24

ผลการทดลอง

เชื้อแบคทีเรีย Staohylococcus aureus เล้ียงเชื้อ S. aureus บนอาหาร Nutrient agar (NA) เพื่อแยกโคโลนีเดีย่ว บมที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เปนเวลา 16 ช่ัวโมง พบวาเชื้อมีการเจริญดี และมีลักษณะโคโลนีกลม และมีสีเหลืองทอง (ภาพที ่ 5) จากนัน้ใชไมจิ้มฟนที่อบฆาเชื้อแลวแตะโคโลนีเดี่ยว มาเล้ียงในอาหารเหลว Nutrient broth (NB) บมในเครื่องเขยา ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส เปนเวลา 16 ช่ัวโมง

ภาพที่ 5 ลักษณะของโคโลนีเชื้อ Staphylococcus aureus ที่เจริญบนอาหารเลี้ยงเชื้อ Nutrient agar

25

การสกัดดีเอ็นเอและการตรวจสอบดีเอ็นเอ

สกัดดีเอ็นเอดวยวิธีประยกุตจากวิธี CTAB buffer (cetyltrimethylammoniumbromide

buffer) และนาํไปตรวจสอบดวยวิธี electrophoresis โดยใช 1.2% agarose gel พบวาจะปรากฏแถบดีเอ็นเออยูในระดับที่สูงกวาระดับของ DNA marker (DNA ladder mix) แถบดีเอ็นเอที่ปรากฏนี้คือ แถบดีเอ็นเอของ Genomic DNA (ภาพที่ 6)

ภาพที่ 6 การสกัดดีเอน็เอจากเชื้อแบคทีเรีย Staphylococcus aureus Lane M = ดีเอ็นเอมาตรฐาน DNA ladder mix Lane 1 – 2 =โครโมโซมดีเอ็นเอจากเชื้อแบคทีเรีย S. aureus

Genomic DNA

kb 10 8 6 5 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1.2 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4

M 1 2

26

การเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอดวยเทคนิค Polymerase chain reaction เมื่อทําการสกดัดีเอ็นเอจากเชื้อแบคทีเรีย S. aureus แลว นําดีเอน็เอทีไ่ดเปนตนแบบในการ

เพิ่มปริมาณยนีโปรตีนเอดวยเทคนิค PCR โดยใชไพรเมอร Fspa : BamHI / Rspa : SalI จากการวิเคราะหขนาดดีเอ็นเอทีไ่ดดวย 1.2% agarose gel electrophoresis พบวาไพรเมอรสามารถเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอได โดยแถบดีเอ็นเอที่ได มขีนาดประมาณ 1.5 กิโลเบส (ภาพที่ 7)

ภาพที่ 7 การเพิ่มปริมาณชิ้นดีเอ็นเอยีนโปรตีนเอโดยไพรเมอร Fspa : BamHI / Rspa : SalI Lane M = ดีเอน็เอมาตรฐาน DNA ladder mix Lane 1 = ผลิตภัณฑพีซีอาร

M 1 kb 5 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1.2 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4

1,563 คูเบส

27

การโคลนชิ้นดเีอ็นเอ การโคลนชิ้นดีเอ็นเอขนาดประมาณ 1,500 คูเบส เชื่อมตอเขากับพลาสมิด pDrive cloning vector ที่ตําแหนงของเอนไซมตัดจําเพาะ BamHI และ SalI ใหเปนวงกลม เพื่อถายเขาสู competent cell ของแบคทีเรีย Escherichia coli สายพันธุ DH5α การทดลองนี้สามารถคัดเลือก recombinant clone ซ่ึงมีโคโลนีสีขาวที่เจริญไดในอาหาร LB ที่เติมสาร x-gal, IPTG และสารปฏิชีวนะแอมพิซิลิน (blue/white screening) นํามาตรวจสอบดีเอ็นเอที่ใสเขาไปในพลาสมิด โดยใชเทคนิค PCR ที่ใชไพรเมอรที่จําเพาะตอยนี (Fspa : BamHI / Rspa : SalI) นําไปตรวจสอบขนาดดีเอน็เอดวยวิธีการ electrophoresis (ภาพที่ 8) พบวา แถบดีเอน็เอของโคลนหมายเลข 1, 2, 4, 5, 7, 8, 9 และ 10 มีขนาดประมาณ 1.5 กิโลเบส โดยโคลนหมายเลข 9 และ 10 มีแถบดีเอ็นเอขนาดใหญและเขม สวนโคลนหมายเลข 3 และ 6 มีแถบดีเอ็นเอต่ํากวาแถบ DNA marker 1.5 กิโลเบส คาดวานาจะไมใชยีนโปรตีนเอ

ภาพที่ 8 การคัดเลือก recombinant clone ในการโคลนยีนโปรตีนเอ Lane M = ดีเอ็นเอมาตรฐาน DNA ladder mix Lane 1 – 10 = recombinant clone ที่คัดเลือกจากการทํา blue/white screening

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M

kb 3 2.5 2 1.5 1.2 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3

1,563 คูเบส

28

การวิเคราะหหาลําดับนิวคลีโอไทด คัดเลือกโคลนหมายเลข 9 และ 10 มาทําการสกัดพลาสมิดดวยชุด QIAprep Spin Miniprep

kit ตรวจสอบขนาดของชิ้นสวน DNA โดยวิธี electrophoresis บน 1.2% agarose gel นําพลาสมิดที่สกัดไดไปวิเคราะหหาลําดับนิวคลีโอไทด วิเคราะหโครงสราง ขนาดและลักษณะทางกายภาพของยีนโปรตีนเอดวยโปรแกรมสําเร็จรูป ExPASy – Tool และ VMD

ผลการหาลําดับนิวคลีโอไทดจากโปรตีนเอ เนื่องจากสายนิวคลีโอไทดที่จะทําการหาลําดับ นิวคลีโอไทดมีขนาดยาวประมาณ 1,500 คูเบส จึงทําการหาลําดับนิวคลีโอไทดจํานวน 2 เสน ทางดาน T7 และ SP6 เมื่อนําเสน T7 มาตอกับ SP6 พบวามีลําดับนวิคลีโอไทดจํานวน 1,563 คูเบส (ภาพที่ 9) ซ่ึงมี GenBank accession number EF455822 โดย 3 เบส สุดทายเปน stop codon เพราะฉะนั้นจงึมีการเรียงตวัของกรดอะมิโน จํานวน 520 เรสิดิวส (ภาพที่ 10)

นําลําดับนิวคลีโอไทดที่ไดไปวิเคราะหสวนประกอบของยีนที่โคลนได ดวยโปรแกรม InterProScan ในโปรแกรมสําเร็จรูป ExPASy – Tool (http://www.ebi.ac.uk/InterProScan/) พบวาลําดับนิวคลีโอไทดตัวที่ 1 ถึง 144 เปนตาํแหนงของ signal ลําดับนิวคลีโอไทดตัวที่ 139 ถึง 300 เปนตําแหนงของ immunoglobulin G binding domain แรก, ลําดับนวิคลีโอไทดตัวที่ 322 ถึง 483 เปนตําแหนงของ immunoglobulin G binding domain ที่สอง, ลําดับนิวคลีโอไทดตัวที่ 496 ถึง 657 เปนตําแหนงของ immunoglobulin G binding domain ที่สาม, ลําดับนวิคลีโอไทดตัวที่ 670 ถึง 831 เปนตําแหนงของ immunoglobulin G binding domain ที่ส่ี, ลําดับนิวคลีโอไทดตัวที่ 844 ถึง 1005 เปนตําแหนงของ immunoglobulin G binding domain ที่หา, ลําดับนิวคลีโอไทดตัวที่ 1012 ถึง 1158 เปนแอนตเิจนที่อยูบนผิวเซลล (cell surface antigen), ลําดับนิวคลีโอไทดตัวที ่1012 ถึง 1035, 1036 ถึง 1059, 1060 ถึง 1083, 1084 ถึง 1107, 1108 ถึง 1131, 1132 ถึง 1155, 1156 ถึง 1179, 1180 ถึง 1203, 1204 ถึง 1227, 1228 ถึง 1251, 1252 ถึง 1275 ซ่ึงตางก็เปนตําแหนงของ octapeptide, ลําดับนิวคลีโอไทดตัวที่ 1279 ถึง 1410 เปนตําแหนงของ peptidoglycan-binding LysM และลําดับนิวคลีโอไทดตัวที ่1432 ถึง 1554 เปนพื้นผิวของโปรตีน (surface protein)

29

IgG – binding domain โดยโปรตีนเอสามารถแบงเปน 5 IgG – binding domains (Moks et al. 1986) โดยจะแบงตามลักษณะการซ้ํากันของลําดับกรดอะมิโนเปนชวงๆ จากการวิเคราะหของโปรแกรม InterProScan ดังนี ้ Domain ที่ 1NAAQHDEAQQNAFYQVLNMPNLNADQRNGFIQSLKDDPSQSANVLGEAQKLNDS Domain ที่ 2QQNNFNKDQQSAFYEILNMPNLNEAQRNGFIQSLKDDPSQSTNVLGEAKKLNES Domain ที่ 3ADNNFNKEQQNAFYEILNMPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQSANLLSEAKKLNES Domain ที่ 4ADNKFNKEQQNAFYEILHLPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDA Domain ที่ 5ADNKFNKEQQNAFYEILHLPNLTEEQRNGFIQSLKDDPSVSKEILAEAKKLNDA การวิเคราะหและเปรียบเทียบลําดับนิวคลีโอไทดดวยโปรแกรม ClustalW

การหาลําดับนวิคลีโอไทดของชิ้นดีเอ็นเอของยีนโปรตีนเอของเชื้อแบคทีเรีย S. aureus aureus หมายเลข 1137 ซ่ึงมีขนาด 1,563 คูเบส นําไปวเิคราะหและเปรียบเทียบลําดบันิวคลีโอไทดของเชื้อแบคทีเรีย S. aureus aureus USA300 ที่มีลําดับนิวคลีโอไทด 1,527 คูเบส ใน (GenBank) พบวาลําดับนวิคลีโอไทดของยีนโปรตีนเอของเชื้อแบคทีเรีย S. aureus aureus หมายเลข 1137 กับเชื้อแบคทีเรีย S. aureus aureus USA300 มีความเหมือนกนัในระดับ 97 เปอรเซ็นต (ภาพที่ 11) การวิเคราะหลักษณะทางกายภาพของโปรตนีเอจากลําดับกรดอะมิโน

1. การวิเคราะห Hydropathicity ของ โปรตนีเอ

วิเคราะหความสามารถการละลายน้ําของโปรตีนเอซึ่งเปน expressed protein เนื่องจากถาโปรตีนละลายน้ําไดไมด ี จะทําใหการวิเคราะหทางดาน bioassay มีความยุงยากมากขึ้น เพราะฉะนั้นในการโคลนยนีเพื่อผลิต expressed protein หากทราบขอมูลการละลายน้ําของโปรตีน

30

จะทําใหสามารถวางแผนในการทดลองตอไปได โดยในการวิเคราะหนั้นจะใชโปรแกรม ProtScale ในโปรแกรมสําเร็จรูป ExPASy – Tool (http://www.expasy.ch/tools/protscale.html) (ภาพที่ 12)

จากการวิเคราะหโดยโปรแกรม ProtScale พบวาโปรตีนเอ มีความสามารถในการละลายน้ํา

ไดคอนขางดี โดยดูไดจากตาํแหนงกรดอะมิโนที่มากกวา 0 จะเปนพวกที่ไมชอบน้ํา (Hydrophobic) และพวกที่มีคาต่ํากวา 0 หรือคาเปน – จะเปนพวกที่ชอบน้ํา (Hydrophillic) เมื่อดูจากสายโพลีเปปไทดทั้งเสนแลวประเมนิไดวาโปรตีนเอนาจะละลายน้ําไดคอนขางดี และเมื่อทําการคํานวณคาเฉลี่ยของ hydropathicity ไดเทากับ -1.099 จากโปรแกรม ProtParam (http://www.expasy.ch/tools/protparam.html) โดยคา hydropathicity สูงสุดเทากับ 2.444 และคา hydropathicity ต่ําสุดเทากับ -3.167

2. การวิเคราะหลักษณะทางกายภาพของโปรตนีเอดวยโปรแกรม ProtParam

จากการวิเคราะหลักษณะทางกายภาพของโปรตีนเอ โดยโปรแกรม ProtParam พบวา โปรตีนเอที่ผลิตไดประกอบดวยกรดอะมิโน 520 เรสิดิวส มีน้ําหนักโมเลกุลเทากับ 56.8728 กิโลดาลตัน คา Theoretical pI เทากับ 5.59 ประกอบดวยกรดอะมิโนชนิดตางๆ ดังตารางที่ 2 มีสูตรโมเลกุลเปน C2450H3930N724O824S5 ประกอบดวยจํานวนอะตอมทั้งหมดเทากับ 7,933 อะตอม และคาเฉลี่ยของ hydropathicity เทากับ -1.099

3. การวิเคราะหโครงสรางสามมิติจากลําดับกรดอะมิโน วิเคราะหโครงสรางสามมิติโดยใชโปรแกรม CPHmodels 2.0

(http://www.cbs.dtu.dk/services/ CPHmodels/) และทําการแปลงขอมูลใหเปนภาพโดยใชโปรแกรม VMD (ภาพที่ 13) โดยโปรแกรมจะทําการคํานวณและเทยีบลําดับกรดอะมิโนของโปรตีนเอ กับ protein database แลวทําการคํานวณโครงสรางที่นาจะเปนของโปรตีนนี้ออกมา แตถาบางสวนของโปรตีนไมสามารถคํานวณออกมาไดแสดงวาขอมูลใน database ไมมีที่คลายคลึงกับโปรตีนในสวนนั้น กจ็ะไมมีโครงสรางในสวนนัน้ปรากฏออกมาใหเห็น จากการวิเคราะหโดยโปรแกรมพบวาโครงสรางที่ไดเร่ิมจากกรดอะมิโนตวัที่ 236 คือ Alanine ซ่ึงอยูทางดาน N-terminus ของโปรตีน โดยกรดอะมิโนตัวสุดทายคือ Alanine

31

เปนกรดอะมิโนตัวที่ 294 เพราะฉะนัน้โครงสรางสามมิติที่ไดมาจากกรดอะมิโน 59 เรสิดิวส จาก โปรตีนเอ

ATGCTGACTT TACAAATACA TACAGGGGGT ATTAATTTGA AAAAGAAAAA CATTTATTCA 60

ATTCGTAAAC TAGGTGTAGG TATTGCATCT GTAACTTTAG GTACATTACT TATATCTGGT 120

GGCGTAACAC CTGCTGCAAA TGCTGCGCAA CACGATGAAG CTCAACAAAA TGCTTTTTAT 180

CAAGTCTTAA ATATGCCTAA CTTAAATGCT GATCAACGCA ATGGTTTTAT CCAAAGCCTT 240

AAAGATGATC CAAGCCAAAG TGCTAACGTT TTAGGTGAAG CTCAAAAACT TAATGACTCT 300

CAAGCTCCAA AAGCTGATGC GCAACAAAAT AACTTCAACA AAGATCAACA AAGCGCCTTC 360

TATGAAATTT TGAACATGCC TAACTTAAAC GAAGCGCAAC GCAATGGTTT CATTCAAAGT 420

CTTAAAGACG ATCCAAGCCA AAGCACTAAC GTTTTAGGTG AAGCTAAAAA ATTAAACGAA 480

TCTCAAGCAC CGAAAGCTGA CAACAATTTC AACAAAGAAC AACAAAATGC TTTCTATGAA 540

ATCTTGAACA TGCCTAACTT GAACGAAGAA CAACGCAATG GTTTCATCCA AAGCTTAAAA 600

GATGACCCAA GTCAAAGTGC TAACCTATTG TCAGAAGCTA AAAAGTTAAA TGAATCTCAA 660

GCACCGAAAG CGGATAACAA ATTCAACAAA GAACAACAAA ATGCTTTCTA TGAAATCTTA 720

CATTTACCTA ACTTAAACGA AGAACAACGC AATGGTTTCA TCCAAAGCTT AAAAGATGAC 780

CCAAGCCAAA GCGCTAACCT TTTAGCAGAA GCTAAAAAGC TAAATGATGC ACAAGCACCA 840

AAAGCTGACA ACAAATTCAA CAAAGAACAA CAAAATGCTT TCTATGAAAT TTTACATTTA 900

CCTAACTTAA CTGAAGAACA ACGTAACGGC TTCATCCAAA GCCTTAAAGA CGATCCTTCA 960

GTGAGCAAAG AAATTTTAGC AGAAGCTAAA AAGCTAAACG ATGCTCAAGC ACCAAAAGAG 1020

GAAGACAACA ACAAACCTGG TAAAGAAGAC GGCAACAAAC CTGGCAAAGA AGACAACAAC 1080

AAGCCTGGTA AAGAAGACAA CAAAAAACCT GGTAAAGAAG ACAACAACAA GCCTGGTAAA 1140

GAAGACAACA ACAAGCCTGG TAAAGAAGAC GGCAACAAAC CTGGCAAAGA AGACAACAAA 1200

AAACCTGGCA AAGAAGACAA CAACAAGCCT GGTAAAGAAG ACGGCAACAA ACCTGGCAAA 1260

GAAGACGGCA ACGGAGTACA TGTCGTTAAA CCTGGTGATA CAGTAAATGA CATTGCAAAA 1320

32

GCAAACGGCA CTACTGCTGA CAAAATTGCT GCAGATAACA AATTAGCTGA TAAAAACATG 1380

ATCAAACCTG GTCAAGAACT TGTTGTTGAT AAGAAGCAAC CAGCAAACCA TGCAGATGCT 1440

AACAAAGCTC AAGCATTACC AGAAACTGGT GAAGAAAATC CATTCATCGG TACAACTGTA 1500

TTTGGTGGAT TATCATTAGC GTTAGGTGCA GCGTTATTAG CTGGACGTCG TCGCGAACTA 1560

TAA 1563

ภาพที่ 9 ลําดับนิวคลีโอไทดของยีนโปรตีนเอของเชื้อแบคทีเรีย Staphylococcus aureus aureus หมายเลข 1137 10 20 30 40 50 60 MLTLQIHTGG INLKKKNIYS IRKLGVGIAS VTLGTLLISG GVTPAANAAQ HDEAQQNAFY 70 80 90 100 110 120 QVLNMPNLNA DQRNGFIQSL KDDPSQSANV LGEAQKLNDS QAPKADAQQN NFNKDQQSAF 130 140 150 160 170 180 YEILNMPNLN EAQRNGFIQS LKDDPSQSTN VLGEAKKLNE SQAPKADNNF NKEQQNAFYE 190 200 210 220 230 240 ILNMPNLNEE QRNGFIQSLK DDPSQSANLL SEAKKLNESQ APKADNKFNK EQQNAFYEIL 250 260 270 280 290 300 HLPNLNEEQR NGFIQSLKDD PSQSANLLAE AKKLNDAQAP KADNKFNKEQ QNAFYEILHL 310 320 330 340 350 360 PNLTEEQRNG FIQSLKDDPS VSKEILAEAK KLNDAQAPKE EDNNKPGKED GNKPGKEDNN 370 380 390 400 410 420 KPGKEDNKKP GKEDNNKPGK EDNNKPGKED GNKPGKEDNK KPGKEDNNKP GKEDGNKPGK 430 440 450 460 470 480 EDGNGVHVVK PGDTVNDIAK ANGTTADKIA ADNKLADKNM IKPGQELVVD KKQPANHADA 490 500 510 520 NKAQALPETG EENPFIGTTV FGGLSLALGA ALLAGRRREL

ภาพที่ 10 ลําดับกรดอะมิโนของโปรตีนเอของเชื้อแบคทีเรีย Staphylococcus aureus aureus หมายเลข 1137 protein_A_gene ATGCTGACTTTACAAATACATACAGGGGGTATTAATTTGAAAAAGAAAAACATTTATTCA gi_87125858 ------------------------------------TTGAAAAAGAAAAACATTTATTCA ************************ protein_A_gene ATTCGTAAACTAGGTGTAGGTATTGCATCTGTAACTTTAGGTACATTACTTATATCTGGT

33

gi_87125858 ATTCGTAAACTAGGTGTAGGTATTGCATCTGTAACTTTAGGTACATTACTTATATCTGGT ************************************************************ protein_A_gene GGCGTAACACCTGCTGCAAATGCTGCGCAACACGATGAAGCTCAACAAAATGCTTTTTAT gi_87125858 GGCGTAACACCTGCTGCAAATGCTGCGCAACACGATGAAGCTCAACAAAATGCTTTTTAT ************************************************************ protein_A_gene CAAGTCTTAAATATGCCTAACTTAAATGCTGATCAACGCAATGGTTTTATCCAAAGCCTT gi_87125858 CAAGTCTTAAATATGCCTAACTTAAATGCTGATCAACGCAATGGTTTTATCCAAAGCCTT ************************************************************ protein_A_gene AAAGATGATCCAAGCCAAAGTGCTAACGTTTTAGGTGAAGCTCAAAAACTTAATGACTCT gi_87125858 AAAGATGATCCAAGCCAAAGTGCTAACGTTTTAGGTGAAGCTCAAAAACTTAATGACTCT ************************************************************ protein_A_gene CAAGCTCCAAAAGCTGATGCGCAACAAAATAACTTCAACAAAGATCAACAAAGCGCCTTC gi_87125858 CAAGCTCCAAAAGCTGATGCGCAACAAAATAACTTCAACAAAGATCAACAAAGCGCCTTC ************************************************************ protein_A_gene TATGAAATTTTGAACATGCCTAACTTAAACGAAGCGCAACGCAATGGTTTCATTCAAAGT gi_87125858 TATGAAATCTTGAACATGCCTAACTTAAACGAAGCGCAACGTAACGGCTTCATTCAAAGT ******** ******************************** ** ** ************ protein_A_gene CTTAAAGACGATCCAAGCCAAAGCACTAACGTTTTAGGTGAAGCTAAAAAATTAAACGAA gi_87125858 CTTAAAGACGACCCAAGCCAAAGCACTAACGTTTTAGGTGAAGCTAAAAAATTAAACGAA *********** ************************************************ protein_A_gene TCTCAAGCACCGAAAGCTGACAACAATTTCAACAAAGAACAACAAAATGCTTTCTATGAA gi_87125858 TCTCAAGCACCGAAAGCTGATAACAATTTCAACAAAGAACAACAAAATGCTTTCTATGAA ******************** *************************************** protein_A_gene ATCTTGAACATGCCTAACTTGAACGAAGAACAACGCAATGGTTTCATCCAAAGCTTAAAA gi_87125858 ATCTTGAATATGCCTAACTTAAACGAAGAACAACGCAATGGTTTCATCCAAAGCTTAAAA ******** *********** *************************************** protein_A_gene GATGACCCAAGTCAAAGTGCTAACCTATTGTCAGAAGCTAAAAAGTTAAATGAATCTCAA gi_87125858 GATGACCCAAGCCAAAGTGCTAACCTATTGTCAGAAGCTAAAAAGTTAAATGAATCTCAA *********** ************************************************ protein_A_gene GCACCGAAAGCGGATAACAAATTCAACAAAGAACAACAAAATGCTTTCTATGAAATCTTA gi_87125858 GCACCGAAAGCGGATAACAAATTCAACAAAGAACAACAAAATGCTTTCTATGAAATCTTA ************************************************************ protein_A_gene CATTTACCTAACTTAAACGAAGAACAACGCAATGGTTTCATCCAAAGCTTAAAAGATGAC gi_87125858 CATTTACCTAACTTAAACGAAGAACAACGCAATGGTTTCATCCAAAGCCTAAAAGATGAC ************************************************ *********** protein_A_gene CCAAGCCAAAGCGCTAACCTTTTAGCAGAAGCTAAAAAGCTAAATGATGCACAAGCACCA gi_87125858 CCAAGCCAAAGCGCTAACCTTTTAGCAGAAGCTAAAAAGCTAAATGATGCTCAAGCACCA ************************************************** ********* protein_A_gene AAAGCTGACAACAAATTCAACAAAGAACAACAAAATGCTTTCTATGAAATTTTACATTTA gi_87125858 AAAGCTGACAACAAATTCAACAAAGAACAACAAAATGCTTTCTATGAAATTTTACATTTA ************************************************************ protein_A_gene CCTAACTTAACTGAAGAACAACGTAACGGCTTCATCCAAAGCCTTAAAGACGATCCTTCA gi_87125858 CCTAACTTAACTGAAGAACAACGTAACGGCTTCATCCAAAGCCTTAAAGACGATCCTTCA

************************************************************ ภาพที่ 11 การเปรียบเทยีบลําดับนวิคลีโอไทดของยีนโปรตีนเอของเชื้อแบคทีเรีย Staphylococcus

aureus aureus หมายเลข 1137 และเชื้อแบคทีเรีย S. aureus aureus USA300 (GenBank) protein_A_gene GTGAGCAAAGAAATTTTAGCAGAAGCTAAAAAGCTAAACGATGCTCAAGCACCAAAAGAG gi_87125858 GTGAGCAAAGAAATTTTAGCAGAAGCTAAAAAGCTAAACGATGCTCAAGCACCAAAAGAG

************************************************************

34

protein_A_gene GAAGACAACAACAAACCTGGTAAAGAAGACGGCAACAAACCTGGCAAAGAAGACAACAAC gi_87125858 GAAGACAATAACAAGCCTGGCAAAGAAGACAATAACAAGCCTGGCAAAGAAGACAACAAC ******** ***** ***** ********* ***** ********************* protein_A_gene AAGCCTGGTAAAGAAGACAACAAAAAACCTGGTAAAGAAGACAACAACAAGCCTGGTAAA gi_87125858 AAGCCTGGTAAAGAAGACAACAACAAGCCTGGCAAAGAAGACGGCAACAAGCCTGGTAAA *********************** ** ***** ********* **************** protein_A_gene GAAGACAACAACAAGCCTGGTAAAGAAGACGGCAACAAACCTGGCAAAGAAGACAACAAA gi_87125858 GAAGACAACAAAAAACCTGGTAAAGAAGATGGCAACAAGCCTGGTAAAGAAGACAACAAA *********** ** ************** ******** ***** *************** protein_A_gene AAACCTGGCAAAGAAGACAACAACAAGCCTGGTAAAGAAGACGGCAACAAACCTGGCAAA gi_87125858 AAACCTGGTAAAGAAGACGGCAACAAGCCTGGCAAAGAAGATGGCAACAAACCTGGTAAA ******** ********* ************ ******** ************** *** protein_A_gene GAAGACGGCAACGGAGTACATGTCGTTAAACCTGGTGATACAGTAAATGACATTGCAAAA gi_87125858 GAAGATGGTAACGGAGTACATGTCGTTAAACCTGGTGATACAGTAAATGACATTGCAAAA ***** ** *************************************************** protein_A_gene GCAAACGGCACTACTGCTGACAAAATTGCTGCAGATAACAAATTAGCTGATAAAAACATG gi_87125858 GCAAACGGCACTACTGCTGACAAAATTGCTGCAGATAACAAATTAGCTGATAAAAACATG ************************************************************ protein_A_gene ATCAAACCTGGTCAAGAACTTGTTGTTGATAAGAAGCAACCAGCAAACCATGCAGATGCT gi_87125858 ATCAAACCTGGTCAAGAACTTGTTGTTGATAAGAAGCAACCAGCAAACCATGCAGATGCT ************************************************************ protein_A_gene AACAAAGCTCAAGCATTACCAGAAACTGGTGAAGAAAATCCATTCATCGGTACAACTGTA gi_87125858 AACAAAGCTCAAGCATTACCAGAAACTGGTGAAGAAAATCCATTCATCGGTACAACTGTA ************************************************************ protein_A_gene TTTGGTGGATTATCATTAGCGTTAGGTGCAGCGTTATTAGCTGGACGTCGTCGCGAACTA gi_87125858 TTTGGTGGATTATCATTAGCCTTAGGTGCAGCGTTATTAGCTGGACGTCGTCGCGAACTA ******************** *************************************** protein_A_gene TAA gi_87125858 TAA ***

ภาพที่ 11 (ตอ)

35

ภาพที่ 12 ผลการวิเคราะหความสามารถในการละลายน้าํของโปรตีนเอ (hydropathicity)

ภาพที่ 13 โครงสรางสามมิติของโปรตีนเอที่ผลิตได ในชวงกรดอะมิโนตัวที่ 236 ถึงกรดอะมิโนตวัที่ 294 จํานวนทั้งหมด 59 เรสิดิวส

36

ตารางที่ 2 องคประกอบของกรดอะมิโนในโปรตีนเอ

Amino acid Amount Percent Ala (A) Arg (R) Asn (N) Asp (D) Cys (C) Gln (Q) Glu (E) Gly (G) His (H) Ile (I) Leu (L) Lys (K) Met (M) Phe (F) Pro (P) Ser (S) Thr (T) Trp (W) Tyr (Y) Val (V) Asx (B) Glx (Z) Xaa (X)

50 9 66 38 0 38 40 38 6 20 45 61 5 16 31 24 13 0 6 14 0 0 0

9.6% 1.7% 12.7% 7.3% 0.0% 7.3% 7.7% 7.3% 1.2% 3.8% 8.7% 11.7% 1.0% 3.1% 6.0% 4.6% 2.5% 0.0% 1.2% 2.7% 0.0% 0.0% 0.0%

ที่มา : คํานวณจากโปรแกรม ProtParam

37

การตรวจสอบชิ้นดีเอ็นเอที่สอดแทรกในพลาสมิดพาหะ pDrive cloning vector ดวยเอนไซมตดัจําเพาะ (Restriction Digestion)

ตัดดีเอ็นเอพาหะสายผสม ดวยเอนไซม BamHI และ SalI ตรวจสอบขนาดชิ้นดีเอ็นเอที่ได

ดวย 1.2% agarose gel electrophoresis จะเห็นแถบดเีอ็นเอสองแถบ แถบลางคือ ช้ินDNA insert (ยีนโปรตีนเอ) แถบบนคือ cloning vector (ภาพที่ 14)

ภาพที่ 14 การตรวจสอบชิ้นดีเอ็นเอที่สอดแทรกในพลาสมิดพาหะ pDrive cloning vector ดวยเอนไซมตัดจําเพาะ (Restriction Digestion) Lane M = ดีเอ็นเอมาตรฐาน DNA ladder mix Lane 1 = ดีเอ็นเอที่ถูกตัดดวยเอนไซมตดัจําเพาะ

M 1

kb 10 8 6 5 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1.2 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5

Cloning vector insert

38

การ แสดงออกของยีนโปรตนีเอ สกัดชิ้น DNA insert สกัดออกจากเจลดวยชุดสกัดดีเอ็นเอจากเจล ไดช้ินยีนขนาดประมาณ 1,500 คูเบส นํามาเชื่อมตอเขากับพลาสมิด pQE – 80L vector ซ่ึงเปน expression vector ที่ตําแหนงของเอนไซมตัดจําเพาะ BamHI และ SalI เพื่อถายเขาสู competent cell ของแบคทีเรีย E. coli สายพันธุ M15 การทดลองนีส้ามารถคัดเลือก recombinant clone ซ่ึงเปนโคโลนีสีขาวที่เจริญไดในอาหาร LB ที่เติมสารปฏิชีวนะแอมพิซิลิน และกานามัยซิน นํามาตรวจสอบดีเอ็นเอที่ใสเขาไปในพลาสมิด โดยใชเทคนิค PCR ที่ใชไพรเมอรที่จําเพาะตอยีน (Fspa : BamHI / Rspa : SalI) นํามาตรวจสอบขนาดดีเอ็นเอดวยวิธีการ electrophoresis บน 1.2% agarose gel เพื่อวิเคราะหหา recombinant clone จากโคลนที่คัดเลือกได จะพบวาเกดิแถบดีเอ็นเอที่โคลนหมายเลข 6 และ 18 เทานั้น จากโคลนที่คัดเลือกมาทั้งหมด 20 โคลน (ภาพที่ 15)

ภาพที่ 15 การคัดเลือก recombinant clone ที่มีการแสดงออกของยีนโปรตีนเอ Lane M = ดีเอ็นเอมาตรฐาน DNA ladder mix Lane 1 – 10 = ดีเอ็นเอของโคลนที่คัดเลือกมา

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M

kb 10 8 6 5 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1.2 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5

1,563 คูเบส

39

ภาพที่ 15 (ตอ) การคัดเลือก recombinant clone ที่มีการแสดงออกของยีนโปรตีนเอ Lane M = ดีเอ็นเอมาตรฐาน DNA ladder mix Lane 11 – 20 = ดีเอ็นเอของโคลนที่คัดเลือกมา

M 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 M

1,563 คูเบส

kb 10 8 6 5 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1.2 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5