC KỸ THUẬT LẤY MẪU

3.2.1 Lấy mẫu headspace

Khi mẫu lỏng hoặc mẫu rắn được để trong lọ đậy kín sẽ tạo thành sự cân bằnggiữa các cấu tử dễ bay hơi trong mẫu và khoảng không gian phía trên của vậtchất. Trong phương pháp headspace tĩnh, các mẫu nhỏ được lấy ở phía trên củamẫu bằng một kim tiêm sắc ký và chúng được tiêm trực tiếp vào cột sắc ký khí.Kỹ thuật này nhanh và đơn giản bởi vì mẫu không kèm theo nhiễu nền và khá

dễ để thực hiện. Khuyết điểm lớn nhất của kỹ thuật này là nồng độ mẫu thấp,chẳng hạn với chất cần phân tích kém bay hơi thì phương pháp này không nhạylắm. Trường hợp này có thể cải tiến bằng cách dùng phương pháp headspaceđộng, ví dụ như kỹ thuật bẫy và thanh lọc (pruge and trap).

3.2.2 Bẫy và thanh lọc

Trong hệ thống bẫy và thanh lọc, dòng khí trơ được dùng để đẩy các cấu tửkhỏi mẫu lỏng. Các cấu tử được bẫy và làm giàu trên một bẫy hấp phụ, bất kỳhơi nước nào đi qua bẫy đều không bị ảnh hưởng. Sau đó, bẫy được giải hấpbằng nhiệt và các cấu tử được mang vào cột trong dòng khí mang. Vì nền nước

hầu như được loại bỏ toàn bộ bằng quá trình này, mẫu được làm giàu và kỹthuật cho phép phát hiện ở mức phần tỷ (ppb) của các cấu tử dễ bay hơi trongcác mẫu nước.

3.2.3 Giải hấp nhiệt

Trong kỹ thuật này, vết các chất nhiễm bẩn trong không khí được bẫy trên các

ống hấp phụ. Sau đó các ống được giải hấp bằng nhiệt vào trong dòng khí mang

hêli và đi qua cột. Để tập trung mẫu, thường dùng một bẫy lạnh thể tích thấptrước khi phân tích sắc ký khí, tức là giải hấp 2 giai đoạn. Bởi vì các bẫy khônghấp phụ các khí vĩnh cửu (ví dụ nitơ, oxy,...) trong mẫu ban đầu, phương phápbị ảnh hưởng trực tiếp bởi nồng độ của chất cần phân tích và có khả năng ápdụng để phát hiện nồng độ vết của các chất nhiễm bẩn trong không khí.

- 20 -

3.2.4 Nhiệt phân

Nhiều phân tử lớn, đặc biệt các polymer, không thể phân tích trực tiếp bằng sắcký khí vì độ bốc hơi của chúng thấp. Trong phương pháp nhiệt phân, nănglượng nhiệt được dùng để phân hủy các vật liệu thành các các mảnh đơn giảnhơn, trọng lượng phân tử thấp hơn để chúng có thể được phân tích bằng sắc kýkhí. Một số nguồn nhiệt khác nhau hiện được sử dụng như “ribbon-type”,“điểm curie” và “bộ nhiệt phân la-de”. Kỹ thuật không chỉ phù hợp trong việcđịnh danh hoặc xác định thành phần ban đầu của polymer mà còn cung cấpthông tin rõ ràng về độ bền nhiệt và các quá trình phân hủy nhiệt liên quan tớivật liệu.

3.2.5 Tạo dẫn xuất

Với các hợp chất không bay hơi, cần phải tạo dẫn xuất dễ bay hơi. Tạo dẫn suấtcó thể được dùng trong sắc ký để thay đổi các tính chất sắc ký hoặc cải thiệnkhả năng phát hiện và liên quan tới những thay đổi hóa học của các nhóm chứctrong hợp chất. Những cải thiện rõ ràng trong độ bốc hơi, thủy phân và bềnnhiệt, dạng mũi, độ phân giải sắc ký, độ nhạy và độ chọn lọc phát hiện có thểđạt được nếu dùng phản ứng tạo dẫn xuất thích hợp như: alkyl, acyl, silyl. Cácnhóm chức điển hình có thể được tạo dẫn xuất là: alcol, phenol, acid

carboxylic, amine, amide và thiol. Các tác nhân tạo dẫn xuất điển hình là

trimethyl silyl, benzyl, benzoyl, phenoxyancyl halogen. Có mặt các nguyên tửhalogen trong dẫn xuất đảm bảo nâng cao độ nhạy và cho giới hạn phát hiện rấtthấp khi dùng đầu dò bắt giữ điện tử.

• Một số nhóm chức có thể tạo dẫn xuất acyl

Cấu trúc hóa học Mô tả

-NH2, -NH-, N amin nhất, nhị, tam cấp

-NH-CO-R amide

-CH2-OH,CHOH

COH

,

alcol nhất, nhị, tam cấp

-SH thiol

OHphenol

C

OH

C enol

- 21 -

C C

OH OH

glycolC C hợp chất chưa no

C

CC

C

CC

vòng thơm

• Một số thuốc thử thường dùng làm tác nhân tạo dẫn xuất silyl hóa

TT Tên Tên viết tắt Công thức

01 Hexamethyldisilazane HMDSSi N Si

H

CH3

CH3

CH3

H3C

CH3

CH3

02Trimethylchlorosilane

(với xúc tác baz)TMCS Si ClH3C

CH3

CH3

03 N-Methyl-N-trimethylsilylacetamide MSA

Si N Si

CH3

CH3

CH3

CH3

H3C

O

04 Trimethylsilyldiethylamine TMSDEA Si NH3C

CH3

CH3C2H5

C2H5

05 Trimethylsilyldimethylamine TMSDMA Si NH3C

CH3

CH3CH3

CH3

06 N-Mehtyl-N-trimethylsilyltrifuoroacetamid

MSTFAC N Si

CH3

CH3

CH3

CH3

CF3

O

- 22 -

TT Tên Tên viết tắt Công thức

07 N, O, Bis(trimethylsilyl)acetamide BSA C N Si CH3

CH3

CH3

CH3

OSiCH3

CH3

CH3

08N, O, Bis(trimethylsilyl)

trifluoroacetamide BSTFA C N Si CH3

CH3

CH3

CF3

OSiCH3

CH3

CH3

09 N-trimethylsilylimidazole TMSI Si NH3C

CH3

CH3 CN

CC

Yêu cầu kỹ thuật

Người phân tích nên tuân theo sổ tay hướng dẫn của nhà sản xuất để quenthuộc với các đặc tính của chính buồng tiêm. Phân tích các chuẩn và kiểm trasự bất thường hoặc các mũi bị biến dạng để biết buồng tiêm đang hoạt động ổnđịnh hay không chính xác.

Khuyến nghị

• Mũi bị chẻ hoặc biến dạng là dấu hiệu cho biết lượng mẫu tiêm quá lớn.Lúc này nên chọn chế độ chia dòng phù hợp hoặc giảm thể tích tiêm mẫu

• Nhiệt độ buồng tiêm quá thấp có thể làm cho mũi kéo đuôi.

• Nhiệt độ buồng tiêm quá cao có thể làm biến đổi cấu tử phân tích.

• Mũi bành rộng ở đầu sắc ký đồ là dấu hiệu chỉ chất tan không được tậptrung chặt thành một dải bởi kỹ thuật tiêm và lấy mẫu. Kiểm tra các thamsố đi kèm với các kỹ thuật này đã được tối ưu và cài đặt chính xác.

• Nhiễm bẩn buồng tiêm có thể tạo ra các ảnh hưởng rất mạnh – mũi tạptrong sắc đồ. Làm sạch hoặc thay thế liner (ống thủy tinh đã được sylanhóa không còn các tâm hoạt tính) của buồng tiêm thường xuyên.

- 23 -

Chương 4 - CỘT SẮC KÝ

Cột sắc ký là con tim của máy sắc ký khí, tại đây các thành phần của mẫu đượctách trước khi chúng được phát hiện, định danh hoặc định lượng. Các cộtthương phẩm ban đầu gồm một ống thủy tinh dài hoặc ống kim loại, đườngkính ¼ insơ (0,635 cm), được nhồi bằng các khoáng vật, bụi gạch, rây phân tử(đối với GSC) hoặc các hạt trơ được bao phủ bằng gôm, sáp ong và các

polymer (đối với GLC). Các cột nhồi ngày càng được dùng ít đi vì ngày càng

sẵn có các cột mao quản ống hở với độ hoàn hảo cao hơn.

Chỉ tiêu hoàn hảo đòi hỏi các cột mao quản ống hở phải dài, lỗ hẹp với một phatĩnh phân bố đồng đều. Các phương pháp hiện đại ra đời tương tự các phươngpháp được dùng trong sản xuất sợi quang, cùng với các kỹ thuật phủ tiên tiếnkhác, nơi đây pha tĩnh được phủ hoặc được liên kết với các thành trơ của ống,đã tạo nên một cuộc cách mạng trong sản xuất cột ống hở. Ngày nay các cột vớiđộ hoàn hảo cao và các cột chuyên biệt sẵn có trên thị trường.

Có một số loại cột ống hở, các loại quan trọng nhất là:

• WCOT - cột ống hở phủ thành

• SCOT - cột ống hở phủ trên sườn (hỗ trợ)

• POT - cột ống hở lớp xốp

4.1 PHA TĨNH

Độ tan của một hợp chất trong pha tĩnh lệ thuộc vào các loại tương tác nội phântử khác nhau. Luật chung là các chất giống nhau sẽ hòa tan giống nhau, vậy phatĩnh phù hợp để tách hợp chất bán phân cực thường là bán phân cực.

Các loại pha tĩnh chính dùng hiện nay gồm:

Chất hấp phụ rắn: Alumina, silica, zeolite, rây phân tử.

Các hợp chất polymer: Tenax, chromosorb và poropark. Các polymer rắn cóthể có hoạt tính bởi vì các chất lỏng duỗi thẳng ở nhiệt độ cột cao hơn.

Pha lỏng: Các pha lỏng thông dụng gồm các hydrocacbon, polyglycol,polyether, polyesther và các polysiloxane. Các polysilonane được dùng rộng rãi

nhất.

- 24 -

Đây là các pha tĩnh đã được biến tính và pha trộn để cho độ phân cực khácnhau.

Các ứng dụng điển hình gồm:

Chất hấp phụ rắn: Các khí trơ, các chất làm lạnh (freon), các hydrocacbon từC1 đến C10 rất bay hơi.

Polymer xốp: Ban đầu được dùng cho các cột nhồi. Đặc tính chảy máu thấp,thường dùng tất cả từ hydrocacbon tới acid.

Pha lỏng: Pha tĩnh thường được dùng nhất có khả năng ứng dụng chung chohầu hết các chất phân tích và nền (matrix). Các pha lỏng được tạo liên kết hóahọc được dùng trong các ứng dụng liên quan đến khối phổ và các công việcthực hiện ở nhiệt độ cao.

Hiện nay, hầu hết các hệ thống sắc ký khí sử dụng thường ngày trong phòng

phân tích đều dùng cột mao quản. Một số tham số thực nghiệm cơ bản của sắcký khí mao quản trong thế kỷ 20 thay đổi như sau: [Theo V.G. Berezkin, E.N.

Viktorova, Journal of Chromatography A, 985 (2003) 3-10]

Chiều dài cột mao quản (%)

NămChiều dài (m)

1970 1980 1990 2000

≤ 10 6 18 13 11

25-30 26 36 57 73

31-50 22 23 22 3

51-100 28 17 7 10

100 và hơn 8 6 1 3

Đường kính cột mao quản (%)

NămĐường kính (mm)

1970 1980 1990 2000

0,2 và nhỏ hơn 7 10 14 11

0,22-0,25 39 31 27 52

0,26-0,31 3 24 6 -

- 25 -

0,32 4 9 29 21

0,33 và hơn 44 26 24 16

Pha tĩnh của cột mao quản (%)

NămPha lỏng

1970 1980 1990 2000

100% Methylsilicon 16 43 35 21,5

Methyl[phenyl(≤25%)]silicon 4 12 26 49

Methyl[phenyl(>25%)]silicon 8 5 4 4

Methyl[cyanpropul(25%)]silicon - - 6 5,5

Methyl[phenyl(7%),cyanpropyl(7%)]silicon Polyether

- - 6 6

Hydrocacbon 32 25 13 7

Apieson 20 5 - 1

Squalane 20 5 - 1

100% Dicyanalkylsilicon - - 0,7 4

Khác - 5 9 3

Hình 10 - Các pha tĩnh thông dụng

được sắp xếp theo độ phân cực tăng dần

- 26 -

4.2 MÔ TẢ CỘT

Hình 11 cho biết các thông tin cần phải được chỉ rõ khi mua cột

Hình 11 - Thông số kỹ thuật của cột

4.3 LỰA CHỌN CỘT

Đối với một người phân tích chưa có kinh nghiệm cần xây dựng phương phápGC trên mẫu mới không quen thuộc thì việc chọn cột phù hợp nhất từ nhiều cộtsẵn có trong tay có thể là một khâu khó. Tiếp cận cơ bản vào vấn đề này là kếthợp các tính chất của mẫu với tính chất của cột mao quản.

Các câu hỏi quan trọng cần đặt ra cho mẫu là:

• Các thành phần và nhiễu (matrix) của mẫu là gì?

• Dự đoán có bao nhiêu hợp chất cần phân tích trong mẫu?

• Điểm sôi của các hợp chất ra sao?

• Dải điểm sôi của các hợp chất trong mẫu?

• Những nhóm chức gì có trong các hợp chất?

• Nồng độ của các hợp chất cần phân tích khoảng bao nhiêu?

• Có bất kỳ hợp chất nào không bền hóa học hoặc nhiệt không?

Các hệ số khác có thể ảnh hưởng đến việc chọn cột là:

• Yêu cầu phân tích định tính hay định lượng?

• Các cấu tử cần phải được định danh rõ ràng không? Ví dụ có dùng đầu dò

khối phổ không?

- 27 -

• Cần phương pháp lấy mẫu hoặc tiêm đặc biệt không? Ví dụ giải hấp nhiệt,tạo dẫn xuất,...?

Các đặc tính quan trọng của cột cần xem xét là:

• “Giống nhau tách giống nhau”. Ví dụ pha tĩnh phù hợp nhất để tách cáccấu tử phân cực (độ bốc hơi tương tự nhau) là vật liệu phân cực. Luật này

không dễ dàng áp dụng khi khả năng bốc hơi của các cấu tử cũng như độphân cực của chúng khác nhau.

• Khi dùng cột không phân cực, các cấu tử sẽ giải hấp cùng thứ tự như điểmsôi của chúng.

• Cột không phân cực chuẩn (cột mao quản 30m; 0,25mm; 0,25μm) có khảnăng phân giải các cấu tử có điểm sôi khác nhau 2 oC.

• Khả năng tách của cột tăng theo chiều dài cột.

• Khả năng tách tăng khi bề dày phim của pha tĩnh tăng.

• Các cột mao quản rộng hơn có thể chịu được tải mẫu cao hơn và thườngdẫn đến giới hạn phát hiện tốt hơn cho các cấu tử của mẫu.

• Nhiệt độ làm việc cao hoặc khi dùng đầu dò khối phổ, cần phải chọn phatĩnh cột có độ bền nhiệt cao và chảy máu thấp.

Mặc dù có thể chọn cột phù hợp dựa trên các tính chất này, người phân tích vẫncần phải cân nhắc và xem xét thực tế từ các thông tin tham khảo về các phépphân tích của các hợp chất và nhiễu mẫu (matrix) tương tự , ví dụ trong các tạpchí, sách, tài liệu ứng dụng, ...

Sắc ký đồ chuẩn được xuất bản là nguồn thông tin tốt hơn các danh mục tính

chất, các bộ tham số hoặc danh mục dữ liệu, bởi vì chúng giúp người phân tíchcó thể trực quan đánh giá độ hoàn hảo của cột.

Ví dụ khi người phân tích cần phân tích hỗn hợp dư lượng 9 chất thuốc trừ sâuhọ chlor (Lindane, Aldrin, Dielrin, Heptachlor, Endrin, Tran-Chlordan, Cis-

Chlordan, Hexachlorobenzen, DDT) trong tôm. Để lựa chọn một cột thích hợp,chúng ta hãy chú ý dùng loại đầu dò nào để phát hiện các thuốc trừ sâu này.

Giả sử, ta dùng đầu dò ECD hoặc đầu dò MS để phát hiện. Thì yêu cầu đầu tiên

đặt ra là phải chọn được một cột bền nhiệt và khả năng chảy máu cột thấp nhấtđể tín hiệu nhiễu nền thấp nhất đảm bảo phát hiện được ở mức rất thấp cácthuốc trừ sâu. Hỗn hợp thuốc trừ sâu này có nhiệt độ sôi tương đối gần nhau,

- 28 -

vậy cần phải chọn cột mao quản đảm bảo tách hỗn hợp. Điều cốt lõi nữa là cả 9thuốc trừ sâu này đều là chất kém phân cực.

Từ các yêu cầu đặt ra như vậy để phân tích hỗn hợp thuốc trừ sâu này chúng ta

sẽ dùng cột mao quản với pha tĩnh kém phân cực như: methy l/5%

phenylsilicon, methyl/35% phenylsilicon hoặc poly (dimethylsiloxy)

poly(1,4-bis(dimetylsiloxy)phenylene)siloxan. Thực tế, khi dùng đầu dò khốiphổ ta nên chọn cột DB-5ms, DB-35ms nhằm hạn chế quá trong chảy máu cột.

Ngoài ra, chúng ta cũng có thể tham khảo theo các phương pháp chuẩn của mộtsố tổ chức quôc tế uy tín. Ví dụ để phân tích các thuốc trừ sâu họ chlor hữu cơ,phương pháp EPA 8081A của cơ quan bảo vệ môi trường Mỹ dùng cột DB-

5ms, DB-35ms 30 m x 0,25 mm x 0,25 µm. hoặc chúng ta cũng có thể dùng cộtDB-1701 30 m x 0,53 mm x 0,5 µm..

Tương tự khi phân tích dầu diesel chúng ta có thể dùng cột DB-5ms 30 m x0,53

mm x 1,5 µm..

Chú ý: Tất cả các ví dụ trên chỉ mang tính chất tham khảo, không nhằm mụcđích quảng bá cho hãng sản xuất.

Khuyến nghị

Nhà cung ứng cho người phân tích đầy đủ thông tin cần thiết để lựa chọn cột.Các cột được liệt kê theo độ phân cực và có thể so sánh với các cột của các nhà

cung cấp khác . Thông tin thường cho biết các tham số lựa chọn quan trọngnhư độ bền nhiệt, chiều dài cột, bề dày lớp phim và mao quản.

• Các tài liệu giới thiệu (catalogue) thường chứa các sắc đồ ứng dụng chomỗi cột cho biết các loại hợp chất được tách hoặc các phương pháp phântích mà cột phù hợp nhất. Ví dụ các phương pháp được đánh số EPA. Dịchvụ này cũng có thể được bổ sung bằng cách hỏi ý kiến các nhà khoa họcứng dụng và cơ sở dữ liệu của các ứng dụng được cung cấp từ các nhà

cung ứng cột và nhà sản xuất sắc ký khí.

• Tuổi thọ của cột sẽ được nâng cao khi người phân tích chuẩn bị mẫu chocác dịch chiết sạch hơn trước khi tiêm. Tốt nhất là các hợp chất và các tiểuphân gây nhiễu nền, không bốc hơi, phân cực phải được loại bỏ trước khitiêm và hệ thống GC.

• Đừng bao giờ thay cột khi nhiệt độ lò cao hơn nhiệt độ phòng.

- 29 -

• Một cột mao quản ngắn được đặt trước và sau cột chính có thể bảo vệ cộtchính khỏi nhiệt độ cao của đầu dò/buồng tiêm. Ngoài ra, gắn một đoạncột rỗng nằm trước cột sẽ bảo vệ cột rất tốt trong quá trình phân tích mẫuthật thường ngày.

• Luôn bịt kín phần cuối cột mao quản (dùng vách ngăn phụ kèm) trước khicất giữ.

• Sự nhiễm bẩn cột hầu như xảy ra ở vài centimet đầu cột mao quản, ta cóthể cắt bỏ phần này để phục hồi độ hoàn hảo của cột.

• Luôn dùng chì bịt đầu (ferrule) mới khi nối lại cột vào hệ thống.

4.4 THAY THẾ CỘT MAO QUẢN1

4.4.1 Kiểm tra bằng mắt tất cả các khía cạnh của hệ thống

• Làm lạnh tất cả các vùng gia nhiệt và kiểm tra bẫy ẩm và oxy bằng mắt.Thay thế nếu cần thiết.

• Kiểm tra bằng mắt buồng tiêm và các ống bọc ngoài, thay thế nếu bị vỡhoặc bẩn.

• Thay thế các seal tới hạn của buồng tiêm, seal của đầu dò và vách ngăn.

4.4.2 Chuẩn bị cột để cài đặt

• Chọn tốc độ dòng khí bổ trợ và khí đầu dò.

• Cắt mỗi đầu cột khoảng 10 cm.

• Đặt nút và nút bằng chì có kích thước phù hợp vào cả 2 đầu cột.

• Cắt thêm 10 cm nữa ở mỗi đầu cột để loại bỏ các mảnh vỡ của nút chì.

• Đặt cột mao quản vào lò.

4.4.3 Nối cột và xác nhận dòng

• Gắn cột vào đường vào (inlet) theo khoảng cách khuyến cáo của nhà sảnxuất.

• Đặt áp suất đầu cột thích hợp.

1 Trích dẫn từ tài liệu giới thiệu của nhà cung cấp RESTEK 2000

- 30 -

• Đặt dòng khí cho chia dòng, lỗ thông, thổi vách ngăn và bất cứ ứng dụngnào khác.

• Xác nhận chắc chắn có dòng qua cột bằng cách nhúng đầu cột còn lại vào

một lọ nhỏ đựng dung môi.

• Nối cột vào đầu dò theo khoảng cách khuyến cáo của nhà sản xuất .

4.4.4 Kiểm tra rò rỉ

• Dùng đầu dò rò rỉ độ dẫn nhiệt để kiểm tra rò rỉ tại buồng tiêm và đầu dò.

Không dùng bọt xà phòng hoặc các dung dịch để kiểm tra rò rỉ.

• Đặt nhiệt độ buồng tiêm, đầu dò và bật đầu dò.

• Cảnh báo: Nhiệt độ không được đặt vượt quá nhiệt độ tối đa của pha tĩnh!

4.4.5 Cài đặt thời gian chết, hoạt hóa và hiệu chỉnh

• Tiêm một chất không bị giữ lại để cài đặt thời gian chết thích hợp .

• Kiểm tra toàn bộ hệ thống để đảm bảo mũi thể tích chết không kéo đuôi.

• Hoạt hóa cột tại nhiệt độ vận hành tối đa.

• Cảnh báo: Nhiệt độ không được đặt vượt quá nhiệt độ tối đa của pha tĩnh!

• Tiêm một chất không bị giữ lại để kiểm tra xác nhận vận tốc tuyến tínhchính xác (thời gian chết).

• Phân tích hỗn hợp kiểm tra để xác nhận sự cài đặt là phù hợp và độ hoàn

hảo của cột.

• Hiệu chỉnh thiết bị và tiêm mẫu.

• Thao tác dự phòng:

Ngắn hạn (tức thời): Dòng khí mang vào GC tại nhiệt độ 100oC - 150oC

Lâu dài: hơ lửa seal hoặc nút chặt bằng vách ngăn - giữ trong tối .

- 31 -

Chương 5 – CHƯƠNG TRÌNH NHIỆT VÀ LÒ CỘT

Mục tiêu của lò cột là duy trì cột sắc ký tại nhiệt độ cài đặt trong suốt quá trình

phân tích. Có 2 kiểu hoạt động chính:

Đẳng nhiệt: Lò cột được giữ tại một nhiệt độ không đổi trong suốt thời giangiải hấp mẫu.

Không đẳng nhiệt (chương trình nhiệt): Bộ gia nhiệt lò cột có quạt có thể lậptrình cho phép nhiệt độ lò cột được gia tăng hoặc theo bậc ở tốc độ có thể kiểmsoát từng phần hoặc toàn bộ chu trình giải hấp. Các phương pháp dùng chươngtrình nhiệt có thể kết hợp chặt chẽ một vài bước đẳng nhiệt và tăng nhiệt và kỹthuật chương trình nhiệt thường được dùng để đạt độ tách tốt như minh họa ởhình 12.

Hình 12 - Sắc đồ tiêu biểu cho các kiểu nhiệt độ lò cột khác nhau

Các sắc đồ ở hình 12a và 12b minh họa những hạn chế của phép phân tíchđẳng nhiệt khi nhiệt độ quá cao hoặc quá thấp:

Quá thấp: Các mũi xấu và thời gian lưu quá dài.

Quá cao: Độ phân giải kém và các cấu tử có thể bị phân hủy bởi nhiệt.

- 32 -

Sắc đồ thứ 3, hình 12c cho thấy các vấn đề này có thể vượt qua bằng chươngtrình nhiệt như thế nào, tám cấu tử trong hỗn hợp được giải hấp với thời gianthỏa đáng và độ phân giải phù hợp. Tất cả các mũi có dạng tương tự nhau và

cùng khả năng phát hiện.

Vì nhiệt độ ảnh hưởng mạnh tới thời gian lưu và dạng mũi nên tất cả nhiệt độcài đặt phải chính xác và tái hiện được.

Yêu cầu kỹ thuật

Các thông số đặc trưng của thiết bị:

Đối lưu lò quạt.

Dải nhiệt độ có thể kiểm soát từ nhiệt độ phòng lên khoảng 500oC với độchính xác ± 0,5oC.

Tốc độ tăng nhiệt trong dải từ 0,50C/phút tới 300C/phút.

Cài đặt gia nhiệt nhanh khoảng 1800C/phút để dùng với cột hoặc các kỹthuật tiêm đặc biệt.

Khuyến nghị

• Đặt tốc độ dòng tối ưu và nhiệt độ tối ưu cho các chất giải hấp trước rồidùng tăng bậc nhiệt độ (ramp) để giảm thời gian giải hấp và cải tiến hình

dạng của các mũi ra sau.

• Tăng nhiệt độ tới giá trị cao ở cuối chương trình nhiệt để đảm bảo tất cảcác mũi ra sau (do dịch chiết hoặc nền chứa các chất có nhiệt độ sôi cao)được giải hấp trước khi mẫu kế tiếp được tiêm.

• Nhiệt độ cột tối đa phải nằm trong nhiệt độ giới hạn của pha tĩnh và

thường ở khoảng 250C thấp hơn nhiệt độ đầu dò .

- 33 -

Chương 6 - ĐẦU DÒ

Mục đích của đầu dò là để đáp ứng các thành phần mẫu khi chúng giải hấp rakhỏi cột sắc ký . Lối ra của đầu dò phù hợp để có khả năng cho phân tích cảđịnh tính và định lượng. Để đầu dò phù hợp với mục đích sử dụng , nó cần thỏamãn một vài yêu cầu về độ nhạy, tính chọn lọc, độ ổn định, dải động tuyến tính,thể tích tế bào đầu dò và thời gian đáp ứng.

6.1. ĐẦU DÒ ION HÓA NGỌN LỬA (FID)

Đầu dò ion hóa ngọn lửa là đầu dò thường dùng nhất trong các phòng phân

tích, các thành phần cơ bản của nó được minh họa như ở hình 13

Hình 13 - Sơ đồ đầu dò ion hóa ngọn lửa

6.1.1 Nguyên tắc hoạt động

Trong đầu dò ion hóa ngọn lửa, chất giải hấp từ cột (các chất hữu cơ trong dòng

khí mang) đi qua ngọn lửa hyđrô-không khí hoặc hyđrô-oxy và được đốt cháytrong ngọn lửa. Khi một hợp chất hữu cơ chứa nối C-H vào ngọn lửa, nó bị đốtcháy tạo thành những ion tích điện dương cũng như các sản phẩm cháy dioxide

- 34 -

cacbon và nước. Sự phân tán của các ion giữa các điện cực đầu dò gây nên

dòng ngoài rồi được đo và chuyển thành tín hiệu của đầu dò. Nhờ đó cho phép

phát hiện và định lượng được các hợp chất hữu cơ trong dòng khí mang.

6.1.2 Tính chất

Các tính chất của đầu dò FID có thể được tóm tắt như sau:

a) Độ nhạy cao cho hầu hết các hợp chất hữu cơ.

b) Không nhạy với các chất không tinh khiết thường có trong khí mangnhư nước, dioxit cacbon.

c) Thăng giáng nhỏ theo những thay đổi áp suất dòng hoặc nhiệt độ.

d) Dải động tuyến tính rất rộng, gấp 8 lần độ lớn.

e) Đầu dò ít có tín hiệu với các khí vô cơ và sắt (chất oxy hóa, nhiên

liệu và các sản phẩm cháy của ngọn lửa) vì vậy tín hiệu nền của đầudò rất nhỏ và rất ổn định.

Các đặc điểm này làm cho đầu dò FID được xem là đầu dò vạn năng và giảithích tính phổ biến và sử dụng rộng rãi của nó trong lĩnh vực phân tích hữu cơvà phân tích thường ngày trong các phòng thử nghiệm.

6.2 ĐẦU DÒ BẮT GIỮ ĐIỆN TỬ (ECD)

6.2.1 Nguyên tắc hoạt động

Khi dòng các phân tử khí mang qua nguồn phóng xạ nikel (Ni) chúng bị ionhóa thành các điện tử và các ion khí dương. Điện tích dương trên anod làm chođiện tử di chuyển tới trung tâm điện cực sinh ra một dòng, thường được xemnhư là dòng “cố định “, trong mạch ngoài. Khi một hợp chất bắt giữ điện tử vào

đầu dò, các điện tử bị dời đi và mật độ điện tử giữa các điện cực tạm thời bịgiảm. Dòng ngoài tương ứng bị giảm hoặc dòng “cố định“ xuất hiện và hợpchất qua đầu dò được ghi như một mũi âm. Trong thực tế, dòng “cố định” rấtkhó để duy trì bằng điện áp một chiều trên anod và đây là lý do tại sao người tathường dùng điện áp xung .

Hình 14 cho thấy các thành phần cơ bản của đầu dò bắt giữ điện tử:

- 35 -

Hình 14 - Đầu dò bắt giữ điện tử

6.2.2 Tính chất

Đầu dò đặc biệt phù hợp cho nhóm halogen, nitro và các hợp chất cơ kim, trongkhi đó các hợp chất như hydrocacbon, ether và ester hầu như không có tính chấtbắt giữ điện tử. Do đầu dò ECD có khả năng đáp ứng đặc biệt với một số hợpchất như vậy, nên so với FID nó là một đầu dò chọn lọc.

a) Nhạy với các chất nhiễm bẩn trong khí mang, nhất là oxy và nhữngthay đổi trong nhiệt độ cột .

b) Dải tuyến tính kém, thường nằm giữa 2 và 4 lần độ lớn.

c) Độ ổn định ngắn hạn và lâu dài kém hơn đầu dò FID.

d) Có thể phát hiện được các hợp chất trong phân tử chứa nhiềuhalogen ở mức 0,1-10 pg. Cho các hợp chất cacbonyl là 50-250 pg.

Độ nhạy cho các halogen tăng theo thứ tự: I > Br > Cl > F và có

khuynh hướng tăng theo số và vị trí halogen được thay thế trong hợpchất như bảng dưới

- 36 -

ĐÁP ỨNG TƯƠNG ĐỐI TRÊN ĐẦU DÒ ECD

Hợp chất Đáp ứng tương đối so với benzenBenzen 1

acetone 8

Đi-n-butyleter 10

Methyl butyrate 15

1-Butanon 17

1-Clorobutan 17

1,4-Điclorobutan 250

1,1-Điclorobutan 1250

1-Bromobenzen 5x103

1-Iodobutan 2x106

Clorobenzen 1250

Bromobenzen 7500

Cloroform 1x106

CCl4 7x106

Clorotrifluorometan 100

Điclorotrodifluorometan 9x105

Triclorofluorometan 4x107

Bromotrifluorometan 3x106

Đầu dò này rất thuận lợi để phân tích các độc chất môi trường như các hợp chấthalogen bay hơi trong nước và các mẫu chứa PCBs, dioxin và các thuốc trừ sâuhọ clo hữu cơ. Đầu dò bắt giữ điện tử cũng có những ứng dụng trong một sốlĩnh vực khác nhưng người phân tích phải tạo dẫn suất để dễ dàng phân tích

hợp chất. Tạo dẫn suất halogen có thể nâng cao khả năng phát hiện cho hợpchất khi dùng GC-ECD để phân tích và đôi khi đồng thời tăng độ chọn lọc phântích hợp chất.

6.3 ĐẦU DÒ KHỐI PHỔ (MS)

Quang phổ khối lượng độ phân giải cao là một kỹ thuật thiết yếu và rất mạnhtrong hóa học phân tích, nó đã được dùng trong 4 thập niên qua. Đối với các

- 37 -

phép phân tích hữu cơ, thiết bị thường được kết nối với sắc ký khí. Chỉ qua việcphát triển các thiết bị hàng đầu dựa trên bẫy ion mà các khối phổ kế nhỏ mới,độ phân giải thấp đã trở nên như một đầu dò dùng cho sắc ký khí.

6.3.1 Nguyên tắc hoạt động

Hình 15 cho thấy cấu hình cơ bản của đầu dò bẫy ion . Hình vẽ minh họa cácquá trình chung cho tất cả các máy quang phổ khối lượng.

Nguyên tắc chung là mẫu được ion hóa tạo thành ion. Sau đó, ion có cùng giátrị m/z được tách và đi đến bộ ghi chuyển thành tín hiệu dưới dạng độ giàu củaion theo m/z. Như vậy, ứng tại một thời điểm cố định ta sẽ thu được một mũichứa nhiều ion có m/z khác nhau và mũi này tạo nên phổ toàn ion (TIC) trong

quang phổ khối lượng.

Hình 15- Sơ đồ đầu dò bẫy ion

- 38 -

6.3.2 Giao diện

Giao diện kết nối cuối cột sắc ký (hoạt động ở áp suất thường) với quang phổkhối lượng (hoạt động ở chân không cao). Các phân tử khí mang được tách bởigiao diện sao cho chủ yếu chỉ các phân tử cần chất phân tích vào quang phổ kếkhối lượng.

6.3.3 Ion hóa và tách

Khi các phân tử chất tan vào bẫy, dây tóc (filament) được bật tạo dòng điện tửnăng lượng cao ion hóa các phân tử chất tan. Năng lượng của các điện tử đượckiểm soát bởi chùm điện tử năng lượng cao 70eV tạo thành các ion (thường làcác ion dương M+) theo phương trình tổng quát:

Sự ion hóa chỉ cần năng lượng khoảng 20 eV. Do đó, năng lượng dư tiếp tụctruyền cho ion phân tử M+* gây nên sự phân mảnh cho tới khi năng lượng cungcấp vào tiêu tốn hết như trong sơ đồ sau:

Tùy theo kỹ thuật ion hóa, chất cần phân tích phân mảnh theo các kiểu mẫu cóthể dự đoán được.

Kích thước và độ giàu của các mảnh ion này đặc trưng cho chất phân tích vào

bẫy và cho phổ đồ khối lượng đặc trưng.

M + e- M+* + 2e-

M+* B+

A+

C+

D+

E+

F+

G+

H+

- 39 -

Ban đầu các ion được giữ trong bẫy bằng cách áp vào các điện cực trong bẫymột điện áp có tần số vô tuyến tương ứng gọi là tần số lưu. Trong suốt giaiđoạn tách, trường này được tăng bậc nhanh chóng. Gia tăng trường làm cho các

ion trở nên không ổn định và được đẩy nhanh ra khỏi bẫy theo tỷ lệ điện tíchtheo khối lượng của chúng (lưu ý là các ion nhẹ hơn được đẩy ra đầu tiên).

6.3.4 Một số kỹ thuật ion hóa thông dụng trong sắc ký khí ghép khối phổ

a) Kỹ thuật ion hóa điện tử (EI): Phân mảnh trực tiếp, dùng chùm điệntử năng lượng cao 70 eV bắn phá phân tử hợp chất thành các mảnhion. Kỹ thuật này th­ êng cho mảnh ion phân tử rất thấp hoặc khôngxuất hiện trên phổ đồ .

b) Kỹ thuật ion hóa hóa học dương (PCI): Ngoài phân tử chất cần phântích ta thêm vào một khí thử ví dụ như CH4, NH3,...Trong kỹ thuậtPCI, đầu tiên khí thử bị ion hóa tạo thành ion khí thử rồi ion khí thửđã được ion hóa phản ứng hóa học với các phân tử mẫu như là cácchất nhận proton để tạo thành ion mẫu. Sự tạo thành ion trong PCI

nhẹ nhàng hơn trong EI, sinh ra ít sự phân mảnh hơn. Phản ứng này

thường cho ra ion phân tử có độ giàu cao và do đó PCI thường đượcdùng để xác định trọng lượng phân tử của các mẫu.

Có 4 quá trình ion hóa cơ bản có thể xảy ra trong kỹ thuật ion hóa học dươngvới nguồn ion ở áp suất từ 0.8 - 2.0 torr là:

• Chuyển proton (Proton Transfer)

• Tách hydride (Hydride Abstraction)

• Cộng thêm (Addition)

• Trao đổi điện tích (Charge Exchange)

c) Kỹ thuật ion hóa hóa học âm (NCI): Trong kỹ thuật NCI, khí thửthường được xem như là khí đệm. Khi khí thử bị bắn phá bởi điện tửnăng lượng cao, phản ứng sau đây xảy ra:

Khí thử + e-(230eV) Ion khí thử + e-

(nhiệt)

Nếu khí thử là CH4 thì xảy ra phản ứng:

CH4 + e-(230eV) CH4

+ + 2e-(nhiệt)

Điện tử nhiệt có mức năng lượng thấp hơn điện tử phát ra ban đầu nên chính

các điện tử nhiệt này sẽ phản ứng với phân tử mẫu.

- 40 -

Trong kỹ thuật NCI, có 4 cơ chế phản ứng thông dụng nhất là:

• Bắt giữ điện tử (Electron Capture: EC)

• Bắt giữ điện tử phân mảnh (Dissociative Electron Capture: DEC)

• Hình thành cặp ion (Ion Pair Formation)

• Phản ứng ion phân tử (Ion-molecule Reactions)

6.3.5 Phát hiện

Đầu dò dạng phễu gom các ion khi chúng ra khỏi bẫy. Khi các ion dương vađập với đầu dò, các điện tử được phóng thích trên bề mặt bao phủ các hợp chất.Các điện tử này khiến cho ngày càng nhiều các điện tử được tạo ra theo chiềudài của đầu dò. Hiệu ứng tầng này khiến cho tín hiệu được khuếch đại cao tạiđầu ra của đầu dò. Sự ion hóa, thời gian tăng bậc và lưu giữ có thể được tối ưuvà được kiểm soát bởi bộ xử lý quang phổ khối lượng trung tâm. Tổng thờigian thực hiện tất cả các giai đoạn này (thời gian quét) thường là 10 mili giây,

có nghĩa là trong thời gian dải chất phân tích giải hấp ra khỏi cột, quá trình quét

có thể được lập lại nhiều lần. Sắc đồ có được bằng cách vẽ tín hiệu tổng ion chomỗi làn quét theo thời gian giải hấp. Sắc đồ tổng ion này hầu như không thểphân biệt với vết FID của cùng một mẫu. Máy quang phổ khối lượng có thểhiển thị phổ ion cho mỗi điểm quét trong sắc đồ. Hình 16a cho thấy sắc đồ tổngion của một mẫu và hình 16b là phổ khối cho điểm quét ở đầu của mũi được vẽđậm trong hình 16a

6.3.6 Tính chất

Máy quang phổ khối lượng cung cấp nhiều đặc điểm thuận lợi có thể đượcdùng để định danh và định lượng một chất phân tích.

a) Đầu dò là loại vạn năng và có thể phát hiện dải hợp chất lớn hơn FID.

b) Trong kiểu theo dõi tổng ion, đầu dò có độ nhạy tương đương như FID.Khi dùng kiểu theo dõi ion đơn (SIM), giới hạn phát hiện có thể đượcgiảm thấp nhiều lần.

c) Dải động học thấp hơn FID. Ví dụ một vài đầu dò bẫy ion có dải động họcthấp hơn FID 3 đến 4 lần. Tuy nhiên, người phân tích có thể phân tíchđược ở khoảng nồng độ rất rộng khi dùng các ion để định lượng có độnhạy khác nhau.

- 41 -

Hình 16 - Phân tích phổ khối lượng

d) Dùng đầu dò khối phổ có thể xác định trọng lượng phân tử của một hợpchất. Đây là một ưu điểm rất quan trọng của đầu dò khối phổ đặc biệttrong lĩnh vực định danh cấu trúc các hợp chất mới.

e) Một hợp chất có thể được định danh từ chính phổ khối của nó.

6.3.7 Theo dõi ion được chọn (SIM)

Thay vì quét toàn dải khối lượng phân tử hợp chất cần nghiên cứu, thường nằmtrong khoảng 40 tới 650 a.m.u. (đơn vị khối lượng nguyên tử) hoặc hơn, ngườiphân tích có thể lập trình thông qua phần mềm máy tính cho thiết bị để quétphát hiện khối lượng của một số các ion hoặc một dải rất hẹp các khối lượngion. Thường người ta chọn khối lượng của các ion giàu nhất (cường độ mạnhnhất) hoặc đặc trưng nhất cho chất cần phân tích, bằng cách này ta có sắc đồchứa chỉ một số ion đặc trưng của hợp chất đó. Lúc này, tỷ lệ tín hiệu trên

nhiễu nền (S/N ) của mũi hợp chất được tăng rất cao, làm cho giới hạn pháthiện hợp chất đó thấp hơn nhiều (đây là một kỹ thuật dùng để giảm giới hạnphát hiện cho một hợp chất và được gọi là kỹ thuật theo dõi ion được chọn,

- 42 -

SIM). Ngoài ra, khi dùng kỹ thuật SIM ta còn có một ưu điểm rất lớn khi địnhlượng.

Ví dụ, khi phân tích Trichlorfon trong tôm bằng sắc ký khí khối phổ dùng kỹthuật ion hóa điện tử, người phân tích có thể SIM bắt 4 ion là: 79, 109, 145,

185. Ion 109 cho độ giàu cao nhất thường được dùng để định lượng ở nồng độthấp. Vậy nếu thực tế bắt gặp một mẫu chứa hàm lượng Trichlorfon ở mức caolọt ngoài đường chuẩn khi dùng ion 109 định lượng bằng phương pháp đườngchuẩn, người phân tích có thể dùng một trong 4 ion còn lại có cường độ kémnhạy hơn để định lượng đảm bảo kết quả phân tích lọt vào dải tuyến tính củađường chuẩn mà không phải pha loãng mẫu.

Ngoài ra, thực tế khi bắt gặp một mẫu cho mũi ion cản trở tại 109 thì ta có thểdùng ion khác (145 hoặc 185) để định lượng. Đây là ưu điểm nổi bật của đầudò khối phổ so với các đầu dò khác.

Đặc biệt khi người phân tích cần phải khẳng định dư lượng của một hợp chất ởmức siêu vết trong các nhiễu nền phức tạp. Nghĩa là cần phải xác định có mặthay không có mặt hợp chất một cách rõ ràng, thì khối phổ là một đầu dò đặcbiệt phù hợp. Ví dụ trong một số tiêu chuẩn kiểm soát như chỉ thị cộng đồngChâu Âu 2002/657/EC, qui định bắt buộc phải dùng khối phổ để phân tíchkhẳng định dư lượng các chất bị cấm tuyệt đối trong thực phẩm làm thức ăncho người.

6.3.8 Nhận danh mũi trọng lượng phân tử

Đối với nhiều hợp chất, bị phân mảnh giới hạn trong máy khối phổ, ion phân tửcó thể được định danh trong phổ đồ. Ion phân tử thường là ion có khối lượngcao nhất trong phổ đồ. Biết được trọng lượng phân tử cũng như tính chất sắc kýcủa hợp chất có thể đi đến nhận danh nó, dự đoán một số công thức thựcnghiệm có thể về hợp chất được giảm đáng kể và đây là nguồn thông tin rất bổích khi định danh một hợp chất chưa biết. Các thiết bị hàng đầu thường có bộphân giải khối lượng qua toàn dải trọng lượng phân tử, có nghĩa là trọng lượngcủa các hợp chất lớn hơn có thể được ấn định chính xác hơn các hợp chất nhỏ.Đối với các hợp chất bị mất ion phân tử trong phổ đồ, ta phải dùng các kỹ thuậtion hóa mềm hơn (ví dụ kỹ thuật ion hóa hóa học trong sắc ký khí, kỹ thuật ionhóa phun điện tử trong sắc ký lỏng) để có thể dễ dàng xác định trọng lượngphân tử của nó.

- 43 -

6.3.9 Phổ đồ khối lượng

Phổ khối (phổ phân mảnh ion) cho mỗi mũi sắc ký có thể được so sánh với phổchuẩn để định danh một hợp chất. Ngay cả những máy khối phổ hàng đầu đơngiản cũng được trang bị với thư viện phổ chuẩn, thường chứa hơn 40 000 phổchuẩn của các hợp chất. Phổ của một hợp chất chưa biết có thể được tìm trong

thư viện và phổ đáp ứng phù hợp nhất cho hợp chất được đưa ra. Người tathường dùng hệ thống tính điểm để tính mức độ phù hợp nhất của hợp chấtchưa biết với phổ chuẩn tìm được trong thư viện. Các nhà phân tích giàu kinh

nghiệm và có kiến thức vững về hóa học cũng có thể giải các kiểu phân mảnhđể định danh đơn vị cấu trúc và các nhóm chức có trong hợp chất. Nếu kết hợpthông tin này với các kỹ thuật phổ khác như IR, NMR, UV-VIS, nhà phân tích

có thể xây dựng được một cấu trúc phân tử đầy đủ và định danh hợp chất.

6.4 ĐẦU DÒ DẪN NHIỆT (TCD)

6.4.1 Nguyên tắc hoạt động

Đầu dò dẫn nhiệt gồm hai cell (ngăn) được kiểm soát nhiệt độ bằng một bộ gianhiệt (hình 17). Khí mang từ cột đi qua cell mẫu; cell tham chiếu được cungcấp với cùng loại và cùng dòng khí đi qua cột. Thông thường mỗi cell của đầudò TCD đều có chứa 1 dây tóc (filament) được nối ở bên trong và mỗi bên

được áp một dòng điện được kiểm soát giống nhau. Khi cường độ dòng điện và

tốc độ dòng khí đi qua dây tóc được giữ không đổi thì mỗi dây tóc thiết lập mộtcân bằng nhiệt. Vậy nếu các hợp chất đi qua cell mẫu, nhiệt độ của dây tóctrong cell mẫu sẽ bị thay đổi làm phá vỡ cân bằng nhiệt. Rồi những thay đổinhiệt độ trong cell mẫu được so sánh với nhiệt độ trong cell tham chiếu và khác

biệt nhiệt độ được chuyển thành tín hiệu điện. Tín hiệu điện này được xử lý bởimột bộ ghi chuyển thành một mũi tương ứng trong sắc ký đồ. Tại một thờiđiểm, nếu lượng lớn hợp chất được giải hấp ra khỏi cột sẽ tạo nên khác biệtnhiều về nhiệt độ và cho ra tín hiệu điện lớn hơn tương ứng với mũi trên sắc đồlớn hơn.

- 44 -

Hình 17 - Cấu tạo đầu dò dẫn nhiệt

6.4.2 Tính chất

Các tính chất của đầu dò dẫn nhiệt có thể được tóm tắt như sau:

a) Cho tín hiệu tốt với các hyđrô cacbon có từ 1 đến 3 cacbon.

b) Độ nhạy kém hơn đầu dò FID khoảng từ 10-100 lần. Lượng hợp chất cóthể phát hiện nhỏ nhất khoảng 5-50 ng.

c) Độ nhạy của đầu dò TCD phụ thuộc rất lớn vào sự khác biệt nhiệt độ giữacell mẫu và cell tham chiếu nên tốc độ dòng khí mang và khí bổ trợ thấpsẽ tăng độ nhạy. Tức là phụ thuộc rất lớn vào khả năng dẫn nhiệt của khímang. Người ta thường dùng các khí có độ dẫn nhiệt tốt như H2, He làm

khí mang và khí bổ trợ. Trong trường hợp đặc biệt khi phân tích H2 hoặcHe thì ta dùng N2 làm khí mang và khí bổ trợ mặc dù N2 cho độ nhạy kémhơn He.

d) Dải tuyến tính cho hầu hết các đầu dò TCD ở khoảng 105.

e) TCD cho tín hiệu với các hợp chất mà đầu dò FID không phát hiện đượcnhư: H2O, CO2, CO, một số hợp chất sunfua (H2S, SO2, CS2, COS,...), các

oxit nitơ (NO, NO2, N2O, N2O2) và các khí trơ (H2, N2, He, Ar, Xe,...)

f) TCD có thể được dùng tốt hơn đầu dò chọn lọc như đầu dò quang hóa

ngọn lửa (FPD) khi định lượng các hợp chất chứa sunfua. Mặc dù TCD

- 45 -

cho độ nhạy kém hơn FPD nhưng lại cho dải tuyến tính dài hơn thuận lợikhi định lượng ở một dải nồng độ rộng.

Các đặc điểm này làm cho đầu dò TCD được xem là đầu dò vạn năng đượcdùng cho các hợp chất không thể phân tích với đầu dò FID.

6.5 ĐẦU DÒ QUANG HÓA NGỌN LỬA (FPD)

6.5.1 Nguyên tắc hoạt động

Dựa vào sự phát xạ cực đại các tia sáng đặc trưng cho lưu huỳnh (λ = 394 nm)

và Phốtpho (λ = 526 nm) với các hợp chất chứa hai nguyên tố này trong phân

tử. Khi các hợp chất trong phân tử có chứa lưu huỳnh hoặc phốtpho được đốtcháy trong ngọn lửa, chúng sẽ tạo thành S2 hoặc HPO. Trong điều kiện ngọnlửa, S2 cho phát xạ cực đại quanh vùng 394 nm và HPO phát xạ quanh 526 nm.Các bước sóng phát xạ cực đại tương ứng của lưu huỳnh và phốtpho được đobằng một ống nhân quang, chuyển qua tín hiệu điện và được xử lý thành mũitương ứng trên sắc ký đồ. (xem hình 18)

6.5.2 Tính chất

Các tính chất của đầu dò quang hóa ngọn lửa có thể được tóm tắt như sau:

a) FPD là một đầu dò chọn lọc cho lưu huỳnh và phốtpho. Như vậy nó chọnlọc với các hợp chất trong phân tử có chứa lưu huỳnh và phốtpho.

b) Độ chọn lọc của FPD cho lưu huỳnh và phốtpho trên các hyđrô cacbon từkhoảng 104-105.

c) Độ chọn lọc cho phốtpho trên lưu huỳnh khoảng 5-10 do đó ta có thể pháthiện nồng độ cao của các hợp chất chứa lưu huỳnh ở chế độ phốtpho.

d) Độ chọn lọc của lưu huỳnh trên phốtpho là 103-104 do đó không có sự cảntrở của các hợp chất chứa phốtpho khi phân tích ở chế độ lưu huỳnh.

e) Lượng phát hiện nhỏ nhất cho các hợp chất chứa lưu huỳnh là 10-100 ng

và 1-10 pg cho các hợp chất chứa phốtpho.

f) Ở nhiệt độ thấp hơn, độ chọn lọc của đầu dò tăng song nguy cơ nhiễm bẩnđầu dò cao.

g) Độ nhạy của đầu dò bị ảnh hưởng bởi tốc độ dòng khí hyđrô, không khíhoặc dòng khí bổ trợ.

- 46 -

h) Khoảng tuyến tính của FPD cho phốtpho là 103-105. Tín hiệu của FPD cholưu huỳnh thường không tuyến tính, một số tác giả báo cáo dải tuyến tính102-103 song tín hiệu bị lệ thuộc rất lớn vào các điều kiện vận hành, kiểuđầu dò và hợp chất cụ thể.

Các đặc điểm này làm cho đầu dò FPD được xem là đầu dò rất chọn lọc khiphân tích các hợp chất trong phân tử có chứa lưu huỳnh và phốtpho. FPD đượcdùng khi yêu cầu phân tích ở hàm lượng rất nhỏ các hợp chất có chứa lưuhuỳnh và phốtpho.

Hình 18 - Cấu tạo đầu dò quang hóa ngọn lửa

- 47 -

6.6 ĐẦU DÒ NITƠ-PHỐTPHO (NPD)

Hình 19 - Cấu tạo đầu dò Nitơ - Phốtpho

6.6.1 Nguyên tắc hoạt động

Dựa vào một dòng nhỏ sinh ra bởi sự di chuyển của các ion đặc biệt từ plasmađến một bộ góp tích điện, các ion này được sinh ra do các hợp chất trong phântử có chứa nitơ hoặc phốtpho phản ứng ở lớp viền khí xung quanh bề mặt birubidium. Sau đó, dòng điện này được đo và chuyển thành tín hiệu của đầu dò.

Trong đầu dò NPD, bộ góp và vòi phun được áp một thế. Bi rubidium được ápmột dòng điện để nung nóng từ khoảng 600oC-800oC tạo nên một plasma.Vùng plasma này được nuôi bởi dòng hyđrô và không khí, tốc độ dòng khí

hyđrô khoảng 2-6 mL/phút và với không khí khoảng 60-200 mL/phút.

6.6.2 Tính chất

Các tính chất của đầu dò nitơ-phốtpho có thể được tóm tắt như sau:

a) NPD bị ảnh hưởng rất lớn bởi nhiệt độ, nên NPD thường được vận hành ởkhoảng 275 oC-325 oC.

- 48 -

b) Độ chọn lọc của NPD cho nitơ trên cacbon là 103-105 và cho phốtpho trên

cacbon là 104-105,5.

c) Có thể phát hiện các hợp chất chứa phốtpho ở mức 0,1-5 pg và 0,5-1 pg

cho các hợp chất chứa nitơ.

d) Độ nhạy phụ thuộc chủ yếu vào cấu trúc của hợp chất, tốc độ dòng khí và

nhiệt độ của đầu dò.

e) Dải tuyến tính của đầu dò NPD khoảng 104-105. Dải này phụ thuộc vào

hợp chất được phân tích, dòng khí và nhiệt độ đầu dò.

f) Đối với các hợp chất trong phân tử có chứa nitơ và phốpho, độ nhạy củaNPD gấp FID khoảng 10 000 lần.

g) Một tính chất nữa là không tạo thành ngọn lửa trong đầu dò NPD, do đóquá trình ion hóa hyđrô cacbon không xảy ra như trong đầu dò FID. VậyNPD rất chọn lọc cho các hợp chất có chứa nitơ hoặc phốtpho nhưng chotín hiệu rất kém với các hợp chất khác như hyđrô cacbon.

- 49 -

Chương 7 – XỬ LÝ DỮ LIỆU

Khả năng xử lý dữ liệu của thiết bị hiện đại đã được cách mạng hóa với sự pháttriển mạnh chuyên sâu và/hoặc kết mạng hệ thống máy tính (PCs). Hiện nay,các hệ thống này thực hiện, xử lý và báo cáo dữ liệu một cách tự động theo cáccài đặt của người phân tích, lưu giữ các phương pháp GC và các bảng tập tincủa bộ tiêm mẫu tự động.

Sơ đồ ở hình 20 cho thấy các bước trong quá trình xử lý dữ liệu:

Hình 20 - Sơ đồ hệ thống xử lý dữ liệu

Tín hiệu tương tự từ đầu dò được chuyển thành tín hiệu số bằng bộ biến đổi ADvà tín hiệu số tương đương của sắc đồ được lưu như một tập tin dữ liệu thô.Người phân tích nhập thông tin cho đợt phân tích như kích thước mẫu; hệ sốpha loãng; nồng độ chuẩn và các tham số xử lý dữ liệu vào máy tính. Phầnmềm xử lý nhận danh các mũi cấu tử và xác định diện tích hoặc chiều cao mũi.Thông tin từ mẫu và chuẩn được dùng để tính nồng độ của chất cần phân tíchvà kết quả được báo cáo dưới định dạng phù hợp nhất.

Ví dụ dưới đây (hình 21) cho thấy tầm quan trọng của việc dùng các tham sốxử lý dữ liệu phù hợp nhất:

- 50 -

Hình 21- Các phương pháp tính tích phân diện tích

Trong mỗi sắc đồ ở hình 21, phần diện tích được tô đậm chỉ mũi của chất cầnphân tích và phần diện tích không tô đậm chỉ nhiễu nền. Rõ ràng 3 phươngpháp lấy tích phân khác nhau cho diện tích mũi khác nhau và nồng độ chất cầnphân tích khác nhau trong mẫu. Tuy nhiên, trong phần mềm xử lý tinh vi, diệntích mũi được phóng to lên và luôn dựa vào các giả định toán học và các phép

tính gần đúng mà nó có thể đưa các sai số vào kết quả cuối cùng.

Người phân tích cần phải làm quen với việc sử dụng phần mềm xử lý dữ liệu và

phần cứng để có thể đảm bảo rằng các kết quả được tính chính xác và các báo

cáo đáp ứng các yêu cầu của phòng thử nghiệm và khách hàng.

Với phần mềm cập nhật mới nhất, có một nhật ký dữ liệu theo dõi các tham sốdụng cụ quan trọng trong đợt phân tích và ghi lại bất cứ những thay đổi nào mà

người phân tích đưa vào phương pháp . Nếu phần mềm không có nhật ký này,

người phân tích nên lưu lại các thông tin vào sổ công tác hoặc nhật ký thiết bị.Các bản sao của các chuẩn hiệu chuẩn thiết bị, sắc đồ, dữ liệu trung gian cũngnhư các báo cáo cuối cùng nên được in ra để lưu lại nếu các thông tin này

không thể được lưu giữ bằng điện tử.

Khuyến nghị

• Các phép tính dựa trên diện tích mũi thường chính xác hơn cách tính theochiều cao bởi vì nó cho phép thay đổi thời gian lưu và hình dạng mũi.

• Người phân tích nên cố gắng để có độ phân giải sắc ký tốt nhất và không

nên ỷ lại vào phần mềm xử lý dữ liệu để xác định diện tích mũi của cáccấu tử không được tách rời nhau.

- 51 -

• Kiểm tra ít nhất một trong những phép tính để xác định nồng độ của chấtcần phân tích trong mẫu bằng cách dùng máy tính bỏ túi hoặc bảng tínhtrong máy tính (ví dụ excell).

• Kiểm tra xem các kết quả từ phần mềm xử lý dữ liệu có phù hợp với giátrị trước đây không (tức là không bị quá khác biệt). Dùng các tập tin dữliệu và kết quả đạt được hoặc dữ liệu QC làm rõ ràng mục đích này.

• Ghi lại bất kỳ những thay đổi nào đối với các tham số xử lý dữ liệu và

lưu trữ các phiên bản ban đầu của phần mềm.

- 52 -

Chương 8 – CÁC PHÉP KIỂM TRA

HIỆU CHUẨN VÀ CHUẨN

Ngày nay, thông thường người phân tích được cung cấp một qui trình phân tích

chuẩn (SOP), quy định chi tiết đầy đủ về phương pháp được dùng cho một chấtcần phân tích và matrix nào đó. Phương pháp sắc ký cũng thường được xâydựng trước và chỉ cần gọi ra để sử dụng từ cơ sở dữ liệu các phương pháp đượclưu giữ trong máy tính. Mặc dù có những thuận lợi này, người phân tích vẫnđược khuyên rằng yếu tố cốt lõi là các thành phần của hệ thống GC đang vậnhành chính xác, các tham số sắc ký được cài đặt thích hợp và được hiệu chuẩntrước khi phân tích.

8.1. KIỂM TRA ĐẦU DÒ VÀ HIỆU CHUẨN ĐẦU DÒ

Với các đầu dò như bắt giữ điện tử và khối phổ, thì việc kiểm tra dòng khí

mang tinh khiết và thiết bị không rò rỉ không khí là rất cần thiết. Rò rỉ có thểđược nhìn thấy thông qua độ lớn dòng cố định của đầu dò ECD, trong khi đóđầu dò khối phổ thường có một thiết bị để kiểm tra theo dõi và xác định hàm

lượng oxy và nước trong khí mang và khí bổ trợ. Đầu dò khối phổ phải đượcđiều chỉnh và hiệu chuẩn trước khi dùng như một đầu dò để phân tích. Thườngngười ta để sẵn một hợp chất hiệu chuẩn tinh khiết trong thiết bị để thực hiệnmục đích này. Điều chỉnh làm cho các tham số đầu dò được tối ưu và khốilượng ion được hiệu chuẩn ở nhiều điểm trên toàn dải khối khoảng từ 30 đến650 a.m.u. Ví dụ khi phân tích ở kiểu ion hóa điện tử người ta dùng chuẩn hiệuchuẩn máy là PFTBA (Perfluorotribytlamine) ứng với các ion có m/z là 69,

100, 139, 219 và 502 hoặc DFTPP (Bis(pentafluorophenyl)phenyl phosphine)với ion m/z là 51, 127, 198, 442.

8.2 CHUẨN HÓA

8.2.1 Chuẩn kiểm tra hệ thống

Để thực hiện một phép phân tích nào đó dễ dàng thì cột, thiết bị lấy mẫu, buồngtiêm hoặc đầu dò được thay đổi bằng cách chạy chuẩn đơn hoặc chuẩn có thành

phần đơn để kiểm tra nhanh hệ thống sắc ký mới cài đặt. Ví dụ nhà sản xuấtdùng dung dịch hexachlorobenzene loãng hoặc phần hơi loãng của methylene

- 53 -

chloride để kiểm tra độ hoàn hảo của hệ thống sắc ký khí khi dùng đầu dò bắtgiữ điện tử . Bằng cách tiếp cận này chúng ta có thể tìm ra được những vấn đềmà chương trình chính có thể phải tốn nhiều giờ để tìm ra. Nếu chuẩn kiểmtra được theo dõi thường xuyên và được lưu lại, độ hoàn hảo của hệ thống cóthể dễ dàng được so sánh với tình trạng trước

8.2.2 Chuẩn hiệu chuẩn cột

Dung dịch chuẩn đa thành phần (chứa nhiều cấu tử) thường nhận được khimua một cột mới . Trước khi gửi cột đi, nhà cung cấp cũng cung cấp sắc ký đồchuẩn chạy cho các chuẩn trên cột đó. Dung dịch chuẩn này chứa một số cáchợp chất chọn lọc nhằm giúp chứng minh độ hoàn hảo của cột tương ứng vớicác loại chất phân tích riêng như: acid lewis, hợp chất phân cực, acid và bazơ,các hợp chất tạo liên kết hyđro,... Dung dịch chuẩn cũng có thể được dùng đểxác định độ phân giải của cột, số đĩa lý thuyết hoặc theo dõi sự hủy hoại cộttheo thời gian.

8.2.3 Phương pháp ngoại chuẩn (đường chuẩn)

Các chất ngoại chuẩn, như hàm ý tên của nó, là các vật liệu được phân tích kèm

theo mỗi đợt phân tích mẫu. Chúng được dùng để định danh và định lượng cácchất phân tích đang được xác định. Các dung dịch chuẩn dùng để dựng đườngchuẩn thường gồm một dãy các dung dịch chứa các nồng độ chất phân tíchquan tâm. Đối với mỗi cấu tử, hệ số nhạy (tín hiệu tương ứng trên đơn vị nồngđộ) được tính từ đường chuẩn. Rồi đường chuẩn này được dùng để xác địnhnồng độ của chất cần phân tích có trong mẫu. Dãy của các chất chuẩn dùng đểhiệu chuẩn phải luôn chứa đựng nồng độ của chất cần phân tích trong mẫu.

8.2.4 Phương pháp nội chuẩn

Mục đích của phương pháp nội chuẩn là khắc phục bất kỳ vấn đề có thể gây saisố bởi kỹ thuật tiêm khi phân tích bằng GC. Ví dụ khác nhau trong thể tích mẫuđược tiêm và các đặc tính nhiệt của buồng tiêm.

Hệ số đáp ứng của đầu dò (Rfactor) cho chất phân tích được so sánh với hệ sốđáp ứng tương ứng cho nồng độ của chất nội chuẩn phải được xác định. Hàm

lượng được biết trước (thể tích và nồng độ) của chất nội chuẩn được thêm vào

dung dịch chuẩn để cho một dung dịch có nồng độ của chất phân tích và chấtnội chuẩn gần bằng nhau. Dung dịch này được tiêm vào sắc ký khí và sắc đồđược cho như hình 22.

- 54 -

Hình 22 - Sắc ký đồ dung dịch chuẩn

Diện tích của các mũi được đo và hệ số đáp ứng đầu dò được tính (diện tích

mũi chuẩn/diện tích mũi nội chuẩn).

Ví dụ đối với một mẫu, hàm lượng được biết trước (là thể tích và nồng độ)của chất nội chuẩn được thêm trước khi phân tích và tiêm vào cột GC.

Hình 23 - Sắc ký đồ mẫu

Sau đó, hàm lượng chất phân tích có trong mẫu (Qmẫu) được tính theo phươngtrình sau:

- 55 -

Phương trình 6

Qs = (QIS × AS) / ( AIS × Rfactor)

Trong đó:

QIS: hàm lượng chất nội chuẩn được thêm vào mẫu

AIS: diện tích mũi chất nội chuẩn trong sắc ký đồ mẫu

AS: diện tích mũi chất phân tích trong sắc ký đồ mẫu

Rfactor: hệ số đáp ứng của đầu dò

Kỹ thuật này hữu dụng cho các phép phân tích đơn giản hơn khi thỏa mãn các

yêu cầu sau:

• Diện tích mũi chất phân tích và chất nội chuẩn trong sắc đồ mẫu và

sắc đồ chuẩn có độ lớn giống nhau.

• Chất phân tích có tính chất nhiệt và tín hiệu đáp ứng của đầu dò

giống nhau.

• Đầu dò có dải động tuyến tính rộng, ví dụ đầu dò FID.

Đối với các phép phân tích phức tạp hơn, các yêu cầu này thường không đượcđáp ứng. Trong trường hợp này độ chính xác và độ chụm (ở giai đoạn phân tích

cuối) đạt được bằng cách dùng phương pháp ngoại chuẩn (nhiều dung dịch trảidài dải nồng độ) để dễ dàng định lượng các chất phân tích trong mẫu. Có thểvẫn có những ưu điểm khi thêm chất chuẩn nội vào tất cả các dung dịch chuẩn(đó là cùng lượng chất nội chuẩn vào mỗi dung dịch) bởi vì diện tích mũi củanó trong sắc đồ có thể được dùng để hiệu chỉnh sự khác nhau thể tích tiêm

trong mỗi lần tiêm. Trong trường hợp này chất nội chuẩn được xem như là chất“hiệu chuẩn kim tiêm” hoặc “ chất thêm kim tiêm”.

Các chất nội chuẩn cũng có thể được thêm vào mẫu khi bắt đầu qui trình phân

tích, đó là trước giai đoạn chiết, làm sạch, tách, tạo dẫn xuất hoặc làm giàu. Kỹthuật này càng tốt nếu chất nội chuẩn càng giống chất cần phân tích , nhằm đểcải tiến độ chính xác (hàm ý độ đúng và độ chụm) của phép phân tích bằngcách bù bất cứ mất mát nào của chất cần phân tích xảy ra trong qui trình chuẩnbị mẫu. Tuy nhiên nhà phân tích rất khó để tìm được chất nội chuẩn thích hợpcó tính chất hóa lý giống cho tất cả các chất đang cần được xác định.

Một dạng chuẩn hóa mà hiện đang ngày trở nên quan trọng là sử dụng các chấtnội chuẩn đánh dấu đồng vị. Phương pháp này yêu cầu dùng trong đầu dò khối

- 56 -

phổ để có khả năng giải quyết các khối lượng khác nhau rất ít cho các ion đặctrưng giữa chất không được đánh dấu, chất tự nhiên sẵn có trong mẫu và chấtđồng vị đánh dấu. Trong hầu hết các trường hợp các hợp chất này có cùng thờigian lưu.

Nồng độ của hợp chất đánh dấu biết trước được thêm vào giai đoạn đầu chuẩnbị mẫu. Dạng đồng vị đánh dấu này được phát hiện cùng với các chất cần phântích không được đánh dấu trong dịch chiết sau cùng. Bởi vì tính chất hóa lý củachất phân tích đánh dấu và không đánh dấu gần như nhau, nên mất mát chấtkhông đánh dấu xảy ra trong suốt các giai đoạn chuẩn bị mẫu như: chiết, làm

sạch, làm giàu và giai đoạn tiêm được theo dõi chính xác qua sự mất chất nộichuẩn đánh dấu. Tỷ lệ đáp ứng (tỷ lệ tương ứng mũi từ chuẩn đánh dấu và

không đánh dấu) và nồng độ biết trước của chất đánh dấu và không đánh dấutrong dung dịch chuẩn có thể được xác định bằng cách đo diện tích mũi nồngđộ của chất không được đánh dấu trong mẫu.

8.2.5 Chuẩn kiểm soát chất lượng

Các vật liệu này có thể là mẫu chứa nồng độ đã biết của chất cần phân tích.Chúng được phân tích định kỳ theo mỗi đợt phân tích mẫu và chuẩn dựngđường chuẩn, nó đóng vai trò là chất kiểm tra độ đúng và độ chụm của phépphân tích. Đôi lúc, chuẩn kiểm soát chất lượng (QCS) là các dung dịch chuẩnđơn được dùng để kiểm tra phép phân tích ở giai đoạn cuối sắc ký khí. Trong

các trường hợp khác, vật liệu chuẩn được chứng nhận dùng cho kiểm soát chấtlượng rất giống với mẫu cần phân tích. Trong trường hợp này, nó được dùng đểkiểm tra chất lượng của toàn bộ phương pháp phân tích từ tách chiết đến phépđo cuối cùng.

- 57 -

Chương 9 – GIẢI QUYẾT SỰ CỐ

Sắc ký khí là một kỹ thuật khá tính vi liên quan tới các quá trình tự độngthường nằm ngoài sự kiểm soát trực tiếp của nhà phân tích. Tuy nhiên, thiết bịhiện đại phức tạp và tinh vi đang là công cụ giúp các nhà phân tích ngày càng

vững tin hơn khi phải đối mặt với các vấn đề chính thường ngày sẽ được tìmthấy vô số lý do từ các nhà sắc ký khác.

May mắn thay trong thực tế, khi phân tích dùng kỹ thuật sắc ký thì tất cả sắc kýđồ của phép phân tích đều dễ dàng được ghi lại bằng hình ảnh. Đây là một bằngchứng rất hữu dụng để làm sáng tỏ các vấn đề đang xảy ra trong phép phântích.

Phần dưới đây chỉ ra một số sự cố thường phát sinh trong sắc ký khí và đề xuấtbiện pháp giúp người phân tích có thể hiểu các vấn đề này xảy ra và được khắcphục như thế nào.

- 58 -

9.1 DẠNG MŨI BẤT THƯỜNG

Hình 24 - Các mũi có dạng bất thường

Nguyên nhân Biện pháp sửa chữa

a) Kéo đuôi:– Sự hấp phụ ảnh hưởng trong

buồng tiêm hoặc trong cột.– Nhiệt độ buồng tiêm hoặc đầu dò

quá thấp.– Cột không được cài đặt thích hợp.

– Làm sạch hoặc thay thế các thànhphần của buồng tiêm và cột.

– Đặt nhiệt độ buồng tiêm hoặc đầudò chính xác.

– Cài đặt lại cột.

b) Mũi doãng trước: Buồng tiêm

hoặc đầu dò quá tải.

Giảm lượng mẫu vào cột hoặc dùngcột đường kính rộng hơn hoặc sứcchứa của pha tĩnh cao hơn.

c) Mũi âm: Đầu dò bắt giữ điện tửbẩn.

Tháo anod làm sạch đầu dò bằng dungmôi hoặc lựa chọn hoạt hóa ở cácnhiệt độ cao .

d) Phân hủy: Hợp chất đang phânhủy trong buồng tiêm hoặc cột.

Kiểm tra nhiệt độ của vùng buồngtiêm và lò cột không quá cao. Thaycột cho phép sắc ký (tách) ở nhiệt độthấp hơn.

- 59 -

9.2 MŨI TẠP

Hình 25 - Các mũi thất lạc và mũi thêm

Nguyên nhân Biện pháp sửa chữa

a) Các mũi ra chậm: Mũi từ cácmẫu trước còn xót lại, các mũibành rất rộng.

Tăng cột lên nhiệt độ cao ở cuốichương trình nhiệt và giữ thời gian đểlàm sạch cột.

b) Các mũi xót lại: Lượng còn xótlại của các mẫu trước đang đượcđưa vào cột.

Giảm nồng độ mẫu, tăng lần rửa kimtiêm, làm sạch và thay thế các thànhphần của buồng tiêm đều đặn (thườngxuyên) .

c) Chỉ mũi dung môi: Cột khôngthể giữ lại các thành phần củamẫu.

Thay cột khác tương thích hơn vớithành phần của mẫu.

- 60 -

9.3 ĐƯỜNG NỀN

Hình 26 - Các vấn đề của đường nền

Nguyên nhân Biện pháp sửa chữa

a) Đường nền nâng cao: Cột chảymáu trầm trọng bởi chươngtrình nhiệt

Thay cột bằng loại polymer hoặc phatĩnh được liên kết.

b) Tiếng ồn cao: Đặt các tham sốđầu dò không chính xác hoặc

đầu dò bị bẩn .

Đặt lại chính xác các tham số hoặc làmsạch đầu dò nếu cần thiết.

c) Đường nền có các vạch nhọn:Đầu dò bẩn hoặc các hạt nhỏpha tĩnh từ cột .

Làm sạch đầu dò và chắc chắn có dùngbẫy hạt nhỏ tại cuối cột.

- 61 -

9.4 MŨI CẮT CỤT

Hình 27 - Các mũi bị cặt cụt

Nguyên nhân Biện pháp khắc phục

a) Cụt đầu: Mẫu quá đặc. Dải tuyếntính của bộ khuếch đại đầu dò bịvượt quá hoặc đặt đầu dò quánhạy.

Pha loãng mẫu lọt vào thang đo hoặcđặt đầu dò kém nhạy hơn.

b)Cụt đường nền: Đặt lấy tíchphân zero quá thấp. Đầu dò trôidạt dưới mức zero.

Đặt lại mức zero.

- 62 -

Chương 10 – CÁC THÍ NGHIỆM GC

Để thực hiện các thí nghiệm này cần phải mua các dung dịch chuẩn từ ThamesTESTEK UK Ltd., Trung tâm công nghiệp Fairacres, Đường Dedworth,Windsor, Berks SL4 4LE hoặc của một hãng nào đó tương đương.

Dung dịch chuẩn là một ống nhỏ 1 mL hỗn hợp ‘GRO’, cat. No. 30069.

Dung dịch chuẩn chứa 9 hợp chất với nồng độ 1000 µg mL-1 trong methanol.

Đặc tính của các hợp chất và thứ tự giải hấp là:

1) Methanol,

2) 3-mehtypentane,

3) 2,2,4-trimethylpentane,

4) Benzene,

5) Toluene,

6) Ethtyl benzene,

7) m-xylene,

8) o-xylene,

9) 1,2,4-trimethylbenzene,

10) Naphthalene.

Đặt các điều kiện sắc ký như sau:

Pha tĩnh phân cực trung bình tương đương với DB210 hoặc DBwax

Cột 50 m-100 m; 0,53 mm; đường kính trong (i.d.) 3,0 µm

Tiêm chia dòng

Nhiệt độ buồng tiêm 250 oC

Thể tích tiêm 0,1 µL

Nhiệt độ đầu dò 250 oC

Đầu dò: FID

Khí mang: Hêli

Vận tốc khí: ≈ 40 cm/giây

- 63 -

Tài liệu hướng dẫn người sử dụng sẽ cho chúng ta thông tin chi tiết cho mỗithiết bị GC khác nhau và cũng có những cột sắc ký khác nhau dùng cho các thí

nghiệm này. Các thí nghiệm cũng được thiết kế cho các cột và hệ thống sắc kýnày. Trên thực tế người sử dụng có thể thay đổi hầu như tất cả các điều kiện chitiết ở trên, ví dụ sử dụng cột nhồi, chiều dài cột khác nhau, kiểu tiêm khác, độphân cực khác và dùng đầu dò khác.

Thí nghiệm 1- Tìm mũi ra sau cùng

Chạy mẫu tại một vài nhiệt độ đẳng nhiệt và chọn nhiệt độ cho sắc ký đồ saocho tất cả các mũi được giải hấp trong thời gian hợp lý, ví dụ 20-30 phút.

Thông tin dưới đây sẽ giúp người sử dụng nhận danh các mũi hợp chất đangđược phân tích và đảm bảo tất cả các mũi đã giải hấp.

Ethylbenzene, m-xylene và o-xylene sẽ giải hấp như là một nhóm mũi chồngsát nhau, 2 mũi đầu tiên có thể chỉ được tách một phần. Khi nhóm này đượcnhận danh, mũi giải hấp sau cùng (naphthalene) sẽ được nhìn thấy 2 mũi sautrong sắc đồ.

Chọn bất kỳ giá trị thời gian t nằm giữa giải hấp o-xylene và 1,2,4-

trimethylbenzene.

Tiêm chuẩn vào cột và tại thời điểm t tiêm mẫu lại lần nữa . Theo dõi và ghi

sắc đồ thứ 2 cho toàn bộ thời gian giải hấp.

Sắc đồ thứ 2 phải có tất cả các mũi thành phần mong đợi và cũng có 2 mũithêm. Đây là các mũi ra sau từ lần tiêm trước. Chúng có thể dễ dàng được nhậndạng bình thường bởi vì các mũi này sẽ bị bành rộng hơn các mũi giải hấp gầnchúng.

Thí nghiệm này nhấn mạnh rằng người phân tích cần phải đảm bảo tất cả các

cấu tử trong mẫu hoặc dịch chiết phải được giải hấp trước khi thực hiện tiêm

mẫu thử kế tiếp vào sắc ký khí.

Thí nghiệm 2- Độ phân giải

Thí nghiệm này chỉ liên quan đến sự tách các mũi ethylbenzene, m-xylene và

o-xylene.

Sau khi các mũi này đã giải hấp, nhiệt độ lò cột nên được tăng bậc tới nhiệt độcao (200 oC) để đảm bảo các hợp chất ra sau được loại bỏ ra hết khỏi cột trướckhi tiêm mẫu kế tiếp.

- 64 -

a) Thay đổi nhiệt độ đẳng nhiệt, ghi sắc đồ và quan sát độ tách 3 mũi đượcchọn. Lập lại (thí nghiệm) tại chương trình đẳng nhiệt khác.

b) Thay đổi tốc độ dòng khí mang (vận tốc khí) và quan sát lại độ tách của cácmũi. Lập lại tại tốc độ dòng khác. Chú ý nếu tốc độ dòng được điều chỉnh bằngtay (không qua máy tính) thì đặt tốc độ dòng mới phải được tính toán từ phépđo thời gian chết, xem hình 2.

Khuyến nghị

Chỉ thay đổi một tham số tại một thời điểm

Các thí nghiệm này phải chứng minh rằng độ phân giải mũi được cải tiến chủyếu bởi giảm (tăng) nhiệt độ và độ phân giải cải tiến ít nhiều khi ta làm yếu tốcđộ dòng khí.

Thí nghiệm 3- Thay đổi khí mang

Cài đặt nhiệt độ cột thấp (40 oC-80 oC) và vận tốc khí 40 cm/giây.

Tiêm mẫu và ghi nhận độ tách của 3 mũi.

Thay đổi dòng khí mang từ hêli thành nitơ và lập lại thí nghiệm này.

Chú ý nếu trong thực tế không thể thay đổi khí này hoặc chất lượng khí nitơkhông đảm bảo, không nên cố gắng để làm thí nghiệm này. Luôn nhớ bảo vệcột, tất cả các vùng được gia nhiệt phải được làm lạnh tới nhiệt độ phòng trướckhi thực hiện thay khí .

Chúng ta sẽ quan sát thấy độ tách khi dùng nitơ làm khí mang giảm bởi vì vậntốc khí nitơ 40 cm/giây không tối ưu cho độ hoàn hảo cột, xem hình 8.

Thí nghiệm 4- Chương trình nhiệt độ

Mặc dù khi phân tích ở nhiệt độ thấp ta có thể đạt được độ phân giải tốt nhấtnhưng lại cho thời gian lưu rất dài cho các cấu tử 1,2,4-trimethylbenzene và

naphthalene, nghĩa là ta phải tiêu tốn thời gian rất dài để hoàn thành một lầnchạy mẫu và khả năng phát hiện đối với các chất có thời gian lưu giữ dài rấtkém vì mũi sẽ bị bành rộng.

Thử một vài chương trình nhiệt, chỉ một hoặc vài bước đẳng nhiệt và các giai

đoạn tăng bậc nhiệt để cải thiện dạng mũi và khả năng phát hiện của tất cả cáccấu tử có trong mẫu thử.

- 65 -

Đầu mối

Bắt đầu chương trình ở 40 oC. Tất cả các mũi trong sắc đồ được tối ưu cuốicùng phải có chiều cao xấp xỉ nhau khi các điều kiện tối ưu được thiết lập.

- 66 -

Chương 11 – HƯỚNG DẪN TÌM THÔNG TIN

Quan hệ trao đổi

Đào tạo và tư vấn có thể nhận được sự hỗ trợ từ các nhà sắc ký khí có kinhnghiệm hơn trong cùng tổ chức hoặc từ các quan hệ bên ngoài.

Một số sách tham khảo như:

1. Dean Rood (1995), Chromatographic Methods: A Practical to the care,

Maintenance, and Troubleshooting of Capillary Gas Chromatographic

Systems, 2nd Edition, ISBN 3-7785-2319-8.

2. John Willett (1991), Gas Chromatography, John Wiley & Sons.

3. W.George Fong, H. Anson Moye, James N. Seiber and John P. Toth

(1999), Pesticide residues in Foods: Methods, Technologies and

Regulations, Vol 151.

4. T. H. M. NOIJ (1988), Trace Analysis by Capillary Gas

Chromatography, Dissertatiedrukkeij Wibro, Helmond.

5. Những nguyên lý và thực hành sắc ký khí, B Ravindrath, 1989, ellisHorwood Ltd.

6. Sắc ký khí – Hóa học phân tích nhập môn, Ian A Fowlis, 1998, Johnwwiley & Sons

Các khóa đào tạo và hội thảo

Các khóa đào tạo thường giới thiệu thiết bị mới và các ứng dụng phân tích cụthể về một số chỉ tiêu phân tích bằng GC. Hầu hết các hãng sản xuất thiết bị tổchức thường xuyên các khóa đào tạo về các khía cạnh lý thuyết và thực hành

GC.

Một số tạp chí chuyên về sắc ký như:

Analytica Chimica Acta

Journal of Chromatography A

Journal of Chromatography B

Journal of High resolution Chromatography.

- 67 -

Một số nguồn thông tin có thể tìm trên internet từ các trang web của cáchãng sản xuất như:

http:// www.Adrich.com/ TheReporter

http:// www.Icgcmag.com

http:// www.agilent.com/chem

- 68 -

Chương 12 – KẾT LUẬN

Tóm lại với nguyên tắc thiết bị về sắc ký khí cũng như các đầu dò dùng trong

sắc ký khí, ví dụ minh họa đã được trình bày ở trên. Chúng ta thấy rằng, GC làmột công cụ rất phù hợp để tách các hỗn hợp phức tạp trong các nhiễu nềnphức tạp. Tuy nhiên, như chúng tôi đã nói ngay đầu giáo trình này, GC chỉ phù

hợp để phân tích các hợp chất bền nhiệt, hóa hơi và chuyển vào pha khí nhanh

chóng ở nhiệt độ GC và không tương tác hóa học với bất cứ thành phần nào củahệ thống. Như vậy, nếu người phân tích đang phải đối mặt phân tích các đạiphân tử sinh học có nhiệt độ sôi rất cao, dược liệu bị phân hủy khi gia nhiệt thì

lúc này sắc ký lỏng lại là một kỹ thuật vạn năng. Tương tự, khi phân tích cáckim loại hoặc các hợp chất cơ kim với hàm lượng hữu cơ rất thấp thì chúng ta

không thể dùng GC được.

Ngoài ra, ngay cả đối với các hợp chất phân tích được bằng GC thì việc lựachọn kỹ thuật tiêm, loại đầu dò, loại cột, chương trình nhiệt cũng hết sức quantrọng. Ví dụ, khi phân tích ở mức vết ta không thể dùng kỹ thuật chia dòng.

Nhưng khi phân tích ở hàm lượng lớn ta lại phải chia dòng đảm bảo mũi sắc kýkhông bị quá tải và bị bóp méo. Cũng vậy, nếu thực tế trong phòng thí nghiệmchỉ có đầu dò ECD mà hợp chất cần phân tích lại không nhạy cho ECD thì ta có

thể nghĩ đến tạo dẫn xuất thêm các nhóm halogen để nâng cao độ nhạy.

Tương tự, khi trong phòng thí nghiệm chỉ có cột không phân cực (ví dụ DB-5)

mà phải phân tích Chloramphenicol bằng đầu dò ECD hoặc MS, lúc này chúng

ta cần phải tạo dẫn xuất silyl hóa giảm độ phân cực phù hợp cho cột DB-5 và

đồng thời nâng cao khối lượng phân tử chọn lọc hơn khi phân tích với đầu dò

MS.

Vậy cần nhấn mạnh, khi đối mặt với thực tế người phân tích phải cẩn thận cânnhắc lựa chọn thiết bị sao cho phù hợp với thực tế của phòng mình và tính sẵncó nhằm tiết kiệm thời gian, chi phí phân tích và đảm bảo an toàn cho ngườiphân tích.

Khi đối tượng phân tích không phù hợp với thiết bị sẵn có trong phòng, ngườiphân tích cần phải khéo léo vận dùng các kỹ thuật hóa học trong quá ly tríchchuẩn bị mẫu như tách chiết làm giàu, tạo dẫn xuất nâng cao tính chọn lọc và

khả năng phát hiện.