RISULTATI DELLE ANALISI GENETICHE - RELAZIONE FINALE · 2003), assumendo l'esistenza di 3...
Transcript of RISULTATI DELLE ANALISI GENETICHE - RELAZIONE FINALE · 2003), assumendo l'esistenza di 3...
LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF
Azione A3 – Caratterizzazione genetica e morfologica degli ibridi
RISULTATI DELLE ANALISI GENETICHE -
RELAZIONE FINALE
Chiara Braschi, Luigi Boitani
Dipartimento di Biologia e Biotecnologie “Charles Darwin”
Università di Roma “La Sapienza”
31 Ottobre 2013
Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF - Azione A3
Risultati analisi genetiche
Indice
PREMESSA:......................................................................................................................2
1. RISSUNTO:....................................................................................................................3
2. MATERIALI E METODI..................................................................................................5
2.1 Analisi del DNA mitocondriale...........................................................................5
2.2 Analisi del DNA microsatellite............................................................................5
2.3 Analisi dei loci microsatellite sul cromosoma Y.................................................7
2.4 Analisi del locus-K...............................................................................................7
3. RISULTATI:....................................................................................................................8
3.1 Analisi del DNA mitocondriale...........................................................................8
3.2 Analisi del DNA microsatellite............................................................................9
3.3 Analisi dei loci microsatellite sul cromosoma Y...............................................12
3.4 Analisi del locus K.............................................................................................12
3.5 Integrazione dei risultati ottenuti con le varie metodologie di indagine........13
IMMAGINE 1..........................................................................................................17
IMMAGINE 2..........................................................................................................17
IMMAGINE 3..........................................................................................................18
IMMAGINE 4..........................................................................................................18
IMMAGINE 5..........................................................................................................19
IMMAGINE 6..........................................................................................................19
4. DISCUSSIONE:............................................................................................................20
5. BIBLIOGRAFIA.............................................................................................................24
1
Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF - Azione A3
Risultati analisi genetiche
PREMESSA:
La presente relazione va intesa come parte integrante della “Relazione tecnica delle
azioni A3 e A4” ultimata a luglio 2012.
I risultati esposti costituiscono un riepilogo delle analisi genetiche effettuate da due
laboratori di analisi differenti (l' U.S Forest Service, Rocky Mountain Research Station,
Montana, Stati Uniti e il Centro de Investigação em Biodiversidade e Recursos
Genéticos, CIBIO, Università di Porto, Portogallo) su un campione di 110 escrementi e
25 resti biologici di esemplari di canidi (Allegato 1). Tutti gli escrementi sono stati
raccolti nel territorio della Provincia di Grosseto nel periodo compreso tra gennaio
2012 e aprile 2013. Il periodo di riferimento è più esteso rispetto a quanto riportato
nella relazione finale delle azioni A3 e A4 dato che si è tenuto conto anche delle analisi
genetiche effettuate su campioni raccolti successivamente al 30 giugno 2012, data di
termine delle azioni A3 e A4.
Per quanto riguarda i campioni biologici, la maggior parte di questi deriva da esemplari
rinvenuti morti nel corso della indagine conoscitiva effettuata nell'ambito delle azioni
A3 e A4 o rinvenuti nel recente passato (dal 2010 al 2013) da altri operatori nell'area
della Provincia di Grosseto e nelle aree a questa confinanti. Alcuni di questi individui
campionati presentavano caratteristiche fenotipiche attribuibili ad un possibile evento
di ibridazione, generalmente identificabili in una colorazione scura del mantello e
dall'assenza della mascherina facciale (ad esempio gli esemplari corrispondenti ai
campioni CAPI 5, CAPI 16, CAPI 164, CAPI 18, Immagini 1 - 4 ).
Il dettaglio delle analisi genetiche effettuate sui campioni invasivi (CI) ovvero resti
biologici, e non invasivi (NI), ovvero escrementi, sono riportate nel paragrafo
“Materiali e Metodi”.
2
Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF - Azione A3
Risultati analisi genetiche
1. RISSUNTO:
Le analisi genetiche effettuate su un campione di 110 escrementi (CNI) e 25 resti
biologici (CI), corrispondenti a 135 campioni totali di esemplari di canidi rinvenuti dal
2010 al 2013 nella provincia di Grosseto e nelle aree a questa immediatamente
limitrofe (province di Siena e di Firenze, aree confinanti con il territorio della provincia
di Grosseto) hanno fornito i seguenti risultati:
1. Sono stati individuati complessivamente 57 genotipi che corrispondono ad un
numero compreso tra 17 e 20 esemplari introgressi e ad un numero compreso tra 29 e
32 lupi a seconda del valore soglia che viene utilizzato per definire la classe di
appartenenza nei test di assegnazione (rispettivamente qi≥0,95 e qi>0,975). I cani
individuati sono invece solamente 7 (12,3% del campione), mentre per un esemplare
non è stato possibile determinare la classe di appartenenza.
2. Il numero di esemplari introgressi aumenta (n = 18 e 21 a seconda del valore
soglia utilizzato) se si tiene conto anche delle analisi effettuate presso ISPRA che
includono l'esemplare CAPI 15 come individuo originato da un reincrocio di
generazione successiva alla seconda (Immagine 6).
3. Escludendo dal totale di esemplari introgressi gli animali morti o catturati (che
non fanno più parte delle popolazione attuale), e limitandosi ai campioni raccolti negli
anni 2012 e 2013 nella Provincia di Grosseto, dai risultati delle analisi genetiche
effettuate dai laboratori americano e portoghese e da ISPRA si evince che attualmente
sono presenti nell'area della Provincia di Grosseto almeno 11 esemplari ibridi.
4. Il sesso degli animali è stato determinato per 37 individui che corrispondono a
16 femmine e 21 maschi.
5. Dato che i campioni sono stati raccolti solamente nelle aree montane e
boschive, distanti dai centri abitati, il numero di cani campionati non è assolutamente
rappresentativo del numero effettivamente presente di cani vaganti nel territorio.
6. Per entrambi i valori soglia considerati (qi≥0.95 e qi>0.975) 8 esemplari
introgressi hanno mostrato evidenze genetiche di ibridazione contemporaneamente
rilevabili in più di un marcatore genetico.
7. Quattro dei cinque animali per i quali è noto l'aspetto morfologico e per i quali
sono state rilevate evidenze fenotipiche attribuibili ad un evento di ibridazione
presentano evidenze di ibridazione in almeno un marcatore genetico tra quelli
analizzati.
8. Per 2 campioni è stato possibile confrontare i risultati delle analisi genetiche
effettuate presso il CIBIO con quelle effettuate da ISPRA (CAPI 15 e CAPI 16), e in
entrambi i casi è stato riscontrato un diverso valore di attribuzione alla popolazione di
lupi (qi) degli esemplari campionati, sottolineando come le routine di laboratorio
abbiano un effetto significativo sulle probabilità di individuare di individui introgressi.
9. Nei casi in cui l'individuo introgresso derivi da un reincrocio di seconda o
successiva generazione la sua identificazione su base genetica diventa problematica e
le tecniche genetiche attualmente utilizzate sono piuttosto limitate nella possibilità di
risalire alla generazione di ibridazione originale. Dalle analisi effettuate risulta infatti
che solamente un campione (EPI 152; il 2,4% del campione analizzato) può essere
3
Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF - Azione A3
Risultati analisi genetiche
assegnato con relativa certezza alla classe F2 (ibrido di seconda generazione); tutti gli
altri individui risultati geneticamente introgressi (il 95% del campione di introgressi)
sono quindi da ascrivere a successive generazioni di reincrocio.
Dai risultati delle analisi effettuate è possibile formulare alcune considerazioni di
carattere generale che costituiscono un utile riferimento ai fini della gestione della
problematica della ibridazione cane-lupo nella Provincia di Grosseto:
• Si è rilevata una elevata percentuale di individui, tra quelli campionati nella
Provincia di Grosseto, che presentano almeno una evidenza genetica di
introgressione. Sebbene questo non costituisca una evidenza inequivocabile di
ibridazione recente, conferma i dubbi iniziali che hanno portato alla
formulazione del presente progetto.
• In tale contesto va tenuto presente che il grado di introgressione rilevato nella
popolazione campionata costituisce una stima approssimativa del numero
effettivo di individui ibridi cane-lupo presenti nella popolazione, dato che le
analisi genetiche, per quanto accurate esse siano, non riescono spesso ad
individuare individui introgressi generati da generazioni successive alla
seconda.
• Inoltre i marcatori genetici attualmente utilizzati per determinare il grado di
introgressione del genoma di cane nella popolazione di lupo non consentono di
stabilire quando sia avvenuta questa introgressione, ovvero non sono in grado
di definire con certezza la classe di appartenenza dell'esemplare campionato,
qualora questo appartenga ad una generazione di reincrocio successiva alla
seconda (F2).
• Diventa pertanto prioritario per l'immediato futuro individuare un approccio di
diagnosi integrativo e complementare alle analisi genetiche che abbia risvolti
pratici maggiormente applicabili in un contesto gestionale, partendo dalla
premessa che la possibilità di identificare in maniera affidabile gli individui
ibridi e introgressi all’interno di una popolazione sia fondamentale per
impostare correttamente una strategia di gestione.
• Tale approccio deve prevedere, oltre alla utilizzazione di più marcatori genetici,
l'integrazione del dato genetico con l'aspetto fenotipico in modo da
incrementarne i rispettivi poteri diagnostici per l’individuazione di esemplari
ibridi.
• Dal punto di vista gestionale, e in considerazione della elevata proporzione di
ibridi/introgressi di generazione successiva alla seconda (F2) rilevati nel
territorio provinciale, deve essere contemplata la possibilità che esemplari
ibridi vengano considerati tali a prescindere dal tempo generazionale
determinabile su sola base genetica.
4
Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF - Azione A3
Risultati analisi genetiche
2. MATERIALI E METODI
Il DNA è stato estratto dai CI mediante il kit “DNeasy Blood & Tissue Kit” (Qiagen)
eseguendo le istruzioni indicate dalla casa produttrice. Il DNA dei CNI è stato invece
estratto seguendo i protocolli descritti da Frantz et al. (2003) and Boom et al. (1990).
Al fine di prevenire eventuali casi di contaminazione, tutte le fasi precedenti alla
amplificazione con PCR sono state condotte in un laboratorio appositamente destinato
alla manipolazione di DNA di ridotta qualità, caratterizzato da ambiente sterile e da
una favorevole pressione dell'aria. Durante l'intero processo sono stati effettuati
controlli al fine di scongiurare la contaminazione di DNA appartenente ad individui
diversi. La qualità di DNA estratto dai campione fecali è stata determinata
dall'amplificazione di un frammento di una regione ipervariabile di DNA mitocondriale
di 420bp (HV1; Vilà et al. 1999) ed effettuando quattro repliche di tre microsatelliti.
Sono stati successivamente utilizzati per l'intero processo solamente quei CNI che
erano stati genotipizzati con successo per i tre marcatori descritti.
Una volta estratto il DNA, i 110 CNI ed i 25 CI sono stati analizzati applicando le
seguenti analisi genetiche:
2.1 Analisi del DNA mitocondriale
L'analisi del DNA mitocondriale consente di attribuire l'appartenenza del campione alla
popolazione di lupo o di cane domestico in base alla individuazione di un aplotipo
diagnostico. Più specificamente, se viene rilevato nel campione l'aplotipo W14 che
costituisce l'aplotipo unico per il lupo in Italia (Randi et al. 2000), viene confermata
l’appartenenza del campione alla specie lupo o cane, mentre se vengono rilevati
aplotipi esclusivi del cane, il campione viene attribuito unicamente alla popolazione di
cane domestico. Essendo il DNA mitocondriale ereditato per via materna consente, nel
caso di individui ibridi, di comprendere la direzionalità (via materna o paterna) della
ibridazione.
2.2 Analisi del DNA microsatellite
L'analisi del DNA microsatellite consente di identificare il genoma degli animali e
fornisce pertanto informazioni sul numero di individui campionati. Attraverso l'analisi
del DNA microsatellite è inoltre possibile ottenere informazioni relative alla potenziale
origine degli animali campionati, ovvero stabilire la probabilità di assegnazione di un
individuo ad una popolazione distinta (lupi, cani, ibridi).
Per quanto riguarda i CNI, i genotipi ripetuti sono stati identificati utilizzando GIMLET
(Valière 2002) e sono stati esclusi dall'analisi. E' stata inoltre stimata, sempre tramite
GIMLET, la probabilità di identità (PID) e la probabilità attesa tra fratelli full-sibling
(PIDsib). Nel caso di campioni con DNA non degenerato (CI), il genotipo degli individui è
stato determinato utilizzando un pannello di 53 loci microsatelliti. Per l'analisi di tutti
gli escrementi ed alcuni CI è stato invece utilizzato un pannello di soli 16 loci. I sedici
marcatori sono stati selezionati in base a: i) valore di F (Fst values) tra lupo e cane per
5
Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF - Azione A3
Risultati analisi genetiche
14 marcatori e ii) probabilità di identità (PID) per due loci in modo tale da
incrementare il potere di identificazione del genotipo individuale. Infine, per i CNI, il
sesso degli individui è stato determinato utilizzando il test molecolare proposto da
Seddon (2005).
Per entrambi i pannelli di loci (53 e 16) i genotipi individuali sono stati analizzati
utilizzando la procedura Bayesiana cluster utilizzata in STRUCTURE 2.3.3 (Falush et al.
2003), assumendo l'esistenza di 3 popolazioni (K = 3), ovvero la popolazione italiana di
lupi, la popolazione europea di lupi e la popolazione di cani (Fig. 1). Una volta definiti i
cluster, il programma utilizzato (STRUCTURE) assegna le probabilità di appartenenza ai
cluster di genotipi individuali in base alla loro composizione. I genotipi le cui frequenze
alleliche hanno probabilità non trascurabili di appartenere a due o più cluster sono
identificati come potenziali ibridi. Questa analisi è stata realizzata per 20 repliche
indipendenti per 106 interazioni, dopo un periodo di “burn-in” pari a 105 interazioni,
utilizzando per la identificazione degli individui un modello misto che includeva sia
frequenze alleliche correlate all'interno della popolazione sia frequenze alleliche senza
precedenti. Il risultato di questo procedimento ha portato a definire, per ogni
individuo, la probabilità di assegnazione ad un determinato cluster (qi) ed il relativo
intervallo di confidenza al 90%. Oltre a STRUCTURE è stato utilizzato il programma
NEWHYBRIDS (Anderson e Thompson 2002) che, partendo da un pannello di 16 loci,
stima la probabilità di un genotipo individuale di appartenere ad una popolazione
parentale (cane o lupo) o ad un gruppo ibrido, distinguendo, nel secondo caso, 4
possibili classi d’appartenenza (F1 = ibrido di prima generazione; F2 = ibrido di seconda
generazione; Bx2W = reicnrocio con un lupo; Bx2D = reicnrocio con un cane; Godinho
et al. 2011)
Al fine di determinare la caratterizzazione genetica delle popolazioni parentali,
necessaria per definire il test di assegnazione e le probabilità di assegnazione ai
cluster, sono stati analizzati 40 campioni appartenenti alla popolazione di lupo italiana
(campionati in tutta Italia) e 17 campioni di cani italiani (popolazione di cani randagi e
cani da pastore campionati nella Provincia di Grosseto e nelle aree a questa limitrofe).
Sono stati inoltre analizzati 21 campioni di lupi europei (campioni provenienti da
Romania, Spagna, Portogallo, Slovenia e Russia) e 181 campioni di cani randagi e razze
da pastore appartenenti alla popolazione di cani iberici. I dati sono stati inoltre
analizzati con la PCA (Analisi delle Componenti Principali) per visualizzare il pattern di
differenziazione tra campioni di lupi iberici, campioni di lupi italiani, campioni di lupi
europei e cani utilizzando GenAlex 6.501 (Peakall &Smouse 2012).
6
Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF - Azione A3
Risultati analisi genetiche
Figura 1. Probabilità di assegnazione (qi) ai cluster genetici utilizzando la procedura
Bayesiana con K=3 (popolazione di lupi italiani in rosso, popolazione di lupi europei in
verde, cani italiani ed europei in blu) utilizzando un pannello a 16 loci e a 53 loci. Ogni
individuo è rappresentato da una linea verticale frammentata in tre sezioni che
corrispondono alla proporzione relativa di appartenenza dell'individuo ad ogni cluster
genetico: lupi italiani in grigio, lupi europei in blu e cani in arancione.
2.3 Analisi dei loci microsatellite sul cromosoma Y
Per gli individui maschi campionati è stato possibile effettuare l'analisi di 6 loci
microsatellite associati tra loro e presenti sul cromosoma Y (Sundqvist et al. 2001;
Bannasch et al. 2005) che risultano spesso sufficientemente differenti tra la
popolazione locale di lupo ed i cani (Sundqvist et al. 2001). La presenza di aplotipi tipici
dei cani nel genoma di esemplari di lupi costituisce una evidenza di introgressione per
via paterna (Iacolina et al. 2010).
2.4 Analisi del locus-KL'analisi del locus K consiste nella identificazione di individui eterozigoti che
presentano la mutazione β-Defensin (mutazione KB del gene). Tale mutazione,
correlata alla colorazione nera del mantello, è assente nella popolazione selvatica di
lupo (Caniglia et al, 2013) e costituisce, in italia, una evidenza genetica di un evento
recente di introgressione con il genoma di cane domestico portatore di questa variante
genetica (Candille et al. 2007; Greco 2009). La mutazione KB del gene è stata ricercata
in tutti i campioni (sia CI che CNI) utilizzando i primers suggeriti da Caniglia et al.
(2013).
7
Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF - Azione A3
Risultati analisi genetiche
3. RISULTATI:
La resa complessiva delle analisi effettuate sui CNI è risultata piuttosto elevata e dei
110 campioni fecali inviati, solamente 16 (14,5%) contenevano quantità di DNA troppo
ridotta per poter essere analizzata. Sui restanti 94 campioni (85,5%) è stata effettuata
l'analisi integrando, quando possibile, diversi marcatori genetici.
La resa complessiva delle analisi effettuate sui CI è risultata molto elevata e tutti i 25
campioni inviati sono stati analizzati utilizzando diversi marcatori genetici. La resa
relativa delle analisi effettuate sui CI è stata particolarmente elevata per l'analisi del
DNA mitocondriale (23 campioni analizzati, 92% del totale dei CI) e leggermente
inferiore per l'analisi del DNA microsatellite con un pannello di 16 loci (17 campioni
analizzati, 68 % del totale) e 53 loci (12 campioni analizzati, 48 % del totale) e del locus
K (19 campioni analizzati, 76% del totale).
3.1 Analisi del DNA mitocondrialeAttraverso l'analisi del DNA mitocondriale è stato sequenziato il DNA rinvenuto in 94
escrementi (85,4% del campione) e in 23 CI (92% del campione). La maggioranza dei
CNI (87 campioni) presentava l'aplotipo W14, 5 campioni presentavano un aplotipo di
origine canina, mentre per due campioni il DNA è risultato contaminato dal DNA
appartenente ad una specie predata (Capriolo; Capreolus capreolus) e non ha fornito
risultati. Per quanto riguarda i CI, 19 presentavano un aplotipo W14 e 2 campioni un
aplotipo di cane. Questi due campioni appartenevano rispettivamente ad un esemplare
rinvenuto morto in cattivo stato di conservazione ma con una dimensione cranica più
simile a quella del cane che del lupo (CAPI 01), mentre il secondo (SPI 04) apparteneva
ad un cane meticcio catturato presso una discarica nel comune di Manciano. Per il
campione di pelo CAPI 04 non è stato possibile individuare il DNA dell'individuo perchè
contaminato dal DNA di peli di lepre (Lepus sp.). Il campione di tessuto CAPI 08
presentava invece l'aplotipo di lupo W16 che è stato osservato nelle popolazioni di lupi
in Europa e mai nella popolazione di lupi in Italia (Randi et al. 2000) (Tab 1 ). La
presenza dell'aplotipo W14 nella maggior parte degli individui campionati è in accordo
con quanto osservato in Italia dove tutti gli ibridi fino ad oggi rilevati mostrano
l'aplotipo mitocondriale del lupo (Ciucci, 2012).
TIPOLOGIA DI
CAMPIONE N
Presenza
aplotipo W14
Presenza
aplotipo W16
Presenza
aplotipo di
cane
Poco
DNA Prede
CNI 110 87 5 16 2
CI 25 19 1 2 2 1
Totale 135 106 11 7 18 3
Tabella 1. Risultati delle analisi del DNA mitocondriale.
1Il campione che presentava l'aplotipo w16 (CAPI 008) possedeva anche alleli precedentemente mai
osservati nella popolazione di lupi italiana
8
Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF - Azione A3
Risultati analisi genetiche
3.2 Analisi del DNA microsatellite12 CI sono stati analizzati utilizzando sia un pannello di 16 loci che uno di 53 loci
mentre per 5 CI e per tutti i CNI (24 campioni) corrispondenti ad un totale di 41
campioni complessivi è stato utilizzato un pannello di 16 loci a causa del DNA
altamente degradato di questi campioni (Allegato 2).
Utilizzando come soglia per l'attribuzione degli individui campionati alla popolazione di
lupi il valore generalmente usato in statistica qi≥0.95 (Tab. 2), solamente 2 CI, che
corrispondono al 16,7 % dei 12 CI analizzati con un pannello a 53 loci, non possono
essere attribuiti alla popolazione di lupi italiani. Per quanto riguarda invece il totale di
campioni (CI più CNI) analizzati utilizzando un pannello a 16 loci, 5 campioni (1 CI e 4
CNI; Tab 2) che corrispondono al 12,2% dei 41 campioni complessivi analizzati con un
pannello a 16 loci non possono essere attribuiti alla popolazione di lupi italiani.
CAMPIONE STRUCTURE
16 loci
STRUCTURE
53 loci
NEWHYBRID Note
Epi_152 0,293 W = 0,000
F2 = 0,888
Epi_153 0,948 W = 0,894
Bx2W = 0,103
Epi_119 0,94 W = 0,896
Bx2W = 0,100
Epi_014 0,040 W = 0,000
D = 0,984
Capi_165 0,909 W = 0,826
Bx2W = 0,166
Capi_06 0,996
%Missing -0,37
0,889
%Missing -0,47
W = 0,998 Elevata % di “missing data”
per entrambi i pannelli di loci.
Il risultato non è affidabile
Capi_10 0,980 0,926 W = 0,995
Tabella 2. Campioni con un valore q<0.95 rilevati tramite il programma STRUCTURE
utilizzando rispettivamente un pannello di 53 loci ed uno di 16 loci. Per questi campioni
è stato riportato anche il valore ottenuto con il programma NEWHYBRIDS (W =
probabilità di assegnazione alla popolazione di lupi, D = probabilità di assegnazione
alla popolazione di cani, F2 = probabilità di assegnazione alla popolazione di ibridi di
seconda generazione, Bx2W = probabilità di assegnazione alla popolazione di
reincrocio di seconda generazione).
Considerando invece come valore soglia qi>0.975, che costituisce un valore arbitrario al
pari di qi≥0.95 ma consente di includere nella categoria di possibili ibridi anche animali
con valore compreso tra 0.95≤qi <0.975, riducendo la probabilità di incorrere in errori
di tipo II (ovvero non riconoscere un ibrido come tale; Allendorf et al. 2001), il numero
di campioni che non possono essere attribuiti alla popolazione italiana di lupi aumenta
sensibilmente per entrambi i pannelli di loci utilizzati (Tab. 3).
9
Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF - Azione A3
Risultati analisi genetiche
CAMPIONE STRUCTURE
16 loci
STRUCTURE
53 loci
NEWHYBRID NOTE
Epi_152 0,293 W = 0,000
F2 = 0,888
Epi_153 0,948 W = 0,894
Bx2W = 0,103
Epi_159 0,963 W = 0,895
Bx2W = 0,102
Non rilevato con qi<0.95
Epi_118 0,962 W = 0,975 Non rilevato con qi<0.95
Epi_119 0,944 W = 0,896
Bx2W = 0,100
Epi_014 0,040 W = 0,000
D = 0,984
qi di attribuzione alla
popolazione di cani = 0,900
Capi_164 0,952 W = 0,949
Bx2W = 0,048
Non rilevato con qi<0.95
Capi 165 0,909 W = 0,826
Bx2W = 0,166
Capi_09 0,974 0,994 W = 0,970 Non rilevato con qi<0.95
Capi_06 0,996
%Missing
-0,37
0,889
%Missing
-0,47
W = 0,998 Elevata % di “missing data”
per entrambi i pannelli di loci.
Il risultato non è affidabile
Capi_10 0,980 0,926 W = 0,995
Capi_11 0,994 0,967
%Missing
-0,39
W = 0,995 Non rilevato con qi<0.95, ma
l'elevata % di “missing data”
rende il risultato non
affidabile per un pannello di
53 loci.
Capi_12 0,994 W = 0,997 Non rilevato con qi<0.95
Capi_13 0,994 0,952 W = 0,998 Non rilevato con qi<0.95
Tabella 3. Campioni con un valore qi<0.975 rilevati tramite il programma STRUCTURE
utilizzando rispettivamente un pannello di 53 loci ed uno di 16 loci. Per questi campioni
è stato riportato anche il valore ottenuto con il programma NEWHYBRIDS (W =
probabilità di assegnazione alla popolazione di lupi, F2 = probabilità di assegnazione
alla popolazione di ibridi di seconda generazione, Bx2W = probabilità di assegnazione
alla popolazione di reincrocio di seconda generazione).
Nel caso di analisi effettuate con un pannello a 53 loci, 5 CI, che corrispondono al
41,6% dei 12 CI analizzati, non possono essere attribuiti alla popolazione italiana di
lupi. Utilizzando invece un pannello di 16 loci, 9 campioni complessivi (3 CI e 6 CNI) che
corrispondono al 21,9% dei 41 campioni complessivi analizzati non possono essere
attribuiti alla popolazione di lupi italiani.
Va fatto presente che i CI CAPI 10, CAPI 12 e CAPI 13, che da una preliminare analisi
con un pannello a 16 loci avevano evidenziato una elevata probabilità di assegnazione
alla popolazione di lupi italiana (qi compresa tra 0.980 e 0.996) hanno mostrato una
probabilità di assegnazione più ridotta con un'analisi a 53 loci (qi compresa tra 0.926 e
0.958), risultato che porta a considerare questi campioni come non assegnabili alla
popolazione di lupo italiano (Tab. 3). Anche per i CI CAPI 06 e CAPI 11 si osserva un
10
Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF - Azione A3
Risultati analisi genetiche
risultato analogo (qi pari rispettivamente a 0.889 e 0.967) ma in entrambi questi casi la
percentuale di dati mancanti nella individuazione del genoma (%Missing) con un
pannello a 53 loci è piuttosto elevata (> del 25%) e questo potrebbe essere
interpretato come una sottostima della probabilità di attribuzione degli esemplari ad
un dato cluster. Pertanto l'esito delle analisi con un pannello a 53 loci per questi due
campioni non è affidabile e deve necessariamente essere escluso dal computo finale. Il
Nel caso di CAPI 06 neanche l'esito ottenuto con un pannello a 16 loci (%Missing = -37)
può essere ritenuto affidabile. Pertanto il campione non può essere attribuito con
certezza a nessuna classe per entrambi i set di loci utilizzati.
Analizzando con NEWHYBRIDS i campioni che, in base alle analisi effettuate con
STRUCTURE, sono risultati non assegnabili alla popolazione italiana di lupi utilizzando
un pannello di 16 loci e come valore soglia qi ≥0.95 (n = 5; Tab. 2), tutti e 5 i campioni
hanno rilevato una bassa probabilità di essere assegnati alla popolazione italiana di
lupi (W <0.95; valori compresi tra W = 0,000 e W = 0,896). Di questi campioni, uno (EPI
152) corrisponde probabilmente ad un individuo ibrido di seconda generazione (F2 =
0,88), 3 campioni (EPI 119, EPI 153 e CAPI 165) corrispondono ad esemplari originati da
reincroci di generazione successiva alla seconda (valore di Bx2W compreso tra 0,166 e
0,100), ed uno (EPI 14) corrisponde ad un esemplare di cane (D = 0,984).
Ripetendo lo stesso confronto utilizzando un pannello di 16 loci e come valore soglia qi
>0.975 (n = 9, W <0.975, valori compresi tra W = 0,000 e W = 0,949; Tab. 3), si osserva
che anche i campioni EPI 159 e CAPI 164 corrispondono probabilmente ad esemplari
originati da reincroci di generazione successiva alla seconda (valore di Bx2W
rispettivamente pari a 0,102 e 0,048), mentre per i campioni EPI 118 e CAPI 09 non è
possibile determinare, tramite NEWHYBRIDS, la generazione di appartenenza degli
individui.
Si fa infine presente che il campione EPI 55, attribuito alla popolazione italiana di lupi
in base all'analisi dei loci microsatellite (pannello a 16 loci, qi = 0,981) presenta una
probabilità non trascurabile di derivare da un reincrocio di generazione successiva alla
seconda in base all'analisi con NEWHYBRIDS (W = 0,944, Bx2W = 0,0539; Allegati 2 e 3).
Dalle analisi del DNA microsatellite è stato possibile complessivamente determinare il
genotipo di 73 campioni, che corrispondono a 57 individui distinti campionati nella
Provincia di Grosseto dal 2010 a fine aprile 2013.
Il sesso è stato identificato in 37 individui evidenziando un rapporto sessi pari a 16
femmine e 21 maschi. I singoli individui sono stati campionati da un minimo di una
volta (n = 45) ad un massimo di 4 volte (n = 1). Tre individui sono stati campionati 2
volte e 8 individui 3 volte.
Di tutti gli individui identificati, 13 corrispondono ad esemplari rinvenuti morti (n = 12)
o mantenuti in cattività (n = 1). Pertanto tali individui non fanno più parte della attuale
popolazione di canidi vaganti nella provincia di Grosseto.
11
Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF - Azione A3
Risultati analisi genetiche
3.3 Analisi dei loci microsatellite sul cromosoma Y
Per 7 CI e 16 CNI è stato possibile analizzare 6 loci microsatellite associati presenti sul
cromosoma Y. I risultati relativi all'analisi dei CI hanno evidenziato la presenza di un
aplotipo Y chiaramente appartenente alla popolazione di lupi italiani (corrispondente
alle due linee paterne più frequentemente documentate da Iacolina et al. 2010, ovvero
WY1 e WY2) in 5 individui (71,4% del campione) mentre 2 CI (28,5% del campione), che
corrispondono entrambi al genotipo CAPI 05, presentavano l'aplotipo Y3 che
generalmente non viene riscontrato nella popolazione di lupi italiani ma costituisce
invece l'aplotipo più comune nella popolazione di cane domestico (Iacolina et al. 2010).
Tuttavia, l'analisi del DNA microsatellite di questo esemplare ha rilevato una elevata
probabilità di attribuzione alla popolazione di lupo per entrambi i valori soglia utilizzati
(qi = 0,977 con un pannello a 16 loci e qi = 0,995 con un pannello a 53 loci),
nonostante l'individuo presentasse inoltre la delezione del locus K e mostrasse una
colorazione anomala del mantello (cfr § 3.4; Tabelle 4 e 5; Immagine 1).
Per quanto riguarda i CNI, 7 campioni (43,7% del campione) hanno evidenziato un
aplotipo Y da lupo e 9 escrementi (56,2% del campione), appartenenti
complessivamente a 5 individui diversi (EPI 14, EPI 119, EPI 130, EPI 152, EPI 153;
Allegato 1), hanno rilevato invece un aplotipo caratteristico del cane, presente sia nella
popolazione di cani italiani che iberici (DY2 e DY5; Tabelle 4 e 5). In base alle analisi
effettuate con altri marcatori genetici, l'esemplare CAPI 14 è risultato essere un cane
(qi di attribuzione alla popolazione di cani = 0,900 ), l'esemplare corrispondente al
campione EPI 152 è probabilmente un ibrido di seconda generazione (F2 = 0,888)
mentre gli esemplari EPI 153 ed EPI 119 sono probabilmente originati da un reincrocio
di generazione successiva alla seconda (Bx2W rispettivamente pari a 0,103 e 0,100).
Per l'esemplare EPI 130, seppur rappresentato da 4 campioni non invasivi (EPI 130, EPI
135, EPI 139 ed EPI 141), non sono state rilevate ulteriori evidenze genetiche tali da
poter definire una specifica classe di ibridazione, anche a causa del DNA altamente
degradato che non ha consentito di effettuare l'analisi del DNA microsatellite di 4
campioni sui 5 disponibili (Allegati 2 e 3).
3.4 Analisi del locus K
L'analisi del locus K ha avuto una resa estremamente ridotta ed è stata effettuata
complessivamente su 54 campioni (19 CI e 35 CNI). L'allele mutato corrispondente alla
colorazione nera del pelo (KB) è stato trovato in 9 CI (47,4% del campione) e in 10 CNI
(28,6% del campione) sempre in eterozigosi. Solamente una volta (CAPI 017) è stata
individuata la forma omozigote del locus K (KB/K
B), anche se tale risultato potrebbe
essere derivato dalla presenza di pseudoalleli, considerando che i risultati ottenuti
dall'analisi dei campioni CAPI 16 e SPI 02, appartenenti allo stesso esemplare, hanno
invece mostrato l'eterozigosi del locus K. La delezione del locus K rappresenta
comunque l'unica evidenza genetica di introgerssione con il genoma di cane per
l'esemplare corrispondente ai campioni CAPI 16 e CAPI 17, per i quali l'analisi del DNA
microsatellite con un pannello a 16 loci ha fornito, in entrambi i casi, una probabilità di
12
Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF - Azione A3
Risultati analisi genetiche
attribuzione alla popolazione di lupi elevata (qi = 0,997) per i due valori soglia
considerati (qi≥0.95 e qi>0.975), sebbene con limiti fiduciali relativamente ampi (min
0,981- max 1,000; Allegato 2).
Tutti i genotipi che presentavano un aplotipo Y caratteristico del cane presentavano
anche l'allele K mutato (Allegato 1). Solamente in un caso (EPI 14) l'aplotipo Y del cane
non era associato alla mutazione dell'allele K. Questo risultato non sorprende, dato che
non tutte le razze di cane domestico sono portatori di questa delezione.
Comparando l'analisi del locus K con le altre analisi effettuate (Tab. 3), si osserva che
quasi tutti i CI che presentano una ridotta probabilità di essere assegnati alla
popolazione di lupi e di cani domestici considerando il valore soglia qi>0.975 (n = 4;
Tab. 5) riportano anche la mutazione del locus K. Lo stesso risultato non si ottiene
invece considerando il valore soglia qi≥0.95,
Solo il CI CAPI 16 ha rilevato la mutazione del locus K non associata a nessun altra
evidenza genetica di introgressione con il genoma del cane domestico, nonostante
presentasse inoltre caratteri fenotipici anomali rispetto allo standard selvatico del lupo
(Immagine 2). Per quanto riguarda invece i CNI, solamente 2 (EPI 119 ed EPI 130) dei 5
campioni che hanno rilevato una mutazione del locus K, presentano anche altre
evidenze genetiche di introgressione con il genoma di cane.
3.5 Integrazione dei risultati ottenuti con le varie metodologie di indagi-
ne
Analizzando tutti gli individui per i quali è stato possibile caratterizzare il genotipo (n =
57) e considerando il valore soglia qi≥0.95, è risultato che 7 esemplari (12,3%) sono
cani (5 CNI e 2 CI), 32 (56,1%) sono stati assegnati alla popolazione italiana di lupi (27
CNI e 5 CI) e 17 (29,8%) presentano almeno una evidenza genetica di introgressione
con il genoma canino (9 CNI e 8 CI) (Tab 4). Di questi, 8 esemplari (47% del campione di
introgressi) mostravano evidenze genetiche di ibridazione contemporaneamente
rilevabili in più di un marcatore genetico.
L'individuo CAPI 06 (1,7% del campione), che non presentava nessuna ulteriore
evidenza genetica oltre al dato microsatellitare, non stato assegnato a nessuna classe
a causa dell'elevata percentuale di dati mancanti nella individuazione del genoma, che
rende inaffidabile il risultato ottenuto utilizzando sia un pannello a 16 loci che a 53 loci
(Tabelle 2 e 3; § 3.2).
13
Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF - Azione A3
Risultati analisi genetiche
ID mtDNA STRUCTURE NEWHYBRIDS LOCUS K CROMOSOMA Y
Epi_55 Bx2W = 0,0539
Epi_56K
B
Epi_119 16 loci qi = 0,944 Bx2W = 0,100K
B DY2
Epi_128K
B
Epi_130K
B DY2
Epi_152 16 loci qi = 0,293 F2 = 0,888 DY2
Epi_153 16 loci qi = 0,948 Bx2W = 0,103 DY2
Epi_154K
B
Epi_159 Bx2W = 0,102
Capi_05*K
B Y3
Capi_08 w162
Capi_09 53 loci qi = 0,974K
B
Capi_10 53 loci qi = 0,926
Capi_11K
B
Capi_16*K
B
Capi_164* 16 loci qi = 0,952 Bx2W = 0,048K
B
Capi_165* 16 loci qi = 0,909 Bx2W = 0,166
Tabella 4. Elenco dei 18 individui assegnati alla classe di ibridi e dettaglio delle analisi
in base alle quali è stata determinata tale assegnazione (valore soglia nei test di
assegnazione per l'analisi del DNA microsatellite qi≥0.95). Gli esemplari indicati
contrassegnati con * presentavano inoltre una colorazione anomala del mantello o
altre evidenze fenotpiche di introgressione, come documentato nelle Immagini 1, 2, 3 e
4.
Considerando un valore soglia pari a qi>0.975, 29 animali (50,9%) sono stati assegnati
alla popolazione italiana di lupi (26 CNI e 3 CI) e 20 animali (35,1%) presentavano
almeno una evidenza genetica di introgressione con il genoma canino (10 CNI e 10 CI)
(Tab 5). Il 40 % di tutti i campioni introgressi rilevati (n = 8) mostrava evidenze
genetiche di ibridazione contemporaneamente rilevabili in più di un marcatore
genetico. La percentuale di cani è invece rimasta invariata.
2Il campione che presentava l'aplotipo w16 (CAPI 008) possedeva anche alleli precedentemente mai
osservati nella popolazione di lupi italiana
14
Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF - Azione A3
Risultati analisi genetiche
ID mtDNA STRUCTURE NEWHYBRIDS LOCUS K CROMOSOMA Y
Epi_55 Bx2W = 0,0539
Epi_56K
B
Epi_118 16 loci qi = 0,962
Epi_119 16 loci qi = 0,944 Bx2W = 0,100K
B DY2
Epi_128K
B
Epi_130K
B DY2
Epi_152 16 loci qi = 0,293 F2 = 0,888 DY2
Epi_153 16 loci qi = 0,948 Bx2W = 0,103 DY2
Epi_154K
B
Epi_159 16 loci qi = 0,963
Capi_05*K
B Y3
Capi_083 w16
Capi_09 53 loci qi = 0,974K
B
Capi_10 53 loci qi = 0,926
Capi_11K
B
Capi_12 53 loci qi = 0,958
Capi_13 53 loci qi = 0,952
Capi_16*K
B
Capi_164* 16 loci qi = 0,952 Bx2W = 0,048K
B
Capi_165* 16 loci qi = 0,909 Bx2W = 0,166
Tabella 5. Elenco degli individui campionati assegnati alla classe di ibridi e dettaglio
delle analisi in base alle quali è stata determinata tale assegnazione (valore soglia per
l'analisi del DNA microsatellite qi>0.975). Gli esemplari indicati contrassegnati con *
presentavano inoltre una colorazione anomala del mantello o altre evidenze fenotpiche
di introgressione, come documentato nelle Immagini 1, 2, 3 e 4.
Come già accaduto per l'analisi precedente, l'individuo CAPI 06 non è stato assegnato a
nessuna classe, mentre per quanto riguarda l'individuo CAPI 11, sebbene dalle analisi
effettuate con STRUCTURE e NEWHYBRIDS l'introgressione con in genoma di cane non
viene rivelata (qi = 0,967 con un pannello a 53 loci, ma con una percentuale di dati
mancanti nella individuazione del genoma pari al 39% e limiti fiduciali compresi tra
0,889 e 1; Allegati 2 e 3), la presenza della delezione del locus K comporta che il
campione sia inserito nel computo dei possibili esemplari introgressi (Tab. 5). In ogni
caso, nelle tabelle di riepilogo (Tabelle 4 e 5) non è stato considerato il risultato della
analisi del DNA microsatellite per i campioni CAPI 06 (sia con un pannello a 16 loci che
a 53 loci) e CAPI 11 (pannello a 53 loci).
3Il campione che presentava l'aplotipo w16 (CAPI 008) possedeva anche alleli precedentemente mai
osservati nella popolazione di lupi italiana
15
Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF - Azione A3
Risultati analisi genetiche
Tutti gli animali per i quali era noto l'aspetto morfologico e per i quali erano state
rilevate evidenze fenotipiche attribuibili ad un evento di ibridazione (n= 4 animali), con
la sola esclusione dell'individuo corrispondente al campione CAPI 18, presentavano
almeno una evidenza genetica di ibridazione (Tab 3 e Immagini 1 - 5).
Comparando i risultati ottenuti con l'analisi del DNA mitocondriale e satellitare
(Allegato 1) si osserva che tutti gli animali con aplotipo w14 presentavano alleli
appartenenti alla popolazione di lupi (106 campioni). Un campione che presentava
l'aplotipo W16 (CAPI 08) possedeva anche alleli precedentemente mai osservati nella
popolazione di lupi italiana.
16
Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF - Azione A3
Risultati analisi genetiche
Immagine 1. Individuo CAPI 05. L'esemplare, mantenuto in cattività presso il centro di
recupero fauna selvatica di Semproniano (CRASM) e morto nel 2012, presentava un
aspetto fenotipico anomalo rispetto allo standard selvatico, come si rivela dalla
colorazione scura del mantello e dall'assenza della mascherina facciale e di bandeggi
neri sulle zampe anteriori. Nonostante queste evidenze fenotipiche, e nonostante la
presenza della delezione del locus K e dell'aplotipo Y3, l'animale ha rilevato una elevata
probabilità di essere attribuito alla popolazione di lupo per entrambi i valori soglia
(q≥0.95 e q>0,975) utilizzati (qi = 0,977 con un pannello a 16 loci e qi = 0,995 con un
pannello a 53 loci).
Immagine 2. Individuo CAPI 16. L'esemplare è stato catturato in località Abbandonato,
in provincia di Grosseto, il 22 marzo del 2013 nell'ambito del Progetto Ibriwolf ed è
attualmente mantenuto in cattività presso il centro di recupero fauna selvatica di
Semproniano (CRASM). Come l'esemplare CAPI 05, nonostante l'aspetto fenotipico
anomalo rispetto allo standard selvatico, come si rivela dalla colorazione scura del
mantello e dall'assenza della mascherina facciale e di bandeggi neri sulle zampe
anteriori, e nonostante la delezione del locus K, l'analisi del DNA microsatellite con un
pannello a 16 loci ha fornito una probabilità di attribuzione alla popolazione di lupi
elevata (qi = 0,997) per i due valori soglia considerati (q≥0.95 e q>0.975), sebbene con
limiti fiduciali relativamente ampi (0,981- 1,000).
17
Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF - Azione A3
Risultati analisi genetiche
Immagine 3. Individuo CAPI 164. L'esemplare è stato rinvenuto morto il 27 dicembre
2012 in località Barbiella in provincia di Firenze. Come i precedenti esemplari
l'individuo CAPI 164 mostra un aspetto fenotipico anomalo rispetto allo standard
selvatico, come si rivela dalla colorazione scura del mantello, dall'assenza della
mascherina facciale e dalle unghie depigmentate. L'analisi del DNA microsatellite per
questo individuo con un pannello a 16 loci ha consentito di attribuire l'esemplare ad
una classe di reincrocio di generazione successiva alla seconda (qi = 0,952, Bx2W =
0,048) rilevante solamente per un valore soglia pari a q>0.975, sebbene con limiti
fiduciali relativamente ampi (0,806-1,000).
Immagine 4. Individuo CAPI 18. L'esemplare è stato rinvenuto morto il 25 marzo 2013
a Roccalbegna, in provincia di Grosseto. Anche l'individuo CAPI 18 presentava un
aspetto fenotipico anomalo rispetto allo standard selvatico, come si rivela dalla
colorazione scura del mantello, dall'assenza della mascherina facciale e dalle unghie
depigmentate. Nonostante l'evidenza fenotipica, nessuno dei marcatori utilizzato per le
analisi genetiche ha rivelato una evidenza di introgressione del genoma di cane
domestico per questo individuo (qi = 0,997 con un pannello a 53 loci, W = 0,998).
18
Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF - Azione A3
Risultati analisi genetiche
Immagine 5. Individuo CAPI 165. L'esemplare è stato rinvenuto morto il 17 marzo 2012
in località Crocioni-Scarperia in provincia di Firenze. L'animale presentava
caratteristiche fenotipiche anomale rispetto allo standard selvatico del lupo
(dimensione e lunghezza anomale delle orecchie) ed è risultato essere un ibrido di
incrocio successivo alla seconda generazione sia in base alle analisi effettuate presso
ISPRA (responso in cui non viene specificata la q di assegnazione ed il numero di loci
satellitari), sia in base alle analisi effettuate presso il CIBIO (qi = 0,909 con un pannello
a 16 loci, Bx2W = 0,166).
Immagine 6. Individuo CAPI 15. L'esemplare è stato catturato in località Abbandonato,
in provincia di Grosseto, il 25 marzo del 2013 nell'ambito del Progetto Ibriwolf e non
presentando nessuna evidenza fenotipica di ibridazione è stato immediatamente
rilasciato. Le analisi effettuate presso il CIBIO hanno escluso l'introgressione del
genoma canino (qi = 989 con un pannello a 53 loci), mentre quelle effettuate da ISPRA,
rilevano una probabilità di attribuzione alla popolazione di lupi (qi = 94 con un pannello
a 24 loci) al di sotto del valore soglia considerato (q>0.95).
19
Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF - Azione A3
Risultati analisi genetiche
4. DISCUSSIONE:
I risultati ottenuti dalla integrazione di tutte le analisi genetiche effettuate sembrano
confermare il dubbio che una percentuale relativamente elevata della popolazione
locale di lupi nella Provincia di Grosseto sia costituita da esemplari introgressi. Infatti,
su un totale di 57 individui, per i quali è stato possibile determinare con certezza il
genotipo, che sono stati campionati nell'area della Provincia di Grosseto e nelle aree a
questa limitrofe (provincia di Siena e di Firenze) negli anni compresi tra il 2010 ed il
2012, ed utilizzando un valore soglia qi ≥0.95, il 12% è risultato rappresentato da cani
(n = 7), il 56,1% da lupi (n = 32) mentre il 29,8% (n = 17) degli esemplari ha rilevato
almeno una evidenza genetica di introgressione con il genoma canino, mentre per un
esemplare (1,7% del campione) non è stato possibile stabilire la classe di attribuzione.
La percentuale di individui introgressi aumenta ulteriormente se viene considerato un
valore soglia nei test di assegnazione più elevato (qi > 0.975). Infatti, in base a questo
valore, il 35,1% degli individui campionati (n = 20) risulta costituito da individui
introgressi.
Ovviamente, il numero di cani rimane invariato a prescindere dal valore soglia dei test
di assegnazione che viene utilizzato. In ogni caso va tenuto presente che i campioni
sono stati raccolti solamente nelle aree montane e boschive, distanti dai centri abitati.
Pertanto il numero di cani campionati è da ritenere una severa sottostima del numero
di cani vaganti realmente presenti sul territorio.
Questo risultato deve essere letto tenendo conto del fatto che una quantificazione
esatta della percentuale di individui introgressi in una popolazione parentale non è né
facile, né solida. Pertanto, nonostante siano stati utilizzati diversi marcatori genetici al
fine di massimizzare il potere diagnostico per la individuazione di casi di ibridazione, e
tenuto conto della elevata percentuale di individui con almeno una evidenza di
introgressione con il genoma di cane domestico comunque riscontrata nel territorio,
tale valore va considerato solamente come una stima possibile del numero effettivo di
individui ibridi cane-lupo presenti nella popolazione campionata. Infatti le attuali
tecniche di analisi genetica utilizzate, ed in particolare l'analisi del locus K che, in
assenza di altre evidenze genetiche o fenotipiche non costituisce una evidenza
inequivocabile di ibridazione recente, non sono in grado di individuare con una certa
affidabilità esemplari introgressi derivati da generazioni successive alla seconda, in
quanto tali individui sono difficilmente rilevabili geneticamente (Ciucci 2012).
Pertanto, per una corretta lettura ed interpretazione dei risultati, non si può
prescindere da una serie di considerazioni fondamentali.
Innanzitutto, come già accennato, va tenuto presente che il risultato delle analisi
genetiche viene fortemente condizionato dalle tecniche utilizzate. Analizzando i
risultati ottenuti dal campionamento condotto nella Provincia di Grosseto, è
interessante notare che di tutti gli animali per i quali è stata riscontrata una evidenza di
introgressione con il genoma di cane (n = 17 per qi ≥0.95) solamente 8 individui
(corrispondenti al 47% del campione; Tab 4) presentavano contemporaneamente
evidenze di introgressione in più di un marcatore genetico. Questo valore percentuale
diminuisce leggermente se si utilizza come valore soglia qi >0.975; in questo caso infatti
20
Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF - Azione A3
Risultati analisi genetiche
dei 20 esemplari campionati introgressi, nuovamente 8 campioni (40% del campione;
Tab 5) presentavano una evidenza genetica di introgressione in più di un marcatore.
E' quindi molto probabile che, soprattutto per quanto riguarda i campioni non invasivi,
per i quali non è stato possibile utilizzare tutti i marcatori o un pannello di 53 loci, la
mancata applicazione di tecniche genetiche di maggiore risoluzione non abbia
consentito di rilevare una percentuale di individui introgressi.
Anche il campione di riferimento ed il modo in cui vengono selezionati gli individui
all'interno di una popolazione condiziona non solo l'affidabilità delle analisi stesse ma
anche il potere diagnostico dei test di assegnazione, determinato quest'ultimo dai
campioni di riferimento (numero e tipologia) che sono stati utilizzati per caratterizzare
le distribuzioni alleliche delle popolazioni parentali. Per quanto riguarda ad esempio
l'individuo a cui corrisponde il campione CAPI 15 (Immagine 6), per il quale è stato
possibile confrontare i risultati ottenuti da due diversi laboratori genetici, CIBIO e
ISPRA (analisi con il programma STRUCTURE con un pannello rispettivamente di 53 e
24 loci) si sono ottenuti due valori diversi di probabilità di assegnazione alla
popolazione di lupo (rispettivamente qi = 0,98 e qi = 0,94).
Considerato il valore soglia qi≥0.95 per l'attribuzione degli individui campionati alla
popolazione di lupo, la piccola differenza riscontrata tra i due valori determina un
risultato completamente diverso, e in base alle analisi condotte presso il CIBIO
l'individuo viene assegnato alla popolazione di lupi italiani mentre dai risultati forniti
da ISPRA è emerso che l'animale in questione è stato originato da un episodio di
ibridazione.
Tenendo conto del fatto che un determinato individuo viene assegnato ad una
popolazione parentale se possiede una composizione allelica simile, in termini
probabilistici, a quella della popolazione parentale stessa, è possibile ipotizzare che la
differenza riscontrata nei referti dei due laboratori sia dovuta al campione di
riferimento di popolazione parentale utilizzato per i test di assegnazione. Infatti se le
popolazioni parentali di riferimento presentano bassi livelli di divergenza genetica
perchè non si conoscono nel dettaglio le frequenze alleliche che le caratterizzano, i due
programmi STRUCTURE e NEWHYBRIDS sono meno efficienti e possono raggiungere un
sufficiente livello di efficienza solamente se viene utilizzato un numero molto elevato
di loci (Vähä and Primmer 2006).
Un ulteriore aspetto da tenere presente è la tipologia di campione (invasivo/non
invasivo) che viene utilizzato per le analisi, dato che questa influisce fortemente sia
sulla resa che sul potere diagnostico delle analisi stesse. Mentre infatti è generalmente
possibile disporre di elevate quantità di DNA non degradato da un campione invasivo,
e di conseguenza poter utilizzare un numero consistente di loci diagnostici che
forniscono una probabilità elevata di rilevare l'introgressione del genoma di cane e
individuare ibridi reincrociati all’interno della popolazione, lo stesso discorso non è
applicabile ad un campione non invasivo che, sebbene sia di più facile reperibilità,
presenta generalmente DNA altamente degradato (qualità e quantità ridotte). Di
conseguenza dai campioni non invasivi è difficile analizzare un numero elevato di loci
microsatellite, e questo, come già accennato precedentemente, limita fortemente
21
Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF - Azione A3
Risultati analisi genetiche
anche la risoluzione dei test di assegnazione.
Prendendo ad esempio il campione analizzato nell'ambito di questo studio, per nessun
escremento è stato possibile utilizzare un pannello di più di 16 loci, ed anche in questo
caso la resa è risultata decisamente bassa (21,8%, n = 24 campioni).
Viceversa è facilmente analizzabile nei campioni non invasivi il DNA mitocondriale (resa
pari all' 85,4%, n = 94 campioni) che tuttavia, pur fornendo dati importanti sulla
direzionalità della ibridazione, ha poco potere diagnostico per il rilevamento di eventi
di ibridazione. Inoltre un campione invasivo presenta generalmente la possibilità di
poter disporre di un riscontro fenotipico dell'animale campionato, e di conseguenza di
poter confrontare tra loro il dato genetico con quello morfologico.
Preso atto delle considerazioni sopra esposte e tenuto conto del fatto che in una
strategia di campionamento la reperibilità di campioni non invasivi è decisamente più
elevata rispetto ai campioni invasivi, una soluzione ideale potrebbe essere quella di
utilizzare marcatori più affidabili come gli SNP (Polimorfismi genici di Singoli
Nucleotidi) che consentono di identificare individui ibridi risultati criptici
dall'applicazione di analisi tradizionali. Tuttavia l'esperienza maturata nel corso del
progetto Ibriwolf ha reso evidente come questa tecnica, ancora poco sperimentata,
preveda costi estremamente elevati, fasi di analisi troppo elaborate ed una resa
complessiva su campioni non invasivi ancora troppo ridotta per poter costituire, al
momento, una valida alternativa alle tecniche di analisi attualmente utilizzate.
Diviene quindi necessario per l'immediato futuro individuare un approccio alternativo
che abbia risvolti pratici maggiormente applicabili in un contesto gestionale, dove tra
l'altro la necessità di intervenire rapidamente spesso collima con i tempi richiesti per lo
svolgimento delle analisi genetiche, partendo dalla premessa che la possibilità di
identificare in maniera affidabile gli individui ibridi e introgressi all’interno di una
popolazione sia fondamentale per impostare correttamente una strategia di gestione
ed eventualmente attuare programmi di rimozione o sterilizzazione (Ciucci, 2012).
Tale approccio alternativo, che deve essere finalizzato principalmente a massimizzare
la probabilità di individuazione di esemplari introgressi, deve prevedere, oltre
all'utilizzazione di più marcatori genetici, l'integrazione del dato genetico con l'aspetto
fenotipico, ovvero con le caratteristiche morfologiche di possibile derivazione canina
che vengono riscontrate in un esemplare di lupo. In questo modo si potrebbe creare
una corrispondenza tra i marcatori genetici ed i caratteri fenotipici ed utilizzare i due
parametri contemporaneamente in modo da incrementare il rispettivo potere
diagnostico per la individuazione di esemplari ibridi.
Un esempio eclatante riscontrato nella popolazione campionata potrebbe confermare
la necessità di un approccio di analisi integrato. Nessuno dei marcatori utilizzati per le
analisi genetiche del campione CAPI 18 ha infatti evidenziato una forma di ibridazione,
seppure l'animale a cui corrispondeva il campione presentava evidenti tratti fenotipici
di ibridazione (colorazione del mantello anomala rispetto al fenotipo selvatico, assenza
della mascherina facciale, unghie depigmentate; Immagine 4).
Questo risultato non è sicuramente sorprendente perchè alcuni tratti fenotipici che
22
Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF - Azione A3
Risultati analisi genetiche
vengono controllati da un solo gene, come il colore del mantello, possono essere
tramandati di generazione in generazione senza subire alcuna ricombinazione. Quindi
è molto probabile che l'individuo CAPI 18 sia un ibrido generato da un reincrocio di
generazione successiva alla seconda la cui natura risulta tuttavia criptica alle analisi
genetiche effettuate. E' evidente che le informazioni ottenute dal riscontro fenotipico
dell'animale non possono essere trascurate solamente perchè il dato genetico non
riesce a rivelare un evento di ibridazione, soprattutto nel caso in cui le analisi
genetiche sono state effettuate utilizzando un numero limitato di loci.
A tale proposito è importante infine sottolineare che, se da una parte il riscontro di
caratteristiche morfologiche discordanti dallo standard selvatico può essere
interpretato come il risultato di un evento di ibridazione, viceversa non è possibile
escludere l'introgressione con il genoma di cane in un esemplare che non presenti
particolari anomalie fenotipiche, se non previa analisi genetica di conferma. Ad
esempio l'individuo corrispondente al campione CAPI 15, (Immagine 6) pur non
presentando caratteristiche fenotipiche anomale rispetto allo standard selvatico è
risultato essere originato da un evento di ibridazione in base alla analisi condotte da
ISPRA. Operando in questo modo, ovvero trascurando di integrare tra loro il dato
genetico con le evidenze fenotipiche, si corre il rischio di non quantificare
correttamente il grado di introgressione in un individuo e di commettere errori di Tipo
II che consistono nell'erronea assegnazione alla popolazione di lupo di esemplari ibridi
(Allendorf et al. 2001), con rilevanti conseguenze da un punto di vista gestionale.
Un altro aspetto interessante che emerge dalla analisi condotte nell'ambito di questo
studio è che gli errori di Tipo II (attribuzione di un esemplare irido alla popolazione
parentale di lupi e, di conseguenza, sottostima dell'entità del fenomeno di ibridazione)
possono essere causati anche nel caso in cui l'introgressione con il genoma di cane
domestico venga riconosciuta tale solamente se riconducibile ad un evento di
ibridazione molto recente nel tempo (ibridi di seconda generazione). I risultati delle
analisi genetiche rivelano infatti una capacità estremamente ridotta delle tecniche
attualmente utilizzate nel poter stabilire in quale momento, nel passato dell'esemplare
di lupo, si sia verificato l'evento di introgressione con il genoma di cane, ovvero se
l'individuo derivi da un reincrocio di seconda o successiva generazione. Dalle analisi
effettuate risulta infatti che solamente un esemplare (EPI 152), che corrisponde al
2,4% del campione analizzato, può essere assegnato alla classe F2 (ibrido di seconda
generazione). Tale aspetto deve essere necessariamente preso in considerazione nella
pianificazione di interventi gestionali che prevedano la rimozione e/o sterilizzazione di
ibridi e che non possono pertanto limitarsi al prelievo di individui appartenenti a classi
specifiche di ibridazione (Ciucci, 2012). E' quindi necessario, parallelamente alla
individuazione di tecniche genetiche più raffinate che consentano di stabilire con
maggior precisione in quale generazione passata si sia verificato l'evento di ibridazione
in un esemplare di lupo, pianificare interventi gestionali che possano contemplare una
più ampia sfera di intervento, in cui la presenza di una evidenza genetica di
introgressione con il genoma di cane domestico sia da sola sufficiente a riconoscere
come ibrido l'animale campionato a prescindere dalla classe di appartenenza.
23
Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF - Azione A3
Risultati analisi genetiche
5. BIBLIOGRAFIA
Allendorf, F.W, R. F. Leary, P. Spruell, and J. K. Wenburg. (2001). The problems with
hybrids: setting conservation guidelines. Trends in Ecology & Evolution 16:
613–622
Anderson, E.C. , E.A. Thompson. (2002). A model-based method for identifying species
hybrids using multilocus genetic data. Genetics 160:1217–1229.
Bannasch DL, Bannasch MJ, Ryun JR, Famula TR, Pedersen N (2005) Y chromosome
haplotype analysis in purebred dogs. Mammalian Genome, 16, 273–280.
Boom, R., Sol, C.J.A., Salimans, M.M.M., Jansen, C.L., Wertheimvandillen, P.M.E. &
Vandernoordaa, J. (1990) Rapid and simple method for purification of nucleic-
acids. Journal of Clinical Microbiology, 28:495-503.
Candille SI, Kaelin CB, Cattanach BM et al (2007) A β-defensin mutation causes black
coat colour in domestic dogs. Science, 318, 1418–1423.
Caniglia R, Fabbri E, Greco C, Galaverni M, Manghi L, Boitani L, Sforzi A, Randi E (2013).
Black coats in an admixed wolf × dog pack is melanism an indicator of
hybridization in wolves? European Journal of Wildlife Research, 59, 543–555.
Ciucci, P. (2012). Ibridazione con il cane come minaccia per la conserazione del lupo:
status delle conoscenze e criteri per l'identificazione degli ibridi. Relazione
tecnica. Progetto Ibriwolf, azione A2
Falush, D., Stephens, M. & Pritchard, J.K. (2003) Inference of population structure
using multilocus genotype data: linked loci and correlated allele frequencies.
Genetics, 164:1567-1587.
Frantz, A.C., Pope, L.C., Carpenter, P.J., Roper, T.J., Wilson, G.J., Delahay, R.J. & Burke,
T. (2003) Reliable microsatellite genotyping of the Eur- asian badger (Meles
meles) using faecal DNA. Molecular Ecology, 12:1649-1661.
Godinho R, Llaneza L, Blanco JC, Lopes S, Alvares F, et al. (2011) Genetic evidence for
multiple events of hybridization between wolves and domestic dogs in the
Iberian Peninsula. Mol Ecol 20: 5154–5166.
Greco, C. (2009). Genomic characterization of the Italian wolf (Canis lupus): the genes
involved in black coat colour determination and aplication off microarray
technique for SNPs detection. PhD Thesis, University of Bologna
Iacolina, L., Scandura M., Gazzola A., Cappai N., Capitani C., Mattioli L., Fercillo F.,
Apollonio M. (2100) Y-chromosome microsatellite variation in Italian wolves: A
contribution to the study of wolf-dog hybridization patterns. Mamm. Biol 75,
341-347.
Peakall R. and Smouse P.E. (2012) GenAlEx 6.5: genetic analysis in Excel. Population
genetic software for teaching and research – na update. Bioinformatics 28,
2537-2539.
Randi, E., Lucchini V, Christensen MF et al. (2000) Mitochondrial DNA variability in
Italian and East European wolves: detecting the consequences of small
population size and hybridization. Conservation Biology, 14, 464 – 473.
Seddon, J.M. (2005) Canid-specific primers for molecular sexing using tissue or non-
invasive samples. Conservation Genetics, 6:147-149.
24
Progetto LIFE10NAT/IT/265 IBRIWOLF - Azione A3
Risultati analisi genetiche
Sundqvist A-K, Ellegren H, Olivier M, Vila` C (2001) Y chromosome haplotyping in
Scandinavian wolves (Canis lupus) based on microsatellite markers. Molecular
Ecology, 10, 1959–1966.
Vähä J. P. and Primmer C. R. (2006). Efficiency of model-based Bayesian methods for
detecting hybrid individuals under different hybridization scenarios and with
different numbers of loci. Molecular Ecology, 15, 63 – 72.
Valière, N. (2002). GIMLET: a computer program for analysing genetic individual identi
fication data. Molecular Ecology Notes, 2: 377-379.
Vilà, C., Amorim, I.R., Leonard, J.A., Posada, D., Castro- viejo, J., Petrucci-Fonseca, F.,
Crandall, K.A., Ellegren, H. & Wayne, R.K. (1999). Mitochondrial DNA
phylogeogra- phy and population history of the grey wolf. Canis lupus.
Molecular Ecology, 8:2089-2103.
25