RZ Seminarka BVFP
-
Upload
radka-chemicka -
Category
Documents
-
view
389 -
download
2
Transcript of RZ Seminarka BVFP
BIOTECHNOLOGIE VE VÝROBĚ ERGOCORNINU
BIOTECHNOLOGIE VE VÝROBĚ ERGOCORNINU
Bc. Radka Zajícová
BIOTECHNOLOGIE VE VÝROBĚ ERGOCORNINU
Bc. Radka Zajícová
Obsah
1 Úvod – historický pohled na danou technologii ................................................................. 3
2 Biologická aktivita produktu ............................................................................................... 4
3 Princip technologického procesu ........................................................................................ 5
4 Charakteristika biotechnologického činitele ....................................................................... 5
5 Mechanismy a regulace vzniku produktu ........................................................................... 7
5.1 Biosyntéza ergocorninu ............................................................................................... 7
5.2 Regulace vzniku produktu ........................................................................................... 9
6 Popis technologie a technologického zařízení .................................................................. 10
6.1 Submerzní kultivace .................................................................................................. 10
6.2 Povrchová (stacionární) kultivace ............................................................................. 13
7 Izolace a purifikace konečného preparátu ......................................................................... 14
8 Aplikace preparátu ............................................................................................................ 15
9 Ekonomické aspekty procesu ............................................................................................ 16
10 Seznam použité literatury .............................................................................................. 17
3
1 Úvod – historický pohled na danou technologii Námelové alkaloidy, mezi které ergocornin patří, jsou přirozenými sekundárními
metabolity parazitické houby paličkovice nachové (Claviceps purpurea), která nejčastěji
napadá žito a jednoděložné trávy (1).
Už z přirozeného výskytu námelových alkaloidů plyne první používaný způsob získávání
těchto sloučenin. Jedná se o parazitickou produkci sklerocií na uměle infikovaném žitě. Tento
způsob produkce se v některých případech používá dodnes, ale má značná omezení. Pro tento
typ produkce byly vypěstovány modifikované kmeny především Claviceps purpurea ale i
jiných mikroorganismů (1).
Jelikož parasitická produkce je vázána na roční období, cena byla stále relativně vysoká a
spotřeba vzrůstala, byla snaha vytvořit kmeny vhodné pro saprofytickou produkci na umělých
kultivačních médiích. Problém byl ale v neznalosti biosyntézy alkaloidů, což vedlo
k neúspěchu při pokusu o saprofytickou produkci alkaloidů (2, 3). Byly připraveny kmeny pro
povrchovou kultivaci, ale produkce touto cestou nebyla zavedena, protože buď byl obsah
alkaloidů velmi malý, nebo zařízení pro povrchovou kultivaci značně složité. Proto byla
v padesátých letech minulého století vyvinuta technologie submerzní kultivace v aerovaných,
promíchávaných bioreaktorech, která ale skýtá mnohá úskalí (4). V sedmdesátých letech
Kybal a Vlček vyvinuli relativně jednoduché zařízení pro povrchovou (stacionární) kultivaci,
která ale byla do praxe uvedena jen v případě produkce alkaloidů ergotoxinové skupiny (2).
Technologie Pozitiva Negativa Parazitická produkce
• Propracovanější technologie – někdy jediná možná
• Stále nejčastější způsob produkce
• Vázanost na roční období a podnebí • Bezpečnost ohledně šíření námele
Saprofytická submerzní produkce
• Celoroční provoz • Lepší kontrola podmínek
pro produkci alkaloidů než u parazitického způsobu
• Vysoké pořizovací a provozní náklady • Používání protipěnivých přísad (snižují
produkci) • Vysoké nároky na udržení sterility • Často nižší obsah alkaloidů než u
parazitické produkce • Nestabilita produkčních kmenů
Saprofytická stacionární produkce
• Nízké pořizovací a provozní náklady
• Celoroční provoz
• Možné odlišnosti v jednotlivých kultivačních vacích (každý vak je samostatný reaktor)
Tabulka 1: Klady a zápory používaných technologií
4
2 Biologická aktivita produktu Ergocornin (Obrázek 1) patří do ergotoxinové skupiny peptidických námelových
alkaloidů. Na organismus působí stejně jako ostatní námelové alkaloidy díky podobnosti své
struktury s přirozenými neurotransmitery – serotoninem, dopaminem a noradrenalinem
(Obrázek 2).
Obrázek 1: Struktura ergocorninu
Obrázek 2: Srovnání struktury ergolinu a přirozených neurotransmiterů (1)
Přesný mechanismus účinku nebyl dosud objasněn díky obrovské diverzitě
noradrenalinových, dopaminových a serotoninových receptorů a schopnosti alkaloidů působit
na receptory jak agonisticky tak antagonisticky (2).
Většinou bývá používán ve své hydrogenované formě, protože ta je méně toxická než
nehydrogenovaná. Byly popsány účinky dihydroergocorninu na průtok krve periferními
oblastmi a hypertenzi. Průtok krve periferiemi po podání dihydrergocorninu stoupá, zatímco
tlak u hypertoniků klesá. Oba účinky jsou dány dilatací cév (5).
5
U směsi mesylátů hydrogenovaných ergotoxinů byly popsány další pozitivní účinky.
Dihydroergotoxin mesylát posiluje účinek tricyklických antidepresiv (př. Nortryptilin), což
umožňuje použití těchto antidepresiv i u tzv. geriatrické deprese, která bývá často spojena
s nějakou formou stařecké demence. Projevuje se zde tedy další účinek dihydroergotoxinu a
to, že příznivě ovlivňuje průběh stařeckých demencí (6). V mozku dochází ke stimulaci
syntézy proteinů centrálního nervového systému a inhibici adenylcyklázy stimulované
katecholaminy (7).
3 Princip technologického procesu
Pro produkci ergocorninu byly vypracovány dvě technologie – submerzní a povrchová.
Oba technologické procesy začínají zpracováním produkčního kmene získaného
z některého depozitu, kde jsou tyto kmeny uchovávány tak, aby byly zachovány jejich
vlastnosti. Výsledkem zpracování původního materiálu je inokulum, které je vhodné pro další
růst. Inokulem jsou očkována média v Erlenmeyerových nebo podobných baňkách, která jsou
pak po určitou dobu inkubována na třepačkách. Tento proces může proběhnout v jednom či
několika stupních a následně jsou pomnožená mycelia převedena do laboratorních
bioreaktorů, kde pokračuje proces zvětšování měřítka až k produkčním reaktorům nebo jen
k získání dostatečného množství inokula pro povrchovou kultivaci v igelitových vacích.
Žádaný produkt se většinou vyskytuje jak v myceliu, tak v kultivačním médiu. Je tedy
nutné zpracovat obojí. Pro izolaci ergocorninu se používá v obou případech řada extrakcí
pomocí běžných rozpouštědel a produkt je získán většinou jako adukt s posledním
rozpouštědlem, případně je ergocornin v nějaké formě ještě podroben hydrogenaci na
dihydroergocornin.
4 Charakteristika biotechnologického činitele
Bylo popsáno několik desítek fyziologicky izolovaných či geneticky modifikovaných
kmenů, které produkují ergocornin většinou ve směsi a dalšími alkaloidy. Absolutní většina z
nich je modifikací Claviceps purpurea (2). Ne všechny popsané kmeny se hodí pro
průmyslovou kultivaci a produkci ergocorninu. V následujícím přehledu je uvedeno několik
kmenů, u kterých byly popsány technologie.
Kmen OKI No. 88/1972 (8) byl vyšlechtěn ze sklerocií Claviceps purpurea s vysokým
obsahem alkaloidů bez použití mutagenních technik ve třech inokulačních krocích
6
v opakujících se cyklech. Při použití většího množství fosforu, je pro přechod do produkční
fáze nutný přídavek chloridu sodného do média. Přídavek 0,1 – 1% dusičnanu amonného
podpoří růst mikroorganismů a produkci alkaloidů. Nejvyššího obsahu alkaloidů je v kultuře
dosaženo 6. až 7. den kultivace, kdy obsah alkaloidů vztažený k množství biomasy je okolo
30 mg/g. Složení alkaloidů produkovaných tímto kmenem je uvedeno v následující Tabulce 2.
Tento kmen je uložen v Národním ústavu pro veřejné zdraví (Orszagos Kozegeszsegugyi
Intezet) v Budapešti v Maďarsku.
Ergokryptinin 5% Ergoconinin 4%
Ergokryptin 30% Ergocornin 28% Ergosin 5% Ergometrinin 4%
Ergometrin 22% Ostatní ve vodě rozpustné alkaloidy
4%
Tabulka 2: Složení alkaloidů produkované kmenem OKI No. 88/1972 (8)
Kmen MNG 00186 (9) byl stejně jako OKI No.88/1972 vyšlechtěn v Maďarsku. Jako
základní materiál byla použita sklerocia Claviceps purpurea sebraná z přirozeně infikovaného
žita. MNG 00186 byl výsledkem opakované selekce a obohacování kmene produkujících
alkaloidy. Selekce probíhala na základě toho, že kolonie produkující alkaloidy jsou na
specifickém médiu fialové na rozdíl od ostatních bílých. Růst tohoto kmene je pomalejší než u
běžně se vyskytující kultury paličkovice a netvoří konidie. Kmen produkuje směs alkaloidů,
z níž 55-60% tvoří ergocornin, 25-30% β-ergokryptin, a malou část tvoří α-ergokryptin.
Kmen je uložen v Maďarské národní sbírce kmenů.
Kmen IMET PA 130 (9) byl připraven mutací a na médiích obsahujících organické nebo
anorganické zdroje dusíku, cukr, organické kyseliny a běžné anorganické soli schopný
produkovat alkaloidy ergotoxinové skupiny a ergometrin. Tento kmen je uložen v Centrálním
institutu pro mikrobiologii a experimentální terapii v Jeně v Německu.
CCM F-725 (10) byl vytvořen mutacemi z kmene CCM F-508, který byl neekonomický
z důvodu malého množství alkaloidů a špatného poměru mezi α a β-ergokryptinem. CCM F-
508 byl postupně vystaven účinku tří mutagenů. Prvním byla kyselina dusičná o koncentraci
0,0030 – 0,0045M, dalším ethylmethansulfonát o koncentraci 0,01M a posledním byl
5-bromuracil ve směsi se sulfathiazolem v poměru 4:1. Tento kmen produkuje směs
7
ergocorninu, α-ergokryptinu a β-ergokryptinu v poměru 6:5:1 a je uložen v Československé
sbírce mikroorganismů J. E. Purkyně v Brně.
5 Mechanismy a regulace vzniku produktu
5.1 Biosyntéza ergocorninu
Při biosyntéze peptidických námelových alkaloidů samostatně vznikají ergolinový a
peptidický skelet, které jsou následně spojeny multienzymovým komplexem.
Biosyntéza kyseliny lysergové je znázorněna na Obrázku 3.
Obrázek 3: Schéma biosyntézy ergolinového skeletu u rodu Claviceps (2)
8
Cyklický skelet tvořený třemi aminokyselinami vzniká v multienzymovém komplexu
d-lysergyl peptidové syntetázy (LPS), která je tvořena dvěma podjednotkami. Aminokyseliny
ani kyselina lyserogová nemohou být do řetězce inkorporovány volné. Proto musí být
aktivovány vazbou přes sirný můstek na protein. V LPS1 podjednotce jsou aktivní místa pro
zabudování aminokyselin do pozice I nebo II (viz. Obrázek 4). Žádná z aminokyselin
nevykazuje výjimečnou afinitu k aktivnímu místu, které slouží k zabudování aminokyseliny
do pozice I. Proto o složení výsledného ergopeptinu rozhoduje pouze složení prostředí, ve
kterém se organismus nachází. Toho se dá využít v řízení kultivačního procesu. Naopak
aktivní místo k zabudování aminokyseliny do pozice dvě značně upřednostňuje L-fenylalanin.
Do pozice III je u rodu Claviceps vždy inkorporován L-prolin. (2)
Obrázek 4: Substráty inkorporované do d-lysergylpeptidlaktámu d-lysergylpeptid syntetázou
a jejich relativní afinity. (2)
Podjednodka LPS2 aktivuje kyselinu lysergovou a začíná tak syntézu cyklického
tripeptidu. Na následujícím obrázku (Obrázek 5) je znázorněno schéma funkce LPS při
biosyntéze ergotaminu. Pro syntézu ergocorninu, pak stačí eliminovat L-fenylalanin
z prostředí a nahradit jej valinem.
9
Takto vytvořený laktám je následně oxidován pomocí oxygenáz čímž vzniká
hydroxylová skupina a poslední otevřený kruh v peptidické části se samovolně uzavře. (2)
Obrázek 5: Schéma syntetických kroků katalyzovaných LPS. Levý horní roh každého
diagramu znázorňuje aktivní místo LPS2, ostatní pak aktivní místa LPS1.(2)
5.2 Regulace vzniku produktu Primární metabolismus je vždy úzce specifikovaný, protože jakákoli chyba ve stavebních
kamenech organismu by mohla mít fatální důsledky. Zato sekundární metabolity, které nemají
přímou souvislost se životaschopností organismu, mají značně volnější regulaci, a proto
konečným výsledkem bývá často směs různých sloučenin. Stejně tak je to i u divokých kmenů
Claviceps. V případě, že žádaným produktem je pouze několik vybraných sloučenin, je nutný
zásah do syntetického systému mikroorganismu a regulace vzniku produktu pomocí složení
kultivačního média (1).
10
Z uhlíkatých zdrojů je nutné používat složitější cukry, které jsou mikroorganismem hůře
metabolizovány, protože syntéza alkaloidů buď v růstové fázi neprobíhá, nebo jen
v minimální míře. Použít jako substrát glukózu není vhodné z důvodu katabolické represe. Pro
dobré využití sacharózy je nutné do kultivačního média přidat sekundární zdroj uhlíku –
například některý intermediát citrátového nebo glyoxalátového cyklu (2).
Pro většinu sekundárních produktů je malý obsah anorganického fosforu v médiu
stimulujícím prvkem. Fosfor je během prvních dní kultivace akumulován v myceliu, kde
zastavuje růst a nastartuje produkci alkaloidů. Naopak vyšší obsah fosforu může vyvolat
degradaci vzniklých alkaloidů (2).
V médiu musí být také přítomen vhodný zdroj dusíku. Tento prvek je důležitý jak pro
růst, tak pro syntézu alkaloidů. Problémem může být nalezení vhodného zdroje pro oba dva
procesy (2).
Dále je syntézu produktu možné ovlivnit přídavkem prekurzorů do média, pH, teplotou a
množstvím kyslíku v reaktoru. V případě ergocorninu je možné do kultivačního média
přidávat malé množství valinu (9).
6 Popis technologie a technologického zařízení
6.1 Submerzní kultivace
Submerzní produkce ergocorninu je podstatně běžnější než stacionární kultivace a proto
je popsáno několik technologií, které mají mnoho společných rysů.
Technologie popsaná Wackem a dalšími (8) používá produkční kmen OKI No. 88/1972
popsaný výše. Tento kmen je po 30 dní kultivován na pevném kultivačním médiu SB 010 o
složení popsaném v Tabulce 3. Vznikne souvislá vrstva mycelia, která je po oddělení
z agarového povrchu suspendována a homogenizována ve vodě. Do 750ml Erlenmeyerových
baněk, které obsahují po 200 ml SC 100 média, je přidáno po 20 ml suspenze získané
v předchozím kroku a baňky jsou 6 dní protřepávány při teplotě 24°C. Šestý den jsou baňky
po dvou použity jako inokulum pro tři 10l bioreaktory, z nichž každý je naplněn 6l sterilního
SB 101 média. V těchto reaktorech probíhá dalších pět dní kultivace při 25°C s rychlostí
aerace 0,5l vzduchu/l.min a mícháním 240 ot./min . Na konci tohoto období je obsah všech tří
reaktorů spojen (18l) a použit jako inokulum pro produkční průmyslový reaktor o objemu
300l, který obsahuje 200l sterilního SC 101 kapalného média. Reaktor je míchán rychlostí
11
300 ot/min a provzdušňován rychlostí 9m3 vzduchu za hodinu. Kultivace probíhá šest dní při
teplotě 25°C, přičemž mezi 55 a 60 hodinou kultivace je pH udržováno na hodnotě 4,5
pomocí přídavku hydroxidu amonného. Po ukončení kultivace je obsah alkaloidů 1246 mg/L,
z čehož 646 mg/L tvoří směs ergocorninu a ergokryptinu.
SB 010 SC 100 Sacharóza 100,0g Sacharóza 100,0g Kyselina jantarová 10,0g Kyselina citronová 10,0g Dusičnan amonný 10,0g Síran hořečnatý 0,3g Dusičnan vápenatý 1,0g Dihydrofosforečnan draselný 0,5g Dihydrofosforečnan draselný
0,25g Chlorid sodný
10,0g
Síran hořečnatý 0,25g Hydroxid amonný do pH 5,2 Hydroxid amonný do pH 5,2 voda zbytek do 1000ml Vláknitý agar 25,0g voda zbytek do 1000ml
SB 101 SC 101 (l) Sacharóza 100,0g Sacharóza 100,0g Kyselina jantarová 10,0g Kyselina citronová 10,0g Dusičnan amonný 1,0g Chlorid sodný 10,0g Dusičnan vápenatý 1,0g Dusičnan amonný 1,0g Dihydrofosforečnan draselný
0,5g Dihydrofosforečnan draselný
0,3g
Síran hořečnatý 0,3g Síran hořečnatý do pH 5,2
Chlorid sodný 10,0g Hydroxid amonný Hydroxid amonný do pH 5,2 Voda zbytek do 1000ml voda zbytek do 1000ml Tabulka 3: Složení kultivačních médií I.
Další technologie byla popsána Wackem et al. v roce 1983 (9) a pro produkci
ergocorninu používá jiný produkční kmen a to MNG 00186. Pro kultivaci je použita 25 dní
stará kultura MNG 00186 rostoucí na St agar (Blake) médiu, která je seškrábnuta a
homogenizována ve 100ml fyziologického roztoku. V třílitrové kuželové baňce s jedním
litrem GK kultivačního média je pak tato suspenze použita jako inokulum. Baňka je pak 44
hodin protřepávána při teplotě 24°C. Poté je obsah baňky převeden do 15l laboratorního
bioreaktoru, který obsahuje 10l TC-54 média. Kultivace probíhá při teplotě 24°C po tři dny
při míchání 240 ot./min a aeraci 0,25 l/l/min. Výsledná kultura je použita pro inokulaci 100l
St média v 150l reaktoru, který umožňuje rychlé přidávání prekurzorů. Následujících 6 dní
probíhá kultivace při 22°C, aeraci 0,35l/l/min a rychlosti míchání 150 ot./min. Druhý, třetí a
pátý den je do reaktoru přidáno po 100g valinu a 20g isoleucinu. Na konci šestého dne je
v reaktoru obsaženo 320mg/L ergocorninu, 60mg/L α-ergokryptinu a 160mg/L β-
ergokryptinu. Složení použitých kultivačních médií je uvedeno v Tabulce 4.
12
St agar médium (Blake) St Sacharóza 100,0g Sacharóza 100,0g Kyselina jantarová 10,0g Kyselina jantarová 10,0g Dusičnan amonný 1,0g Dusičnan amonný 1,0g Dihydrofosforečnan draselný
0,25g Dihydrofosforečnan draselný
0,25g
Síran hořečnatý 0,25g Síran hořečnatý 0,25g Chlorid sodný 1,0g Chlorid sodný 1,0g Hydroxid amonný do pH 5,2 - 5,3 Hydroxid amonný do pH 5,2 - 5,3 Práškový agar 25,0g voda zbytek do 1000ml voda zbytek do 1000ml
GK TC-54 Trypcasin 7,0g Sacharóza 100,0g Kyselina citronova 4,1g Kyselina citronová 10,0g Dihydrofosforečnan draselný
0,3g Chlorid sodný
10,0g
Síran hořečnatý 0,3g Dihydrofosforečnan draselný 0,5g Hydroxid amonný do pH 5,7 – 5,8 Síran hořečnatý 0,5g voda zbytek do 840ml Hydroxid amonný do pH 5,7 – 5,8 Voda zbytek do 1000ml Tabulka 4: Složení kultivačních médií II.
Patent společnost VER Arzneimittelwerk Dresden z roku 1978 (9) popisuje technologii
založenou na produkčním kmeni uloženém pod číslem IMET PA 130. Tento kmen je opět
modifikací Claviceps Purpurea. Základní materiál pro přípravu inokulí je uchováván
v uzavřených konzervách, kde jsou uloženy spory lyofilizované v odstředěném mléku. Obsah
konzervy je suspendován v 5% sladině a přenesen na pevné kultivační médium (SC1)
obsažené v průmyslových úzkohrdlých skleněných lahvičkách o objemu 500ml. Po 14 dnech
inkubace při teplotě 24°C každá lahvička obsahovuje 3x109 spor, které lze uchovávat po dobu
10 měsíců při teplotě 4°C. Takto připravené inokulum je použito pro naočkování dvou
ocelových 18l bioreaktorů, z nichž každý obsahuje 10l kultivačního média A (LCA).
Kultivace zde probíhá 7 dní za míchání 360 ot./min a aeraci 2,5 l vzduchu/min. Podíly
vytvořené v těchto reaktorech jsou spojeny a použity jako inokulum pro 180l kultivačního
média B (LCB) obsaženého v 250l bioreaktoru ze speciální oceli. Po pěti dnech míchání
rychlostí 160 ot./min a aeraci 0,5l vzduchu/l.min, je kultura převedena do 2000l nerezového
bioreaktoru, který obsahuje 1400l kultivačního roztoku C (LCC). Zde probíhá kultivace 7 dní
za míchání rychlostí 160 ot./min a aerací 0,6l/l/min. V případě nutnosti je do všech reaktorů
přidávána protipěnivá přísada. Sedmý den kultivace je celkové množství alkaloidů 2430mg/L,
z čehož 1150mg/L tvoří egocornin.
13
SC1 LCA Sacharóza 3% Sacharóza 10% Dusičnan sodný 0,3% Citrát amonný 1,5% Dihydrofosforečnan draselný 0,1% Dihydrofosforečnan draselný 0,05% Síran hořečnatý – heptahydrát 0,05% Síran hořečnatý 0,03% Chlorid draselný 0,05% Síran železnatý 0,001% Síran železnatý – heptahydrát 0,001% Síran zinečnatý 0,0004% Corn steep 1% Agar 3% pH 6,8 - 6,9
LCB LCC Sachazóza 10% Sacharóza 20% Kyselina citronová 1,4% Kyselina citronová 1,75% Hydroxid amonný (25%) 1,0% Chlorid draselný 0,02% Dusičnan vápenatý 0,05% Dihydrofosforečnan draselný 0,075% Dihydrogenfosforečnan draselný
0,025% Síran hořečnatý
0,03%
Chlorid draselný 0,01% Síran železnatý 0,003% Síran hořečnatý 0,03% Síran zinečnatý 0,0012% Síran železnatý 0,001% Hydroxid amonný do pH 5,3 Síran zinečnatý 0,0004% pH 5,5 Tabulka 5: Složení kultivačních médií III
6.2 Povrchová (stacionární) kultivace
Zařízení pro stacionární kultivaci bylo patentováno J. Kybalem a V. Vlčkem v roce 1974
(4). Kultivace se provádí na povrchu kapalného média, které je obsaženo ve sterilních
igelitových vacích. Používá se kmen s označením CCM F-725 (10).
Sterilní kultivační pytel je naplněn médiem a sterilizován a ochlazen na přijatelnou
teplotu. Poté je horní část vaku propíchnuta dutou kovovou jehlou a vak je částečně naplněn
sterilním vzduchem. Tato jehla je nahrazena kovovou či skleněnou trubičkou o průměru
odpovídajícím velikosti vaku a lehce zúženým koncem, která je napojena na zdroj inokula. Po
inokulaci zůstává trubička na místě a slouží jako přívod kyslíku při kultivaci. Plyny vznikající
při kultivaci jsou odváděny podobnou trubičkou případně lépe několika děrami v horní části
pytle. Jakýkoliv způsob odvodu odpadních plynů musí zajistit mírný přetlak v kultivačním
pytli, aby byla zachována sterilita. Kultivační vaky jsou uloženy v policích, které jim
poskytují oporu a zároveň je pod dnem police chladicí potrubí, které odvádí teplo uvolňované
při utilizaci uhlíkatých zdrojů. Jelikož jsou tyto police skládány na sebe, dochází k chlazení
kultivačních vaků ze spod i ze shora. Kultivační vaky jsou na konci kultivace likvidovány. Na
Obrázku 6 je znázorněno zařízení pro stacionární kultivaci.
14
Obrázek 6 : Průmyslové uspořádání povrchové kultivace (4) : 1) Dmychadlo, 2)měřič průtoku vzduchu,
3) třícestný kohout s kontrolním ventilem, 4) vzduchový filtr, 5) kultivační vak v polici, 6) by-pass ventil, 7) duplikátor pro
přípravu kultivačního média, 8) manipulační stolek, 9) transportér, 10) měřicí ventil
7 Izolace a purifikace konečného preparátu
Veškeré průmyslové izolace alkaloidů jsou založeny na extrakce v systému rozpouštědel,
z nichž některá, která jsou použita ve starších patentech, nejsou dnes použitelná pro
průmyslovou výrobu (např. ethery, některá chlorovaná rozpouštědla) (11).
Liší se izolace ze stacionární a submerzní kultivace. V případě stacionární kultivace
ergocorninu je zpracováváno pouze mycelium, protože peptidické námelové alkaloidy
v tomto případě téměř nepřechází do média. U submerzní kultivace se díky střihovému napětí
a dalšímu namáhání mycelia dostává do média nezanedbatelná část peptidických alkaloidů a
tudíž je nutné zpracovat celá obsah bioreaktoru (2).
V patentu publikovaném Wackem a dalšími v roce 1975 (8) je popsán systém rozpouštědel
chloroform-isopropylalkohol, chloroform- metanol, metanol-voda a chromatografie na
alumině.
15
Izolace produktu popsaná společností VER Arzneimittelwerk Dresden (9) počítá se
zpracováním média a mycelia odděleně. Kultivační médium je po ukončení kultivace
naředěno stejným množstvím vody a zfiltrováno.
Zpracování filtrátu začíná úpravou pH na 8,5 pomocí 25% hydroxidu amonného. Takto
upravený filtrát je extrahován ethylacetátem na dvoustupňovém protiproudém extraktoru.
Extrakt je pak na vakuové odparce opařen na dvacetinu svého původního objemu, smísen
s dvojnásobným objemovým množstvím chloroformu a ponechán 15h při 4°C. Z roztoku
vypadnou krystalky ergometrin-chloroformového aduktu, které jsou odděleny filtrací. Ve
filtrátu se nachází ergotoxin, který je z něj získán ve formě krystalického ergotoxin-
benzenového aduktu. Filtrát je zpracován pomocí aluminy a ethylacetátu v kolonovém nebo
míchaném uspořádání, ethylacetátový podíl je odpařen a k odparku přidán benzen na 15h při
4°C. Ergotoxin-benzenový adukt je pak zpracován buď kyselinou ethansulfonovou v ethanolu
na ethansulfonát, nebo hydrogenací v dioxanu na Ra-Ni na dihydroergotoxin-bázi, z níž je
opět vytvořen ethansulfonát pomocí kyseliny ethansolfonové.
Mycelium je tři hodiny extrahováno acetonem při 20°C. Po filtraci je vodno-acetonový
extrakt okyselen kyselinou fosforečnou na pH 2-3 a extrahován petroletherem a směsí
petrolether-xylen (1:1), U těžké fáze je upraveno 25% hydroxidem amonným pH na 8-9a je
extrahována ethylacetátem. Acetátová fáze je promyta vodou v poměru 1:1, odpařena při
30°C na vakuové odparce na desetinu objemu, zreagována s dvojnásobným objemovým
množstvím chloroformu a umístěna do 4°C přes noc. Suspenze je odfiltrována a filtrát je
odpařen na desetinu objemu stejně jako v předchozím kroku. Odpařený filtrát je přečištěn na
aluminové koloně ethylacetátem. Eluát je odpařen a rozpuštěn v toluenu a krystalován při
teplotě 4°C za zisku ergotoxin-toluenového aduktu.
8 Aplikace preparátu
K léčbě se používá především hydrogenovaný semisyntetický analog –
dihydroergocornin a to v ekvimolární směsi s dalšími alkaloidy ergotoxinové skupiny ve
formě soli. Dihydroergotoxin mesylát je ekvimolární směs dihydroergocorninu,
dihydroergocristinu a dihydroergokryptinů (α:β 2:1) (6). Používá se na léčbu stařeckých
demencí př. Alzheimerova choroba), periferního i centrálního prokrvení a při vysokém
nitroočním tlaku. Použití dihydroergotoxinu u stařeckých demencí je značně kontroverzní,
16
protože v posledních letech byla provedena kontrolovaná studie, ve které nebyl zpozorován
rozdíl mezi léčbou placebem a dihydroergotoxinem.
9 Ekonomické aspekty procesu Saprofytická produkce dlouho nebyla schopná konkurovat tradiční parazitické produkci
námelových alkaloidů. V posledních letech se situace obrací díky pokrokům v molekulární
genetice, genetickém inženýrství a biochemii, což ale nic nemění na finanční náročnosti
kultivačního procesu.
Saprofytická submerzní kultivace je náročná jak na pořizovací, tak na provozní náklady.
Zařízení pro tento typ produkce musí být z vysoce kvalitních slitin a možností sterilizace jak
kultivačních médií tak zařízení samotného. Všechny dnes používané technologie jsou řízeny
především výpočetními systémy, které rovněž představují nemalou investici. Přibližně stejnou
nebo vyšší investici představují náklady na downstream procesy.
Provozní náklady se skládají především z nákladů na sterilizační páru a elektrickou
energii nutnou pro chod celého zařízení, z čehož největší zátěž představují příkony míchacích
elektromotorů. Jelikož jsou celé technologie řízeny softwarem, je zde úspora na lidské síle.
Saprofytická povrchová kultivace není tak náročná na pořizovací náklady co se kultivace
samotné týče, ale náklady na downstream procesy se od submerzní kultivace příliš neliší.
17
10 Seznam použité literatury 1. Řehaček Z., Sajdl P.: Ergot Alkaloids. Chemistry, Biological Effects, Biotechnology,
Academia, Praha, 1990
2. V knize: Ergot – The Genus Claviceps (Křen V., Cvak L. ed.) , Harwood Academic
Publishers, Amsterodam, 1999
3. Kybal J., Protiva J., et al. (SPOFA): US Patent 3110651; 1963
4. Kybal J., Vlček V.: Biotechnology and Bioengineering 1976, 18, 1713-1718
5. Hayes D.W., Wakim K.G. et al.: The Effects of Dihydroergocornine on the
Cirkulation in the Extremities of Man, 1948
6. Griffith R.W., Singer J. (Sandoz, Inc.): US Patent 4593031; 1986
7. Udvardy Nagy née Cserey Pechány E., Budai M., et al.( Richter Gedeon Vegyeszeti
Gyar RT): US Patent 4390625; 1983
8. Wack G., Nagy L. et al.(Richter Gedeon Vegyeszeti Gyar RT): US Patent 3884762;
1975
9. Wack G., Kiss J. et al. (Richter Gedeon Vegyeszeti Gyar RT): US Patent 4369252;
1983
10. Borowski E., Braun K. et al. (VEB Arzneimittelwerk Dresden): US Patent 4086141;
1978
11. Strnadová K., Kybal J. et al. (SPOFA): US Patent 4447540; 1984
12. Cvak L., Holan J. et al. (IVAX Pharmaceuticals s.r.o.): US Patent US 2007/0161795
A1; 2007