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UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPRITO SANTO

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ROTEIROS DE AULAS PRATICAS BIOQUMICA

Curso de Farmcia - 2013/01

ProfJ.9 Suely Gomes de Figueiredo

REAES DE CARACTERIZAODEAMINOCIDOS

I - Reao com Ninidrina: (geral) Solues: - Soluo de ninidrina .

- Solues amostras de aminocidos (usar Glicina e Prolina) Procedimento: - Adicionar 2,0 m1 de soluo amostra.

- Adicionar 0,5 ml de soluo de ninidrina - Ferver por dois minutos.

Reao Positiva - Colorao azul violcea Obs.: Para a reao com Proiina a colorao obtida amarela.

II - Reao de Folin - caracterizao do grupamento Arnmtico. Solues: - Soluo amostra de aminocidos (Tirosina e Glicina)

- Soluo de NaOH 10% - Soluo Fenol reagente.

Procedimento: - Adicionar a 1,0 ml da amostra. -Adicionar 1,0 ml de NaOH 10%. - Adicionar 5 gotas de Fenol reagente ou reagente de Folin.

Reao Positiva - Colorao azul violcea

m - Reao de Erlich - Caracterizao do grupamento Indol. Solues: - Soluo amostra de aminocidos (Usar Triptofano e Glicina)

- Reativo de Erlich Procedimento: - Adicionar a 1,0 m1 da soluo amostra.

- Adicionar 2,0 ml do reativo de Erlich. - Levar ebulio por 1 O minutos

Reao Positiva - colorao vermelho-violceo

IV - Reao Xantoproteica - Caracterizao de grupo aromtico em R' Solues: - Soluo amostra de aminocidos ( Fenilalanina e Glicina)

- Soluo de NaOH 10% - cido Ntrico concentrado - Soluo padro de fenol a 0,5%

Procedimento: - Preparar 3 Lubos de ensaio l )Adicionar 1,0 mi de Fenilalanina. 2) Adicionar 1, O ml de soluo padro de Fenol 3) Adicionar 1.0ml de Glicina.

- Adicionar 0.5 ml de h"'N03 concentrado a cada um dos tubos. - Levar ao banho fervente por 5 minutos.

- Adicionar posteriormente 4.0 ml de NaOH a l O~' Reao positiva - colorao amarela.

V - Reao de Sakaguchi - caracterizao de grupamento guanidnico Solues: - Soluo amostra de aminocidos (Arginina e Glicina)

- Soluo e aifa-naftoi a 5% em Etanol - Hipoclorito de sdio (gua sanitria) - Soluo de NaOH 10%

Procedimento: - Adicionar 2,0 rnl soluo amostra de aminocido. - Adicionar 2 gotas da soluo de alfa-naftol. - Adicionar 5 gotas de soluo de hipoclorito de sdio. - Adicionar 0,5 ml da soluo de NaOH a 10%.

Reao positiva - colorao vermelha.

VI - Reao para aminocidos sulfurados Solues: - Soluo amostra de aminocidos (cistena e glicina)

- Soluo de acetato de chumbo a 5~ - Soluo e NaOH a l 0%

Proceimento: - Aicionar 2,0 mi a amostra. - Adicionar 2,0 mi de soluo de NaOH l 0%. - Aquecer em banho de ebulio por 3 minutos. - Adicionar 0,5 mi de acetato de chumbo a 5% - Manter em banho fervente por mais 5 minutos

Reao positiva - precipitado preto-castanho de sulfeto de chumbo.

Testes Folio 1 Erlich 1 Xantopro 1 Sakaguchi 1 -

Para

1 Ninidrina 1 1 1 tica

' sulfurados

Aminocios 1 Giv 1 Pro Tvr i Giy i Tro i Glv 1 Phe Glv 1 JArg 1 Glv 1 Cvs Resultados

1 1

1

1 l 1 1 1 1 ! 1 1 1 !

/ VII - Precipitao da Tirosina

1. Numerar 2 tubos de ensaio - A e B. 2. Adicionar a cada tubo amostras do aminocido tirosina (pi 5,66). 3. Adicionar aos tubos 1 ml de H20. Observar a solubilidade. 4. Adicionar aos dois tubos uma gota de indicador universal. 5. Observar colorao e compar-la com escala de pH. Anotar o pH. 6. Adicionar HCI 1 N (gota a gota) ao tubo A, observando a variao de pH e a

solubilidade do aminocido. 7. Adicionar NaOH 2N (gota a gota) ao tubo B, observando a variao do pH e

a solubilidade do aminocido. 8. Interpretar os resultados.

Giv

REAO DA NINIDRINA PARA AMINOCIDOS o ~~'/OH lo J e ~'C/ 'oH

~ + R-C-COOH ~

1 11 NH2

+ RCHO + NH3 + C02

Q Q ,..........._,.,e, ,, e ,,..A....

NH3 ~ J o J e- N = e, ) o 1 + 3H20 ......._ /'C/ e '\.:,..J

REAO XANTOPROTICA A) ~ H .

~ - - COOH + 2HN03 -. 2H20 OH~ H NH2

8) OH OH

d o Complexo azul - violceo ( Prpura de Ruhemann)

OH O Na

+ O,N0No, + 2NaOH ____. NO,~O, . y '

R R + 2H20

Na OH e ~ + 3HN03 --+ 3H20 + 1yrN02 ~ REAO DE SAKAGUCHI

COOH

' -C-NH2 1

{H1Ch ~H 1 C.:NH

' NH2

NaCJO

+ ou +

NaBrO

N01

a-nattol

H03f OH o o ----+

COOH 1 Hy NH2

(H2fh + H20 + NH

4=N~(~OH NH2 ""'-./,/

REAO PARA AMINOCrDOS SULFURADOS

CH, -CH -COOH ' - ' SH NH2 + HiO

Na OH

H2S + NaOH ---+ Nai S + H:O

CH:-CH-COOH 1 1

OH NHl + HzS

+ PbS {Prec101taao ne

01. SELEO DO COMPRIMENTO DE ONDA: - Tomar uma soluo de permanganato de potssio a 4,5mg% e em 02 tubos de ensaio

diluir como a seguir:

Tubo Sol. de KMn04 (mi) gua dest. (mi) Cone. Final 01 2,5 2,5 2,25 mg0/o 02 5,0 - 4,5 mg%

- Fazer a leitura dos tubos 01e02 nos comprimentos de onda de 400, 500, 530, 540, 550, 600 e 650 nm.

- Com os dados obtidos, construir os seguintes grficos 1 -Comprimento de onda na abscissa e absorvncia na ordenada 2 -Comprimento de onda na abscissa e transmitncia na ordenada.

- Analisar os grficos e estabelecer um comprimento de onda ideal para as leituras dessas solues.

Tubo 01 Tubo 02 nm A T A T 400 450 500 530 540 550 600 650

02. VERIFICAO EXPERIMENTAL DA LEI DE LAMBERT-BEER -Tomar uma soluo de KMn04 a 4,5mg% (soluo padro). A partir desta soluo, preparar

as seguintes diluies:

Tubo KMn04 gua dest. Cone. Final Absorvncia Transmitncia (mi) (mi) (mg%)

01 1,0 ml 4,0ml 0,9 02 2,0 ml 3,0 ml 1,8 03 3,0ml 2,0ml 2,7 04 4,0 ml 1,0 ml 3,6 05 5,0 ml

-4,5

- Sabendo-se que para esta soluo tem absoro max1ma no comprimento de onda 530nm, fazer a leitura nesse comprimento de onda, e construir grficos colocando em abscissa as concentraes e em

ordenadas a absorvncia ou a transmitncia.

03. DETERMINAO DA CONCENTRAO DE UMA SOLUO DE KMn04 DE CONCENTRAO DESCONHECIDA. - Tomar uma soluo de KMn04 de concentrao desconhecida e determinar sua absorvncia

(ou transmitncia) em 530nm. - Utilizando-se os grficos feitos no item anterior, calcular a concentrao.

15

FOTOCOLORiiVIETRIA

A Fotocolorimetria uma das metodologias mais amplamente usad;is nos laboratrios cm geral. Em laboratrios relativos rea biomdica. sua aplicaes principais s:io:

1. Medida da concenc.ra:io de solues coradas 2. Medida da concentra5o de substncias incolores. mas que :ips reaes qu1m1cis ;:ipropriad:is

resultem em produtos corados. cuja intens icbde de cor proporcional:'.\ subst.5.ncia cm cslu! h 3. Estudo do espectto de absorio (rnrva especrra[) de subst.:incias . 4. Identificao de substncias e determinao de seu gnu de purcz..'.l.

Exemplo: 1. Solues coradas:

Hemoglobina. citocromos. pigmentos em geral. sais cor:idos, etc ... Solues coradas aps re:ies qumicas: . Glicose (incolor) + Ono-toluidina resulL1 n:i forma:o de glic i\s;1mina de col or::i ;o verde com Absorv:i.ncia m:

0,600

o.soo

0,400

O.JOO ~ \

0,200 \ \ \

0, 100 \ \ \ \ 1 1 \ 1 1 1 - - - - - -1-L - ...!.. - - - -

.1J

Pedoda - Corresponde a um comprimento de onda que represcnt:ido pel:i letra grega . "lamb.:l". 2 . Freqncia - Corresponde ao nmero de vezes em que as ondas de uma determinada rad i:i.:lo se

repetem em um intervalo de tempo (s) e represent.ada pela grega v "nu". Comprimento de on

aJ Espectro visive( - Faixa de 350 a 750 nm. compreendem.lo as cores fundamenL:J.is. b) Espectro Ultravioleta - Faixa de aproximacL1111ente 100 :i 350 nm . Podemos us:u- :i exprcss:'io U1t.r:ivi okt.:i

prximo para comprimentos de onda no !ItUitos distantes do visvel (350 nm) ou lJluavioleL.1 diswnlc. quando nos referimos a comprimentos de onda j prximos de l 00 nm.

c) Espectro infravennelho - Faixa de 750 nm at cerca de l0.000 nm. D::i mesma forma. podemo~ nos rdcrir :1 [V prximo ou IV distante, conforme a proximidade do espectro visvel.

d) Espectro Herre.:iano - Correspondente s radiaes de maiores comprimentos de onda. onde lc:-nos :is ondas de rdio e TV.

OBS : Em fotocolorimeuia. interessa part.icul:.innentc o espectro visvel .

6. Emisso de Radiaes - Fontes de luz visvel . Metais inc:i.ndescentes e luz solar so fontes de energi::i radiante que compreendem ampla faixa do espectro radiante. qas quais uma pequena parte percebemos como luz branca. Fazendo-se a "luz branca" incidi( sobre um prisma cm ngulo adequado, ao atravess-lo decomposw confom1c seu . A luz ~ecomposr:..1 fornt:cc o cham::ido Espectro visvel formado das sele cores fundJ.ITlenc..1.is. 1

i e o m Q fim e n (o d e lo n ci J ( l 1Qrn~!m:id o -;

1

Em nm Ern_A

6~:::1~to 350 a 4 o o 1 3500 a 4000 400 :l 450 4 o() o a 4500 LUZ r anil 450 a 500 4500 a 5000 BRANCA > verde 5 IJ o a 550 5000 a 5500 _,____ ~ arn_ar~lo 550 a 600 5500 J 6000 Prisma ~ l:.ir:in_.a 600 J 650 6000 a 6500

vermelho 6 5 () a 700 6500 a 7 5 O:J

U prt~_;ma, n.:stc c:1so, scrliu como mon1:cromar!or 1.: J c::ida 'Jma d.::ts se(c L1i,:.1s corre~:pont.k um:i luz monocromtica.

7. Coe - lbdiaes de:\. menores que: 350 nm ou maiores qU'.:: 750 nm. nfi'.:1 '.,J.o vi:;i:i;: :; J.O o'!w lwman o. P:;rt.:mtc. a -.:or resuila d.a conjuga5o de um tenmeno t"sco (on.J. dt'.uomag11uc:1) '.: IH'' (en ,'irr! : ~:o foiolgi;;a (impulso nervoso) .

.-adi;.t~o iuminosa

visfvt~I

crtex cerebr

FOTOCOLOR i iYIETRIA

r. SubsLincias que em soluo so coradas. t.J.is como meL'.lis ( vanidio, ferro, cobalto. cromo. molibdi!n io, cobre. etc ... ) ou por subsLincas de natureza orgnica que apresentam grupos cromforos (hemoglohina. citocromos. corantes diversos etc ... )

II. Subst5ncias incolores em soluo. mas que aps rc::i:io qumic::i especfica. resull:lm em prcxJuto cor:ido ( o ma.is comum).

A fotocolorimeuia est baseada em leis relativas absoro de energia r;J.diJ.n!c. Lei Fundamental d.a Fotocolorimeuia - lei de Beer. Enunciado: " A intensidade de um feixe de luz monocromitic1 que atravessa uma solu:l corarJ:i.

decresce exponencialmenr.e medida que a espessura d::i cuba ou a co11c:::ntn:lo d.:J. solu:o. aumenta aritmelicamente."

III. Demonstra5.o da Lei de Beer: Sejam 4 tubos: A. B. C, e D. confom1e abaixo:

e

Io--- ... ~[2

Considere-se: lo - Luz incidente (100%)

B

lo-W-lt

D e~

~ r o ---1 ... ~:::: .. --_.. . ..... ...... \.!.!..Y

I Luz emergente (transmitida) a) Os tubos A, B e D tm o mesmo dimetro (mesmo caminho ptico). b) As solues A, B e C tm a mesma concenua.o. e) A soluo D duas vezes mais concentrada que as demais. d) o tubo c tem dimetro duas vezes maior que os demais.

RESULTADOS E CONCLUSES: l. A luz emergente em A e B a mesma (mesmo dimetro e mesma concentrao) 2_ A luz emcrgcnlc em C menor que em A e B (maior diimetro) 3. A luz cmergeme em D menor que em A e B (maior concentr:i5.o) 4. A luz cmcrgcnlc em C e D igual (a m:iior conet:ntrao em D compcnsacfa pelo maior diii.mctro em C)

IV . Relaes rnatern:ticas: Absnrvni:in. dcsignatla por A. a quantidade corad.a. tamht'.m designada de Den.sidadc ()plica (00). Transmitncia. designai.ia por T, a cncrgi:i radiante que efetivamente atravbsa a solu:o.

-------------------~-------

(100%) Parte Absorvida A

Na dependncia de 3 fatores: Caminho ptico (d). concentrao (c) natureza (k).

Parte Transmitida

T

i A== log lo - log T A == log 100 - Iog T

(corno Io, arbitrariamente considerado cortjo 100'lo) !

1A=2 -log T 1 EsL1 a relao matcmr.ica entre A e T.

Relao entre Absorvncia.. k. c_ d : Sendo log lo - Iog I = k.c.d ou seja. "a luz absorvida depende do cominhtjl ptico (d) , dimetro da cubet.:l. d:.i

concentrao da soluo (e) e do coeficiente da abscr:io da soluo (k)". l

j Assim, A= k.c.d 1 i

Considerando-se: o diirnetro da cubcta de l cm (d= lcm), a equao resua1e-sc a A= k.c Sendo K uma constante (coeficiente de absoro ). deduz -se que A propo~cional a e

. . . 1

jAacl : 1

Obs. Quando a concentrao do soluto for expressa em termos de molaridade. la equaJ.o pode ser escrita A = E.e onde E designado Coeficiente dr! Extino Molar, cujos valores so ta~l:Jdos e tem brgo emprc~o no Laboratrio. !

Portanto, A = k.c ou A = E.e

Relao entre Transmic.ncia e Concentrao:

Seja a seguinte seqncia de tubos de mesmo dimetro e contendo a mesma soluo (mesma subscincia e mesma concentrao), exceto o tubo l. que contm gua destilada.

;_ - ----- ----- - ----

2 3 4 5 6

{, li I4 ls 16

.. ...

H,O d e l e 1 e 1 e 1 e 1

,._.,m .- - ____ ........ -----~-,.-- --- - -

Cnsi

T"la

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 r o ~~--J'--~-'--~-'-~--'-~-'

C1 Ci Cl C4 Cs

2 3 4 5 6 (tubos)

Relao entre Absorvncia e concentrao:

(A)

Sendo A o: e e sendo k esta constante de prpporcion:tlicbde. o grfico rel:1~ionando Exemplo: soluo de CuSO,.

na concentrao de O a 10% Cone. (g%) A

o o 2 0,097 4 0,194 6 0,291 8 0,388

(C) 10 0,485

Do exemplo acima:

~.5 1

!o~ ! '

f

!o.:i i

A ! i2 !. !0.1

l. A substncia segue a Lei de B eer (pelo menos at a concentra:lo d~ 1 Og%) 2. Determina-se a concentrao desconhecida. por regra de trs simple~. 3. C:tlcula.-se o Fator de Calibrao (Fc). por Fc = cJ A; ' 4. O Fc uma constante (a substncia. segue a Lei de Be:er). 5. A concentrao de um desconhecido Cllja A= 0,242 ser igu:tl a 5g'fo.

l\llEDIDAS COLORilVITRICAS Esquema de um colorfmetro:

A= f(c). scr:i:

1 1 1

1 S'I.

:1 2 4 6 e

01 10 20 30 40 50 60 70 80 80 100 ( +) r"\.JiJ\.f\J'.J\.,

10

7 '!. (Tr>osmileoc,i:)

A A=2-logT

a b e ~J\..J (.\b10rbloci~)

d () Ul.WJJ.U..1..-'-~'--'---'--'-----'-~--'------' 1,5 0 ,9 0,7 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 o

a) Fonte de energia radi;inte (UV. VIS. [V) b) Monocromador de luz (prisma. filtros. grade de filtrao. etc ... ) e) Cu beta de: le:itura (vidro ou quartzo, formato redondo ou quadrado. em ger:tl com l cm de caminho

tico d) Clula fotoeltrica (ger;i.o de corrente el1.rica em funo de luz incidente) e) Galvanmetro (escalas de leitura em Absorvncia e/ou Tra.nsmitincia)

Escolha do comprimento de onda: Baseia-se na curva espectr:tl da soluo corada final relacionando Absorvncia e comprimento de onda. A escollia do comprirnenlo de onda definida. pela Absorvncia mxima para cadasolujo.

A

0,7 A,

0,6

o.s

0,4 0,5

-F-----,~n~:~--0,7 0,6 0,4

0,3

0,2

0, 1

o

----

----

300 400 500 600 700 800 nm Mn :I.= 480nm

--------

0,3

0,2

0, 1

C l e C2 tratam-se da mesma soluo, onde a concentrao de C2 = 2xC 1 ,

e. Ci

No grfico 1 observa-se que a Amu para Cl e C2 em 660 nm e a Amin em 480 nm. No grfico 2 observa-se que o comprimento de onda ideal para leitura colobmtrica deve ser preft:renternente na regio de absoro mxima (menor erro). i

l DOSAGENS BIOQUMICAS - Tabela de~~ para leitJras colorimtricas

DOSAGEM METODOLOGIA i .mx Glicose Readio com orto-tolu.id.ina i 630 nm Glicose Reao enzimca. 4- aminoantipirina (4-ANA) 505 nm Glicose Reao enzimca. 4-aminofenazona (4-AF) ' 510 nm Colesterol Reao de Lieberman-Burchard ' 625 nrn l Colesterol Reao enzimtica. 4-aminofenazoma ( 4-AF) ' 500 nm Trigliceriueos Reao de cor com acetilacetona i 450 nm ! Creatinina Reao de Jaff (picrato alcalino) i 500 nm Protenas Reao do B iureto i 550 nm 1 Uria Reao da Diacetilmonoxina i 5~0 nm Diversa.-; Reao de xido-reduo do NAD (UV) 1 3-+0 nm i

1

! Opel"ando com o Fotocolorimetro: Leitura col~rimtrica usual

1 - Preenche-se a cube~ de leitura com gua destilada ou branco dai soluo a ser lida. 2 - Acerta-se o ze~ do g:.tlvanmetro (A= O ou T = 100%). 3 - Preenche-se a cubera com padro(es) de concentrao(es) conhecida(s) . 4 - Preenche-se a cubeta com a soluo de concentrao desconhecida e determina-se sua Absorvncia ou

T ransmitnca. 5 - Calcula-se a concentrao da soluo desconhecida, us.ando o fator de Calibrao ou regra de t:rs

simples ( substncias que seguem a Lei de Bcer) .

.Suhst:lncias quem n:io seguem a Lei de Beer, usar o gr:fico de c.:i!ibr:iu.

,... -

CL4SS!F!CA.Ci..O DAS ANrlUSES ESPECTROFOTOMTR!CJ.5 TIPO CARACTERSTICAS USQ LABORATORIAL ABSOR.i\O A soluo at.ra vcss:i.a por luz Dos~gcns bioqumic:i.s cm gcr:Ll .

monocromtica. onJc.: parte absorvili1 e hormonais. pigmentos. etc .. . parte transmitida (UV , '{IS. IV)

EMISSO: A soluo em anlise gotcjaa ou 1. Fotometria de chama vaporizaa cm queimador de alw.

lcmpcrawra. C:cions cm icem luz Dosagem de ons: canctc:rscic:is. proporcion:il N:i K . Ca-. Lt concentrao.

2. fluorimet.ri:l A subslinci:i a ser dos:id:i c:cciw.cb por. luz (gcralrm:ntc UV) e.: p;L~sa a cmitir cm Dos:igcm dc vil1minas. hormnios .

.. comprimcnlo de ornla rnprio. neurolrarlsmissorts . etc .. .

1 Precipitao por solvente orgnico:

ACETONA. 1 1 Precipitao por solvente orgnico: j 1 ALCOOL. I Influncia da temperatura na solubi-1 liza o de orotenas. 1 Reao do Biureto

EXPERINCIA I - Precipitao por cido forte

- Colocar em um tubo de ensaio, 1,0 ml da soluo de protena a lg%. - Adicionar lentamente pelas paredes do tubo 0,5 ml de HN03 cone. - Interpretar os resultados

EXPERINCIA II - Precipitao salina

- Colocar num tubo de ensaio 1,0 ml de soluo de protena a lg%. - Adicionar lentamente 2,0 ml da soluo saturada de sulfatode sdio. No agitar o tubo. - Observar a formao de uma zona esbranquiada na parte mdia do tubo. -- Interpretar os resultados:

EXPERINCIA III - Precipitao por solventes orgnicos

- Adicionar num tubo de ensaio 2,0 m1 de soluo de protena a lg% - Adicionar ao tubo 3,0 ml de acetona gelftda, lentamente, pelas paredes do tubo. - Repetir o experimento usando lcool gelado. - Interpretar os resultados, estabelecendo a relao com a experincia II

EXPERINCIA 1 V - Precipitao por sais de metais pesados

- Adicionar a um tubo de ensaio 1,0 ml da soluo de protena 1,0g%. - Adicionar lentamente 0,5 rnl da soluo de acetato de chumbo a 0,5%.No agitar. - Interpretar os resultados.

EXPERINCIA V - Influncia da temperatura na solubilizao de protenas.

- A um tubo de ensaio colocar 2,0 ml de soluo de casena a lg%. - A outro tubo de ensaio adicionar 2,0 ml de soluo de albumina a lg%. - Levar ambos os tubos a um banho fervente por 2 minutos - Interpretar os resultados.

EXPERINCIA VI - Reao do Biureto

- Adicionar a um tubo de ensaio cerca de 0,5 ml de soluo de protena. - Adicionar 2,0 m1 de soluo de Biureto e agitar. - Interpretar os resultados obtidos.

CROMATOGRAFIA EM PAPEL Amostra: Mistura de aminocidos

Procedimento:

01. Preparar o sistema solvente em uma ampla de decantao, misturando n-Butanol:cido actico:gua (4: 1:5, v/v). Usar a fase aquosa para saturao da cmara cromatogrfica durante cerca de 1 hora.

02. Marcar sobre papel de filtro (Whatman n 01) 4 pontos de aplicao de amostras (Al, A2, Pl, P2) a 2,5 cm de uma das extremidades da fita de papel

03. Aps a saturao colocar dentro de uma placa de Petri localizada dentro da cuba contendo a cromatofolba a fase orgnica do sistema solvente que dever ficar aproximrdamente a 1 cm abaixo do ponto de aplicao . .

04. Para facilitar a saturao da cuba, colocar uma folha de papel de filtro embebida na fase aquosa revestindo seu interior.

05. Desenvolver a cromatografia a temperatura na temperatura ambiente, marcando ao final da cromatografia a frente do sistema solvente.

06. Secar a cromatofolha em estufa e revelar com soluo de ninidrina a 0,2% em acetona.

07. Submeter a aquecimento entre 70 e 8C para a reao de colorao dos aminocidos.

08. Marcar as manchas originadas e medir as distncias em cm percorridas pelos aminocidos, considerando o centro destas manchas. Calcular os valores de Rf.

cc PP

1

I [' A,A,p,p, .... z-+ A,A,p, p,

2 1

CC - Cuba cromatogrfica PF - Papel de filtro (suporte) AI ,A2 ,PI ,P2 (pontos de aplicao de amostras e padres) 1 - Fase aquosa de saturao (Polar) 2 - Fase orgnica de cromatografia (Apoiar) X - Frente de migrao do solvente Z - Pontos de aplicao das amostras e padres A Distancia percorrida pelo solvente B, C, - Distncia percorrida pelos padres Rf = Distncia (cm) percorrida pelas amostras

Distncia (cm) percorrida pelo solvente

CROMATOGRAFIA EM PAPEL Amostra: Mistura de aminocidos

Procedimento:

01. Preparar o sistema solvente em uma ampla de decantao, misturando n-Butanol:cido actico:gua (4: 1:5, v/v). Usar a fase aquosa para saturao da cmara cromatogrfica durante cerca de 1 hora

02. Marcar sobre papel de filtro (Whatman n 01) 4 pontos de aplicao de amostras (Al, A2, PI, P2) a 2,5 cm de uma das extremidades da fita de papel

03. Aps a saturao colocar dentro de uma placa de Petri localizada dentro da cuba contendo a cromatofolha a fase orgnica do sistema solvente que dever ficar aproximrdamente a 1 cm abaixo do ponto de aplicao . .

04. Para facilitar a saturao da cuba, colocar uma folha de papel de filtro embebida na fase aquosa revestindo seu interior.

05. Desenvolver a cromatografia a temperatura na temperatura ambiente, marcando ao final da cromatografia a frente do sistema solvente.

06. Secar a cromatofolha em estufa e revelar com soluo de ninidrina a 0,2% em acetona.

07. Submeter a aquecimento entre 70 e 80"C para a reao de colorao dos aminocidos.

08. Marcar as manchas originadas e medir as distncias em cm percorridas pelos aminocidos, considerando o centro destas manchas. Calcular os valores de Rf.

cc PP

1

I [ A,A,p,p, .... ,_ A,A,p, p,

2 1

CC - Cuba cromatogrfica PF - Papel de filtro (suporte) AI ,A2 ,PI ,P2 (pontos de aplicao de amostras e padres) 1 - Fase aquosa de saturao (Polar) 2 - Fase orgnica de cromatografia (Apoiar) X - Frente de migrao do solvente Z - Pontos de aplicao das amostras e padres A Distancia percorrida pelo solvente B, C, - Distncia percorrida pelos padres Rf = Distncia (cm) percorrida pelas amostras

Distncia (cm) percorrida pelo solvente

6

IDENTIFICAO DE CARBOIDRATOS

OBJETIVOS: a) Executar testes qualitativos em tubos de ensaio para reconhecimento dos pnnc1pa1s glicdios. b) Conhecer o significado dos testes de benedict, Seliwanoff, Iodo, Biai , Barfoed e etc .. c) Aplicar os testes acima para identificao de glicdios desconhecidos. NOTA: Cada grupo de estudantes receber vrios acares tais como: glicose, frutose, sacarose, amido, maltose, lactose e ribose e um acar para ser identificado, usando os testes abaixo. Cada teste deve ser realizado com todos os acares recebidos inclusive com o desconhecido. Os resultados devem ser lanados no quadro abaixo

RESULTADOS DOS TESTES (+ou-)

CH Molisch Benedict Seliwanoff Barfoed Biai Iodo Obs.

Glicose

Frutose

Sacarose

Amido

Maltose

Lactose

Ribose

Desco-

nhecido

PROCEDIMENTOS:

l) Reao de Molisch: uma reao geral e de caracterizao para os carbohidratos. a partir de pentoses.

Colocar em um tubo de ensaio: - 2,0 ml de soluo do acar a ser identificado - 3 gotas de soluo alcolica de alfa-naftol a 10%. - Misturar bem.

- Adicionar 2 ml de H2S0-1 concentrado (ateno no pipetar), inclinando o tubo lentamente de modo que os dois lquidos no se misturem. No agitar o tubo.

Notar o aparecimento de um anel prpura ou violeta no limite da separao dos dois lquidos, resultante da condensao do furfural ou hidroximetilfurfural com alfa-naftol.

2) Reao de Benedict: Ions cpricos estabilizados em soluo por agentes complexantes so reduzidos pelos grupos carbonila (livres ou potencialmente livres) das aldoses e cetoses.

Colocar em um tubo de ensaio: - 1, O m1 de reativo de Benedict. - 0,5 ml de soluo do accar a ser identificado.

- Ferver durante 1 minuto em banho-maria e deixar esfriar espontaneamente.

Observar a reduo notando o precipitado vermelho-tijolo que se forma. O precipitado vermelho tijolo que se forma de xido-cuproso.

3) Reao de SeliwanofT: O teste diferencia aldoses de cetoses, a reao se processa mais rapidamente com as cetoses do que com as aldoses. Solues concentradas de aldoses podero dar resultado falsamente positivo.

Colocar em um tubo de ensaio: - 0,5 m1 de sol. do acar a ser identificado. - 1,0 m1 do reativo de Seliwanoff Cuidado! no aspirar. - Colocar o tubo em banho-maria fervente durante 5 minutos, observando o tubo a

intervalos de 30 segundos.

O aparecimento imediato de colorao vermelha indica teste positivo para cetoses.

4) Reao de Barfed: Reao que se distingue monossacarideos de dissacardeos redutores pela velocidade com que se forma Cu20 a partir da reao entre o acetato cprico e o carboidrato. Os dissacardeos reagem mais lentamente com o reativo de Barfed do que os monossacardeos.

Colocar em um tubo de ensaio: - 1,0 m1 do reativo do Barfed. - 1,0 ml de soluo do acar a ser identificado. - Levar o tubo em banho-maria fervente por 5 minutos.

Observar a formao de um precipitado de xido cuproso.

5) Reao de Biai: Caracterstica para Pentoses. As pentoses e nucleotdios que as contm, quando aquecidos com cido diludo, produzem furfural. Este se condensa com o orcinoL produzindo um produto de cor azul. Colocar em um tubo de ensaio: - 1,0 ml do acar a ser identificado. - 0,5 ml do reativo de Bial. - 1 ml de HCI concentrado (no pipetar) . - Misturar bem e levar o tubos em banho-maria fervente por 1 O minutos.

Reao positiva se caracteriza por formao de produto corado em azul (ou azul esverdeado).

6) Teste do Iodo: Formao do complexo Amido-Iodo (e sua reverso pelo calor). Iodo em soluo produz reao colorida com polissacardeos, com o amido produz colorao azul e com o glicognio colorao vermelha. Colocar em um tubo de ensaio: - 2,0 ml da soluo do acar a ser identificado. - Adicionar 2 ou 3 gotas de soluo de iodo (Iugol).

Notar o aparecimento de colorao azul , o que caracteriza teste positivo para o amido.

7) HIDRLISE CIDA DOS DISSACARDIOS

-Tomar 4 tubos de ensaio e colocar: Tubo 1: 1 ml de maltose+ 1 ml de HCl 2N Tubo 2: 1 mI de sacarose + 1 ml de HCl 2N Tubo 3: 1 ml de maltose + 1 mi de H20 Tubo 4: 1 mI de sacarose+ 1 ml de H20

- Ferver por um minuto em banho-maria. - Neutralizar os tubos 1 e 2 com 1,0 ml de NaOH 2N - Adicionar 1,0 mI de H20 aos tubos 3 e 4. - Acrescentar a cada tubo 1,0 ml do reativo de Benedict. - Levar os tubos ao banho-maria fervente por 1 min. - Interpretar os resultados

ELETROFORESE DE PROTENAS PLASMTICAS

01. Retirar as tits de cellogel da soluo conservadora (metanol a 40%), enxug-las entre duas folhas de papel de filtro e mergulh-las em soluo tampo apropriada por aproximada.mente 10 minutos.

02. Retirar as fitas d.a soluo tampo, coloc-las entre duas folhas de papel de filtro a fim de retirar o excesso de tampo. Coloc-las na cuba eletrofortica com o lado absorvente para cima, convenientemente estirada.

03. Ligar a fonte e aguardar alguns minutos para que haja estabilizao da corrente eltrica (aproximada.mente 3 minutos).

04. Aplicar o soro com aplicador especial aproximadamente a 1,0 cm da dobra da fita a parr do polo negativo.

05. Ligar a fonte de corrente contnua e aguardar a corrida eletrofortica que dever ser 30 a 40 minutos com uma ddp de 200V.

06. Aps a corrida, r:erirar as fitas e coloc-las num recipiente contendo o corante que dentre outros, p

{+) 11 111 () Oelk>camento eu F ran

t Instrumental da Eletroforese. A) Vista superior: Cmara de Separao, compartimento catdico e andico, com duas fitas suporte. B) Vista lateral - Cmara de separao. C) Fraes de soro sanguneo humano separadas e reveladas por corance especial. D) Quantificao das Fraes. As faixas so cortadas no pontilhado e dissolvidas em cido actico, a Absoro lida em espectrofocmetro. E) Densitmetro. A fita corada deslizada numa fenda milimtrica de luz, e a Absoro medida por fotoclula. Um computador analgico fornece traado proporcional quantidade de protena, e o percentual de cada frao, lida automaticamente. Este mtodo exige o densitmetro que um espectrofotmetro especial.

Consiste ~a separao dos componentes de um sistema atravs da aplicao de um campo eltrico. um dos mtodos mais usados no laboratrio, tanto na forma fundam~ntal, como nas variantes. Tem inmeras aplicaes.

Princpio do Mtodo - Substncias em soluo que possuem carga eltrica livre, deslocam-se quando submetidas a um campo eltrico de sentido invarivel. A migrao faz.se de acordo com a lei de Coulomb (Fig. 1).

Plo (+) -o-- -- -

- --1 -

Origem

Plo H

1. Componentes de carga negativa migram para o plo positivo. 2. Componentes de carga positiva migram para o plo negativo.

CELMGEL FlLMEDEAGAROSEGERAL Filmes de agarose para separao eletrofortica de protenas e lipoproteinas. Somente para uso "in vtro".

Artigo N 1801 10 x 1 O Determinaes

1. PROTEINOGRAMA

INTRODUO i A anlise do quadro protico-plasmtico importante, pois se podem diagnostidar vrias alteraes patolgicas. Entre os mtodos de qualificao e quantificao dessas protenas destaca-se a eletrororese, que se tem tornado um importante m$io auxiliar de diagnstico na maioria dos laboratrios clinicas. A eletroforese permite uma avaliao aproximada das concentraes de vrias protenas importantes, cujas alteraes, seja de regulao de suas snteses, ou de seu maior consumo, podem refletir nas suas mobilidades eletroforticas ou nas suas concentraes.

AMOSTRA Usar soro fresco livre de hemlise por at 3 dias mantidos em geladeira (2 a 8C)10 congelamento desaconselhvel.

PROCEDIMENTO 1) Colocar 80 mL de tampo tris pH 9,5 gelado (2 a SC) , na cuba. 2) Aplicar 0,4 L de cada soro no filme de agarose. 3) Colocar o filme de agarose no porta-filme coincidindo os plos negativos l:lo

i lme com a cuba. 4) Colocar o porta-filme na cuba e tamp-la. Deixar por 20 minutos a 100 volts. 5) Retirar a tampa da cuba e o porta-filme, colocando-a sobre uma folha de pai)el

de fi ltro para eliminar o excesso de tampo das bordas do filme. 6) Retirar o filme do porta-filme. 7) Mergulhar o filme em 200 mL de corante por 5 minutos sem agitao. 8) Retirar o filme do corante e colocar em 200 mL de descorante por 5 minutos. t 9) Retirar o excesso de descorante do filme e coloc-lo a 60C (55C a 65C), t

que o mesmo fique completamente seco. Sugerimos o uso de secador e cabelos com aquecimento.

1 O) Colocar o filme de agarose no descorante at o fundo ficar transparente. e necessrio, trocar o descorante.

11) Secar a 60C (55C a 65C) novamente. ~ 12) Ler no scanner ou no densitmetro 520 nm. Pode-se ainda fazer a eluio d s

bandas com NaOH 2% (2 g NaOH em 100 mL H20): recortar cada fra e colocar em 2 mL do eluente. Aps a dissoluo, ler a absorbncia em 580 nm.

No reutilizar o tampo , Materiais necessrios no fornecidos: i Corante - Negro de Amido (Amido Black 10-8 - art. 1810 - CELM) 0,1% em ci~o actico a 5%. ( Descorante - cido aclico a 5%.

=CELM' Reviso: P&D - Maio/2003 VALORES DE REFERNCIA

% q/dl Albumina 53,70 a 62,9 3,60 a 4,20 Alra-1 3,30 a 5,20 0,20 a 0,40 Alfa - 2 7,20 a 11,20 0,50 a 0,80 Beta 10.40 a 14,70 0,70 a 1,00 Gama 10,80 a 19,70 0,70 a 1,40

... ~---- ---~-

Recomenda-se que cada laboratrio estabelea seus prprios valores de rererncia .

ILUSTRAO DA SEPARAO DE PROTENAS PLASMTICAS

= CELM [i\me-:-Paciente I F _ Cone. [3I] raoes %

~ 0,5 57,8 3,5 7,9 13,6 16,5 0,031 3,552 0,217 0,487 0,838 1,015 Grfico obtido no aparelho DS-35 Grfico obtido no sistema SE-250

Observaes 1. Em mulheres usurias de contraceptivos orais e gestantes, os valores de albumina e gama-

globulina apresentam-se ligeiramente inferiores aos intervalos apresentados. Pela mesma razo, as fraes alfa-1-globulina, alfa-2-globulina e beta-globulina apresentam valores ligeiramente superiores aos intervalos citados (vide re ferncia bibliogrfica 2 no verso desta pgina).

CELM Cla. Equipadora de Laboratrios Modernos AI. Amazonas, 764 - Alphaville - Baruerl - SP - CEP 06454-070

Fone: (11) 4191-1647 -Fax: (11) 4195-5390 CNPJ 61 .086.82310001-76 - IND. BRAS.

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li. LIPIDOGRAMA

INTRODUO As lipoproteinas do plasma sangineo so complexos macromoleculares constitudos de protenas e lipdeos, como triglicerideos, colesterol e seus steres. Pela tcnica de eletroforese possvel separar quatro fraes principais de lipoproteinas: quilomcrons, beta, pr-beta e alfa.

AMOSTRA Usar soro fresco livre de hernlise, colhido em, no mximo, 12 horas. Deve-se evitar o congelamento da amostra, pois pode ocorrer degradao das lipoprotenas sricas, em especial se sua concentrao estiver aumentada.

PROCEDIMENTO 1) Colocar 90 mL de tampo tris pH 9,5 gelado (2 a SC ), na cuba. 2) Aplicar 0,5 L de cada soro ou plasma recm-colhido livre de hemlise no

filme de agarose. Aguardar alguns segundos para que o soro penetre no filme e aplicar mais 0,5 ~LL de amostra.

3) Colocar o filme de agarose no porta-filme coincid indo os plos negativos do filme com a cuba. Colocar o porta-filme na cuba e tamp-la. Deixar por 14 minutos a 100 volts .

4) Retirar a tampa e o porta-filme. colocando-o sobre uma folha de papel de filtro para eliminar o excesso de tampo das bordas do filme.

5) Retirar o filme do porta-filme. 6) Colocar o filme de agarose a 60"C (55C a 65C), at que o mesmo fique

completamente seco. Sugerimos o uso de secador de cabelos com aquecimento. Este procedimento deve ser realizado antes da colorao do filme.

7) Colocar o filme de agarose seco sobre uma folha de papel de filtro e. com o auxilio de uma pipeta, colocar sobre o filme de agarose 5 mL de corante soluo trabalho. No tocar a superfcie da agarose com a ponta da pipeta.

8) Deixar corando de 2 a 3 minutos, at que o corante comece a precipitar e se torne azulado.

9) Mergulhar o filme de agarose no descorante (metanol 70%) at que o fundo se torne rosa claro (alguns segundos).

1 O) Retirar o filme de agarose do descorante e colocar numa soluo de glicerol a 2% por 15 segundos, SEM AGITAO.

11) Secar a 60C (55C a 65C) novamente. 12) Ler no scanner ou no denstmetro 520 nm. Pode-se ainda fazer a

eluio das bandas com gua/metanol/acetato de etila (2,5 I 7,0 I O, 5. v/v): dissolver cada uma das fraes recortadas em 2 ml do eluente e ler a absorbncia em 530 nm.

* No reutilizar o tampo. Materiais necessrios no fornecidos:

Corante - Fat Red 7 - B (art. 0775 - CELM) - 0.225 gil em metanol (soluo estoque). Soluo trabalho - 10 ml da soluo estoque + 2 ml de NaOH O, 1 N Descorante - Metanol 70%

VALORES DE REFERNCIA Alfa - 20,0 a 35,0 % Pr-beta - 10,0 a 25,0 % Beta - 45,0 a 65,0 %

p.a .[

Recomenda-se que cada laboratrio estabelea seus prprios valores de referncia .

ILUSTRAO DA SEPARAO DE LIPOPROTENAS

C cELM

[No-me: Paciente 1 Fraes %

[l

Grfico obtido no aparelho DS-35 Grfico obtido no sistema SE-250

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS 1. Naoum, P.C. Eletroforese - Tcnicas e Diagnsticos. 2 ed. So

Paulo -Livraria Santos Editora, 1999.

2. Rancharam, S., Sponzilli, E.E . e Wingerd, J.C. Serum protein fractions.

Effects of oral contraceptives and pregnancy. Obstet Gynecol, 48(2):211-5, 1976 AUG.

OBJETIVOS - a) Executar testes qualitativos em tubos de ensaio para reconhecimento das principais propriedades dos lipdios mais comuns.

b) Aplicar os testes acima para identificar lipdios desconhecidos.

01. PROPRIEDADE DOS CIDOS GRAXOS.

Os resultados dos procedimentos abaixo podem ser sintetizados no quadro resumo no final do presente roteiro.

a) Em 03 tubos de ensaio colocar: Tubo 1 - 3 gotas de cido actico Tubo 2 - 3 gotas de cido oleico Tubo 3.,. fragmentos de cido esterico (3 gotas)

- Verificar o cheiro e o aspecto fsico de cada um. - Adicionar l,Oml de gua destilada a cada tubo e agitar, verificar ento a solubilidade em

gua de cada substncia acima.

b) - Retirar uma gota de cada soluo e coloca-la sobre papel indicador para verificar o pH aproximado de cada tubo acima.

- Colocar na extremidade de cada um dos trs tubos, um pedao de papel indicador.

- Aquecer cada tubo e verificar por meio de papel indicador aqueles que so volteis ou fixos.

c) Adicionar a cada tubo - Uma gota de fenolftalena

- Completar o volume para 5,0 ml com gua destilada (adicionar 4,0ml de gua destilada).

- Adicionar NaOH l N, gota a gota, at o aparecimento de colorao rsea. - Aquecer e observar a formao dos sais de sdio dos respectivos cidos graxos.

Consideram-se sabes aqueles que por agitao formam espuma.

d) - Completar o volume de cada tubo para cerca de 10,0ml com gua destilada. - Dividir o contedo de cada tubo em 3 partes aproximadamente iguais, conforme

esquema abaixo.

1 2

/l~ A B e A B e A

3

I' /~.~ B e

Neste ponto teremos 9 tubos aos quais adicionaremos as seguintes solues: tubos IA; 2A; 3A -)- 3 gotas de CaCh 0,5% tubos lB; 2B; 3B -)- algumas gotas de HCl 2 N (at recuperar o cido graxo).

( 3 gotas) tubos 1 C; 2C; 3C -)- algumas gotas de NaCl em soluo saturada ( 3 gotas).

(interpretar os resultados obtidos)

Caracteres Gerais Reao Propriedades dos

Lipdio Cheiro Aspecto pHem Volati- Solub. com com Fsico gua lidade em NaOH CaCl2

gua

02. TESTE PARA CIDOS GRAXOS NO SATURADOS a) Reao de Halogenao:

Numerar 5 tubos de ensaio e colocar em cada um respectivamente Tubo 1 - 1 gota de cido oleico. Tubo 2 - pequenos fragmentos de cido esterico Tubo 3 - 1 gota de leo de algodo Tubo 4 - 1 gota de leo de linhaa Tubo 5 - 1 gota de banha de porco

Sabes com

HCL

Obs. Se alguma das gorduras citadas no estiver presente, use outra qualquer.

A cada um dos 5 tubos adicionar: - 4 mi de lcool etlico. - Agitar e aquecer rapidamente. - l gota de soluo de bromo. - Agitar e observar se houve descoramento.

com

NaCl

- Nos tubos em que houve descoramento continuar adicionando soluo de bromo gota a gota at o aparecimento de uma colorao ligeiramente amarelada e persistente

- Anotar o nmero de gotas que foi gasto em cada caso. (interpretar os resultados obtidos)

.\'mm: c.011111111

. dt/11; .. Sut11ratlt1.'i Frmico Actico Propinico Butrico Valrico C:wrico Enntico Caprilico Pclargmico

Cprico lJndcc:mico L:1urico

-

Mirslico Palmtico Esterico A numidico J.J.gnocrico Certico lmut11rutlo.'> - lcitlo.

1. FUNDAMENTO:

A saliva incubada com o substrato (amido), em condies timas de temperatura, pH e concentrao de cloretos. A atividade amilsica medida pelo tempo mnimo necessrio digesto total do amido, o que se revela pela reao negativa com iodo (ponto acromtico). Alm da avaliao da atividade amilsica, faz-se- um estudo sobre o efeito de alguns fatores, tais como pH, temperatura, concentrao do substrato, concentrao de enzima e presena de ion ativador e inibidor.

2. REAGENTES E SOLUES:

2.1-Soluo aquosa de amido solvel a 1%; 0,2% e 2,0%. 2.2-Soluo tampo de fosfato de pH 7,0; pH 4,0 e pH 9,0 2.3-Soluo aquosa de cloreto de sdio a 1 % 2.4-Soluo de lugol (Soluo de iodo) 2.5-Soluo de fluoreto de sdio a 2%. 2. 6-Saliva diluda a 1: 100 em gua destilada

3. OPERAES:

3.1 - PRELIMINARES - Diluir 1,0 mi de saliva no filtrada com gua destilada para volume final de

1 OOml, utilizar um balo volumtrico. (Diluio da saliva 1 100). - Preparar uma srie de tubos contendo 0,5ml de lugol (soluo de iodo).

3.2- PREPARO DO MEIO DE INCUBAO. Colocar em um tubo de ensaio: a) 5,0ml de soluo de amido a 1 % b) 2,0ml de soluo de cloreto de sdio a 1 % c) 2,0ml de tampo de pH 7,0. d) Pre incubar (Manter a mistura por 2 a 3 minutos em temperatura 37C). e) 1,0ml de saliva diluda a l: 100. Neste momento voc tem o ponto zero da reao.

De minuto em minuto (ou tempos mais adequados), pipetar uma amostra de 2 gotas do material em incubao e adicionar estante preparada em 3. 1 contendo uma srie de tubos com soluo de iodo, at que no se obsorve colorao (ponto acrmico ), exceto a prpria cor da soluo de lugol. Marcar o tempo. Se for inforior a 5 ou superior a 20 minutos, repetir a operao com diluio diferente de saliva de modo que a digesto total do amido se faa em tomo de 1 O minutos.

5. ESTUDO DAS VARI VEIS QUE INFLUEM NA ATIVIDADE DA ENZA AMILASE.

5.1. EFEITO DA VARIVEL pH: - A incubao descrita em 3.2 ser efetuada em solues tampes pH 4,0;

pH 7,0 e pH 9,0. - Anotar os resultados na tabela abaixo.

pH Tempo de ponto acromtico 4.0 7.0 9.0

5.2. EFEITO DA VARIVEL TEMPERATURA. - A incubao descrita em 3 .2 ser efetuada nas seguintes temperaturas: O C

(banho de gelo); temperatura ambiente ( C); 60 C e 100 C. - Anotar os resultados na tabela abaixo.

Tcmocratura Tempo de nonto acromtico O"C

Temo. amb. ( ''C) 60 "C 1 ()() "C

5.3. EFEITO DA VARIVEL CONCENTRAO DE SUBSTRATO. - A incubao descrita em 3 .2 ser efetuada utilizando-se solues de amido

nas seguintes concentraes: 0,2 %; 1,0 % e 2,0 %. - Anotar os resultados na tabela abaixo.

r s 1 Temoo de oonto acromtico 0,2% LO% 2.0%

-~ . ---~ - - -- ------- ----- ------- ---- - .

5.4. EFEITO DA VARIVEL CONCENTRAO DA ENZIMA. - A incubao descrita em 3.2 ser efetuada utilizando-se solues de

saliva diluda emgua nas propores: 1: 10; 1: 100 e 1;1000. - Anotar os resultados na tabela abaixo.

El Tempo de ponto acromtico 1:10

1:100 1:1000

5.5. EFEITO DE DIFERENTES IONS NO MEIO DE INCUBAO. - A incubao descrita em 3 .2 ser efetuada nas seguintes condies: a) em

presena de gua; b) em presena de cloreto de sdio e c) em presena de fluoreto de sdio.

- Anotar os resultados na tabela abaixo.

IONS Tempo de ponto acromtico Ausncia

c1 -F-

INTERPRETAR OS RESULTADOS

J

~

,, BloTe t=ntc a ~ BIOTECNOLOGIA AVANADA

GLICOSE Mtodo Enzimtico Colorimtrico

FINALIDADE

Kit destinado determinao da Glicose no Soro, Plasma e Lquor.

PRINCPIO DO MTODO

A enzima glicose oxidase catalisa a oxidao da glicose existente na amostra, em presena de oxignio, produzindo perxido de hidrognio. A enzima peroxidase catalisa a oxidao do fenol pelo perxido de hidrognio formado, em presena de 4-aminoanlipirina produzindo um composto rseo-avermelhado (quinonimina), que apresenta um mximo de absoro em 505 nm. A intensidade de cor proporcional concentrao de glicose na amostra.

glicoso oxid;:isa . Glicose+ 02 + H20 --------------------> Acido Glucnico + H20 2

poroxidase 2H202 + 4-Aminoantipirina + Fenol --------------> Quinonimina + 4 H20

COMPOSIO DOS REAGENTES

1- Reagente: Tampo fosfato 182,42 mmol/L pH 7,0; GOD - Glicose Oxidase > 15000 U/L; POD - Peroxidase > 1200 U/L; 4-aminoantipirina 0,3 mmol/L; fenol 10 mmol/L.

2- Padro: Soluo de glicose (valor do padro: vide no rtulo do frasco) .

CONDIES DE ARMAZENAMENTO E ESTABILIDADE

Estabilidade: Estvel at a data de validade do kit que est impressa no rtulo da embalagem. No usar reagentes cuja data de validade tenha expirado. Conservar de 2 a 8 c. Os reagentes devem permanecer fora da temperatura especificada somente o tempo necessrio para a realizao dos testes. No congelar e manter ao abrigo da luz.

MATERIAL NECESSRIO NO FORNECIDO

Espectrofotmelro ou lotmetro para leituras a 505 nm (490-510). Pipetas de vidro e/ou automticas. Relgio ou cronmetro Tubos de ensaio.

CUIDADOS E PRECAUES

O kit destina-se somente para uso diagnstico in vitro. Os procedimentos higinicos normais para o manuseio de materiais bioqumicos devem ser observados.

As amostras a serem analisadas (soro ou plasma) devem ser tratadas como material potencialmente infeclante. Utilizar os EPl's de acordo com as Boas Prticas de Laboratrio Clnico. Descartar as sobras das reaes de acordo com as Boas Prticas de Laboratrio Clinico em local prprio para materiais potencialmente infectantes. Em caso de ingesto procurar atendimento mdico. As informaes de Descarte, Segurana e Primeiros Socorros esto descritas na Ficha Individua/ de Segurana de Produtos Qumicos (FISPQ) deste produto. No misturar diferentes lotes de reagentes. Usar pipetas de vidro e ponteiras descartveis separadas para cada amostra, controle, padro/calibrador e reagente. No trocar as tampas dos frascos dos reagentes, a fim de evitar contaminao cruzada. No usar o reagente quando este mostrar-se com sinais de contaminao. O nvel de gua do banho-maria deve ser superior ao dos tubos de ensaio que contm as reaes.

AMOSTRA - PREPARO E ESTABILIDADE

Soro e plasma (lluoreto): obtido no mximo duas horas aps a coleta para evitar a gliclise.

A glicose estvel por 3 dias de 2 a B C ou 2 meses a -20 c.

Liquor Utilizar amostra centrifugada.

PROCEDIMENTO TCNICO

A) PREPARAO DOS REAGENTES

Reagentes prontos para uso.

B) PROCEDIMENTO

1. Pioetar em tubos d ..... ..... . " ... """ " Branco Padro Amostra

1 Padro - 10 uL 1 Amostra - 10 L 1 Reaoente 1,0 mL 1,0mL 1,0mL

2. Homogeneizar bem e incubar os tubos durante 10 minutos a 37 2C. 3. Medir a absorbncia (Ap) do Padro e (Aa) da Amostra frente ao Branco a 505 nm. A cor estvel durante 1 hora.

PROCEDIMENTOS DE CALIBRAO/CLCULO

Clculos

t\A Amostra x Concentrao do Padro = mg/dl glicose t\A Padro

Com Fator:

Fator Calibrao (Fc) = Concentraco do PadrQ Absorbncia Padro

Glicose (mg/dL) = Absorbncia da amostra x Fc

Exemplo: Abs. amostra = 0,219 Abs padro = 0,302

Concentrao padro = 100 mg/dL

LINEARIDADE

glicose (mg/dL) = ! t

glicose (mg/dL) =

A linearidade da reao de 400 mg/dl. Para valores sur. a amostra com NaCI 150 mM (0,9%). realizar nova mulliplicar o resultado obtido pelo fator de diluio.

LIMITAES DA TCNICA

Hemlise, lctericia e Upemia

Hemoglobina~ 0,2 g/dL Bilirrubina ~ 40 mg/dL Triglicrides ~ 400 mg/dL

cido ascrbico~ 5 mg/dL CONTROLE INTERNO DA QUALIDADE

Todo laboratrio clinico deve manter um programa de con qualidade que defina claramente os objetivos, procedimer critrios para limites de tolerncia, aes corretivas 1 atividades. Ao mesmo tempo, deve ser mantido um sistem monitorar a variabilidade analtica que ocorre em tod medio. O uso de controles para avaliar a impreciso e a r determinaes deve ser prtica rotineira no laboratrio. Sug controle na faixa de referncia ou no nvel de deciso e outr valor em outra faixa de significncia clnica. A aplicao regras mltiplas de Westgard para avaliao do estac tambm recomendvel. O laboratrio deve participar de programas de contra qualidade, a exemplo daqueles oferecidos pela SBA Brasileira de Anlises Clinicas) e SBPC (Sociedade Brasilei Clnica).

VALORES DE REFERNCIA

Glicemia de ie Plasma (jejum de B horas) 1 100: _1_2s m.~'.dL 1 Glicemia de jej

Provvel DiabE

Uouor Glicemia de ie

Estes valores so unicamente orientativos, sendo recomem laboratrio estabelea seu prprio intervalo de referncia.

Converso para Unidade do Sistema Internacional (SI): rmnc Glicose (mg/dL) x 0,0556

Reviso

Data 03/04

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPRITO SANTO Fisiologia Humana - Curso de Farmcia - Perodo 2014/1

Professores: Prof! Dr3 gata Lages Gava (Coordenadora) - Prof Dr Roger Lyrio dos Santos Prof Horrio Assunto Agata 08-12h Apresentao da disciplina

Transporte atravs das membranas celulares Bioleletrognese do nervo - potencial de repouso, potencial de ao, propagao do potencial de a co

Agata 14-17h Fisiologia das sinapses, classificao e funes das fibras nervosas Contrao do msculo esaueltico e do msculo liso

Agata 08-12h Sistema somatossensorial - fisiologia dos receptores, codificao da informao sensorial , vias aferentes, crtex somatossensorial Bases fisiolaicas da dor

Roger 14-17h Orgos especiais dos sentidos: fisiologia da audio e viso rios especiais dos sentidos: fisioloaia do olfato e austaco

Roger 08-12h Funes motoras da medula espinhal e arcos reflexos Crtex motor, tronco cerebral e sistema vestibular

Roger 14-15:30h Aula prtica: Reflexos (turma 1) 15:30-17h Aula prtica: Reflexos (turma 2)

Roger 14-17h Funes motoras dos gnglios da base e cerebelo Sistema nervoso autnomo e a medula supra renal

Agata 08-12h Bioeletrognese cardaca Acoplamento excitaco contraco do msculo cardaco e contratilidade miocrdica

Roger 14-17h AVALIAAO DE NEUROFISIOLOGIA Agata 08-12h Ciclo e dbito cardaco

Biofsica da circulaco Roger 14-17h Microcirculao e trocas

Funces do sistema arterial e venoso Aiata 08-12h Regulao da circulao Agata 14-17h Aula prtica: medida da presso arterial Roaer Aula prtica: reatividade coronariana Agata 08-12h AVALIAO DE FISIOLOGIA CARDIOVASCULAR Roger 14-17h Mecnica respiratria, espao morto e ventilao alveolar

Trocas iasosas e transporte de iases Roger 08-1 Oh Aula prtica: Volumes e capacidades pulmonares (turma 1)

10-12h Aula prtica: Volumes e capacidades pulmonares (turma 2) Roger 14-17h Princpios gerais da funo do TGI e motilidade do TGI

Secrees do TGI Roger 08-12h Digesto e absoro de micro e macronutrientes

Funes Hepticas Agata 14-17h Formao da urina pelos rins: filtrao glomerular, fluxo sanguneo renal e processamento tubular

do filtrado glomerular Controle da excreco renal de sdio e aua: reaulaco do volume e da osmolaridade plasmtica

Agata 08-12h Controle da excreo renal de sdio e gua: regulao do volume e da osmolaridade plasmtica Equilbrio renal de potssio, clcio, fosfato e mainsio

Agata 14-17h Mecanismos de concentrao e diluio da urina Reaulaco do eauilbrio cido-base

Roger 08-10h Aula prtica: Diurese no homem (turma 1) 10-12h Aula prtica: Diurese no homem (turma 2)

Agata 08-12h AVALIAAO DE FISIOLOGIA RESPIRATORIA, RENAL E DIGESTORIA Agata 08-12h Mecanismos gerais de sntese e ao hormonal e eixo hipotlamo hipfise

Hormnio do crescimento Rogar 14-17h Fisiologia dos hormnios sexuais masculinos e femininos

Hormnios do crtex da adrenal Agata 08-12h Hormnios da tireide

Metabolismo do clcio e fosfato Agata 14-17h Regulao da glicemia

Hormnios reauladores do apetite e saciedade Agata 08-12h AVALIAAO DE FISIOLOGIA ENDOCRINA Agata 14-17h AVALIAAO SUBSTITUTIVA Aaata 08-11h Planto tira-dvidas Agata 13-17h AVALIAAO FINAL

~J - (; f ! t.O CI ,. / , , ,,,,..r .... ~ ,,.. Bibliografia recomendada: Tratado de Fisiologia Mdica, GuYton & Hall, 11 ed., Editora Elsevier

Fisiologia, Linda Costanzo, 4 ed, Editora Elsevier

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Avaliaes: 4 provas (9 pontos cada) + notas dos relatrios de aula prtica (1 ponto cada)