RNAナノスイッチ:目的の細胞を安全・ 簡便・精密 …...DNAを傷つけない...
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RNAナノスイッチ:目的の細胞を安全・
簡便・精密に同定・識別する新技術
京都大学 iPS 細胞研究所 (CiRA)未来生命科学開拓部門
齊藤 博英
1
京都大学 新技術説明会May 23, 2017
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本日お話したいこと
1. 標的の細胞を安全かつ精密に選別できる新技術、「マイクロRNAスイッチ」の紹介
特定の細胞内で発現するマイクロRNAを検知する合成RNAを利用することで、標的とする細胞を自在に選別・制御できる
2. 「マイクロRNAスイッチ」の応用例と産業応用への思い
iPS/ES細胞から分化した様々な細胞を精密に取得できる(成功例:心筋細胞、インスリン産生細胞、肝細胞など)
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iPS細胞研究所 (CiRA)
2010年4月設立
約30の研究グループ
およそ500名の研究者
3期棟が今春完成
未来生命科学開拓部門 (2015年度新部門)私のミッション:安全かつ精密な標的細胞の創出
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克服すべき“2つの課題”
ほぼ全ての細胞へ分化できる
ほぼ無限に増殖できる
幹細胞(ES/iPS)
様々な細胞が混在すると
遺伝子が損傷/細胞が残存すると 腫瘍形成の危険
【安全性の課題】
【精密性の課題】
目的細胞の取得が困難
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従来の細胞選別:抗体による方法
分化細胞(様々な種類の細胞が混在)
ヒトiPS細胞
特異的な表面抗原が同定されていない細胞種が多数存在
例) 心筋細胞、肝細胞、膵臓細胞 etc.
特異的な細胞表面抗原により選別
抗体
新たな細胞選別法の開発が重要!
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RNAスイッチの特徴
【安全性の課題】○ゲノム損傷の危険が回避【精密性の課題】○細胞内環境に応じた制御が可能
マイクロRNA
タンパク質発現制御
細胞質
核合成mRNA
DNAを傷つけない 速やかに分解される
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人工RNAの導入による細胞プログラミングにより
安全かつ精密な制御を可能にさせる
RNAスイッチによる標的細胞の選別と創出
本技術で達成したい課題
未分化
がん化 除去
除去
目的細胞A
目的細胞B
RNAスイッチ
安全かつ精密な制御
分化
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マイクロRNAスイッチ:細胞の選別
マイクロRNA: mRNAに結合することで遺伝子発現の抑制に関与
目的のmiRNAの相補的配列
レポーター人工mRNA
マイクロRNAスイッチ
マイクロRNA
核
目的のmiRNAがない細胞の
場合翻訳
目的のmiRNAがある細胞の
場合
マイクロRNA
核
mRNA分解
翻訳抑制
××
細胞が光る
細胞が光らない
蛍光タンパク質
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マイクロRNAスイッチの原理
FP2
FP1
マイクロRNAを発現していない細胞
FP2
FP1
FP2FP
1
マイクロRNAの発現に応じて標的細胞を精密に選別可能
2種類の人工mRNAを細胞に導入⇒細胞が発現する蛍光の比がほぼ一定になることを発見⇒ 特定のマイクロRNAを発現している細胞を精密に識別可能に !
マイクロRNAを発現している細胞
2種類の人工mRNAを細胞に導入
1. マイクロRNAスイッチmRNA(FP1発現を抑制)
2. コントロールmRNA(FP2を発現)
蛍光タンパク質(FP1) 蛍光タンパク質
(FP2)
HaLa細胞 (microRNA21を発現)と293細胞を分離した例
細長い帯状に分離
FP1が抑制
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Miki et al., Cell Stem Cell , 2015 (CiRA吉田研究室との共同研究)
心筋以外の細胞を自律的に除去
ヒトiPS細胞
ES細胞
抗体による選別(細胞表面)
RNAスイッチ(細胞内)
精製前
マイクロRNAスイッチによる心筋細胞の純化心筋細胞の選別率
(%)
機器 (FACS) を必要としない純化も可能!
細胞死誘導因子
ヘテロな細胞集団
心筋細胞の純化
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Purification of cardiomyocytes without cell sorting
セルソーターを用いた方法では大量の細胞数を得ることは難しい。
マイクロRNAスイッチによる心筋細胞の純化(大量純化法の確立)
心不全治療を想定した必要な心筋細胞数 数億個
セルソーターを用いない純化法の開発が重要!!
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Purification of cardiomyocytes without cell sorting
miR-Bimスイッチ
ピューロマイシン耐性mRNA +
Bim
Puror
導入
分化細胞集団
非心筋細胞
Bimによるアポトーシス誘導→細胞死
非導入細胞
培地中のピューロマイシン
→細胞死
→生存
心筋細胞
アポトーシス抑制
ピューロマイシン耐性
×
マイクロRNAスイッチによる心筋細胞の純化(アポトーシス誘導因子を利用した細胞純化法の確立)
0
20
40
60
80
100
心筋細胞陽性率
(%)
マイクロRNAスイッチ
非純化
409B2KhES1
201B7
cTNT 核 merge
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RNAスイッチの汎用性
肝細胞 膵臓細胞
アルブミン陽性細胞 インスリン陽性細胞
取得困難な細胞も選別が可能!
RNAスイッチは、細胞内の情報を検出し、標的細胞の精密な識別や運命制御など、様々な出力に対応できる!
心筋細胞
RNAスイッチで純化した心筋細胞
機器(FACS)なしで純化が可能!
選別
様々な細胞
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RNAスイッチの汎用性
EGFP
BFP
miR-122-5p switch
0
20
40
60
80
100
ALBUMIN+ cellsHNF4A+ cells ALBUMIN/Hoechst
bar: 100 mmmiR-122-5p w/o sortnegativefraction
% o
f cel
ls
肝細胞
EGFP
BFP
miR-375 switch
0
20
40
60
80
100
INS
ULI
N+
cells
(%)
miR-375 w/o sortnegativefraction
bar: 100 mm
INSULIN/Hoechst
インスリン産生細胞
取得困難な細胞も選別が可能!
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in vivo assays of purified cardiomyocytes by miRNA switch
心臓への移植 (生着試験)
精巣への移植(造腫瘍性試験)
ヒトiPS細胞 純化前分化細胞
移植後3ヶ月の心臓
純化した心筋細胞
1週 2週 4 週 12週
移植後
cTNT
核 Merge
ヒト核
移植後3ヶ月のマウス心臓
RNAスイッチによリ純化した心筋細胞の移植
100
80
60
40
20
0
腫瘍
形成
率(%
) 6/6
1/80/8
ヒトiPS細胞 純化前分化細胞
純化した心筋細胞
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Future possibility of miRNA switch
分化細胞集団
ヒトES/iPS細胞
インスリン産生細胞
肝細胞
内皮細胞
心筋細胞
RNAスイッチで選別できた細胞種
各細胞種特異的マイクロRNAスイッチ
細胞内を精密に識別!
マイクロRNAスイッチによる標的分化細胞の同定・純化
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iPS細胞を精密に識別
iPS細胞
残存するiPS細胞
危険な細胞(分化が不完全)
分化した細胞、安全な細胞
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iPS細胞の腫瘍形成リスクを下げる
RNAスイッチで未分化iPS細胞を除去すれば、腫瘍は形成されない
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miRNA switch has no significant harmful effects.RNAスイッチの安全性
発現タンパク質の残存
時間(h)導入後(日)
速やかに分解
マイクロRNAスイッチ(mRNA)の残存
24h 48h
BFP陽
性率
(%)
相対
発現
量(d
1=1)
相対
発現
量(非
導入
細胞
=1)
マイクロRNAスイッチ導入細胞
非導入細胞
細胞内ターゲットマイクロRNA量の変化
遺伝子発現への影響
miR-1スイッチ
非導入
d18心筋
d0ヒトiPS細胞
d25心
筋d1
9心筋
miR-1スイッチ
非導入
miR-1ターゲット遺伝子
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応用例 1) RNAスイッチによる標的細胞の純化・創出
RNAスイッチの産業応用にむけた戦略
目的細胞の純化・創出様々な細胞集団
神経細胞血球細胞
骨格筋
RNAスイッチ
応用例 2) 不要な細胞(がん細胞など)の選択的な死滅
人工RNAスイッチのin vitro モデル実験に成功 (Nature Biotechnology, 2015)標的細胞のみに細胞死を誘導!
細胞内を精密に識別!iPS/ES 細胞
分化
生存
細胞死
他の細胞
マイクロRNA-X +マイクロRNA-Y -
マイクロRNA-X -マイクロRNA-Y +
標的細胞(がん細胞など) マイクロRNA-X
マイクロRNA-Y
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RNAスイッチ:細胞選別のコア技術
神経細胞
心筋細胞
インスリン産生細胞
血液細胞
未分化iPS/ES細胞
骨格筋細胞
目的とする細胞を安全かつ精密に選別できる!
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RNAスイッチを未来医療へ
RNAスイッチのメリット 新分野開拓・産業応用
(1) 安全 (遺伝子を傷つけない)
(2) 精密 (細胞環境の検知が可能)
(3) プログラマブル(改変が容易、様々な細胞に対応)
(1) 新しい生命工学分野の開拓生きた細胞を精密に計測・制御
(2) 再生医療、創薬を加速これまで純化が不可能であった細胞(膵臓細胞など)を創出できる均一な細胞の調整、不要な細胞の除去を一気に解決
安全・精密な細胞創出技術により
再生医療や創薬を加速したい!
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企業への期待
• 未解決の「細胞の純化、選別」については、合成RNAの技術により克服できる 。
• 再生医療や細胞の選別に興味がある企業との共同研究を希望。
• また、細胞製造工場を開発中の企業、ヘルスケア分野への展開を考えている企業には、本技術の導入が有効と思われる。
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本技術に関する知的財産権 (代表特許)
• 発明の名称 :miRNAの発現を指標として所望の細胞種を判別する方法
• 出願番号 :PCT/JP2015/050467(2015/01/09)出願人 :京都大学
• 発明者 :齊藤博英 ほか
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お問い合わせ先
京都大学
iPS細胞研究所 齊藤博英研究室
• E-mail: [email protected]• TEL: 075-366-7029• FAX: 075-366-7096
様々な共同研究を通じて、産業応用を目指します!