Research Collection

Doctoral Thesis

Strukturbasiertes Design, Synthese und in vitro Bewertung vonBisubstrat-Inhibitoren der Catechol-0-Methyltransferase (COMT)

Author(s): Lerner, Christian Daniel

Publication Date: 2003

Permanent Link: https://doi.org/10.3929/ethz-a-004537966

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ETH Library

Diss ETH Nr. 15033

Strukturbasiertes Design, Synthese undin vitro Bewertung von Bisubstrat-Inhibitoren der Catechol-O-Methyltransferase (COMT)

ABHANDLUNG zur Erlangung des Titels

DOKTOR DER NATURWISSENSCHAFTEN der

EIDGENÖSSISCHEN TECHNISCHEN HOCHSCHULE ZÜRICH

vorgelegt von

Christian Daniel Lerner

Dipl. Chem. ETH geboren am 26. Januar 1972

aus Deutschland

Angenommen auf Antrag von:

Prof. Dr. François Diederich, Referent Prof. Dr. Erick Carreira, Korreferent

Dr. Roland Jakob-Roetne, Korreferent

Zürich 2003

Meinen Eltern, meiner Frau Petra und meiner Tochter Jasmine gewidmet.

Danksagung

Prof. Dr. François Diederich für das interessante Projekt und die mir gewährte Selbständigkeit bei der Arbeit.

Prof. Dr. Erick Carreira für die Übernahme des Korreferats.

Dr. Roland Jakob-Roetne bei Hoffmann-La Roche, Basel, für die Unterstützung dieser Arbeit und die Übernahme des zweiten Korreferats.

Meinen Diplomanden Romain Siegrist, Eliane Schweizer und Lukas Brändli, denen ich für ihre Beiträge zu besonderem Dank verpflichtet bin.

Stefan Sahli und Severin Odermatt für die Korrektur des Manuskriptes.

Gerhard Zürcher, Martine Buhler und Dr. Edilio Borroni bei Hoffmann-La Roche,Basel, welche mich bei den enzymatischen in vitro Assays unterstützten.

Dr. Armin Ruf bei Hoffmann-La Roche, Basel, für die Protein-Röntgenstrukturanalyse,welche ein entscheidendes Highlight dieser Arbeit darstellt.

Prof. Dr. Gramlich für die Anfertigung der Röntgenstrukturanalysen kleiner Moleküle.

Dr. Ronald Castellano, Dr. Philip Skinner, William Pomerantz und Christine Crane für die Korrektur aller englischsprachigen Texte.

Dr. Birgit Masjost bei Hoffmann-La Roche, Penzberg, für das fortwährende Interesse an dem Projekt.

Prof. Dr. Stefan Pitsch für hilfreiche Diskussionen über chemische Fragestellungen.

Dem NMR-, dem MS- und dem Mikroanalytischen Labor der ETH Zürich für die Aufnahme der Kernresonanz- und Massensprektren und die Durchführung der Elementaranalysen.

Irma Näf für die ausserordentliche Hilfsbereitschaft bei administrativen Fragen aller Art.

Meinen Laborkollegen Raffaela Faraoni, Dr. Philip Skinner, Dr. Mogens Nielsen, Dr. Ronald Castellano, Christine Crane, Marine Guillot und Beatrice Felber für die gute Zusammenarbeit.

Allen übrigen Mitgliedern der Diederich-Gruppe für das gute Arbeitsklima und die ausgezeichnete Hilfsbereitschaft.

Meinen Eltern, welche mir diese faszinierende Ausbildung ermöglicht haben.

Der grösste Dank gilt meiner Frau Petra Nelke-Lerner für all die Unterstützung und Liebe während meines Studiums und der Doktorarbeit, und meiner kleinen Tochter Jasmine Lerner für ihre ansteckende Lebensfreude.

Teile dieser Arbeit wurden bereits veröffentlicht oder vorgestellt:

Wissenschaftliche Publikationen

C. Lerner, A. Ruf, V. Gramlich, B. Masjost, G. Zürcher, R. Jakob-Roetne, E. Borroni, F. Diederich, Angew. Chem. 2001, 113, 4164-4166; Angew. Chem.-Int. Edit. 2001, 40,4040-4042. X-Ray Crystal Structure of a Bisubstrate Inhibitor Bound to the Enzyme Catechol-O-Methyltransferase: A Dramatic Effect of Inhibitor Preorganization on Binding Affinity.

C. Lerner, B. Masjost, A. Ruf, V.Gramlich, R. Jakob-Roetne, G. Zürcher, E. Borroni, F. Diederich, Org. Biomol. Chem. 2003, 1, 42-49. Bisubstrate Inhibitors for the Enzyme Catechol-O-Methyltransferase (COMT): Influence of Inhibitor Preorganisation and Linker Length Between the two Substrate Moieties on Binding Affinity.

C. Lerner, R. Siegrist, E. Schweizer, and F. Diederich, Helv. Chim. Acta, im Druck. Bisubstrate Inhibitors for the Enzyme Catechol-O-Methyltransferase (COMT): Dramatic Effects of Ribose Modifications on Binding Affinity and Binding Mode.

Präsentationen

Roche Symposium for Leading Chemists of the Next Decade, 24.-26. Oktober 2001, Basel. Vortrag: Design, Synthesis and Evaluation of Novel Bisubstrate Inhibitors for the S-Adenosylmethionine (SAM)-Dependent Enzyme Catechol-O-Methyltransferase (COMT) for the Treatment of Parkinson's Disease.

37th ESF/EUCHEM Conference on Stereochemistry, 13.-19. April 2002, Bürgenstock. Posterpräsentation: Design, Synthesis and Evaluation of Novel Bisubstrate Inhibitors for the S-Adenosylmethionine (SAM)-Dependent Enzyme Catechol-O-Methyl-transferase (COMT).

Populärwissenschaftliche Artikel

C. Lerner, F. Diederich, Bulletin ETH Zürich 2001, Nr. 282, 14-17. Chemischer Baustein im Kampf gegen Parkinson.

Inhaltverzeichnis

Zusammenfassung........................................................................................ i

Abstract ....................................................................................................... iv

1 Einleitung ................................................................................................. 1

1.1 Wirkstoffdesign ................................................................................................ 1 1.1.1 Auffinden und Optimieren einer Leitstruktur ........................................... 1 1.1.2 Pharmakokinetik ....................................................................................... 4 1.1.3 Molekulare Erkennung.............................................................................. 5

1.1.3.1 Komplementarität............................................................................... 5 1.1.3.2 Elektrostatische Wechselwirkungen .................................................. 6 1.1.3.3 Wasserstoffbrücken............................................................................ 7 1.1.3.4 Dispersionswechselwirkungen........................................................... 8 1.1.3.5 Hydrophobe Wechselwirkungen........................................................ 8

1.1.4 Computergestützte Molekülmodellierung (Molecular Modeling) ............ 9 1.1.4.1 Molekülmechanik, Kraftfeldrechnungen ......................................... 10 1.1.4.2 Optimierungsverfahren .................................................................... 12 1.1.4.3 Moleküldynamik .............................................................................. 12 1.1.4.4 Konformationsanalyse...................................................................... 13

1.2 Überblick über die Parkinson-Krankheit und deren Therapie ........................ 13 1.3 Das Enzym Catechol-O-Methyltransferase (COMT)..................................... 17

1.3.1 Funktion und Vorkommen von COMT................................................... 17 1.3.2 Struktur von COMT ................................................................................ 18 1.3.3 Katalytischer Mechanismus von COMT................................................. 21

1.4 Inhibitoren für COMT .................................................................................... 25 1.4.1 Das Konzept der Bisubstrat-Inhibition.................................................... 28 1.4.2 Entwicklung des ersten effektiven Bisubstrat-Inhibitors für COMT...... 30 1.4.3 Aufgabenstellung .................................................................................... 33

2 Einfluss der Inhibitor Präorganisierung und Linker-Länge zwischen der Substrat- und Cofaktor-Einheit auf die Bindungsaffinität........ 35

2.1 Design ............................................................................................................. 35 2.2 Synthese.......................................................................................................... 38

2.2.1 Synthese von Inhibitor 32 ....................................................................... 38 2.2.1.1 Syntheseplanung .............................................................................. 38 2.2.1.2 Darstellung der Catecholeinheit ....................................................... 38 2.2.1.3 Darstellung von 5'-Amino-5'-deoxyadenosin und Reaktion

mit 41 zu 32...................................................................................... 39 2.2.2 Synthese von Inhibitor 33 ....................................................................... 41

2.2.2.1 Syntheseplanung .............................................................................. 41 2.2.2.2 Synthese des Amins 45 und Reaktion mit 41 zu 33 ......................... 42

2.2.3 Synthese der Inhibitoren 31 und 34 ........................................................ 44 2.2.3.1 Syntheseplanung .............................................................................. 44 2.2.3.2 Darstellung des Oxidationsmittels ortho-Iodoxybenzoesäure

(IBX) (50)......................................................................................... 45 2.2.3.3 Darstellung des Ylids 52 .................................................................. 45 2.2.3.4 Synthese des Phtalimids 55 .............................................................. 46 2.2.3.5 Darstellung des Amins 47 und Reaktion mit 41 zu 31..................... 48 2.2.3.6 Darstellung des Amins 48 und Reaktion mit 41 zu 34..................... 49

2.2.4 Synthese des Inhibitors 35 ...................................................................... 49 2.2.4.1 Syntheseplanung .............................................................................. 49 2.2.4.2 Darstellung des Nitrils 59 und Synthese von 35 .............................. 50

2.2.5 Synthese des zu 41 analogen Ketons 62 ................................................. 52 2.3 Biologische Resultate ..................................................................................... 56

2.3.1 Bestimmung der IC50-Werte................................................................... 56 2.3.2 Kurze Einführung in die Kinetik der Enzyminhibition........................... 59 2.3.3 Messung der Inhibitionskinetik für den Inhibitor 31 .............................. 64 2.3.4 Röntgenstruktur des ternären Komplexes zwischen COMT,

einem Mg2+-Ion und dem Bisubstrat-Inhibitor 31.................................. 66 2.4 Ausblick.......................................................................................................... 70

3 Effekte von Modifikationen der Ribose-Einheit auf Bindungsaffinität und Inhibitionsmechanismus ................................ 71

3.1 Design ............................................................................................................. 71 3.2 Synthese.......................................................................................................... 73

3.2.1 Synthese des Inhibitors 87 mit 2'-Deoxyadenosinfragment.................... 73 3.2.1.1 Syntheseplanung .............................................................................. 73 3.2.1.2 Synthese des Esters 94 ..................................................................... 73 3.2.1.3 Darstellung des Amins 93 und Reaktion mit 41 zu 87..................... 76

3.2.2 Versuch zur Synthese des Zielmoleküls 88 mit 2',3'-Didehydro-2',3'-dideoxyadenosinfragment ..................................... 78

3.2.2.1 Syntheseplanung .............................................................................. 78 3.2.2.2 Synthese von 2',3'-Didehydro-2',3'-dideoxyadenosin (98)............... 78 3.2.2.3 Versuch zur Synthese des Esters 110............................................... 82

3.2.3 Synthese des Zielmoleküls 89 mit 2',3'-Dideoxyadenosinfragment ....... 83 3.2.3.1 Syntheseplanung .............................................................................. 83 3.2.3.2 Synthese von 2',3'-Dideoxyadenosin (111) ...................................... 83 3.2.3.3 Synthese des Amins 112 und Reaktion mit 41 zu 89 ....................... 84

3.2.4 Synthese des Cyclopentanderivats 90 ..................................................... 86 3.2.4.1 Syntheseplanung .............................................................................. 86 3.2.4.2 Darstellung des chiralen Allylacetats 116 nach Crimmins .............. 88 3.2.4.3 Variante A: Herstellung von 116 unter Verwendung des

Evans-Auxiliars 119......................................................................... 88 3.2.4.4 Variante B: Herstellung des Intermediats 116 unter

Verwendung des Evans-Auxiliars 118 ............................................. 90 3.2.4.5 Einführung von Adenin an das Intermediat 116

via Allylsubstitution ......................................................................... 92 3.2.4.6 Synthese des Allylamins 134 und Reaktion mit 41 zu 90................ 94

3.2.5 Synthese der Pyrrolidinderivate (–)-91 und (+)-91 ................................. 95 3.2.5.1 Syntheseplanung .............................................................................. 95 3.2.5.2 Synthese des chiralen Bausteins (–)-140.......................................... 97 3.2.5.3 Synthese des Intermediates (+)-140 ................................................. 97 3.2.5.4 Einführung von Adenin in den Pyrrolidinring und Reduktion

der Estergruppe ................................................................................ 98 3.2.5.5 Synthese von Amin (–)-146 und Reaktion mit 41 zu (–)-91.......... 100

3.3 Biologische Resultate ................................................................................... 105 3.3.1 Bestimmung der IC50-Werte................................................................. 105 3.3.2 Messung der Inhibitionskinetik für die SAM-Bindungstasche............. 106

3.4 Ausblick........................................................................................................ 108

4 Analoga des Carbonucleosids Aristeromycin................................... 109

4.1 Design ........................................................................................................... 109 4.2 Synthese........................................................................................................ 112

4.2.1 Versuch zur Synthese des Zielmoleküls 161 ........................................ 112 4.2.1.1 Syntheseplanung ............................................................................ 112 4.2.1.2 Synthese der Cyclopentenon-Zwischenstufe 167 .......................... 113 4.2.1.3 Enantioselektive Cyclopropanierung ............................................. 119 4.2.1.4 Versuche zur Michael-Addition des Cylopropropylstannanes....... 122

4.2.1.5 Michael-Addition des Vinylstannans 189 an das Cyclopentenon 167......................................................................... 123

4.2.1.6 Umsetzung zum Allylalkohol 190 ................................................. 125 4.2.1.7 Diastereoselektive Cyclopropanierung des Allylalkohols 190 ...... 126 4.2.1.8 Versuche zur Einführung des Adenins........................................... 129

4.3 Ausblick........................................................................................................ 131

5 Experimenteller Teil ........................................................................... 133

5.1 Materialien und Methoden............................................................................ 133 5.2 Allgemeine Arbeitsvorschriften.................................................................... 135 5.3 Experimentelle Daten zu Kapitel 2............................................................... 137 5.4 Experimentelle Daten zu Kapitel 3............................................................... 159 5.5 Experimentelle Daten zu Kapitel 4............................................................... 203 5.6 Enzymatische Studien................................................................................... 223

6 Anhang ................................................................................................. 227

6.1 Abkürzungen................................................................................................. 227 6.2 Daten zur Kristallstrukturanalyse von 55 ..................................................... 229 6.3 Daten zur Kristallstrukturanalyse von 94 ..................................................... 235

7 Literatur............................................................................................... 241

Zusammenfassung i

Zusammenfassung

Das Enzym Catechol-O-Methyltransferase (COMT) katalysiert den Methyl-gruppentransfer von dem Cofaktor S-Adenosylmethionin (SAM) auf die Hydroxy-gruppe catecholischer Substrate wie z.B. L-DOPA und Dopamin. Die Hemmung von COMT ist von signifikantem Interesse für die L-DOPA-basierte Therapie der Parkinsonschen Krankheit, wodurch erreicht wird, dass ein höherer Anteil von oral verabreichtem L-DOPA das Ziel im Gehirn erreicht.

In dieser Arbeit wurden Bisubstrat-Inhibitoren, welche sowohl in die Catechol-Bindungstasche, als auch in die Cofaktor-Bindungstasche von COMT binden, durch strukturbasiertes Design entworfen. Durch schrittweise Einschränkung der konformationellen Beweglichkeit wurden Bisubstrat-Inhibitoren mit Bindungs-affinitäten (IC50-Werte) bis in den einstelligen nanomolaren Bereich erhalten.

Ausgehend von dem Bisubstrat-Inhibitor 23 der ersten Generation (IC50 = 2 M), welcher in unserer Gruppe durch rationelles Design entwickelt worden war, wurden die Moleküle 31 - 34 mit kürzeren und weniger flexiblen Verbindungsstücken zwischen der Adenosin- und Catecholeinheit, sowie die Vergleichssubstanz 35, in welcher das Sauerstoffatom im Linker von 23 durch eine Methylengruppe ersetzt wurde, entworfen.

N

NH

OOH

HO

NO2

O

HO OH

X

NH2

NN

N

O

23 31 32 n = 133 n = 234 n = 335 n = 4

X = ( ) n

Die Verbindungen wurden in einem enzymatischen Assay auf ihre in vitroInhibitionswirkung für COMT getestet. Wie erwartet war der Linker von 32 zu kurz, um eine effektive Bisubstrat-Bindung zu ermöglichen (IC50 = 90 M). Etwas unerwartet zeigte Verbindung 33 mit zwei Kohlenstoffatomen im Linker einen niedrigeren IC50-Wert (60 nM) als der Inhibitor 34 mit einer drei-Kohlenstoff-Brücke (IC50 = 200 nM). Der vier-Kohlenstoff-Linker von 35 (IC50 = 5 M), sowie der vier-Atom-Linker von 23 (IC50 = 2 M), scheinen zu lang zu sein. Die Brücken in 33 und

Zusammenfassungii

34 haben deutlich die beste Länge, um eine Bindung sowohl in die SAM- als auch in die Catechol-Bindungstasche zu ermöglichen. Eine weitere Versteifung des Linkers durch Einbau einer trans-Doppelbindung hatte einen dramatischen Effekt auf die Bindungsaffinität. Verbindung 31, mit einem IC50-Wert von 9 nM, ist der zur Zeit potenteste Bisubstrat-Inhibitor für COMT. Um den Inhibitionsmechanismus von 31 zu untersuchen, wurden Kinetikexperimente durchgeführt. Der Inhibitor 31 zeigte gegenüber der SAM-Bindungstasche einen kompetitiven Mechanismus mit einem Kic-Wert von 28 ± 2 nM. Betreffend der Catechol-Bindungstasche zeigte 31 eine gemischte Inhibitionskinetik. Die berechneten Inhibitionskonstanten betragen Kic = 23 ± 4 nM und Kiu = 13 ± 4 M. Der kompetitive Mechanismus betreffend der SAM-Tasche und gemischte Mechanismus betreffend der Catechol-Tasche weisen auf einen geordneten Mechanismus hin, in welchem zuerst die SAM-Tasche gebunden wird, was eine effektive Bindung in die Catechol-Tasche ermöglicht. Um Strukturinformationen zu erhalten, wurde COMT zusammen mit dem Inhibitor 31 und Mg2+-Ionencokristallisiert. Die Röntgenstruktur konnte mit einer Auflösung von 2.6 Å erhalten werden. Der Inhibitor besetzt wie angenommen die SAM- und die Catechol-bindungstaschen.

OH

HO

NO2

X

O

N

O

O

41 X = O62 X = CH2

Der N-Hydroxysuccinimidester 41, eine Vorstufe in der Synthese von 23 und 31 - 35 hat eine überraschend hohe Inhibitionswirkung (IC50 = 100 nM). Daher wurde das stabile Analogon 62 synthetisiert. Die Verbindung 62 ist ein vergleichsweise schwacher Inhibitor für COMT (IC50 = 3 M) und deshalb als Monosubstrat-Inhibitorvon geringem Interesse.

Um den strukturellen Einfluss der Ribose und ihre Funktion als H-Brücken-Donor zu untersuchen, wurden die Strukturanaloga 87 und 89 - 91 des potenten Bisubstrat-Inhibitors 31 synthetisiert. Die Bindungsaffinitäten und die Bindungsmodi der getesteten Inhibitoren waren gegenüber Veränderungen der Riboseeinheit ausser-ordentlich empfindlich.

Zusammenfassung iii

N

NN

N

NH2

NH

O

NO2

OH

HOX

O

HO

OX =

87 9089HN

HN

(-)-91 (+)-91

Das Entfernen der 2'-OH Gruppe von 31 führte für 87 (IC50 = 28 M) zu einem Verlust an Bindungsaffinität von über drei Grössenordnungen. Der kompetitive Inhibitionsmechanismus für die SAM-Bindungstasche blieb erhalten, was auf einen Bisubstrat-Bindungsmodus hinweist. Andererseits zeigte der Dideoxyribose-Inhibitor 89 (IC50 = 3 M) einen gemischten und das Cyclopentan-Derivat 90 (IC50 = 1 M)einen unkompetitiven Inhibitionsmechanismus für die SAM-Bindungstasche. Im gebundenen Zustand ist der Adenin-substituierte Cyclopentanring von 90wahrscheinlich zur Oberfläche des Enzyms in die umgebende Lösung gerichtet. Der Pyrrolidinring der enantiomeren Zielverbindungen (–)-91 (IC50 = 43 M) und (+)-91(IC50 = 141 M) war kein geeigneter Ersatz für die Ribose.

N

NH

OOH

HO

NO2

O

HO OH

X

NH2

NN

N

162

X =

161 158

160

N

HO OH

NH2

NN

N

HO

Die Strukturanaloga 161, 162 und 158 des Naturstoffs Aristeromycin (160)wurden als potentielle Bisubstrat-Inhibitoren für COMT entworfen. Ausgehend von D-Ribose konnte das Phthalimid 164 in 13 Stufen einer effizienten, diastereoselektiven Synthese erhalten werden. Leider scheiterten alle Versuche, Adenin durch Aktivierung der sekundären OH-Gruppe und nucleophile Substitution einzuführen. Gründe dafür sind möglicherweise eine sterische Hinderung durch den Substituenten in 4'-Position und Destabilisierung des Übergangszustandes der Substitution durch den Elektronenzug der 2'-O und 3'-O Atome.

Zusammenfassungiv

OO

OH

H

H

N

164

O

O

N

N N

N

NH2

OO

H

H

N

O

O

D-Ribose

13 Schritte

1'2'3'

4'

Abstract

The enzyme catechol-O-methyltransferase (COMT) catalyzes the methyl group transfer from the cofactor S-adenosylmethionine SAM to the phenolic hydroxy group of catechol-type substrates, such as L-DOPA and dopamine, in the presence of magnesium ions. The inhibition of COMT is of significant interest in the L-DOPA-based treatment of Parkinson's disease, since it ensures that a higher quantity of orally administered L-DOPA reaches its target in the brain.

In this thesis, bisubstrate inhibitors that bind to both the cofactor and the catechol binding sites of COMT were developed using X-ray structure-based design. By sequential increase of the conformational rigidity, the bisubstrate inhibitors were optimized to provide binding activities in the single-digit nanomolar range.

Based on the first generation bisubstrate inhibitor 23 (IC50 = 2 M), that was developed by rational design in our group, we designed compounds 31 - 34 with shorter and conformationally less flexible linkers between the adenosine and catechol moieties, and the reference compound 35, with the O-Atom in the linker of 23 replaced by a methylene group.

Abstract v

N

NH

OOH

HO

NO2

O

HO OH

X

NH2

NN

N

O

23 31 32 n = 133 n = 234 n = 335 n = 4

X = ( ) n

The compounds were submitted to an enzymatic assay for determination of their in vitro inhibitory activity against COMT. As expected, the linker of 32 was too short to provide effective bisubstrate binding (IC50 = 90 µM). Somewhat unexpectedly, compound 33 with a two-carbon linker showed a lower IC50 value (60 nM) than inhibitor 34 with a three carbon bridge (IC50 = 200 nM). The four-carbon linker used in 35 (IC50 = 5 µM), similar to the four-atom linker in 23 (IC50 = 2 µM), seems to be too long. Clearly, the spacers in 33 and 34 have the best length to allow docking in both the SAM and the catechol binding sites. Further rigidification of the spacer by introduction of a trans double bond had a tremendous effect on binding affinity. Compound 31, with an IC50 value of 9 nM, is the most potent bisubstrate inhibitor for COMT to date. To investigate the mechanism of enzyme inhibition by 31, kinetic studies were performed. Inhibitor 31 showed a competitive inhibition mechanism with regard to the SAM binding site, and had a Kic value of 28 ± 2 nM. With respect to the catechol binding site, 31 showed a more complex, mixed inhibition mechanism. The calculated inhibition constants were Kic = 23 ± 4 nM and Kiu = 13 ± 4 M. The competitive inhibition pattern with respect to the SAM binding site and the mixed inhibition pattern with respect to the catechol site suggest an ordered mechanism of inhibition, with binding into the SAM binding site first required to allow effective binding to the catechol binding site. For structural characterization, COMT was co-crystallized with inhibitor 31 and Mg++ ions. The X-ray crystal structure of the ternary complex was refined at 2.6 Å resolution. As predicted, the inhibitor occupies both, the SAM and the catechol binding sites.

Abstractvi

OH

HO

NO2

X

O

N

O

O

41 X = O62 X = CH2

N-Hydroxysuccinimide ester 41, a precursor in the synthesis of 23 and 31-35,exhibits a surprisingly high inhibitory activity (IC50 = 100 nM). Therefore, the stable analog 62 was synthesized. Because 62 is a comparatively weak inhibitor (IC50 = 3

M) for COMT, it is of low interest as a single-substrate inhibitor.

N

NN

N

NH2

NH

O

NO2

OH

HOX

O

HO

OX =

87 9089HN

HN

(-)-91 (+)-91

In order to study the structural influence of the ribose and its function as H-bond donor, the structural analogs 87 and 89-91 of the potent bisubstrate inhibitor 31 were synthesized. Both binding affinity and binding mode were exceedingly sensitive towards modifications of the ribose moiety. Removal of the 2'-OH upon changing from 31 to 87 (IC50 = 28 M) led to a reduction in binding affinity of more than three magnitudes. At the same time, competitive inhibition kinetics with respect to the SAM binding site was maintained, thereby supporting a bisubstrate binding mode. Unlike 87,the dideoxyribose inhibitor 89 (IC50 = 3 M) showed a mixed and the cyclopentane derivative 90 (IC50 = 1 M) an uncompetitive inhibition mechanism with respect to the SAM binding site. In the complex of the latter, the adenine-substituted cyclopentane ring orients most probably towards the surface of the enzyme into the surrounding solution. The enantiomeric compounds (–)-91 (IC50 = 43 M) and (+)-91 (IC50 = 141

M), wherein the ribose had been replaced by a pyrrolidine ring, showed only low binding affinity.

Abstract vii

N

NH

OOH

HO

NO2

O

HO OH

X

NH2

NN

N

162

X =

161 158

160

N

HO OH

NH2

NN

N

HO

Structural analogs 161, 162 and 158 of the natural product aristeromycin (160), were designed as potential bisubstrate inhibitors for COMT. Starting from D-ribose, the intermediate phthalimide 164 was synthesized in an efficient diastereoselective way in 13 steps. Unfortunately, all attempts to introduce adenine by activation and nucleophilic substitution of the secondary alcohol failed, possibly due to steric hindrance by the substituent in 4'-position and destabilization of the transition state of the nucleophilic substitution by the electron-withdrawing effect of the 2'-O and 3'-Oatoms.

OO

OH

H

H

N

164

O

O

N

N N

N

NH2

OO

H

H

N

O

O

D-ribose

13 steps

1'2'3'

4'

Einleitung 1

1 Einleitung

1.1 Wirkstoffdesign

1.1.1 Auffinden und Optimieren einer Leitstruktur

Im Mittelpunkt der modernen Arzneimittelforschung steht der Begriff der Leitstruktur. Leitstrukturen sind Moleküle, welche bereits eine gewisse biologische Aktivität aufweisen, deren Eigenschaften jedoch einer weitergehenden Optimierung bedürfen, um als Medikament potenziell geeignet zu sein [1,2]. Der Entwicklungs-prozess eines neuen Arzneistoffes kann bis zu 15 Jahre dauern und bis zu einer halben Milliarde Dollar verschlingen [3].

Häufig spielt beim Auffinden einer Leitstruktur der glückliche Zufall (Serendipity) eine wichtige Rolle [4]. Das bekannteste Beispiel ist die Entdeckung der Penicillin-Antibiotika 1* durch Alexander Fleming im Jahr 1928.

N

S

O

HN

H CO2H

HHR

O

1

Die Natur bietet eine riesige, noch kaum erschöpfte Anzahl von Naturstoffen, und mit Hilfe biologischer Tests können darunter Substanzen mit interessanten Wirkstoff-eigenschaften gefunden werden [5,6]. Die Strukturen von Naturstoffen, wie beispielsweise Taxol 2, sind häufig hochkomplex, weshalb deren Totalsynthese eine Herausforderung für den Synthesechemiker darstellen [7].

OH

O

AcOHOBzO

H

ONH

Ph

O

OH

PhO

OHO

2

* Im Folgenden beziehen sich die Substanznummern immer auf das in den Schemata gezeigte Enantiomer. (+)- und (–)- werden nur vorangestellt, falls beide Enantiomere explizit diskutiert werden. Bei racemischen Gemischen wird (±)-vorangestellt.

Einleitung2

Durch Miniaturisierung und Automatisierung der Testverfahren ist man heute in der Lage, im High Throughput Screening (HTS) sehr viele Verbindungen in kurzer Zeit zu bewerten [8]. Der schnellen und verlässlichen Identifizierung von hochaffinen Liganden kommt im Hinblick auf die durch die Genomprojekte zu erwartende Flut charakterisierter Rezeptoren eine besondere Bedeutung zu [9,10]. Bei einem Massen-Screening (Random-Screening) wird eine grosse Anzahl von Substanzen unabhängig von deren Strukturen untersucht. Diese teuere und zeitaufwendige Vorgehensweise wird mehr und mehr durch gerichtetes Screening (Nonrandom-Screening) ersetzt [11].

Um die enorme Kapazität dieser Testmodelle ausschöpfen zu können, erscheint die Synthese von grossen Substanzbibliotheken wünschenswert. Dies kann durch automatisierte Parallelsynthese oder durch simultane Herstellung von Verbindungsgemischen unter Verwendung von Methoden der kombinatorischen Chemie geschehen [12,13]. Auch gibt es Ansätze, mit Computerprogrammen virtuelle Bibliotheken zu erzeugen und zu evaluieren (in silico Screening) [14,15].

Dank Fortschritten in der Strukturaufklärung von Proteinen mit Hilfe der Röntgenstrukturanalyse oder der Kernresonanzspektroskopie sowie in der Entwicklung leistungsfähiger Computermodelle ist auch ein rationelles Design von Leitstrukturen möglich geworden [16,17]. Mit Hilfe der Molekülmodellierung können durch de novoDesign neue Leitstrukturen entworfen werden, welche optimal in die Bindungstasche eines Enzyms passen [18,19]. Im chemischen Laboratorium werden die Substanzen hergestellt und dann mit biologischen Testsystemen auf ihre Hemmstoffwirkung hin bewertet. Durch kristallografische Aufklärung der Struktur von Enzym-Inhibitor-Komplexen kann das verwendete Modell evaluiert und ein neuer Ausgangspunkt für eine weitere Optimierung der Leitstruktur erhalten werden (Abb. 1) [20-22].

Abb. 1 Der iterative Prozess des strukturbasierten Wirkstoffdesigns: Der Design-Zyklus muss in den meisten Fällen mehrfach durchlaufen werden, bevor eine Struktur in weitere Entwicklungsstufen der Arzneimittelforschung gelangt.

Einleitung 3

Eindrucksvolle Beispiele von bereits in der Therapie eingesetzten Wirkstoffen, bei deren Entdeckung das rationale Design von entscheidender Bedeutung war, sind der HIV-1 Protease-Inhibitor Saquinavir 3 [23] und der Neuraminidase-Inhibitor GS4071 4[24]. Zahlreiche Referenzen zu weiteren Beispielen (Aldose-Reductase, Calmodulin, Cyclooxygenase-2, Elastase, FKBP12, Gyrase, Papain, Purin-Nucleosid-Phosphatase, Renin, Reverse Transkriptase, Selectin, Streptavidin, Thermolysin, Thymidylat-Synthase) werden in [21,22] aufgeführt.

NNH

OCONH2

HN N

HN

O

OHHH

O

O CO2H

HN

NH

NH2

O

AcHN

4IC50= 1 nM

3IC50= 0.4 nM

Abb. 2 In der Therapie eingesetzte Wirkstoffe, bei deren Entwicklung das rationale Design von entscheidender Bedeutung war.

Durch strukturbasiertes Design sind in der Arbeitsgruppe Diederichbeispielsweise Inhibitoren von Thrombin [25-29], tRNA-Guanin Transglycosidase (TGT) [30] und Plasmepsin II [31] entworfen worden (Abb. 3).

NN

H

H

OO

O

H2NNH

· HCl

N

NHH2N

S

NH2

O

HN

O

O

S

SN

Cl

5Ki = 7 nM

6Ki = 100 nM

(±)-7IC50 = 2 M

Abb. 3 Durch strukturbasiertes Design entworfene Inhibitoren für Thrombin (5), TGT (6) und Plasmepsin II ((±)-7).

Einleitung4

1.1.2 Pharmakokinetik

Parallel zur Optimierung der Hemmwirkung einer Leitstruktur werden in der modernen Medizinalchemie ebenfalls deren Eigenschaften der Aufnahme, der Verteilung, des Metabolismus und der Ausscheidung, die sogenannten pharmako-kinetischen ADME-Parameter (adsorption, distribution, metabolism, excretion), welche die Bioverfügbarkeit einer Substanz bestimmen, getestet und verbessert, damit der Wirkstoff, der zu einem Medikament entwickelt werden soll, im Körper auch sein Ziel erreicht [32-34]. Die Verabreichung einer Arznei kann oral, durch Aufnahme und Absorption des Wirkstoffes im Magen-Darm-Trakt, oder durch verschiedenste Arten von Injektionen und Diffusionen durch Haut oder Schleimhäuten erfolgen [35]. Es wird zwischen topischen, auf das betreffende Gebiet beschränkte und systematischen Applikationen, bei welchen der Wirkstoff sich über den Blutkreislauf im Körper verteilt, unterschieden. Für systematische Anwendungen ist die orale Aufnahme die bevorzugt angestrebte Art der Verabreichung. Um den Wirkort zu erreichen, muss der Wirkstoff mit einer lipophilen (z.B. Membranen) und einer wässrigen Umgebung (z.B. das Cytoplasma) wechselwirken können. Eines der wichtigsten Membransysteme ist die Blut-Hirn-Schranke, sie umgibt die Kapillargefässe des Kreislaufsystems im Gehirn und schützt es vor unerwünschten chemischen Substanzen aus dem Blutstrom. Sie ist eine hervorragende Schutzeinrichtung, kann jedoch auch den Transport von Medikamenten, die auf das Zentrale Nervensystem wirken sollen, daran hindern, ihren Wirkort zu erreichen [1].

Lipophilie, Grösse und Ionisationsgrad einer Substanz sind hierbei entscheidende Grössen. Quantitativ ausgedrückt wird die Lipophilie einer bestimmten Substanz häufig durch den Logarithmus ihres Octanol/Wasser Verteilungskoeffizienten (logP) [1,34]. LogP Werkte können gemessen oder mit relativ hoher Zuverlässigkeit berechnet werden (calculated log P, cLogP) [36]. Durch statistische Analyse von im WDI (World Drug Index) verzeichneten 50000 Wirkstoffen (1997), wurden qualitative Regeln für die Eigenschaften von geeigneten (drug-like) Molekülen aufgestellt (Lipinski's Rule of 5)[37,38]:

• Das Molekulargewicht ist unter 500. • Der LogP ist unter 5. • Es hat nicht mehr als 5 H-Brücken Donor- und nicht mehr als 10 H-Brücken

Akzeptor-Atome.

Obwohl es sich nur um qualitative Regeln mit vielen Ausnahmen handelt, wurde festgestellt, dass weniger als 10% der Wirkstoffe gleichzeitig zwei Punkte verletzen.

Einleitung 5

1.1.3 Molekulare Erkennung

Neben der Erfindung potenzieller Wirkstoffe gegen teilweise lebensbedrohliche Krankheiten werden durch die strukturbasierte Entwicklung von Hemmstoffen ebenfalls grundlegende allgemeine Erkenntnisse über die zwischenmolekularen Wechsel-wirkungen, die für die Komplexierung an einer Enzymbindugsstelle verantwortlich sind, gewonnen [21,22]. Mit dem Verständnis zwischenmolekularer Kräfte und der molekularen Erkennung in Biologie und Chemie beschäftigt sich die aufstrebende Disziplin der supramolekularen Chemie [39-41].

Die Lage des Gleichgewichtes für die reversible Assoziation von Rezeptor und Ligand zum Rezeptor-Ligand-Komplex wird durch die Assoziationskonstante Ka beschrieben:

]][[][

a ezeptorRLigandezeptorRLigandK (1)

Damit im Zusammenhang steht die freie Standard-Bindungsenthalpie G°:

G° = -RTlnKa (2) R = Gaskonstante (8.314 J mol-1 K-1)

In der Medizinalchemie wird als charakteristische Grösse für die Hemmfähigkeit eines Liganden üblicherweise nicht die Assoziationskonstante, sondern die Inhibitions-konstante Ki verwendet, welche in etwa der Dissoziationskonstanten Kd entspricht:

adi

1K

KK (3)

Eine Änderung von Ki um eine Grössenordnung bedeutet bei 298 K eine Änderung der freien Bindungsenthalpie um 1.4 kcal/mol. Die Zusammenhänge von Ki mit der Enzymkinetik und Methoden zur Bestimmung von Ki-Werten werden in Kapitel 2.3.2 erläutert.

1.1.3.1 Komplementarität

Sterische und elektronische Komplementarität ist eine Grundvoraussetzung für die effektive Komplexierung eines Liganden durch einen Protein-Rezeptor. Dieses "Schlüssel-Schloss"-Prinzip wurde bereits vor über 100 Jahren von Emil Fischer postuliert [42]. Gegenüber dieser eher statischen Betrachtungsweise geht die induced-fit-Theorie davon aus, dass während der Annäherung eines Liganden an einen Rezeptor eine Konformationsänderung des Rezeptors induziert werden kann, wodurch die wesentlichen Bindungsstellen entsprechend orientiert werden [43].

Einleitung6

1.1.3.2 Elektrostatische Wechselwirkungen

Geladene Gruppen des Liganden können an entgegengesetzt geladene Gruppen des Proteins über ionische Wechselwirkungen ("Salzbrücken") binden. Im Protein sind bei physiologischem pH-Wert (ca. 7.4) die Guanidin-Seitenketten von Arginin (pKa = 12.5*) und die Amin-Seitenkette von Lysin (pKa = 10.8) protoniert und damit positiv geladen. Die Imidazol-Seitenkette von Histidin (pKa = 6.5) kann in Abhängigkeit der mikroskopischen Umgebung protoniert oder neutral vorliegen [44]. Negativ geladene Gruppen stellen die Carboxylat-Seitenketten von Asparagin- (pKa = 3.9) und Glutaminsäure (pKa = 4.1) dar. Nach dem Coulomb-Gesetz ist die Energie von elektrostatischen Wechselwirkungen umgekehrt proportional zum Abstand der Ionen (r)und zur Dielektrizitätskonstante ( ).

* pK-Werte hängen von der Mikroumgebung der ionisierbaren Gruppen ab.

rezzU

r

2

oionion 4

1 (4)U = Potentielle Energie, z·e = Ionenladungen

o, r = Dielektrizitätskonstanten des Vakuums und des Mediums, r = Ionenabstand

Für eine Vielfalt von synthetischen Ionenpaarkomplexen (203 Komplexe) in Wasser wurde von Schneider ein linearer Zusammenhang zwischen ln(Ka) und der Anzahl an Salzbrücken gefunden [45][41,46]. Durch lineare Regression wurde daraus der Beitrag zur freien Bildungsenthalpie von G° = -1.25±0.25 kcal mol-1 pro Salzbrücke erhalten. Ein ähnliches Resultat wurde durch Auftragung von ln(Ka) gegen die Anzahl an Salzbrücken in DNA-Polyamin-Komplexen gefunden [47].

In Abb. 4 ist als Beispiel ein Ausschnitt (S1-Tasche) aus der Röntgenstruktur des Komplexes von Thrombin mit dem Inhibitor 5 gezeigt, in welchem eine Salzbrücke zwischen der Guanidinium-Gruppe von 5 und der Carboxylat-Seitenkette von Asp189 des Enzyms von wesentlicher Bedeutung ist [25-28].

Einleitung 7

Abb. 4 Ausschnitt (S1-Tasche) aus der Röntgenstruktur des Komplexes zwischen Thrombin und Inhibitor 5 mit einer Salzbrücke (gestrichelte Linien) zwischen der Guanidinium-Gruppe des Inhibitors und der Carboxylat-Seitenkette von Asp189 des Enzyms.

Von der Energie her geringere Beiträge liefern Wechselwirkungen zwischen Ionen und Dipolen, sowie Dipol-Dipol-Wechselwirkungen.

Durch die Wechselwirkung des Quadrupolmomentes eines aromatischen -Systems mit einer positiven Ladung können Kationen auch von aromatischen Ringen gebunden werden [48-50].

1.1.3.3 Wasserstoffbrücken

Wasserstoffbrücken beruhen hauptsächlich auf der elektrostatischen Anziehung zwischen einem an ein elektronegatives Atom X (meist N oder O) gebundenes Wasserstoffatom und einem weiteren elektronegativen Atom Y oder einem -Elektronensystem. Als gerichtete Kräfte sind Wasserstoffbrücken äusserst wichtig für die spezifische Erkennung in biologischen Systemen [51,52]. Typische H-Brücken-Donoren sind O-H und N-H. Der C-H-Rest kann als schwacher H-Brücken-Donor in C-H···O-, C-H···N- und C-H··· -Systemen wirken, insbesondere falls es zur Azidifizierung durch benachbarte elektronenziehende Gruppen kommt. Typische H-Brücken-Akzeptoren sind C=O, COO-, OR und NR2. Die optimale Geometrie einer Wasserstoffbrücke X-H···Y ist linear, obwohl häufig auch Winkel bis zu 160° gefunden werden [53,54]. Als Länge von Wasserstoffbrücken wird der Abstand der beiden beteiligten Heteroatome angegeben, da die exakte Position der Protonen aus Röntgenstrukturen nicht bestimmbar ist. Typische Längen von Wasserstoffbrücken betragen 2.5-3.5 Å. Bedingt durch ihren elektrostatischen Charakter hängt die Stärke

Einleitung8

einer Wasserstoffbrücke erheblich von ihrer mikroskopischen Umgebung ab. Typische freie Bindungsenergien von Wasserstoffbrücken in der Gasphase betragen 3 bis 9 kcal/mol [55]. Im freien Protein und freien Liganden in wässriger Lösung sind die Wasserstoffbrückendonor- und -akzeptoratome durch Wasser solvatisiert. Bei der Komplexierung bleibt die Anzahl der Wasserstoffbrücken somit üblicherweise konstant. Der Gewinn an freier Bindungsenergie wird durch die relative Stärke der verschiedenen Wasserstoffbrücken sowie durch die entropisch günstige Überführung von an die Donor- und Akzeptoratome gebundenen Wassermolekülen in das Umgebungswasser bestimmt. Im Mittel werden für den Beitrag von Wasserstoffbrücken zur freien Bindungsenergie Werte von 0.5-1.5 kcal/mol gefunden [56,57].

1.1.3.4 Dispersionswechselwirkungen

Dispersionswechselwirkungen (van-der-Waals-Wechselwirkungen, London-Dispersionskräfte) sind Anziehungskräfte zwischen induzierten Dipolen, welche auf sehr kurzem Abstand wirken (~1/r6) und sehr schwach sind, sich bei grösseren Assoziationsflächen aber zu beträchtlichen Energiebeiträgen summieren. Bei zu nahem Kontakt kommt es zu einer stark abstossenden Wechselwirkung, die von 1/r12 abhängt. Dieser Zusammenhang kann durch das Lennard-Jones-Potential ausgedrückt werden [2,41]:

612vdWrB

rAU (5)

1.1.3.5 Hydrophobe Wechselwirkungen

Der Begriff der hydrophoben Wechselwirkungen beschreibt das Bestreben zur Aggregation lipophiler Gruppen in wässriger Lösung [41]. Hierzu werden auch Stapel- (face to face) und T-förmige (edge to face) Wechselwirkungen zwischen aromatischen Ringen gezählt [58]. Der klassische hydrophobe Effekt ist durch eine hohe günstige Komplexierungsentropie, welche auf der Verdrängung und Freisetzung geordneter Wassermoleküle beruht, und einen geringen enthalpischen Beitrag gekennzeichnet. Kalorimetrische Messungen der Komplexierung p-disubstituierter Benzolderivate mit synthetischen Cyclophanrezeptoren haben überraschend hohe günstige Komplexie-rungsenthalpien ergeben, welche teilweise durch ungünstige Komplexierungsentropien kompensiert werden [59]. Dieses Verhalten wird als nichtklassischer hydrophober Effekt bezeichnet. Der nichtklassische hydrophobe Effekt ist auch für Komplexierungs-vorgänge in biologischen Systemen, beispielsweise dem Einschub (Interkalation) aromatischer Ringe zwischen gestapelten DNA-Basenpaaren [60,61], von Bedeutung (Beispiel: Abb. 5).

Einleitung 9

OMe O

O

OH

OH

OHAc

O O

H

NH2

OH

Me

Daunomycin

Abb. 5 Röntgenstruktur eines DNA-Doppelstranges mit zwei eingeschobenen Daunomycin-Molekülen [62].

Computergestützte Molekülmodellierung (Molecular Modeling)

Durch die Verfügbarkeit von Computern mit beeindruckenden Graphikleistungen und hoher Rechengeschwindigkeit, sowie der fortlaufenden Verbesserung der Simulationsmodelle stehen dem Forscher in der Medizinalchemie zunehmend leistungsfähige Werkzeuge zur Verfügung. Die wichtigsten Methoden, die im Rahmen der Molekülmodellierung eingesetzt werden, sind in Tabelle 1 zusammengestellt [2].

Im Folgenden werden die für das strukturbasierte Wirkstoffdesign besonders wichtigen Methoden der Kraftfeldrechnung, Moleküldynamik und Konformations-analyse näher erläutert.

Einleitung10

Tabelle 1 Übersicht über die wichtigsten Methoden der Molekülmodellierung.

Interaktive Computergraphik Liganden-Modellierung

Molekülvergleich

Protein-Modellierung

Darstellung von 3D-Strukturen StrukturerzeugungMolekülmechanik Moleküldynamik Quantenmechanische Verfahren Konformationsanalyse Berechnung physikochemischer Eigenschaften Ähnlichkeitsanalyse (Topologie und Struktur) QSAR (Quantitative Structure Activity Relationships)SequenzvergleicheHomologiemodellierung Simulation der Proteinfaltung

Modellierung von Protein-Ligand-Wechselwirkungen

Berechnung von Bindungskonstanten Docking von Liganden Pharmakophor-Modelle Virtual Screening

1.1.3.6 Molekülmechanik, Kraftfeldrechnungen

Kraftfeldmethoden, auch Molekülmechanik genannt, gehen von der Annahme aus, dass Bindungslängen und -winkel in Molekülen, wann immer möglich, Standardwerte annehmen. Sterische und elektrostatische Wechselwirkungen können dazu führen, dass bestimmte Bindungslängen und -winkel von den Idealwerten abweichen [63]. Kraftfeldmodelle enthalten Terme für Bindungsstreckungen (Es),Winkeldeformationen (Eb), Verdrehung von Diederwinkeln (Etor), Dispersionskräfte (EvdW) und elektrostatische (Eelec) Wechselwirkungen (Abb. 6) [64].

Es

Eb

Etor

EvdW

Eelec

Abb. 6 Darstellung der intra- und intermolekularen Wechselwirkung in Kraftfeldmodellen.

Einleitung 11

Die Ableitung der Parameter eines Kraftfeldes erfolgt durch Kalibrierung an experimentelle Daten und aus den Resultaten möglichst genauer quantenmechanischer Rechnungen. Es gibt auf biologische Makromoleküle (Proteine, Nukleinsäuren, Kohlenhydrate, Lipide) spezialisierte Kraftfelder wie AMBER [65], GROMOS [66], CHARMM [67] und OPLS [68]. Diese Kraftfelder behandeln CH, CH2 und CH3-Gruppen häufig als einzelne Atome (united atoms model). Zudem gibt es auf kleine organische Moleküle spezialisierte Kraftfelder, wie MM2 [69] und MM3 [70], sowie mittlerweile relativ universell einsetzbare Kraftfelder wie ESFF [71] und MAB [72], welches in dieser Arbeit eingesetzt wurde.

Eine Besonderheit des MAB-Kraftfeldes ist die Verwendung eines Energieterms für die geometrische Beschreibung von H-Brücken:

),(jiji,ji,hb )()()(

jiPaarerfrfrBAE (6)

Hierbei bezeichnet der Parameter Ai,j die Gewichtung des Potentials einer H-Brücke zwischen Atom i und Atom j. B(ri,j) ist eine Funktion des Abstandes ri,j mit einem Minimum im optimalen Abstand von H-Brücken-Donor und -Akzeptor. Die Funktion f( r ) gewichtet H-Brücken entsprechend der geometrischen Anordnung von H-Brücken-Donor und -Akzeptor. Weitere elektrostatische Wechselwirkungen werden durch das MAB-Kraftfeld nicht berücksichtigt, so dass keine Parameter für die Zuordnung von Partialladungen nötig sind. Ein Test mit Strukturoptimierungen von 1589 Strukturen der Cambridge Structural Database ergab eine durchschnittliche Abweichung der Bindungslängen von den Röntgenstrukturen von nur 0.02 Å, 2° für die Bindungswinkel und Standardabweichungen der Atomkoordinaten (rmsd) von 0.1-0.2 Å [72]. Zu beachten gilt, dass erfahrungsgemäss durch das MAB-Kraftfeld H-Brücken übergewichtet und sterische Abstossungen untergewichtet wurden, sowie Amid-bindungen relativ leicht aus der Planarität herausgedreht werden konnten. Diese Probleme sind jedoch bekannt und mit der neuesten MAB/MOLOC-Version (16/10/02) weitgehend behoben worden.

Einer der grossen Vorteile von Kraftfeldrechnungen ist die Geschwindigkeit, in welcher Molekülstrukturen optimiert werden können. Nachteile von Kraftfeldern sind: häufig sind Parameter für die jeweilig aktuelle Fragestellung unvollständig; es werden keine Informationen über elektronische Eigenschaften (beispielsweise HOMO/LUMO-Energien) erhalten; chemische Reaktionen können nicht simuliert werden; Kraft-feldmodelle neigen dazu, einzelne Terme über- oder unterzugewichten [73]. Für die Anwendung des rationellen Wirkstoffdesigns überwiegt der Geschwindigkeitsvorteil die Nachteile jedoch bei weitem, da dadurch ein interaktives Arbeiten möglich wird.

Einleitung12

Kraftfeldrechnungen gehören zudem zum Standardwerkzeug für die Bestimmung der räumlichen Molekürstruktur auf der Grundlage von Röntgenbeugungs- oder 2D-NMR-Daten, ohne welche ein strukturbasiertes Design nicht möglich wäre [2].

1.1.3.7 Optimierungsverfahren

Um zu einer Struktur mit einem Energieminimum auf der Energie-Hyperfläche zu gelangen, werden häufig die steepest-descent- und die conjugate-gradient-Methode eingesetzt [63]. Hierzu wird die erste Ableitung der Potentialfunktion berechnet, welche Auskunft über die Steigung auf der Hyperfläche gibt. Die Atome werden nun entsprechend dieses Vektors verschoben und der Vorgang iterativ wiederholt, bis sich der Gradient der potentiellen Energie unterhalb eines Schwellwertes nicht mehr ändert. Während bei der steepest-descent-Methode die Verschiebungen orthogonal zueinander erfolgen, was zu einer langsamen Konvergenz in der Nähe von Minima führen kann, vermeidet die conjugate-gradient-Methode orthogonale Gradienten, indem Linear-kombinationen des aktuellen Gradienten mit vorhergehenden Gradienten berechnet werden.

1.1.3.8 Moleküldynamik

Moleküldynamiksimulationen (MD) berücksichtigen neben der potentiellen auch die kinetische Energie eines Systems. Die Newtonschen Bewegungsgleichungen (Formeln 7 und 8) werden hierbei mit einem numerischen Verfahren (meist durch den leap-frog-Algorithmus) schrittweise gelöst [74].

i1

ii2

2)(

dd Fmtrt

(7)

),...,,( N21i

i rrrUr

F (8)

iF : auf das Atom i wirkende Kraft mi: Masse von Atom i

ir : Koordinaten von Atom i t: Zeit U: Potentielle Energie

Die Schrittweite beträgt typischerweise 1 Femtosekunde. Auf sehr leistungsfähigen Computern werden bei der Simulation von Proteinen in wässriger Lösung bis zu zehn Nanosekunden (107 Schritte) berechnet. Dies ist ausreichend, um die Bewegung von Seitenketten und sogar Proteindomänen zu verfolgen, reicht aber nicht aus, um die Diffusion eines Wirkstoffes in die Bindungstasche oder gar die Faltung eines Proteins zu simulieren. Dennoch werden wichtige Informationen darüber erhalten, welche Teile des Proteins und des Liganden im Komplex starr bleiben und welche flexibel sind. Durch Integration der Trajektorie (Konfigurationen als Funktion der Zeit) über thermodynamische Kreisprozesse lassen sich zudem Differenzen der

Einleitung 13

freien Bindungsenergien von ähnlichen Liganden voraussagen, die sich z.B. um eine zusätzliche Methylgruppe voneinander unterscheiden [2,74].

1.1.3.9 Konformationsanalyse

Eine Möglichkeit zum Absuchen des Konformationsraumes besteht in der systematischen Variation der Diederwinkel von Einfachbindungen. Da der Aufwand dieses Verfahrens exponentiell mit der Anzahl von Einfachbindungen steigt, ist es nur beschränkt anwendbar.

Moleküldynamiksimulationen können auch zur Konformationsanalyse behilflich sein [75]. Mit dem Computer ist es kein Problem, eine starke Temperaturerhöhung zu simulieren, wodurch sich Molekülgeometrien von lokalen Minima entfernen können. Eine Energie-Minimierung ist anschliessend durch schrittweise Abkühlung der simulierten Temperatur auf 0 K möglich (simulated annealing) [76].

Zu den effektivsten Methoden der Konformationsanalyse gehören Monte-Carlo-Verfahren [74,75]. Dabei werden zunächst Atome der Konfiguration Sr zufällig in alle Richtungen verschoben. Die neu erzeugte Konfiguration 1Sr wird anhand eines Energiekriteriums, das die Änderung )()( S1S rUrUE der potentiellen Energie bezüglich der vorhergehenden Konfiguration enthält, entweder angenommen oder abgelehnt. Die neue Konfiguration wird angenommen, wenn 0E oder 0E und

Re TkE B/ , wobei R eine Zufallszahl im Intervall (0, 1) ist. Durch dieses Verfahren wird ein statistisches Ensemble von Konformationen erhalten, deren potentielle Energie der Boltzmann-Verteilung entsprechen [77].

1.2 Überblick über die Parkinson-Krankheit und deren Therapie

Etwa ein Prozent der über Sechzigjährigen ist von der Parkinson-Krankheit betroffen, welche erstmals 1817 von dem Londoner Arzt und Paläontologen Dr. James Parkinson (1755–1824) unter dem Namen Schüttellähmung beschrieben wurde [78]. Symptomatisch äussert sich diese Krankheit durch unwillkürliches Zittern, Muskelverspannung und nicht beeinflussbare Bewegungsstörungen mit Fallneigung. Hinzu kommen als nichtmotorische Störungen Angst, Depression, Schlafstörungen und Schmerzen [79].

Einleitung14

Die genaue Ursache dieser Krankheit ist immer noch nicht bekannt, es wurde jedoch festgestellt, dass Parkinson-Patienten im Gehirn eine gegenüber gesunden Menschen bis zu 90% erniedrigte Konzentration an Dopamin 8, einem wichtigen neuronalen Botenstoff, der in einer Nervenansammlung des Hirnstammes, der Substantia nigra, angereichert ist, besitzen (Abb. 7) [79,80].

HO

HO

NH2

COOH

HO

HO

NH2

8 9

Abb. 7 Die Symptome der Parkinson-Krankheit werden durch einen zu niedrigen Dopamin-Spiegel verursacht. Verabreichung von L-DOPA in der Behandlung von Parkinson-Patienten soll deren Dopamin-Gehalt des Gehirns erhöhen.

Diese Tatsache ist auf eine Degenerierung der dopaminergen Neuronen zurückzuführen. Die Parkinson-Symptome sind erst feststellbar, wenn dieser Abbau schon zu etwa 80% fortgeschritten ist. In der medikamentösen Therapie wird versucht, die verminderte Produktion von Dopamin auszugleichen [81]. Dopamin selbst kann die Blut-Hirnschranke nicht überwinden [82]; daher wird den Patienten L-DOPA (Levedopa) (9), eine carboxylierte Vorstufe von Dopamin verabreicht [80]. Im Körper gelangt L-DOPA über die Blut-Hirn-Schranke ins Gehirn [83], wo es durch das Enzym Aromatische-Aminosäure-Decarboxylase (AAD) in Dopamin umgewandelt wird. Leider kann L-DOPA jedoch bereits im Blutkreislauf, vor Überschreiten der Blut-Hirn-Schranke, zu Dopamin decarboxyliert werden. Zu hohe Konzentrationen an Dopamin ausserhalb des Gehirns verursachen beim Patienten Übelkeit, Erbrechen und einen hohen Blutdruck. Einen grossen Fortschritt bewirkte die Entwicklung von AAD-Inhibitoren, welche diese Umwandlung ausserhalb des Gehirns selektiv blockieren. Derzeit im Gebrauch sind die Inhibitoren Benserazid 10 und Carbidopa 11 (Abb. 8) [84].

HO

HO

HO

HO

NH

HN

10 11

OH

O

NH2

OH

HNNH2

CH3OH

O

Abb. 8 Zur Hemmung von AAD in der Therapie der Parkinsonschen Krankheit finden gegenwärtig Benserazid 10 und Carbidopa 11 Verwendung.

Ohne diese Vorkehrung würde nur etwa 1% des eingenommenen L-DOPA ins Gehirn gelangen, aber auch nach Hemmung der AAD liegt dieser Anteil bei lediglich 5-10%. Grund dafür ist ein zweites Enzym, die Catechol-O-Methyltransferase (COMT),

Einleitung 15

welches die Methylierung von Catechol-Substraten katalysiert und dadurch die katabolische Inaktivierung von L-DOPA zur Folge hat. Bei dieser Umwandlung entsteht 3-Methoxytyrosin 12 (3-OMD), welches aufgrund seiner Langlebigkeit (t1/2 = ~ 15 h) gegenüber L-DOPA (t1/2 = ~ 1 h) und der Kompetitivität mit L-DOPA um denselben aktiven Transport über die Blut-Hirnschranke ein unerwünschtes und möglicherweise schädliches Nebenprodukt darstellt (Schema 1) [85,86].

HO

HO

NH2

COOH

HO

HO

NH2

HO

HO

COOH

AAD

MAO

COMT

COMT

COMT

O

HO

NH2

O

HO

NH2

COOH

O

HO

COOH

9 L-Dopa 12 3-OMD

13 3-MT8 Dopamin

15 HVA14 DOPAC

Schema 1 Metabolismus von L-Dopa.

Auch Dopamin kann durch COMT methyliert werden, unter Bildung von 3-Methoxytyramin 13 (3-MT) oder durch Monoaminoxidase (MAO) in Dihydroxyphenyl-essigsäure 14 (DOPAC) überführt werden. DOPAC kann wiederum durch COMT zu Homovanillinsäure 15 (HVA) umgewandelt werden [85,86].

Die Entstehung dieser unerwünschten Metaboliten wird durch gleichzeitige Hemmung der peripheren AAD und von COMT vermieden, wobei wünschenswert ist, dass der AAD-Hemmer nur in der Peripherie, der COMT-Inhibitor hingegen sowohl im peripheren als auch im zentralen Nervensystem aktiv ist. Durch Hemmung von COMT kann die ins Gehirn gelangende L-DOPA-Menge auf bis zu 30% des eingenommenen Medikamentes gesteigert werden [85-89]. Auch die Hemmung des Enzyms Monoaminoxidase (MAO) sollte den Abbau von Dopamin bremsen und zu einer Erhöhung des Dopaminspiegels führen [85,86].

Einleitung16

Abb. 9 L-DOPA wird von den Enzymen AAD und COMT abgebaut. Werden beide Enzyme gehemmt, gelangen bis zu 30% des Wirkstoffs ins Gehirn [90].

Dieses lässt sich auch direkt im Hirn beobachten: Zur Abklärung der Diagnose eines Parkinson-Syndroms und zum Beobachten des Therapieverlaufes kann eine mit radioaktiven 18F-Isotopen markierte L-DOPA Lösung in die Vene gespritzt werden. Das L-DOPA wird im Gehirn aufgenommen, in markiertes Dopamin umgewandelt und in der Substantia Nigra des Gehirns angereichert. Durch Positronen-Emissions-Tomografie (PET) kann die Dopamin-Konzentration visuell dargestellt werden [91] (Abb. 10).

Einleitung 17

Abb. 10 PET-Abbildungen des Gehirns eines Parkinson-Patienten, dem radioaktiv markiertes L-DOPA intravenös verabreicht wurde. Links: ohne COMT-Hemmstoff. Rechts: nach Verabreichung des COMT-Hemmstoffs Entecapone zeigt sich deutlich eine grössere Anreicherung von L-DOPA in bestimmten Hirnregionen [91].

1.3 Das Enzym Catechol-O-Methyltransferase (COMT)

1.3.1 Funktion und Vorkommen von COMT

COMT dient der O-Methylierung und somit der Inaktivierung von Catecholaminen, wie die Neurotransmitter Dopamin, Norepinephrin und Epinephrin sowie von L-Dopa; auch sind Ascorbinsäure und Melanin-Intermediate Substrate von COMT. Die Methylgruppe stammt vom Cofaktor S-Adenosylmethionin (SAM). COMT kommt in fast allen Organismen und in nahezu allen Geweben von Säugern vor. Es ist vor allem in der Leber und den Nieren angereichert. Im Gehirn kommt COMT vor allem in Gliazellen vor, während seine Aktivität in postsynaptischen Neuronen niedriger und in präsynaptischen dopaminergen Neuronen eher unbedeutend ist. Ein einziges Gen kodiert für COMT, aufgrund der Existenz zweier Promotoren entstehen jedoch zwei unterschiedliche Proteine, ein lösliches (S-COMT), bestehend aus 221 Aminosäuren, und ein membrangebundenes (MB-COMT), welches in Bezug auf ersteres über einige zusätzliche Aminosäuren verfügt (43 in der Ratte, 50 beim Menschen), die die Verankerung des Proteins in der intrazellulären Membran erlauben. Mit Ausnahme des Gehirns, wo 70% des gesamten Proteins als MB-Form vorliegt, überwiegt die lösliche Form mindestens um das Dreifache [85,86].

Einleitung18

1.3.2 Struktur von COMT

COMT ist ein Ein-Domänen-Protein und besteht aus einer von acht -Helices umgebener, fünfsträngigen -Faltblattstruktur (Abb. 11) [92,93].

Abb. 11 Röntgenkristallstruktur des quaternären Komplexes zwischen COMT, SAM, einem Mg2+-Ion und 3,5-Dinitrocatechol. Für das Protein sind die -Faltblätter und

-Helices, sowie die Conolly-Oberfläche [94] gezeigt.

Die aktive Tasche des Enzyms besteht aus der Cofaktor-Bindungsstelle für SAM und der Substrat-Bindungsstelle für Catechole (Abb. 12 und Abb. 13) [90,92,93,95].

Einleitung 19

Abb. 12 SAM, 3,5-Dinitrocatechol und Mg2+ im aktiven Zentrum von COMT [90,95].

HO

H

N

N N

N

NH2

O

OO

O2N

O

O

O

O

O

NH2O

H

OH

O

O

S

CH3

NH3+

O O

H

OH Val42

HN O

HO

Ser72

O2N

OH

Mg++

HNO

NHO

OO

H H

NH2

O

Glu90

Asp141

Asp169

Asn170

Ser119

Gln120

Glu199

Gly66

2.8

2.7

3.0

3.3

3.2

2.5

3.0

2.7

2.9

2.1

2.0

2.7

1.9 1.9

2.0

2.3

2.8

1

6 5

432

7

89

1'2' 3'

4'

5'

Abb. 13 Schematische Darstellung der Wasserstoffbrückenbindungen zwischen SAM, Mg2+ und 3,5-Dinitrocatechol und den Aminosäureresten des Enzyms [90,95] (Abstände in Å).

Einleitung20

Die SAM-Bindung wird durch eine für Methyltransferasen konservierte consensusSequenz (GAxxG für COMT) gewährleistet [96]. In dieser Region werden die Amino- und die Carboxylatgruppe der Methionin-Seitenkette gebunden. Die Riboseeinheit wird durch Glu90, welches Wasserstoffbrücken mit den 2'- und 3'-Hydroxygruppen eingeht, gebunden (Abstände: Abb. 13). Der Adeninring hat einen günstigen T-förmigen (edge-to-face) Kontakt (kürzester C···C Abstand: 3.5 Å) mit dem Indolring von Trp143, welches an der Oberfläche von COMT lokalisiert ist und die Nucleobase vom Äusseren abschirmt. Die Nucleobase ist zwischen dem Imidazolring von His142, welches sich im Inneren des Enzyms befindet, und der Seitenkette von Met91 eingeklemmt. Während der Imidazolring eine günstige CHis-H··· Wechsel-wirkung mit dem Adeninring (Abstand der Zentren beider Ringsysteme: 5.3 Å) eingeht, liegt die Methionin-Seitenkette auf dem Sechsring der Nucleobase (kürzester C···S Abstand: 3.8 Å). Intermolekulare Wechselwirkungen zwischen Methionin-Seiten-ketten, mit deren hochpolarisierbaren Schwefelatom, und Nucleobasen werden häufig in Kinasen [97,98] und anderen Nucleobase-bindenden Enzymen [30,99-101] beobachtet. Die Aminogruppe von Adenin bildet Wasserstoffbrücken zu Glu120 und einem in der Röntgenstruktur erkennbaren Wassermolekül, während N(1) eine Wasserstoffbrücke zum Amid-Proton von Ser119 ausbildet. Ein Mg2+-Ion ist durch Asp141, Asp169, Asn170, einem Wassermolekül und den beiden Catechol-Hydroxygruppen oktaedrisch koordiniert. Glu199 bildet eine Wasserstoffbrücke zu einer Hydroxygruppe des Catechols. Eine Nitrogruppe hat einen van-der-Waals-Kontakt zu Pro174.

Die Röntgenstruktur des Apoenzyms von COMT weist im Vergleich zu der Röntgenstruktur des quaternären Komplexes grössere stukturelle Unterschiede im Bereich der SAM- und Catechol-Bindungstaschen auf [90,93,95] (Abb. 14). Wegen der konformationellen Beweglichkeit der Proteinstruktur in diesen Bereichen ist ein rationelles Design von Bisubstrat-Inhibitoren, welche in die Methionin-Tasche binden sollen, schwierig. Moleküldynamik-Simulationen (MD) könnten zu einem weiter-gehenden Verständnis dieser dynamischen Vorgänge beitragen.

Einleitung 21

Abb. 14 Überlagerung der Röntgenstrukturen des Apoenzyms (hell) und des quaternären Komplexes (dunkel) [90,93,95].

1.3.3 Katalytischer Mechanismus von COMT

Das oktaedrisch koordinierte Mg2+-Ion spielt für die katalytische Aktivität des Enzyms eine wichtige Rolle. Es bewirkt, dass die Catechol-Hydroxygruppenazidifiziert und somit einfacher ionisiert werden, zudem kontrolliert es die Orientierung der Catecholeinheit, wodurch die Transmethylierungsreaktion durch Präorganisation des Übergangszustandes beschleunigt wird. Lys144 fungiert als allgemeine katalytische Base, indem es eine Hydroxygruppe des Catechols deprotoniert. Es wird vermutet, dass im Enzym ohne Substrat dieses Lysin in der deprotonierten Form vorliegt [102]. Trp38, Trp143 und Pro174 bilden eine hydrophobe "Wand" (Abb. 12), sie bestimmen die korrekte Stellung des Catecholringes und tragen bedeutend zur Selektivität der Substratbindung durch das Enzym bei [102]. Die Methylierung erfolgt durch direkten Angriff der durch Lys144 deprotonierten Hydroxygruppe auf die Methylgruppe von SAM, über einen SN2-artigen Ügergangszustand (Abb. 15) [103,104]. Die von COMT katalysierten Methylierungen finden relativ langsam statt (Vmax = ~ 40 min-1) [105].

Einleitung22

N

N N

N

NH2

O

OHHO

SCH3

CO2

H3N

O OH

Mg

O

O

O OH

Mg

O

O

H3C

Glu199

NH3

Glu199

Lys144

NH3

Lys144

N

N N

N

NH2

O

OHHO

S

CO2

H3N

Abb. 15 Schematische Darstellung des Katalysemechanismus von COMT.

Die Substrate L-Dopa, Dopamin und 3,4-Dihydroxybenzoesäure (DBA) zeigen bemerkenswert unterschiedliche Affinitäten zu COMT (Tabelle 2) [105].

Tabelle 2 KM-Werte ( M) für die 3-O-Methylierung durch menschliche COMT, in mit Baculovirus-infiszierten Insekten-Zellen exprimiert.*

S-COMT MB-COMT

DBA 38.9 4.1 30.0 1.0

Dopamin 207 14 15.1 0.9

L-Dopa 613 35 266 10

* S-COMT: lösliches-, MB-COMT: membrangebundenes Enzym (s. Kapitel 1.3.1)

Einleitung 23

DBA verfügt über eine bei physiologischem pH-Wert negativ geladenene Carboxylatgruppe. Das Molekül ist jedoch planar und passt optimal zwischen die für die Substraterkennung wichtigen Reste Trp38 und Pro174 (Abb. 12 und Abb. 17) hinein, hat daher eine grosse Affinität zum Enzym. In Dopamin ist eine protonierte, flexible Aminogruppe anzutreffen, die trotz ihrer Flexibilität zu repulsiven Wechselwirkungen mit der hydrophoben "Wand" führt. L-DOPA besitzt gegenüber Dopamin oder DBA die grösste, zwitterionische Seitenkette, die zur stärksten Repulsion und daher zur niedrigsten Affinität führt [105].

COMT kann nur eine der beiden Hydroxygruppen seiner Catecholsubstrate methylieren, beide Isoformen (S- und MB-COMT) bevorzugen für Substrate mit hydrophilen Seitenketten (L-Dopa, Dopamin) eine 3-O-Methylierung (Abb. 16).

R

HO

HOMg2+

COMT

R

H3CO

HO R

HO

H3CO1

24

3

5 6

12

43

5 6

12

43

5 6

AdoMet

Produkt der3-O-Methylierung

Produkt der4-O-Methylierung

+

Abb. 16 Mögliche Reaktionsprodukte bei der enzymatischen Transmethylierungs-Reaktion durch COMT [106].

Grund dafür ist, dass wenn die para-ständige Hydroxygruppe sich an SAM annähert, die Seitenkette des Catechols gezwungen wird, eine sterisch ungünstige Orientierung einzunehmen, in welcher sie in die durch Trp38 und Pro174 gebildete hydrophobe Tasche ragt (Abb. 17). Daraus ergibt sich, dass unpolare, lipophile Seitenketten mit Vorteil in diese Tasche hineinragen und dadurch para-O-Methylierung bevorzugt ist, während bei hydrophilen Substituenten genau das Gegenteil gilt. Da L-DOPA die grössten repulsiven Wechselwirkungen aufweist, ist es nicht erstaunlich, dass für dieses Substrat das höchste Verhältnis zwischen 3- und 4-O-Methylierung erhalten wird. Eine von Lau und Bruice [106] durchgeführte Molecular Dynamics-Studie bekräftigen diese Befunde.

Der Mechanismus von COMT ist sequentiell geordnet, das heisst, dass zuerst der Cofaktor SAM gebunden sein muss, bevor das Mg2+-Ion und zuletzt das Catecholsubstrat gebunden wird [105].

Einleitung24

Abb. 17 Modelle für die Bindung von L-Dopa an die Catechol-Bindungstasche von COMT. Oben: Orientierung des Substrats, welche zu einer para-O-Methylierung führt. Unten: Orientierung, welche zu einer meta-O-Methylierung führt [105]. Ein Ausschnitt aus der Conolly-Oberfläche des Proteins [94] ist gezeigt.

Einleitung 25

1.4 Inhibitoren für COMT

In der folgenden Abbildung ist eine Auswahl an potenten COMT-Inhibitoren gezeigt:

HO

HO

NO2

OHO

HO

N

NO2

CN

O

17 Entacapone IC50= 10 nM (Zwölffingerdarm Ratte) a

Ki = 0.3 nM b

18 TolcaponeIC50= 36 nM c

Ki = 0.3 nM b

HO

HO

NO2

NitecaponeIC50= 18 nM (Zwölffingerdarm Ratte) d

Ki = 1 nM b

O

O

HO

HO

NO2

NO2

IC50= 37 nM e

HO

HO

CN

IC50= 88 nM e

HO

HO

CN 16IC50= 74 nM e

O F

HO

HO

NO2

IC50= 6 nM (Rattenhirn) f

Ki = 4 nM g

HO

HO

NO2

N

21 BIA 3-335Ki = 6 nM j

O

N

CF3

HO

HO

NO2

O

20 BIA 3-202IC50= 4 nM (Rattenhirn) i

NO2

HO

HO

NO2

19IC50= 30 nM h

O O

Ph

O

Abb. 18 Beispiele für potente COMT-Inhibitoren. IC50 Werte (ohne Vorinkubation, ausser 20: 20 min Vorinkubation) sind, falls nicht anders angegeben, mit Rattenleber-Homogenat bestimmt worden. Falls bekannt, sind auch Ki-Werte angegeben, welche mit rekombinanten S-COMT (human) bestimmt wurden. Referenzen: a) [107], b) [105], c) [108], d) [109], e) [110], f) [111], g) [102], h) [112], i) [113], j) [114]

Einleitung26

Die Inhibitoren tragen nahezu ausschliesslich eine Nitro-Gruppe in 3-Position und eine weitere elektronenziehende, Gruppe in 5-Position. In dem Inhibitor 16 [110] ist die Nitrogruppe durch eine elektronenziehende Cyanogruppe ersetzt.

Die zur Nitrogruppe ortho-ständige Hydroxygruppe ist durch den stark elektronenziehenden Substituenten azidifiziert. Das entsprechende Anion wird zusätzlich durch den in para-Stellung stehenden -Akzeptor stabilisiert. Dass Nitro-catechole schlechte COMT-Substrate sind, lässt sich durch eine Erhöhung der Aktivierungsenergie für die Methylierungsreaktion gegenüber Catechol als Substrat erklären. Die elektronegative Nitrogruppe stabilisiert den ionisierten Catechol-COMT-Komplex, wodurch die Barriere für den geschwindigkeitsbestimmenden Trans-methylierungsschritt ungünstig wird [102,115].

Die Inhibitoren Entacapone 17 (Comtan®, Orion) [107] und Tolcapone 18(Tasmar®, Hoffmann-La Roche) [108] wurden zu Arzneien entwickelt und zur Behandlung von Parkinson auf den Markt eingeführt. Mikrodialyse-Studien haben gezeigt, dass Entacapone nicht ins Gehirn gelangt, sondern ein peripher aktiver Inhibitor darstellt, während Tolcapone am meisten die O-Methylierung von Dopamin im Gehirn beeinflusst [86]. Da jedoch im Gehirn der Katabolismus durch Monoamino-Oxidase (MAO) und die Wiederaufname in die Synapsen (uptake1) dominieren, ist der Beitrag der peripheren Inhibition von wesentlich grösserer Bedeutung [116].

Nitrocatechole können die oxidative Phosphorylierung und somit die mitochondriale Energieproduktion beeinträchtigen, wobei Tolcapone ein vielfach stärkerer Hemmer ist als Entacapone [117]. Die grössten Nebenwirkungen, die mit Entacapone und Tolcapone in Verbindung gesetzt werden, sind Beschwerden im gastrointestinalen Bereich, besonders Erbrechen und Durchfall, dazu kommen Schlafstörungen und Halluzinationen. Bei einigen mit Entacapone behandelten Patienten wurde ein leichter Rückgang des Hämatokrit-Wertes festgestellt, wahrscheinlich aufgund der Eigenschaft dieses Inhibitors als Eisen-Chelator. Einsatz von Tolcapone hat in wenigen Fällen zu lethaler Hepatitis und zu potentiell fatalen neurologischen Störungen geführt, daraufhin wurde in Europa dieses Medikament abgesetzt, während es in Amerika in speziellen Fällen immer noch angewendet wird [118-120]. Ein weiteres Problem dieser Inhibitoren stellt die kurze Halbwertszeit (17,:0.3 h, 18: 2 h) im Organismus dar [121,122]. Daher wird derzeit immer noch intensiv nach neuen Inhibitoren für COMT gesucht.

Beispiele für neuere Arbeiten sind kürzlich patentierte potente Coumarin-Derivate wie der Inhibitor 19 [112] und Inhibitoren mit modifizierter Seitenkette, beispielsweise der Inhibitor 20 [113], für welchen eine im Vergleich mit Tolcapone und Entecapone

Einleitung 27

verlängerte Wirkungszeit festgestellt wurde. Die Substanz wird derzeit klinisch getestet.

In einer kürzlich erschienenen Arbeit wurde eine Röntenstruktur des quaternären Komplexes von COMT mit SAM, einem Mg2+-Ion und dem Inhibitor BIA 3-335 (21),mit einem langen Substituenten in 5-Position, vorgestellt [114]. Die Struktur des Proteins ist im Vergleich zur Röntgenstruktur des quaternären Komplexes mit 3,5-Dinitrocatechol [92] praktisch unverändert. Die Autoren postulieren hydrophobe Kontakte der expandierten Seitenkette des Inhibitors mit Trp38, Pro174 und Met201 (Abb. 19).

Abb. 19 Röntgenstruktur des quaternären Komplexes zwischen COMT, SAM, einem Mg2+-Ion und BIA 3-335. Links: Conolly-Oberfläche [94] des Proteins. Rechts:Überlagerung der Röntgenstruktur von BIA 3-335 im Kristall und im quaternären Komplex (von der Elektronendichtekarte umgeben) [114].

Auch wurden Strukturanaloga des Cofaktors SAM synthetisiert und deren Bindungsaffinität für COMT getestet, jedoch wurde bisher kein Inhibitor mit einem Ki-Wert unter 10 M gefunden [123-127]. Da der Cofaktor SAM zahlreiche Funktionen im Organismus hat, ist die Enzym-Selektivität ein grösseres Problem dieses Ansatzes.

Einleitung28

1.4.1 Das Konzept der Bisubstrat-Inhibition

Inhibitoren, bei welchen ein Substrat-Analog und ein Cofaktor-Analog über einen Linker kovalent zu einem Bisubstrat-Inhibitor verknüpft sind, können gegenüber Monosubstrat-Inhibitoren verbesserte Aktivitäts- und Spezifitätseigenschaften verfügen [128,129]. Prinzipiell ist jedes Enzym, welches eine chemische Reaktion zwischen zwei oder mehr Substraten oder einem Cofaktor mit einem Substrat katalysiert, ein plausibles Ziel für das Design von Mehrsubstrat-Inhibitoren. Beispiele sind Inhibitoren der Aspartat-Carbamoyl-Transferase [130,131], Spemidin-Synthase [132], Spermin-Synthase [133], Indol-N-Methyltransferase [134], RNA Guanin-7-Methyltransferase[135], Dopamin- -Hydroxylase [136], Fucosyltransferase [137], Insulin-Rezeptor Tyrosin-Kinase [138,139], Farnesyltransferase [140,141], Serotonin-N-Acetyl-transferase [142], Acetyl-CoA-Carboxylase [143], und Catechol-O-Methyltransferase [90,95].

N

NN

N

NH2

O

HO OH

22

OP

OP

OP

S

O

O

O

OO

O

NH

OR1'HN

OR2'

R1' = AcNH-Lys-Lys-Lys-Leu-Pro-Ala-Thr-Gly-Asp-R2' = -Met-Asn-Met-Ser-Pro-Val-Gly-Asp-CO2H IC50 = 370 nM

OH

R1HN

OR2

A

B

N

NN

N

NH2

O

HO OH

OP

OP

OP

O

O

O

OO

O

O

ATP

Tyr

Abb. 20 Der Bisubstrat-Inhibitor 22 ist der bisher potenteste Inhibitor für die Insulin-Rezeptor Tyrosin-Kinase. A: Substrat und Cofaktor, B: Bisubstrat-Inhibitor [138,139].

Einleitung 29

A

N

NN

N

NH2

O

HO OH

OP

OP

O

O

O

O

O

Acetyl-CoA

NH

HOSerotonin

NH

NH

O

S

O

O

OHNH2

BNH

HNO

SCoA

IC50= 48 nM

H2N OP

O

O O

O

Carbamoylphosphat

A NH3O2C

CO2

Aspartat

NH

O

BO2C

CO2

PO

O

O

IC50= 28 nM

a)

c)

b)

OP

OP

O

O

O

O

OFarnesylpyrophosphat

SH

NHR1

R2O

O Cys

A

B

HN

O

HN

O

NHO

O

IC50= 400 nM

Abb. 21 Weitere ausgewählte Beispiele für Bisubtrat-Inhibitoren. a) Aspartat-Carbamoyl-Transferase [130,131], b) Farnesyltransferase [141], c) Serotonin-N-Acetyltransferase [142]. A: Substrat und Cofaktor, B: Bisubstrat-Inhibitor.

Einleitung30

1.4.2 Entwicklung des ersten effektiven Bisubstrat-Inhibitors für COMT

In anderen Arbeitsgruppen wurden die in Abb. 22 gezeigten potentiellen Bisubstrat-Inhibitoren synthetisiert, welche jedoch keine oder nur eine schwache Bindungsaffinität für COMT aufweisen [144-147].

N

NN

N

NH2

O

HO OH

X

OMe

Ki = 0.5 mM

N

NN

N

NH2

O

HO OH

S

OMe

OH

N

OMe

X CO2H

NH2

X = S

Ki = 5.8 mM

S

inaktiv

S

inaktiv

S

inaktiv

O O

X = S

Ki = 0.8 mM

S

inaktiv

N

NN

N

NH2

O

HO OH

XHO2C

NH2

X =S N

OMe

HO2C

OH

HO2C

alle inaktiv

Abb. 22 Potentielle Bisubstratinhibitoren für COMT, die nicht oder kaum inhibieren.

Einleitung 31

Der erste Durchbruch auf der Suche nach Bisubstrat-Inhibitoren gelang der Arbeitsgruppe Diederich mit der Entdeckung der im mikromolaren Bereich bindenden Leitstuktur 23 (IC50 = 2 M), welche mit Hilfe von Computer-gestütztem, struktur-basierten Design gefunden wurde [90,95]. In vitro durchgeführte kinetische Studien mit der Verbindung 23 gaben Hinweise darauf, dass diese die Substrat- und die Kofaktor-Bindungsstelle im Enzym besetzt, wobei Ki Werte von 0.55±0.1 M bezüglich der Substrat- und 0.3±0.1 M bezüglich der Kofaktor-Bindungsstelle gemessen wurden.

N

NN

N

NH2

O

HO OH

ONH

OOH

HO

NO2

23IC50 = 2 M

Die Strukturvarianten von 23, welche Pyrimidinbasen enthalten, 24 und 25,wurden synthetisiert. Diese Moleküle waren über 100 mal weniger aktiv als die Leitstruktur 23 (Abb. 23).

Um herauszufinden, ob die catecholische Untereinheit von 23 im aktiven Zentrum von COMT mit Hydroxygruppen an das Mg2+-Ion bindet, wurde das analoge Molekül 26 ohne Nitrogruppe synthetisiert, welches eine über 100-fach niedrigere Aktivität hatte als 23. Dieses Ergebnis ist ein starker Hinweis dafür, dass Leitstruktur 23 in die Catechol-Bindetasche von COMT bindet.

Die Verbindungen 27, 28 und 29, die Alkandiyl- und 3-Azaalkandiylketten zwischen Adenin und Nitrocatechol enthalten, wurden synthetisiert, um den strukturellen Einfluss der Ribose zu untersuchen. In den entsprechenden Enzymtests zeigte sich, dass 27, 28 und 29 25-50 mal schwächere Inhibitoren sind als 23.

Um den Einfluss der Länge für das Verbindungsstück zwischen Ribose und Catechol zu studieren, wurde die Verbindung 30 synthetisiert, die wegen des fehlenden Sauerstoffs eine im Vergleich zu 23 kürzere Brücke hat. Wie sich in den Enzymtests zeigte, ist 30 10 mal aktiver 23. Die Gründe hierfür werden in Kapitel 2 diskutiert.

Einleitung32

BO

HO OH

ONH

OOH

HO

NO2

N

NN

N

NH2

O

HO OH

ONH

OOH

HO

26IC50 > 100 M

B =

N

N

NH2

O

24IC50 > 100 M

N

N

NH2

O

25IC50 > 100 M

N

NN

N

NH2

O

HO OH30

HN

OOHHO

O2N

IC50 = 200 nM

N

NN

N

NH2

XHN

O

OH

OH

O2N

X = CH2 NH NHCH2

27IC50 = 55 M

28IC50 = 77 M

29IC50 = 86 M

Abb. 23 Erste Strukturvariationen der Leitstruktur 23 [90,95].

Einleitung 33

1.4.3 Aufgabenstellung

Die Zielsetzungen der vorliegenden Arbeit waren:

• Optimierung der Leitstruktur 23 durch Computer-gestütztes strukturbasiertes Design zu einem Bisubstrat-Inhibitor, welcher eine Inhibitionskonstante für COMT im unteren nanomolaren Bereich aufweist.

• Eine systematische Variation des Verbindungsstückes zwischen Ribose- und Catechol-Rest, um den Einfluss von konformationeller Beweglichkeit und Länge auf die Bindungsaffinität zu studieren.

• Untersuchung der Inhibitionsmechanismen durch Kinetik-Experimente.

• Beweis des Bisubstrat-Bindungsmodells und Untersuchung der intramolekularen Wechselwirkungen durch Röntgenstrukturanalyse eines ternären Komplexes zwischen COMT, einem Mg2+-Ion und einem Bisubstrat-Inhibitor.

• Eine systematische Variation der Riboseeinheit, um weitere Struktur-Aktivitäts-beziehungen zu erhalten.

Einleitung34

Kapitel 2 35

2 Einfluss der Inhibitor Präorganisierung und Linker-Länge zwischen der Substrat- und Cofaktor-Einheit auf die Bindungsaffinität

2.1 Design

N

NH

OOH

HO

NO2

O

HO OH

X

NH2

NN

N

O

23 31 32 n = 133 n = 234 n = 335 n = 4

X = ( ) n

Für ein Cytosin-Analoges von 23 war bei einer Konformationsanalyse durch 1H-NMR-Spektroskopie in D2O ein starker Nuclear-Overhauser-Effekt (NOE) zwischen den Catecholprotonen und H-C(5) der Nucleobase beobachtet worden, welcher auf einen hydrophoben Kollaps [148] des ungebundenen Inhibitors hinweist [90]. In der kollabierten Konformation hat die Catechol-Einheit nicht die richtige Orientierung, um am aktiven Zentrum von COMT zu binden. Für eine Bindung würde ein erheblicher energetischer Aufwand für die Reorganisierung benötigt werden. Zudem ist die Solvatisierung des kollabierten Moleküls besonders günstig, was die Tendenz zur Bindung am Enzym weiter reduziert. Deshalb war es für uns von grossem Interesse, den Grad der Preorganisierung [149] des Hemmstoffes vor der Komplexierung zu erhöhen. Um den hydrophoben Kollaps im ungebundenen Zustand zu verhindern, wurden die Inhibitoren 31, 32, 33 und 34 mit kürzeren und konformationell weniger flexiblen Linkern zwischen dem Nucleosid und der Catecholeinheit sowie die Vergleichssubstanz 35, bei welcher der Sauerstoff von 23 durch eine Methylengruppe ersetzt wurde, entworfen. Hierzu wurde das Programm MOLOC [72] auf Silicon Graphics Workstations eingesetzt. Die vorgeschlagenen Inhibitoren wurden manuell in das aktive Zentrum von COMT gedockt, indem ihre Catechol- und Nucleosideinheit dem 3,5-Dinitrocatechol und SAM der Röntgenstruktur von COMT [92,95] überlagert wurden. Anschliessend wurden die Strukturen im aktiven Zentrum mit dem MAB-Kraftfeld [72] Energie-minimiert, wobei die Koordinaten des Proteins und des Mg2+-

Kapitel 2 36

Ions fixiert wurden. Die Computermodelle von 32, 33, 34 und 35 sind in Abb. 24 gezeigt. Abb. 25 zeigt die Wasserstoffbrückenabstände der Modelle in der SAM-Bindungstasche.

a) b)

c) d)

Abb. 24 Computermodelle der ternären Komplexe zwischen COMT, einem Mg2+ undden potentiellen Bisubstrat-Inhibitoren 32 (a), 33 (b), 34 (c) und 35 (d).

Die Konformation von 31 im gebundenem Zustand ist im Computermodell nahezu identisch mit der gezeigten Konformation von 34. Durch die Einführung der trans-Doppelbindung ist der Inhibitor 31 präorganisiert.

Kapitel 2 37

a) b)

N

N N

N

NH2

O

OO

NH

NHO

OO

H H

NH2

O

Glu90

Ser119

Gln120

2.9

3 .1

3.0

3.3

32 N

N N

N

NH2

O

OO

NHO

OO

H H

NH2

O

Glu90

Ser119

Gln120

2.8

2 .9

2.9

3.1

33HN

c) d)

N

N N

N

NH2

O

OO

NH

NHO

OO

H H

NH2

O

Glu90

Ser119

Gln120

2.9

2.8

2.9

3.2

34 N

N N

N

NH2

O

OO

NHO

OO

H H

NH2

O

Glu90

Ser119

Gln120

2.8

2.8

2.8

3.1

35 HN

Abb. 25 Schematische Darstellung der Wasserstoffbrücken der Inhibitoren 32 (a), 33(b), 34 (c) und 35 (d) in der SAM-Bindungstasche von COMT (Abstände in Å).

Kapitel 2 38

2.2 Synthese

2.2.1 Synthese von Inhibitor 32

2.2.1.1 Syntheseplanung

Eine einfache Strategie zur Synthese von 32 besteht in der Verknüpfung von Carbonsäure 36 mit 5'-Amino-5'-deoxyadenosin (37) (Schema 2), wobei 36 aus 2-Hydroxy-3-methoxybenzoesäure (38) und 37 aus Adenosin (39) zugänglich sein sollten.

N

NN

N

NH2

O

HO OH

HN

OOHHO

O2N

32

N

NN

N

NH2

O

HO OH

H2N

37

OH

HOOH

O

NO2

+

36

OH

OOH

O

38

N

NN

N

NH2

O

HO OH

HO

39

Schema 2 Retrosynthetische Analyse für das Zielmolekül 32.

2.2.1.2 Darstellung der Catecholeinheit

Nitrierung von käuflicher 2-Hydroxy-3-methoxybenzoesäure (38) mit Nitriersäure (HNO3/H2SO4) ergab 40 (Schema 3), welches mit Bromwasserstoffsäure unter drastischen Bedingungen zu Nitrocatechol 36 [150] demethyliert wurde (67%, 2 Stufen). Die ursprüngliche Synthese von 36 [90,95] wurde dahingehend vereinfacht, dass das Zwischenprodukt 40 nicht durch Sublimation, sondern durch Ausfällen mit Eiswasser gereinigt wurde und überschüssiges HBr in der zweiten Stufe durch Extraktion statt Hochvakuumdestillation entfernt wurde.

Kapitel 2 39

O

OH

OH

OO

OH

OH

O

NO2

HO

OH

OH

O

NO2

HNO3/H2SO4,CH2Cl2,0 °C, 1 h, dannRT, 2 h

45% HBr,145 °C, 18 h,

67%, 2 Stufen

36

38

40

Schema 3 Nitrierung von Methoxycatechol 40 und Entschützung zu 36.

Veresterung von 36 mit N-Hydroxysuccinimid in Anwesenheit von N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid ergab den Aktivester 41 [90,95] in 53% Ausbeute (Schema 4).

HO

OH

OH

O

NO2

N

O

O

HO

OH

O

O

NO2

N

O

O

36 41

DCC, THF, 4 °C, 20 h

53 %

HO

Schema 4 Herstellung des Aktivesters 41.

2.2.1.3 Darstellung von 5'-Amino-5'-deoxyadenosin und Reaktion mit 41 zu 32

2',3'-O-Isopropylidenadenosin (42) [151] wurde aus Adenosin (39) in hoher Ausbeute von 95% erhalten (Schema 5). Über eine Mitsunobu-Reaktion [152] wurde 42 in das Phthalimid 43 [153] umgewandelt (70%), welches mit Hydrazin-Monohydrat zum Amin 44 [153] gespalten wurde (97%).

Kapitel 2 40

N

NN

N

NH2

O

O O

HO

42

N

NN

N

NH2

O

HO OH

HO

39

HC(OEt)3, p-TsOH,Aceton, RT, 68 h

95%

NH

O

O

PPh3, DEAD,THF, RT, 5 h

70%

N

NN

N

NH2

O

O O

43

N

O

O

N

NN

N

NH2

O

O O

44

H2NN2H4· H2O,EtOH, Rückfluss, 16 h

72%

Schema 5 Darstellung von Amin 44.

Entschützung der Hydroxygruppen von 44 mit TFA/H2O (5:2) lieferte das Amin 37 [154] in nahezu quantitativer Ausbeute von 97% (Schema 6), wobei überschüssige Trifluoressigäure an einen Anionenaustauscher (Dowex 1x8, OH- Form) gebunden wurde. Der Aktivester 41 reagierte selektiv mit der primären Aminogruppe von 37 zur Zielverbindung 32 (86%). Allgemein waren Versuche, die Zielverbindungen durch Umkristallisation zu reinigen, schlecht reproduzierbar und ergaben niedrige Ausbeuten. Wegen der hohen Polarität der Nitrocatecholderivate war eine säulenchromato-graphische Reinigung mit SiO2 nicht möglich. Daher wurde hierfür die Umkehrphasen-chromatographie mit SiO2 100 C18 zur Trennmethode der Wahl. Als Eluent wurden Mischungen von CH3CN mit 1% wässr. HCOOH verwendet.

Kapitel 2 41

N

NN

N

NH2

O

O O

44

H2N

N

NN

N

NH2

O

HO OH

37

H2N

OH

HOO

O

N

O

O

NO2

41

Et3N, DMF,RT, 15 h

86%

N

NN

N

NH2

O

HO OH

HN

OOHHO

O2N

32

1. TFA/H2O (5:2), 0 °C, 3 h2. Dowex (OH-)

97%

Schema 6 Entschützung von 44 und Kupplung mit dem N-Hydroxysuccinimidester 41zur Zielverbindung 32.

2.2.2 Synthese von Inhibitor 33

2.2.2.1 Syntheseplanung

Das Zielmolekül 33 sollte aus dem N-Hydroxysuccinimidester 41 und dem Amin 45 erhalten werden (Schema 7). Der Einbau des zusätzlichen Kohlenstoffatoms an der 5'-Position von Adenosin sollte durch Umwandlung von 2',3'-O-Isopropylidenadenosin(42) in das Nitril 46 erreicht werden, welches daraufhin zum Amin 45 reduziert werden sollte.

Kapitel 2 42

N

NN

N

NH2

O

HO OH

45

N

NN

N

NH2

O

HO OH33

H2N

NHO

OH

OH

O2N

+

N

NN

N

NH2

O

O O

NC

46

N

NN

N

NH2

O

O O

HO

42

41

Schema 7 Retrosynthetische Analyse für 33.

2.2.2.2 Synthese des Amins 45 und Reaktion mit 41 zu 33

Die Umsetzung von 2',3'-O-Isopropylidenadenosin (42) in einer Mitsunobu-Wilk-Reaktion [155] mit Acetoncyanhydrid als gut handhabbare Quelle von HCN, ergab das Nitril 46 [156] in 89% Ausbeute (Schema 8). Diese Methode lieferte bessere Ausbeuten als die Reaktion von 2',3'-O-Isopropyliden-5'-O-tosyladenosin mit Kalium-cyanid in Gegenwart von 18-Krone-6 [156]. Das Nitril 46 wurde unter Verwendung von katalytischen Mengen Platinoxid in Essigsäure zum primären Amin hydriert. Versuche mit anderen Katalysatoren und anderen Lösungsmitteln für diese Reaktion gelangen nicht. Entschützung mit TFA/H2O ergab das Amin 45 in 74% Ausbeute (2 Stufen). Die Reinigung des Amins 45 war wegen seiner hohen Polarität nicht einfach. Kieselgel-Chromatographie war ungeeignet. Das Amin wurde statt dessen auf einen mit NH4+ beladenen saueren Ionenaustauscher adsorbiert und Verunreinigungen mit MeOH/H2O ausgewaschen. Schlussendlich wurde das Amin durch Behandlung mit einer Mischung aus MeOH und wässr. NH3 freigesetzt (Schema 9). Die Zielverbindung 33 wurde durch Umsetzung von 45 mit N-Hydroxysuccinimidester 41 und Reinigung durch Umkehrphasen-Chromatographie in ausgezeichneter Ausbeuter (98%) erhalten.

Kapitel 2 43

N

NN

N

NH2

O

O O

NC

46

DEAD, PPh3, THF,0 °C, 50 min,RT, 16 h

89%

N

NN

N

NH2

O

HO OH

45

N

NN

N

NH2

O

HO OH

33

41, Et3N, DMF,RT, 14 h

98%

N

NN

N

NH2

O

O O

HO

42

HO CN

1. PtO2, AcOH, H2,RT, 19 h2. TFA/H2O (5:2),RT, 2 h3. Dowex (NH4

+) 74%

H2NNHO

OH

OH

O2N

Schema 8 Synthese von Nitril 46 durch Mitsunobu-Wilk-Reaktion, Hydrierung und Entschützung zum Amin 45 und Kupplung mit 41 zur Zielverbindung 33.

S O

O

O

R NH2

S O

O

OH3N R S O

O

O

R NH2

1. Waschen mit MeOH/H2O2.NH4

NH3

NH4

NH3

Schema 9 Schematische Darstellung der Reinigung von polaren Aminen mittels Ionenaustauscher.

Kapitel 2 44

2.2.3 Synthese der Inhibitoren 31 und 34

2.2.3.1 Syntheseplanung

Durch Reaktion des N-Hydroxysuccinimidesters 41 mit dem Allylamin 47 sollte das Zielmolekül 31 und mit dem gesättigten Amin 48 das Zielmolekül 34 erhalten werden (Schema 10). Beide Amine sollten aus dem gemeinsamen Vorläufer 49dargestellt werden. Der , -ungesättigte Ester 49 sollte durch Oxidation der 5'-Hydroxygruppe von 2',3'-O-Isopropylidenadenosin (42) und nachfolgende Wittig-Reaktion erhalten werden.

N

NN

N

NH2

O

HO OH

H2N

47

N

NN

N

NH2

O

HO OH

HN

31

OOHHO

O2N41 +

N

NN

N

NH2

O

O O

49

OON

NN

N

NH2

O

O O

HO

42

N

NN

N

NH2

O

HO OH

H2N

48

N

NN

N

NH2

O

HO OH

HN

34

OOHHO

O2N41 +

Schema 10 Retrosynthetische Analyse für 31 und 34.

Kapitel 2 45

2.2.3.2 Darstellung des Oxidationsmittels ortho-Iodoxybenzoesäure (IBX) (50)

Umsetzung von 2-Iodbenzoesäure (51) mit Kaliumbromat ergab in guter Ausbeute (92%) ortho-Iodoxybenzoesäure (IBX) (50) [157], welche als Präzipitat abfiltriert werden konnte (Schema 11). Dieses Reagenz eignet sich hervorragend zur selektiven Oxidation von primären Alkoholen zu Aldehyden [158], hat jedoch den Nachteil, dass es bei 230 °C heftig explodiert.

IO

O

O

OH

OH

O

I

Kaliumbromat,0.73 M H2SO4,55 °C, 1 h,65 °C, 3 h 45 min,RT, 14 h

93%

51 50

Schema 11 Oxidation von 2-Iodbenzoesäure (51) zu IBX (50).

2.2.3.3 Darstellung des Ylids 52

Durch Reaktion von Bromessigsäureethylester 53 mit PPh3 wurden grosse Mengen (172 g) des Phosphoniumsalzes 54 [159] in 90% Ausbeute hergestellt und zum stabilisierten Phosphorylid 52 [160] umgesetzt (72%). (Schema 12).

PPh3, Toluol,RT, 1 h 30 min

90%

53 54

BrO

O

Ph3PO

OBr

NaOH, H2O,15 min,

72%

52

Ph3PO

O

Schema 12 Synthese des Wittig-Reagenzes 52.

Kapitel 2 46

2.2.3.4 Synthese des Phtalimids 55

Die primäre 5'-Hydroxygruppe von 2',3'-O-Isopropylidenadenosin (42) wurde mit IBX (50) zum Aldehyd oxidiert und in situ mit Wittig-Reagenz 52 in 70% Ausbeute zum Ester 49 [161] umgesetzt (Schema 13) [162]. Versuche zur Synthese von 49gemäss Literaturvorschriften [161,163], welche hierzu eine Pfitzner-Moffat-Oxidation[164] mit DCC/(CH3)2SO als Oxidationsmittel, gefolgt von der Wittig-Reaktion mit 52verwenden, ergaben nur 23% Ausbeute. Zudem war die Abtrennung von ausgefallenem Dicyclohexylharnstoff problematisch. Der Ester 49 wurde mit DIBAL-H in sehr guter Ausbeute (98%) zum Allylalkohol 56 reduziert, welcher in einer Mitsunobu-Reaktion[152] zum Phthalimid 55 umgesetzt wurde.

N

NN

N

NH2

O

O O

49

(CH3)2SO,RT, 72 h

70%

N

NN

N

NH2

O

O O

HO

42

DIBAL-H, Hexan, CH2Cl2,-78 °C, 2 h

98%

OO

52

Ph3PO

O

IO

O

O

OH

50

+

N

NN

N

NH2

O

O O

HO

56

Phthalimid,DEAD, PPh3,THF, RT,2 h 30 min

68%

N

NN

N

NH2

O

O O

N

55

O

O

Schema 13 Oxidation und Wittig-Reaktion zum , -ungesättigten Ester 49, Reduktionzum Allylalkohol 56 und Mitsunobu-Reaktion zu Phthalimid 55.

Kapitel 2 47

Durch langsames Abdampfen einer konzentrierten Lösung von 55 in CH3CNwurden Kristalle (farblose Prismen) erhalten, welche für die Röntgenstrukturanalyse (Abb. 26) geeignet waren. Die Verbindung kristallisiert in der Raumgruppe P21. Im Kristall sind die Heterocyclen von Adenin und Phthalimid räumlich weit separiert, was ein Hinweis darauf ist, das der starre Linker auch im Bisubstratinhibitor 31 einen hydrophoben Kollaps verhindern sollte. Die Nucleobase nimmt eine anti-Konformation im Nucleosid ein.

Abb. 26 Struktur der Verbindung 55 im Kristall (willkürliche Numerierung).

Abb. 27 Ausschnitt aus der Kristallpackung des Phthalimids 55 (Abstände in Å).

Kapitel 2 48

Im Kristall sind die Adenine benachbarter Einheitszellen reissverschlussartig über ein Netz von Wasserstoffbrücken miteinander verbunden (Abb. 27). Charakteristische H-Brücken Abstände sind N(7)···N(10) = 2.84 Å und N(10)···N(1) = 2.85 Å. Der elektronenreiche Sechsring des Adenins und der elektronenarme Benzolring des Phthalimids gehen eine parallele -Stapelung ein. Der Abstand zwischen den beiden Sechsring-Zentren beträgt 3.51 Å.

2.2.3.5 Darstellung des Amins 47 und Reaktion mit 41 zu 31

Spaltung von Phthalimid 55 mit MeNH2 in EtOH [165] ergab das Amin 57 (95%) in besserer Ausbeute als die entsprechende Reaktion mit sehr giftigem Hydrazin-Monohydrat (Schema 14). Entschützung von 57 und Reinigung des Produktes durch Ionenaustausch-Chromatographie lieferte das Amin 47 in 80% Ausbeute. Umsetzung von 47 mit N-Hydroxysuccinimidester 41 ergab die Zielverbindung 31, welche durch Umkehrphasen-Chromatographie gereinigt wurde (82%).

N

NN

N

NH2

O

O O

N

55

O

OMeNH2, EtOH, RT, 16 h

95 %

N

NN

N

NH2

O

O O

H2N

57

N

NN

N

NH2

O

HO OH

H2N

47

N

NN

N

NH2

O

HO OH

HN

31

OOHHO

O2N41, Et3N, DMF,RT, 18 h

82%

1. TFA/H2O (5:2),RT, 1 h2. Dowex (NH4

+) 80%

Schema 14 Spaltung des Phthalimids 55 mit MeNH2, Entschützung von 57 und Reaktion mit 41 zur Zielverbindung 31.

Kapitel 2 49

2.2.3.6 Darstellung des Amins 48 und Reaktion mit 41 zu 34

Hydrierung und anschliessende Entschützung von Verbindung 57 ergab das Amin 48, welches durch Ionenaustausch-Chromatographie gereinigt wurde (84%). Umsetzung von 48 mit N-Hydroxysuccinimidester 41 und Reinigung durch Umkehrphasen-Chromatographie ergab die Zielverbindung 34 in 89% Ausbeute (Schema 15).

1. H2, Pd/C, EtOH,18 h RT, 16 h2. TFA/H2O (5:2), RT, 1 h3. Dowex (NH4

+)

84%

N

NN

N

NH2

O

O O

H2N

48

N

NN

N

NH2

O

HO OH

HN

34

OOHHO

O2N

41, Et3N, DMF,RT, 17 h

89%

N

NN

N

NH2

O

HO OH

H2N

57

Schema 15 Hydrierung und Entschützung von Allylamin 57 zum Amin 48, Reaktion mit 41 zur Zielverbindung 34.

2.2.4 Synthese des Inhibitors 35

2.2.4.1 Syntheseplanung

Das Zielmolekül 35 sollte durch Reaktion von 41 mit dem Amin 58 gebildet werden, welcher durch Reduktion und Entschützung von Nitril 59 erhalten werden sollte (Schema 16). Das Nitril sollte aus dem Allylalkohol 56, welches für die Synthese der Inhibitoren 31 und 34 dargestellt worden war, gebildet werden.

Kapitel 2 50

N

NN

N

NH2

O

O O

HO

58

N

NN

N

NH2

O

O O

NC

56

35

N

NN

N

NH2

O

HO OH

NHO

OH

OH

O2N

N

NN

N

NH2

O

HO OH

41 + H2N

59

Schema 16 Retrosynthetische Analyse für 35.

2.2.4.2 Darstellung des Nitrils 59 und Synthese von 35

Versuche den Allylalkohol 56 über eine Mitsunobu-Wilk-Reaktion [155] mit Acetoncyanhydrin als HCN-Quelle zum Nitril 60 umzusetzen, gelangen nicht (Schema 17). Auch wurde versucht, durch Reaktion mit TMS-Cl und NaI in situ ein Iodid zu erzeugen, welches durch Cyanid substituiert werden sollte [166]. Dies gelang ebensowenig wie der Versuch, das Tosylat 61 zu erzeugen. Da alle Versuche, den Allylalkohol zu funktionalisieren scheiterten, wurde 56 zum aliphatischen Alkohol hydriert, welcher über eine Mitsunobu-Wilk-Reaktion [155] in 49% Ausbeute zum Nitril 59 umgesetzt werden konnte (Schema 18). Das Nitril 59 wurde durch PtO2-katalysierte Hydrierung in Essigsäure zum Amin hydriert und mit TFA/H2O (5:2) entschützt. Das Produkt konnte nicht in befriedigender Reinheit isoliert werden und wurde daher roh mit N-Hydroxysuccinimidester 41 zur Zielverbindung 35 umgesetzt, welche mit 18% Ausbeute erhalten wurde.

Kapitel 2 51

DEAD, PPh3,THF

N

NN

N

NH2

O

O O

HO

6056

HO CN

Me3SiCl, NaI, NaCN, CH3CN

Ts-ClPyridin

N

NN

N

NH2

O

O O

NC

N

NN

N

NH2

O

O O

TsO

61

Schema 17 Versuche zur Darstellung von 60 und Allyltosylat 61, ausgehend von Allylalkohol 56.

1. H2, Pd/C, EtOH RT, 3 h2.

DEAD, PPh3, THF, RT, 70 h

49%

N

NN

N

NH2

O

O O

HO

59

HO CN N

NN

N

NH2

O

O O

NC

56

1. H2, PtO2, AcOH, RT, 19 h2. TFA/H2O (5:2), RT, 2 h3. 41, Et3N, DMF, RT, 15 h

18%

35

N

NN

N

NH2

O

HO OH

NHO

OH

OH

O2N

Schema 18 Hydrierung und Mitsunobu-Wilk-Reaktion von Allylalkohol 56 zum Nitril 59, Hydrierung, Entschützung und Reaktion mit 41 zur Zielverbindung 35.

Kapitel 2 52

2.2.5 Synthese des zu 41 analogen Ketons 62

O

N

NO2

OH

HO

O

O

62

Da der N-Hydroxysuccinimidester 41 eine unerwartet hohe Bindungsaffinität für COMT aufweist (IC50 = 106 nM) und sowohl Dialyse- als auch Kinetikexperimente Hinweise auf einen reversiblen Inhibitionsmechanismus geben [90], ist die Synthese und Bewertung der stabilen Vergleichssubstanz 62 von Interesse.

Eine Strategie für die Synthese von 62 bestand in der Friedel-Crafts-Acylierung von Nitrocatechol 63 mit dem Säurechlorid 64, welches aus Bernsteinsäureanhydrid (65) und Gylcin (66) erhalten werden sollte (Schema 19).

HONH2

O

O

N

NO2

OH OH

HO

NO2

NHO

O

O

O

O

O

O

O

62 63

Cl

O

64

66 65

Schema 19 Retrosynthetische Analyse für das Zielmolekül 62.

Die Carbonsäure 67 wurde entsprechend einer Literaturvorschrift [167] in 41% Ausbeute aus Glycin (66) und Bernsteinsäureanhydrid (65) in einer Schmelzreaktion bei 160 °C erhalten (Schema 20). Die Umsetzung von 67 zum Säurechlorid erfolgte mit Thionylchlorid. Der Versuch zur direkten in situ Friedel-Crafts-Acylierung von 63gelang nicht.

Kapitel 2 53

HONH2

O

O

HO

O

N

67

O

O

O

O

66

160 °C, 0.5 Torr, 2 h

41%

1. SOCl2, RT, 20 min2. OH

HO

NO2

AlCl362

63

Schema 20 Synthese von 67 und Versuch zur Friedel-Crafts-Acylierung.

Der Grund für das Misslingen dieses Experimentes ist wahrscheinlich die Komplexierung des Aluminiumchlorids mit dem Catechol.

Als nächstes wurde Veratrol (68) über eine ortho-Lithiierung [168] mit der Lochmann-Schlosser-Base [169,170], gefolgt von Reaktion mit TMS-Cl zum Silan 69[171] in 72% Ausbeute umgesetzt (Schema 21). Doch auch der Versuch zur ipso-Substitution der Silylgruppe in 69 gelang nicht.

OCH3

H3CO

OCH3

H3CO Si(CH3)3

1. t-BuOK, n-BuLi, THF, -78 °C, 10 min2. (CH3)3SiCl, THF, -78 °C, 10 min

72%

6968

ClN

O

O

O

OCH3

H3CO

AlCl3, CH2Cl2

O

N

O

O

Schema 21 Synthese von Silan 69 und Versuch zur Friedel-Crafts-Acylierung.

Schlussendlich führte eine etwas abgewandelte Strategie zum Ziel (Schema 22).

Kapitel 2 54

OH

HO

O

NO2

OCH3

H3CO

O

NO2

BrNaN

OCH3

H3CO

O

NO2

O

O

OCH3

H3CO

N

O

O

H

O

62 70 71

7268

73

Schema 22 Zweite retrosynthetische Analyse für das Zielmolekül 62.

Dabei sollte das Succinimid-Fragment durch nucleophile Substitution von Bromid 70 mit 71 eingeführt werden. 70 sollte durch Bromierung von 72 erhalten werden, welches aus Acetaldehyd (73) und Veratrol (68) aufgebaut werden sollte.

Durch ortho-Lithiierung [168], gefolgt von Reaktion mit Acetaldehyd, wurde der Alkohol (±)-74 [172] in 61% Ausbeute erhalten (Schema 23). Jones-Oxidation ergab in 81% Ausbeute das Keton 75 [172].

OCH3

H3CO

OCH3

H3CO

(±)-74

1. n-BuLi, THF, -78 °C -> RT, 3 h2. CH3CHO -78 °C -> RT, 14 h

61%

68

OHCrO3, H2SO4,Aceton, 5 °C

81%

OCH3

H3CO

75

O

Schema 23 Synthese von Alkohol (±)-74 und Keton 75.

Die Nitrierung von 75 (Schema 24) erfolgte mit konzentrierter Salpetersäure und Schwefelsäure im Verhältnis 1:1.2 (Nitriersäure). Trotz tiefer Temperatur und langsamen Zutropfen der Nitriersäure wurden die zwei Regioisomere 72 (53%) und 76(47%) erhalten [173]. Das Keton 72 wurde mit Pyridiniumperbromid (77) in 90% Ausbeute zum Bromketon 70 bromiert [174].

Kapitel 2 55

OCH3

H3CO

O

NH Br3

OCH3

H3CO

O

NO2

OCH3

H3CO

O

NO2

Br

OCH3

H3CO

O

O2N

HNO3, H2SO4,CH2Cl2, 0 °C,1 h

44%

7572 7653% 47%

AcOH60 °C, 15 min

90%

70

77

Schema 24 Nitrierung von 75 und Bromierung von 72.

Succinimid (78) wurde mit Natriumhydrid deprotoniert und in 41% Ausbeute mit dem Bromid 70 zu 79 umgesetzt (Schema 25). Ein Versuch, 79 mit BBr3 zu entschützen, führte nur zu einfacher Demethylierung. Die zweifache Demethylierung zu 62 gelang in einer Schmelzreaktion mit Pyridiniumchlorid bei 158°C in 54% Ausbeute.

NH

1. NaH, DMF, RT, 30 min 2.

DMF, RT, 10 min

41%

O

O

OCH3

H3CO

NO2

O

N

O

O

OCH3

H3CO

NO2

O

Br

70

78

79

BBr3, CH2Cl2,-78 °C -> RT, 4 h

OH

H3CO

NO2

O

N

O

OOH

HO

NO2

O

N

O

O

62

NCl

158 °C,2 h

54%

Schema 25 Nucleophile Substitution mit Succinimid und Demethylierung zum Zielmolekül 62.

Kapitel 2 56

2.3 Biologische Resultate

2.3.1 Bestimmung der IC50-Werte

Zur Bestimmung der biologischen Aktivität der in der vorliegenden Arbeit synthetisierten Verbindungen, wurde ein von Zürcher und Da Prada entwickelter radio-chemischer Assay verwendet (Schema 26) [95,175]. In dem Assay wird ein Rattenleber-Homogenat, welches das Enzym COMT in ausreichender Menge enthält, mit variablen Konzentrationen an Inhibitor während 15 min bei 37 °C vorinkubiert, wodurch dem System Zeit gegeben wird, ein Gleichgewicht einzustellen. Die Reaktion wird durch Zugabe des Cofaktors S-Adenosylmethionin (SAM), dessen Methylgruppe teilweise trityliert ist, und des Substrates 1,2-Benzoldiol 80 gestartet. Nach einer Inkubationszeit von 15 min bei 37 °C wird die Reaktion durch Zugabe von Essigsäure gestoppt und eine Lösung eines Scintillationsreagenzes in Toluol zugegeben. Das Produkt 3H-2-Hydroxy-1-methoxybenzol (81) wird in die organische Phase extrahiert, während überschüssiges 3H-SAM in der wässrigen Phase verbleibt. Dann wird die Anzahl der Zerfälle pro Minute (DPM, decays per minute) gezählt. Diese gibt Aufschluss über die Produktkonzentration und somit die Aktivität des Enzyms (zur Auswertung der Messkurven für die Bestimmung der IC50-Werte siehe Kapitel 5.6). Der Assay wurde optimiert, indem für die Herstellung der Proben Multipipetten und Multititerplatten verwendet wurden, was die Arbeit sehr vereinfacht und beschleunigt. Durch die erfolgte Miniaturisierung des Assays ist auch ein Roboter-gesteuertesScreening denkbar.

OH

HOO

HO

CH3 (enthält 3H)

COMT, Mg2+

80 81

N

NN

N

NH2

O

HO OH

SH3C

O2CNH3

N

NN

N

NH2

O

HO OH

S

O2CNH3

(enthält 3H)

S-Adenosylhomocystein (SAH)3H-SAM

Schema 26 Funktionsweise des radiochemischen Assays zur Bestimmung der IC50-Werte.

Kapitel 2 57

Tabelle 3 IC50-Werte (relative Fehler ± 5%) der Zielmoleküle mit Modifikationen des Linkers zwischen Catechol- und Nucleosideinheit und der Leitstruktur 23.

N

NH

OOH

HO

NO2

O

HO OH

X

NH2

NN

N

O

23 31 31 n = 133 n = 234 n = 335 n = 4

X = ( ) n

Inhibitor IC50 [ M]

23 2

31 0.009

32 90

33 0.06

34 0.2

35 5

Wie erwartet war der Linker zwischen der Nucleosid- und Catechol-Einheit von 32 für eine effektive Bisubstrat-Hemmung zu kurz (IC50 = 90 M) (Tabelle 3). Etwas überraschend war, dass der Inhibitor 33 mit nur zwei Kohlenstoffatomen im Linker einen tieferen IC50-Wert (60 nM) hat, als der Inhibitor 34 (200 nM) mit drei Kohlenstoffatomer im Linker. Der Linker mit vier Kohlenstoffatomen von Inhibitor 35(IC50 = 5 M), sowie der Linker der Leitstruktur 23 (IC50 = 2 M) scheinen zu lang zu sein. Die Messergebnisse zeigen eindeutig, dass die Brücken der Inhibitoren 33 und 34geeignete Längen aufweisen, um eine effektive Bindung der Nucleosid-Einheit in die SAM-Tasche und der Nitrocatechol-Einheit in die Catechol-Bindungstasche zu erlauben. Eine weitere Versteifung des Linkers durch Einführung einer trans-Doppelbindung hatte einen enormen Effekt auf die Bindungsaffinität. Das Molekül 31ist mit einem IC50-Wert von 9 nM der zurzeit wirksamste Bisubstratinhibitor für COMT. Der Inhibitor ist somit bereits vor der Bindung hochgradig präorganisiert, und ein hydrophober Kollaps wird verhindert.

Kapitel 2 58

Tabelle 4 IC50-Werte (relative Fehler ± 5%) von N-Hydroxysuccinimidester 41 und der stabilen Vergleichsverbindung 62.

OH

HO

NO2

X

O

N

O

O

41 X = O62 X = CH2

Verbindung IC50 [ M]

41 0.1

62 3

Der stabile Inhibitor 62 (IC50 = 3 M) bindet wesentlich schlechter an COMT als der reaktive N-Hydroxysuccinimidester 41 (IC50 = 100 nM) (Tabelle 4). Wegen der geringen Bindungsaffinität ist 62 als Monosubstrat-Hemmstoff für COMT von geringem Interesse. Es kann nicht ausgeschlossen werden, dass die Inhibition von COMT durch 41 eine Folge seiner chemischen Reaktivität ist.

Kapitel 2 59

2.3.2 Kurze Einführung in die Kinetik der Enzyminhibition [176,177]

Die Geschwindigkeit v einer enzymatischen Reaktion, bei welcher zwischen einem Substrat (S) und einem Enzym (E) ein Enzym-Substrat-Komplex (ES) gebildet wird, welcher zum Produkt (P) und Enzym (E) zerfällt,

S + E ES E + Pk1

k-1

k2

lässt sich in vielen Fällen durch die Michaelis-Menten-Gleichung beschreiben:

][][

M

maxSKSVv (9) Vmax = Maximalgeschwindigkeit,

KM = Michaelis-Menten-Konstante

Dabei werden folgende Annahmen getroffen:

a) Das Gleichgewicht stellt sich schnell ein und der Zerfall des Enzym-Substrat- Komplexes ist der geschwindigkeitsbestimmende Schritt.

b) Das System befindet sich in einem Fliessgleichgewicht, d.h. [ES] bleibt in einem "steady state" (stationärer Zustand).

Bei hohen Substratkonzentrationen [S] >> KM nähert sich die Anfangsgeschwindigkeit der Reaktion der Maximalgeschwindigkeit Vmax, welche proportional zur eingesetzten Enzymkonzentration ist:

Vmax = kcat[E]0 (10)

Bei einer Substratkonzentration von [S] = KM wird die halbe Maximalgeschwindigkeit erreicht (Abb. 28).

Kapitel 2 60

Abb. 28 Auftragung der Anfangsgeschwindigkeit v einer Enzymreaktion, welche durch die Michaelis-Menten-Kinetik beschrieben wird gegen die Substratkonzentration [S].

Wird 1/v gegen 1/[S] aufgetragen, die sogenannte Lineweaver-Burk-Auftragung,wird eine Gerade mit der Steigung KM/Vmax, dem Schnittpunkt mit der Ordinate 1/Vmaxund dem extrapolierten Schnittpunkt mit der Abszisse -1/KM erhalten (Abb. 29). Mittlerweile werden kinetische Daten durch nichtlineare Regression computergestützt analysiert. Lineweaver-Burk-Diagramme sind trotzdem zur graphischen Darstellung von kinetischen Daten wertvoll.

][111

max

M

max SVK

Vv (11)

Abb. 29 Doppelt-reziproke (Lineweaver-Burk-) Auftragung.

Kapitel 2 61

Eine Substanz, die mit dem normalen Substrat um eine Bindungsstelle am Enzym konkurriert, bezeichnet man als kompetitiven Inhibitor:

S + E ES E + P+I

k1

k-1

k2

EI

Kic

Falls die Kinetik der ungehemmten enzymkatalysierten Reaktion durch die Michaelis-Menten-Gleichung (9) beschrieben werden kann, gibt folgende Gleichung die Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der Substrat und Inhibitor-konzentration wieder:

][][1

][

icM

max

SKIK

SVv (12)

mit ][]][[

ic EIIEK (13)

Die doppelt-reziproke Darstellung dieser Gleichung bei verschiedenen Konzentrationen von [I] liefert Geraden, welche sich alle auf der 1/v-Achse in einem Punkt bei 1/Vmax

schneiden (Abb. 30).

Abb. 30 Lineweaver-Burk-Diagramm eines kompetitiv gehemmten Michaelis-Menten-Enzyms.

Kapitel 2 62

Bei der unkompetitiven Hemmung bindet der Inhibitor an den Enzym-Substrat-Komplex, nicht aber an das freie Enzym:

S + E ES E + P + I

k1

k-1

k2

ESI

Kiu

Die Gleichung für unkompetitive Hemmung lautet:

iuM

max][1][

][

KISK

SVv (14)

mit ][]][[

iu ESIIESK (15)

Die Lineweaver-Burk-Auftragung bei verschiedenen Konzentrationen von [I] liefert für die unkompetitive Hemmung parallele Geraden (Abb. 31).

Abb. 31 Lineweaver-Burk-Diagramm eines Michaelis-Menten-Enzyms in Gegenwart eines unkompetiven Inhibitors.

Kapitel 2 63

Können sowohl Enzym als auch Enzym-Substrat-Komplex einen Inhibitor binden, so spricht man von gemischter Hemmung:

S + E ES E + P + I

k1

k-1

k2

ESI

Kiu

+I

EI

Kic

Die folgende Gleichung beschreibt die gemischte Hemmung:

iuicM

max

][1][][1

][

KIS

KIK

SVv (16)

Die Lineweaver-Burk-Auftragung bei verschiedenen Konzentrationen von [I] liefert für die gemischte Hemmung Geraden, welche sich links von der 1/v-Achse schneiden (Abb. 32). Ist Kic = Kiu, liegt dieser Schnittpunkt auf der 1/[S]-Achse. Dieser Spezialfall wird oft als nichtkompetitiv bezeichet, wobei von dem Gebrauch dieser Terminologie abgeraten wird [176].

Abb. 32 Lineweaver-Burk-Diagramm eines Michaelis-Menten-Enzyms in Gegenwart eines gemischten Inhibitors.

Kapitel 2 64

2.3.3 Messung der Inhibitionskinetik für den Inhibitor 31

Um Hinweise auf den Inhibitionsmechanismus für den hochpotenten Inhibitor 31zu erhalten, wurden Kinetikmessungen durchgeführt [90,95]. Die Anfangs-geschwindigkeiten wurden durch den radiochemischen Assay ohne Vorinkubation erhalten. Um den Inhibitionsmechanismus bezüglich der SAM-Bindungstasche zu bestimmen, wurde bei konstanter Catechol-Konzentration sowohl die Inhibitor-, als auch die SAM-Konzentration variiert. Durch Variation der Inhibitor- und Substrat-Konzentration bei konstanter SAM-Konzentration wurde der Inhibitionsmechanismus bezüglich der Catechol-Bindungstasche bestimmt und die Messdaten in einem Lineweaver-Burk-Diagramm visualisiert. Anschliessend wurden mit dem Programm Origin [178] durch einen globalen Fit der Parameter der Gleichung (12) für einen kompetitiven und Gleichung (16) für einen gemischten Inhibitionsmechanismus die Ki-Werte berechnet.

Der Inhibitor 31 zeigte bezüglich der SAM-Bindungstasche einen kompetitiven Inhibitionsmechanismus (Abb. 33), was auf eine Bisubstrat-Bindung hinweist. Der Kic-Wert betrug 28 ± 2 nM.

Abb. 33 Lineweaver-Burk-Diagramm der reziproken Enzymaktivität gegen die reziproke SAM-Konzentration bei verschiedenen Konzentrationen an Inhibitor 31 und konstanter Catechol-Konzentration. DPM = decays per minute.

Kapitel 2 65

Bezüglich der Catechol-Bindungstasche zeigte Inhibitor 31 einen gemischten Inhibitionsmechanismus (Abb. 34). Die berechneten Inhibitionskonstanten betragen Kic= 23 ± 4 nM und Kiu = 13 ± 4 M.

Abb. 34 Lineweaver-Burk-Diagramm der reziproken Enzymaktivität gegen die reziproke Benzol-1,2-diol-Konzentration bei verschiedenen Konzentrationen an Inhibitor 31 und konstanter SAM-Konzentration. DPM = decays per minute.

Die kompetitive Inhibitionskinetik bezüglich der SAM-Bindungstasche und die gemischte Inhibitionskinetik bezüglich der Catechol-Bindungstasche deuten auf einen geordneten Inhibitionsmechanismus hin, in welchem die Besetzung der SAM-Bindungstasche zuerst erfolgt, und folglich die Besetzung der Catechol-Bindungstasche ermöglicht (Abb. 35) [90,95].

E + S2

S1

S2

S1E

S2

S1E

Abb. 35 Schematische Darstellung eines geordenten Inhibitionsmechanismus des Bisubstrat-Inhibitors 31.

Kapitel 2 66

2.3.4 Röntgenstruktur des ternären Komplexes zwischen COMT, einem Mg2+-Ion und dem Bisubstrat-Inhibitor 31

Um das Bisubstrat-Bindungsmodell zu beweisen, wurde COMT mit dem Inhibitor 31 und Mg2+-Ionen kokristallisiert. Die Röntgenstrukturanalyse des ternären Komplexes gelang mit einer Auflösung von 2.6 Å. Wie aus der Elektronendichtekarte ersichtlich ist (Abb. 36) besetzt der Bisubstratinhibitor 31 wie vorhergesagt sowohl die SAM- als auch die Catechol-Bindungstasche. Die Struktur des ternären Komplexes ist sehr ähnlich zu der Struktur des quaternären Komplexes zwischen COMT, SAM, 3,5-Dinitrocatechol und einem Mg2+-Ion [92], welche für das Computer gestützte Design von 31 verwendet worden war. Die durchschnittliche Abweichung (root mean square,r.m.s.) der C -Atome der Proteinstrukturen beträgt 0.4 Å.

Abb. 36 Röntgenstruktur des ternären Komplexes zwischen COMT, dem Bisubstrat-Inhibitor 31 und einem Mg2+-Ion: Blick in das Aktive Zentrum, die Elektronendichte von 31 ist als Kontur von 2.5 gezeigt.

Kapitel 2 67

Die Elektronendichte des Indol-Ringes von Trp143, welcher das Adenin und den Linker von 31 von äußerem Lösungsmittel abschirmt (Abb. 37), ist in der Röntgenstruktur nicht gut aufgelöst, was auf eine relativ grosse Beweglichkeit von Trp143 hinweist.

Abb. 37 Röntgenstruktur des ternären Komplexes zwischen COMT, dem Bisubstrat-Inhibitor 31 und einem Mg2+-Ion: Blick in das Aktive Zentrum, Kalottenmodell von 31und Conolly-Oberfläche [94] des Proteins. Es ist deutlich zu sehen, wie der Indolring von Trp143 das Adenosin und den Linker von 31 von äusserem Lösungsmittel abschirmt.

Die intermolekularen Kontakte zwischen dem Protein und dem Inhibitor 31entsprechen weitgehend den für den quaternären Komplex detailliert beschriebenen Wechselwirkungen (Kapitel 1). Die Wasserstoffbrückenabstände sind in Abb. 38 gezeigt. Wie im quaternären Komplex wechselwirkt Adenin durch einen günstigen T-förmigen edge-to-face Kontakt (der kürzeste C···C Abstand beträgt 3.5 Å) mit Trp143 und ist zwischen dem Imidazolring von His142 und der Seitenkette von Met91 eingeklemmt (der Abstand zwischen den Zentren der Heterocyclen von Adenin und Histidin beträgt 5.1 Å und der kürzeste S···C Abstand beträgt 3.6 Å) (Abb. 39). Es kann davon ausgegangen werden, dass im Komplex die OH Gruppe in para-Position zur elektronenziehenden Nitrogruppe deprotoniert vorliegt, da für 31 in Wasser ein pKa von 4.4 gemessen wurde und die Koordination zum Mg2+ zu einer weiteren Acidifizierung führen sollte. Die Methylgruppe der Seitenkette von Met40, welche das Catechol- und Teile der Linkereinheit abschirmt (Abb. 40), ist relativ zur im quaternären Komplex gefundenen Konformation von Met40 um 79° rotiert.

Kapitel 2 68

HO

H

N

N N

N

NH2

O

OO

NH

OO OH

NO2

Mg

O

O O

O

H2N O

H

OH

NHOO

O

OO

H H

NH2

O

Glu90

Asp141Asp169

Asn170

Ser119

Gln120

Glu199

++2.

6

3 .0

2.7

3.23.

0 1.8

2.3

2.0

1.9

2.7

2.1

2.2

2.931

Abb. 38 Schematische Darstellung der H-Brücken (gestrichelte Linien) im ternären Komplex (Abstände in Å).

Abb. 39 Die Nucleosidbindungstasche in der Röntgenstruktur des ternären Komplexes. H-Brücken sind als gestrichelte Linien dargestellt.

Kapitel 2 69

Abb. 40 Die Catecholbindungstasche in der Röntgenstruktur des ternären Komplexes. H-Brücken sind als gestrichelte Linien dargestellt.

Kapitel 2 70

2.4 Ausblick

Obwohl die in diesem Kapitel beschriebene Optimierung des Linkers ein voller Erfolg war, was die erreichte Bindungsaffinität und den Beweis der Bisubstrat-Bindung durch Kinetik-Experimente und Röntgenstrukturanalyse betrifft, kann über weitere sinnvolle Variation des Linkers nachgedacht werden. Ein Problem der Doppelbindung von 31 könnte metabolische Oxidation durch Enzyme in der Leber darstellen, diese Behauptung muss jedoch noch durch entsprechende aufwendige biologische Experimente belegt werden. Die Cyclopropane 83 und 84 sollten gegenüber einem solchen Metabolismus stabil sein, Schritte in diese Richtung sind in Kapitel 4 beschrieben. Des weiteren sind auch die Sulfonamide 85 und 86 durch den starken Elektronenzug der Sulfoxidgruppe interessant. Trotz zahlreichen Syntheseversuchen ist die Darstellung von Bisubstrat-Inhibitoren mit Sulfonamid-Gruppe noch nicht gelungen [90].

N

NH

OOH

HO

NO2

O

HO OH

X

NH2

NN

N

83

X =

84

N

NH

S

OH

HO

NO2

O

HO OH

X

NH2

NN

NO O

8685

X =

Abb. 41 Weitere Modifikationen des Linkers.

Kapitel 3 71

3 Effekte von Modifikationen der Ribose-Einheit auf Bindungsaffinität und Inhibitionsmechanismus

3.1 Design

N

NN

N

NH2

NH

O

NO2

OH

HOX

O

HO

O O

X =

87 8988

HN

HN

(-)-91 (+)-91

O

HO31

OH90

Unter Verwendung des Computerprogramms MOLOC [72] wurden die Zielmoleküle 87, 88, 89, 90 und die Enantiomere (–)-91 und (+)-91 entworfen. Hierzu wurde in der Röntgenstruktur des ternären Komplexes zwischen COMT, dem potenten Bisubstrat-Inhibitor 31 und einem Mg2+-Ion die Ribose-Einheit des Moleküls 31modifiziert, und die neuen Strukturen mit dem MAB-Kraftfeld [72] Energie-minimiert, wobei die Koordinaten des Proteins und des Mg2+-Ions fixiert wurden. Im Vergleich zur Struktur von 31 änderte sich die Position der Nucleobase- und Catechol-Einheiten in den Computermodellen der modifizierten Inhibitoren kaum. Als Beispiel ist in Abb. 42 die Modellstruktur von 87 gezeigt. Die Hydrophilie sollte in der Reihenfolge 31, 87,89, 90 abnehmen, was einen günstigen Effekt auf die Bindungsaffinität und Bioverfügbarkeit haben kann [2,37,38]. Andererseits war es an dieser Stelle schwierig abzuschätzen, welchen Effekt das Entfernen von H-Brücken zu Glu90 haben würde. Es ist jedoch wohlbekannt, dass die Ribose-Tasche der ATP-Bindungsstellen einiger Kinasen selbst in der Anwesenheit von Carboxylat-Seitenketten durch hydrophobe Substituenten besetzt werden kann [179,180]. Eine Reorientierung der Seitenkette von Glu90, durch Herausdrehen aus der Ribosetasche, konnte für die Komplexe von 88 - 90,

Kapitel 3 72

mit fehlenden, H-Brücken bildenden OH-Gruppen, a priori nicht ausgeschlossen werden. Für die Enantiomere (–)-91 und (+)-91 wurde eine Salzbrücke zwischen dem Ammonium-Ion der protonierten Pyrrolidin-Einheit und der Carboxylat-Gruppe des deprotonierten Glu90 angenommen.

a)

b)

HOH

N

N N

NNH2

O

O

NH

OO OH

NO2

Mg

O

O O

O

H2N OH

OH

O

O

NHO

OO

H

NH2

O

Glu90

Asp141Asp169

Asn170

Ser119

Gln120

Glu199

++

2.9

2.8

3.2

3.0 1.8

2.3

2.0

1.9

2.72.1

2.2

2.987

Abb. 42 a) Computermodell des ternären Komplexes zwischen COMT, einem Mg2+-Ion und dem Bisubstrat-Inhibitor 87. Die Conolly-Oberfläche [94] des Inhibitors ist gezeigt.b) Schematische Darstellung der Wasserstoffbrücken im ternären Komplex (Abstände in Å).

Kapitel 3 73

3.2 Synthese

3.2.1 Synthese des Inhibitors 87 mit 2'-Deoxyadenosinfragment

3.2.1.1 Syntheseplanung

Das Zielmolekül 87 sollte ausgehend von 2'-Deoxyadenosin (92) synthetisiert werden (Schema 27). Der Aufbau des Linkers sollte analog zur Synthese von 31erfolgen und zum Amin 93 führen.

N

NN

N

NH2

O

HO

H2N

93

N

NN

N

NH2

O

HO

HN

87

OOHHO

O2N41 +

analog zur Synthese von 31

N

NN

N

NH2

O

HO

HO

92

Schema 27 Retrosynthetische Analyse für 87.

3.2.1.2 Synthese des Esters 94

Die primäre Hydroxygruppe von 2'-Deoxyadenosin (92) wurde mit IBX (50) zum Aldehyd oxidiert und in situ mit Wittig-Reagenz 52 zum Ester 95 umgesetzt (Schema 28) [162]. Da die Extraktion des gebildeten Esters 95 wegen seiner Polarität schwierig war, wurde entschieden, eine Schutzgruppe an der 3'-OH-Gruppe einzuführen. Die Einführung einer tert-Butyldimethylsilyl-(TBDMS) Schutzgruppe erfüllte alle Erwartungen, und der Ester 94 konnte in 62% Ausbeute (2 Stufen) erhalten werden.

Kapitel 3 74

N

NN

N

NH2

O

HO

(CH3)2SO,RT, 70 h

N

NN

N

NH2

O

HO

HO

92

TBDMS-ClImidazol, DMF,RT, 18 h62% (2 Stufen)

OO

52

Ph3PO

O

IO

O

O

OH

50

+

94

95

N

NN

N

NH2

O

TBDMSO

OO

Schema 28 Synthese des Esters 94.

Von dem Ester 94 konnten durch langsames Abdampfen einer konzentrierten Lösung in MeOH Kristalle (farblose Nadeln) erhalten werden, die für die Röntgenstrukturanalyse (Abb. 43) geeignet waren. Die Verbindung kristallisiert in der Raumgruppe P212121. Im Kristallgitter gehen benachbarte Moleküle Basenpaarungen ein, welche Watson-Crick-ähnlich bezüglich des einen Adenins und Hoogsteen-ähnlich bezüglich des anderen Adenins ist. Charakteristische H-Brücken-Abstände im dimeren Assoziat sind N(10)···N(1) = 3.06 Å und N(10)···N(7) = 3.13 Å (Abb. 44). Die Basen nehmen dabei eine syn-Konformation im Nucleosid ein. Im Kristall sind die Basenpaare verschiedener Einheitszellen über H-Brücken reissverschlussartig miteinander verbunden (Abb. 45), und zwei Methylgruppen der Schutzgruppe wechselwirken mit dem -System der Base. Stapelung der Basen wird nicht beobachtet.

Kapitel 3 75

Abb. 43 Struktur der Verbindung 94 im Kristall (willkürliche Numerierung).

Abb. 44 H-Brücken im Dimeren von 94 (Abstände in Å).

Kapitel 3 76

Abb. 45 Ausschnitt aus der Kristallpackung des Esters 94.

3.2.1.3 Darstellung des Amins 93 und Reaktion mit 41 zu 87

Durch Reduktion des Esters 94 mit DIBAL-H wurde der Allylalkohol 96 in 73% Ausbeute erhalten (Schema 29). Über eine Mitsunobu-Reaktion [152] wurde 96 in das Phthalimid 97 umgewandelt (84%). Ein Teil des Produktes fiel aus dem Reaktions-gemisch aus und wurde ohne aufwendige Reinigung sehr sauber isoliert. Um das Amin93 zu erhalten, muss das Phthalimid geöffnet und die Schutzgruppe an 3'-OH abgespalten werden. Für diese zwei Schritte wurden verschiedene Bedingungen untersucht. Die Spaltung des Phthalimids mit Hydrazin lieferte schlechte Ausbeuten. Schliesslich erwies sich die Verwendung von MeNH2 in EtOH [165] als die beste Lösung. Für die Abspaltung der Silylschutzgruppe wurde zuerst HF in Pyridin gewählt [181]. Da die Resultate schlecht waren, wurde die Entschützung mit Bu4NF untersucht [182]. Die Reaktion lief gut ab, aber die Entfernung von überschüssigem Bu4NF war problematisch. Es wurde eine elegante Methode gefunden, um dieses Problem zu lösen [183]: Sobald die Umwandlung fertig war, wurde das Reaktionsgemisch eingeengt und der Rückstand in einer wässrigen Phosphatpuffer-Lösung, die NaClO4 enthielt, gelöst. Durch diese Behandlung fiel Tetrabutylammoniumperchlorat aus, welches abfiltriert

Kapitel 3 77

werden konnte. Die beiden Schritte wurden unmittelbar aufeinanderfolgend durchge-führt. Das polare Amin 93 wurde durch Ionenaustausch-Chromatographie gereinigt und in quantitativer Ausbeute erhalten.

94

N

NN

N

NH2

O

TBDMSO

OO

DIBAL-H, Hexan, CH2Cl2,-78 °C, 4 h

73%

96

N

NN

N

NH2

O

TBDMSO

HO

97

N

NN

N

NH2

O

TBDMSO

N

O

O

93

N

NN

N

NH2

O

HO

H2N

Phthalimid,DEAD, PPh3,THF, RT, 12 h

84%1. MeNH2, EtOH, RT, 35 h2. TBAF, THF RT, 16 h

3. Dowex (NH4+)

quantitativ

Schema 29 Reduktion des Esters 94, Synthese von Phthalimid 97 über eine Mitsunobu-Reaktion und Entschützung zum Amin 93.

Das Amin 93 wurde mit dem N-Hydroxysuccinimidester 41 umgesetzt. Die Reaktion wurde in DME/H2O in Gegenwart von NaHCO3 [184,185] durchgeführt (Schema 30). Das Produkt 87 wurde durch Umkehrphasen-Chromatographie gereinigt und mit 26% Ausbeute erhalten.

N

NN

N

NH2

O

HO

H2N

93

N

NN

N

NH2

O

HO

HN

87

OOHHO

O2N

41, NaHCO3,DME, H2O,RT, 20 h

26%

Schema 30 Kupplung des Amins 93 mit N-Hydroxysuccinimidester 41.

Kapitel 3 78

3.2.2 Versuch zur Synthese des Zielmoleküls 88 mit 2',3'-Didehydro-2',3'-dideoxyadenosinfragment

3.2.2.1 Syntheseplanung

Die gewählte Strategie zur Synthese von 88 ist in Schema 31 dargestellt. 2',3'-Didehydro-2',3'-dideoxyadenosin (98) sollte aus Adenosin (39) erhalten werden (Schema 31). Ein an die Synthese von 31 angelehnter Weg sollte zum Amin 99 führen.

N

NN

N

NH2

O

N

NN

N

NH2

O

HN

OOHHO

O2N

HO

N

NN

N

NH2

OHO

OHHO

88

9839

N

NN

N

NH2

O

H2N

99

41 +

Analog zur Synthese von 31

Schema 31 Retrosynthetische Analyse für 88.

3.2.2.2 Synthese von 2',3'-Didehydro-2',3'-dideoxyadenosin (98)

Adenosin wurde an der primären 5'-OH-Gruppe selektiv mit tert-Butyldiphenyl-silylchlorid (TBDPS-Cl) in 78% Ausbeute zur Verbindung 100 [186,187] umgesetzt (Schema 32). Reaktion der verbleibenden OH-Gruppen mit MeSO2Cl ergab das Dimesylat 101 [187] in 83% Ausbeute. Durch Reaktion mit Naphtalin-Radikalanion konnte aus Verbindung 101 das geschützte 2',3'-Didehydro-2',3'-dideoxyadenosin 102erhalten werden (62%) [187]. Der wahrscheinliche Mechanismus dieser Reaktion ist in Schema 33 dargestellt [187]. Zunächst findet ein Einelektrontransfer zu einer Mesylat-Gruppe statt. Homolytische Spaltung ergibt das Radikal 103. Ein zweiter Einelektrontransfer vom Naphtalin-Radikalanion zum gebildeten Radikal liefert das

Kapitel 3 79

Anion 104. Dieses Anion besitzt in -Stellung eine gute Abgangsgruppe. Durch Eliminierung wird das gewünschte Olefin erhalten. Eine Testreaktion lief mit einer Ausbeute von 62% ab. Sie war für grössere Ansätze jedoch nicht reproduzierbar. Ein Überschuss von Natriumnaphthalenid, eine lange Reaktionszeit oder eine Temperatur grösser als -20 °C hatten einen Basenverlust zur Folge [188].

N

NN

N

NH2

O

HO OH

TBDPSO

100

N

NN

N

NH2

O

HO OH

HO

39

TBDPS-Cl, Pyridin,RT, 13 h

78%

101

Me2SO2Cl,Pyridin, RT, 14 h 83%

N

NN

N

NH2

O

MsO OMs

TBDPSO

102

N

NN

N

NH2

OTBDPSO

THF, -60 °C, 5 min

62 %

Na

Schema 32 Darstellung des Dimesylats 101 und Umsetzung mit Natriumnaphthalenid zu Verbindung 102.

EET - Na O3SMe

Na

101

N

NN

N

NH2

O

MsO OMs

TBDPSO

N

NN

N

NH2

O

MsO OMs

TBDPSO

- Na O3SMeEET

Na

103

N

NN

N

NH2

O

MsO

TBDPSO

104

N

NN

N

NH2

O

MsO

TBDPSO

102

Schema 33 Wahrscheinlicher Mechanismus der reduktiven Eliminierung mit Natrium-naphthanelid. (EET = Einelektronentransfer)

Kapitel 3 80

Aus dem geschützten Adenosin 100 wurde durch Behandlung mit CS2 und MeI in Me2SO das Xanthogenat 105 in 31% Ausbeute erhalten (Schema 34). Mit einer von Barton [189-191] entwickelten Methode wurde versucht, 105 mit Triethylsilan in Gegenwart katalytischer Mengen Benzoylperoxid in das Olefin 102 zu überführen, was jedoch nicht gelang.

N

NN

N

NH2

O

HO OH

TBDPSO

100

1. CS2, NaOH, Me2SO, RT, 1 h2. MeI, RT, 3 h

31%

102

Et3SiH,Benzoylperoxid

N

NN

N

NH2

OTBDPSO

N

NN

N

NH2

O

O O

TBDPSO

105SS

SS

Schema 34 Darstellung des Xanthogenats 105 und Versuch zur doppelten Dideoxygenierung nach Barton.

Aus Adenosin wurde das Acetoxybromid 106 [192] durch Behandlung mit Trimethylorthoacetat und Acetylbromid in 85% Ausbeute erhalten (Schema 35). Reduktive Eliminierung mit aktiviertem Zink in Gegenwart von Essigsäure [193] ergab 107 in relativ guter Ausbeute (73%), welches in 85% Ausbeute zum Alkohol 98umgesetzt wurde. Bei der Synthese grösserer Mengen 107 gab es leider auch hier Probleme, als beim Einengen plötzlich ein Niederschlag von abgespaltenem Adenin ausfiel.

Eine alternative Methode zur Umwandlung von 106 in 107 bestand in der Zweiphasen-Reduktion von 106 mit Natriumdithionit und Dioctylbipyridiniumbromid (108) als Phasentransferkatalysator, wodurch Alken 107 in 78% Ausbeute erhalten wurde (Schema 36) [194].

Kapitel 3 81

N

NN

N

NH2

O

HO OH

HO

1. CH3C(OMe)3, AcOH, 30 °C, 3 h2. AcBr, MeCN, 10 °C, 1h, dann 15 °C, 2 h

85%

N

NN

N

NH2

O

Br OAc

AcO

Zn/Cu,AcOH, THF, EtOHRT, 24 h,

73%

N

NN

N

NH2

OAcO

N

NN

N

NH2

OHO

39 106

98 107

NH3, MeOH,RT, 14 h

85%

Schema 35 Darstellung des Acetoxybromids 106 aus Adenosin, Reduktive Eliminierung mit aktiviertem Zink und Entschützung.

N

NN

N

NH2

O

Br OAc

AcO

N

NN

N

NH2

OAcO

106 107

K2CO3, Na2S2O4,CH2Cl2/H2O 10:4,RT, 69 h

78 %

NN RR

R = (CH2)7CH3 108BrBr

Schema 36 Reduktive Eliminierung des Acetoxybromids 106 zum Olefin 107 mit Natriumdithionit und Dioctylbipyridiniumbromid 108 in einem Zweiphasen-System.

Der wahrscheinliche Mechanismus [194] ist im Schema 37 dargestellt. Natrium-dithionit wirkt als Elektronendonor, das Bipyridiniumbromid 108 als Elektronenakzeptor und Elektronencarrier. Das Bipyridiniumbromid 108 wird zunächst in der wässrigen Phase durch Natriumdithionit reduziert, wobei das Zweiphasen-System sich tiefblau färbt. Das gebildete Radikal 109 wandert in die organische Phase, wo es zur reduktiven Eliminierung des Acetoxybromids 106 dient, wobei Bipyridiniumbromid 108 regeneriert wird, welches in die wässrige Phase

Kapitel 3 82

zurückkehrt und für einen weiteren Zyklus bereitsteht. Die zugegebene Base (K2CO3)schützt das sehr säurelabile Produkt vor Zersetzung.

NN RR NN RRNa2S2O4

NN RR

2

2

2

NN RR2

Organische Phase

Wässrige Phase

108

108

109

109

106

N

NN

N

NH2

O

Br OAc

AcO

N

NN

N

NH2

OAcO

107

Schema 37 Wahrscheinlicher Zyklus für die reduktive Eliminierung des Acetoxybromids 106 mit Natriumdithionit und Bipyridiniumbromid 108 in einem Zweiphasen-System.

3.2.2.3 Versuch zur Synthese des Esters 110

Es wurde versucht, 2',3'-Didehydro-2',3'-dideoxyadenosin 98 mit IBX (50) zu oxidieren und in situ durch Reaktion mit dem Ylid 52 in den Ester 110 umzuwandeln (Schema 38) [162]. Dies gelang leider nicht.

N

NN

N

NH2

O

110

(CH3)2SO, RT

N

NN

N

NH2

OHO

98 OO

52

Ph3PO

O

IO

O

O

OH50

+

Schema 38 Versuch zur Synthese des Esters 110.

Kapitel 3 83

3.2.3 Synthese des Zielmoleküls 89 mit 2',3'-Dideoxyadenosinfragment

3.2.3.1 Syntheseplanung

Durch Hydrierung von 2',3'-Didehydro-2',3'-dideoxyadenosin (98) sollte 2',3'-dideoxyadenosin (111) erhalten werden (Schema 39). Ein an die Synthese von 31angelehnter Weg sollte zum Amin 112 führen. Reaktion mit 41 sollte dann zum Zielmolekül 89 führen.

N

NN

N

NH2

O

N

NN

N

NH2

O

HN

OOHHO

O2N

HO

89

111

N

NN

N

NH2

O

H2N

112

41 +

Analog zur Synthese von 31

N

NN

N

NH2

OHO

98

Schema 39 Retrosynthetische Analyse für 89.

3.2.3.2 Synthese von 2',3'-Dideoxyadenosin (111)

Durch Entschützung der Verbindung 107 [195] und nachfolgende Hydrierung [188] konnte 2',3'-Dideoxyadenosin 111 in 35% Ausbeute erhalten werden (Schema 40).

Kapitel 3 84

N

NN

N

NH2

OHO

111

1. NH3, MeOH, RT, 12 h,2. H2, Pd/C, EtOH, RT, 24 h

35%

N

NN

N

NH2

OAcO

107

Schema 40 Entschützung und nachfolgende Hydrierung der Verbindung 107 zum 2',3'-Dideoxyadenosin (111).

Da die Ausbeute unter den Erwartungen lag, wurde ein anderer, direkter Weg verwendet [192]. Das Acetoxybromid 106 konnte damit durch katalytische Hydrierung mit 41% Ausbeute in 2',3'-Dideoxyadenosin (111) umgewandelt werden (Schema 41).

N

NN

N

NH2

O

Br OAc

AcO

N

NN

N

NH2

OHO

106111

1. H2, Pd/C, Na2CO3, NaOAc·H2O, MeCN/H2O 5:1, RT, 48 h2. NaOH, H2O, RT, 1 h

41%

Schema 41 Darstellung von 2',3'-Dideoxyadenosin (111) aus dem Acetoxybromid 106.

3.2.3.3 Synthese des Amins 112 und Reaktion mit 41 zu 89

2',3'-Dideoxyadenosin (111) wurde mit IBX (50) in situ oxidiert und durch Wittig-Reaktion mit dem Ylid 52 in Ester 113 in 57% Ausbeute umgewandelt [162]. Durch Reduktion mit DIBAL-H wurde daraus der Allyalkohol 114 in 67% Ausbeute erhalten (Schema 42). Durch eine Mitsunobu-Reaktion [152,153] wurde der Allylalkohol 114 in das Phthalimid 115 in 96% Ausbeute umgewandelt.

Kapitel 3 85

N

NN

N

NH2

O

113

(CH3)2SO, RT, 37 h

57%

N

NN

N

NH2

OHO

DIBAL-H, Hexan, CH2Cl2,-78 °C, 1 h

67%

OO

52Ph3P

O

O

IO

O

O

OH

50

+

N

NN

N

NH2

O

HO

114

Phthalimid,DEAD, PPh3,THF, RT,18 h

96%

N

NN

N

NH2

O

N

O

O

111

115

Schema 42 Oxidation und Wittig-Reaktion zum , -ungesättigten Ester 113,Reduktion zum Allylalkohol 114 und Mitsunobu-Reaktion zu Phthalimid 115.

Das Phthalimid 115 wurde mit MeNH2 in EtOH gespalten [165] (Schema 43). Nach Reinigung durch Ionenaustausch-Chromatographie konnte das Amin 112 in 83% Ausbeute isoliert werden. Das Allylamin 112 wurde mit N-Hydroxysuccinimidester 41umgesetzt. Die Reaktion wurde in DMF in Gegenwart von Triethylamin durchgeführt [90,95]. Wiederum konnte durch Kristallisation kein sauberes Produkt erhalten werden. Zunächst wurde zur Aufreinigung Umkehrphasen-Chromatographie mit 0.1% TFA oder 1% HCOOH im Laufmittel (Acetonitril/H2O 2:7 3:7) gewählt. Diese Methode war für die Reinigung von Zielmolekül 87 verwendet worden. Die säureempfindliche Verbindung 89 überstand jedoch diese Bedingung nicht. Schliesslich konnte 89 durch Umkehrphasen-Chromatographie unter Zugabe von flüchtigem Triethylammonium-carbonatpuffer gereinigt werden. Ohne Pufferzugabe ist die Trennung sehr schlecht; mit Zugabe jedoch sehr gut. Anhaftendes, restliches Triethylamin wurde mit einem Ionenaustauscher entfernt.

Kapitel 3 86

N

NN

N

NH2

O

N

115

O

OMeNH2, EtOH, RT, 16 h

83%

N

NN

N

NH2

O

H2N

112

N

NN

N

NH2

O

HN

89

OOHHO

O2N

41, Et3N, DMF,RT, 16 h

63%

Schema 43 Spaltung des Phthalimids 115 mit MeNH2 und Reaktion mit 41 zur Zielverbindung 89.

3.2.4 Synthese des Cyclopentanderivats 90

3.2.4.1 Syntheseplanung

Das Zielmolekül 90 sollte in einer zur Synthese von 89 analogen Reaktionsfolge erhalten werden (Schema 44). Ein Schlüsselschritt dieser Strategie ist das regio- und diastereoselektive Verknüpfen des Allylacetats 116 mit Adenin (117).

Der chirale Baustein 116 sollte entsprechend einer modernen Literaturvorschrift von Crimmins et al. [196], welche eine asymmetrische syn-Aldoladdition und eine Grubbs-Olefinmetathese beinhaltet, dargestellt werden (Schema 45). Die in der Synthese verwendeten chiralen Auxiliare 118 und 119 sollten aus L-Phenylalanin (120)erhalten werden.

Kapitel 3 87

N

NN

N

NH2

N

NN

N

NH2

HN

OOHHO

O2N

HO

90

N

NN

N

NH2

H2N41 +

Analog zur Synthese von 89

N

NN

N

NH2

HO

AcO

AcO

N

NNH

N

NH2

+

116

117

Schema 44 Retrosynthetische Analyse für 90.

AcO

AcO

116

NO

R2O

R1

HO

R1 = H R2 = O 129R1 = CH3 R2 = S 125

NO

R1O

R1 = O 128R1 = S 124

HN O

R1

R1 = O 118R1 = S 119

OH

NH2

CO2H

120

NH2

121

Schema 45 Retrosynthetische Analyse für den Synthesebaustein 116 nach Crimmins.

Kapitel 3 88

3.2.4.2 Darstellung des chiralen Allylacetats 116 nach Crimmins

Zur Herstellung des Zielmoleküls 90 wurde zunächst auf zwei Wegen (Variante A, bzw. Variante B) das chirale cyclische Allylacetat 116 [196] synthetisiert, wobei die chiralen Evans-Auxiliare 119 (Variante A) und 118 (Variante B) verwendet wurden. Diese Auxiliare wurden jeweils ausgehend von L-Phenylalanin (120), das im ersten Schritt zu L-Phenylalaninol (121) [197] reduziert wurde (66%), synthetisiert. Aus 121wurde durch Umsetzung mit CS2 das Oxazolidinthion 119 [198] in 77% Ausbeute erhalten (Schema 46). Das Oxazolidinon 118 [199] wurde in einer Reaktion von 121mit Diethylcarbonat generiert (84%).

CO2H

NH2

OH

120 121

NH2

HN O

S

119

LiAlH4, THF,Rückfluss, 16 h

66%

CS2, 1N Na2CO3,Rückfluss, 15 min

77%

HN O

O

118

EtO OEt

O

K2CO3,140 °C, 2 h

84%

Schema 46 Herstellung der Evans-Auxiliare 119 und 118.

3.2.4.3 Variante A: Herstellung von 116 unter Verwendung des Evans-Auxiliars 119

Pentensäure 122 wurde mit Pivaloylchlorid in das reaktive gemischte Anhydrid 123 überführt, bevor es in 57% Ausbeute (2 Stufen) mit dem Evans-Auxiliar 119 zu 124verknüpft wurde (Schema 47) [196].

Kapitel 3 89

NO

SO

OH

O

O

O O122 123

124

Et3N, Pivaloylchlorid,THF, -78 °C -> 0°C, 2h

119, n-BuLi, THF,-78 °C -> 0 °C, 30 min, dann 0 °C, 1 h

57% (2 Schritte)

Schema 47 Verknüpfung des Auxiliars 119 mit Pentensäure 122.

Die Verwendung eines Evans-Auxiliars erlaubte eine diastereospezifischeSynthese der Verbindung 125 in 61% Ausbeute durch Aldoladdition von Crotonaldehyd. Dazu wurden die sperrige Base (–)-Spartein und die Lewis-Säure Titantetrachlorid eingesetzt (Schema 48) [196,200].

NO

SO

1. TiCl42. (-)-Spartein3. Crotonaldehyd

CH2Cl2,0 °C -> -78 °C, 1 h

61%

NO

SOHO

124 125

Schema 48 Diastereospezifische syn-Aldoladdition an 124.

Abspaltung des chiralen Auxiliars unter Verwendung von LiBH4 als Reduktionsmittel ergab das Diol 126 [196] in 51% Ausbeute (Schema 49). Versuche zur in der Literatur [196] beschriebenen Reduktion von 125 mit günstigerem NaBH4

lieferten 126 in sehr geringer Ausbeute (13% - 26%). Zweifache Acetylierung ergab 127 [196] in 44% Ausbeute.

Kapitel 3 90

NO

SOHO

125

HOHO

126

LiBH4,THF, MeOH,0 °C, 1 h

51%

OO

127

OO

(Cy3P)2Cl2Ru=CHPh,CH2Cl2, RT, 3 h

40%

OO

116

OO

Ac2O, Et3N,kat. DMAP,CH2Cl2, 0 °C,2 h

44 %

Schema 49 Abspaltung des Auxiliars durch Reduktion zum Diol 126, Acetylierung des Diols, Olefinmetathese unter Verwendung des Grubbs-Katalysators[(Cy3P)2Cl2Ru=CHPh].

Der Ringschluss zum Cyclopentenderivat 116 [196] erfolgte durch eine Olefinmetathese unter Verwendung des Grubbs-Katalysators Benzyliden-bis-(tricyclohexylphosphin)-dichlorruthenium [(Cy3P)2Cl2Ru=CHPh]. Die Abtrennung des Katalysators vom Reaktionsprodukt durch Filtration über Celite gestaltete sich problematisch; durch Kugelrohrdestillation hingegen konnte das Produkt rein isoliert werden.

3.2.4.4 Variante B: Herstellung des Intermediats 116 unter Verwendung des Evans-Auxiliars 118

Analog zur Verknüpfung des Auxiliars 119 mit Pentensäure 122 wurde mit dem Auxiliar 118 die Verbindung 128 erhalten (Schema 50), wobei die Ausbeute (77%) höher als mit dem schwefelhaltigen Auxiliar 119 (57%) war.

Kapitel 3 91

NO

OO

OH

O

O

O O

HN O

O

118

122 123

128

Et3N,Pivaloylchlorid,THF, -78 °C -> 0°C, 2 h

n-BuLi, THF,-78 °C -> 0 °C, 15 min, dann 0 °C, 2 h

77% (2 Schritte)

Schema 50 Verknüpfung des Auxiliars 118 mit Pentensäure 122.

Die Synthese von 129 [196] erfolgte analog zur Variante A, jedoch wurde Acrolein statt Crotonaldehyd als Additionspartner verwendet (Schema 51) (70%).

NO

OO

1. TiCl42. (-)-Spartein3. Acrolein

CH2Cl2,0 °C -> -78 °C, 1 h 30 min

70%

NO

OOHO

128 129

Schema 51 Diastereospezifische syn-Aldoladdition an 128.

Bei diesem Syntheseweg wurde die Metathese-Reaktion zum Cyclopentenderivat 130 [196] bereits auf der Stufe des Aldoladduktes 129 durchgeführt. Bis auf eine um eine Stunde längere Reaktionszeit blieben die Reaktionsbedingungen unverändert gegenüber der Umsetzung von 127 zu 116. Die Ausbeute (75%) war wieder besser als bei Variante A (Schema 52).

Kapitel 3 92

(Cy3P)2Cl2Ru=CHPh,CH2Cl2, RT, 4 h

75%

NO

OOHO

130

NO

OOHO

129

Schema 52 Olefinmetathese von 129 zu 130.

Für die Abspaltung von 118 wurde LiBH4 verwendet und gegenüber der Synthese von 126 die Reaktionszeit verdoppelt, wodurch das cyclische Diol 131 [196] in 66% Ausbeute erhalten wurde (Schema 53). Doppelte Acetylierung von 131 ergab den chiralen Baustein 116 [196] in 80% Ausbeute.

NO

OOHO

HO

HO

LiBH4THF, MeOH,0 °C, 2 h

66%

131130

O

O

116

O

O

Et3N, Ac2O,kat. DMAP,CH2Cl2, 0 °C, 3 h

80%

Schema 53 Reduktion von 130 zum cyclischen Diol 131 und Acetylierung zu 116.

3.2.4.5 Einführung von Adenin an das Intermediat 116 via Allylsubstitution

Zur Optimierung der Synthese des Carbonucleosids 132 [201] wurden verschiedene Testreaktionen durchgeführt (Schema 54 und Tabelle 5). Dabei wurde mit Natriumhydrid als Base das beste Ergebnis erzielt (55% Ausbeute). Bei Verwendung der Basen Triethylamin, Caesiumcarbonat und Butyllithium konnte keine Umsetzung festgestellt werden. Bemerkenswert ist der regio- und diastereoselektive Angriff des N-9-Atoms von Adenin.

Kapitel 3 93

O

O

116

O

O

N

NN

N

NH2

AcO

132

Adenin,Base,Pd-Katalysator

Schema 54 Herstellung des Carbonucleosids 132.

Tabelle 5 Reaktionsbedingungen für die Allylsubstitution am Intermediat 116.

Base Katalysator Lösungsmittel Temperatur Ausbeute

Et3N [Pd2(dba)3], PPh3 DMSO / THF 1:1 RT 45 °C -

Cs2CO3 [Pd2(dba)3], PPh3 DMSO / THF 1:1 RT 45 °C -

- [Pd2(dba)3], PPh3 DMSO / THF 1:1 RT 45 °C -

NaH [Pd2(dba)3], PPh3 DMSO / THF 1:1 RT 45 °C 48%

NaH [Pd(PPh3)4] DMSO / THF 1:1 45 °C 55%

Cs2CO3 [Pd(PPh3)4] DMSO 45 °C -

- [Pd(PPh3)4] DMF RT -

n-BuLi Pd(OAc)2, P(OiPr)3 DMSO / THF 3:2 RT -

Die Entschützung von 132 zum Alkohol 133 [201] wurde auf zwei Arten durchgeführt, wobei sich beide Varianten durch quantitative Umsetzung auszeichneten (Schema 55). Die Verseifung mit Natronlauge läuft in einer Reaktionszeit von nur 10 min ab, während die Abspaltung durch Ammoniak-gesättigtes Methanol mit 16 h wesentlich mehr Zeit beansprucht.

N

NN

N

NH2

AcO

132

N

NN

N

NH2

HO

133

1M NaOH,THF/MeOH0 °C, 10 min

oder NH3 in MeOH,RT, 16 h

quant.

Schema 55 Verseifung von Ester 132.

Kapitel 3 94

3.2.4.6 Synthese des Allylamins 134 und Reaktion mit 41 zu 90

Der Homoallylalkohol 133 wurde hydriert, mit IBX (50) oxidiert und in situ mit Ph3P=CHCO2Et (52) zum Ester 135 umgesetzt, welcher in 71% erhalten wurde [162] (Schema 56). Die Reduktion von 135 mit DIBAL-H ergab den Allylalkohol 136 in 38% Ausbeute. Eine Mitsunobu-Reaktion [152] ergab daraus das Phthalimid 137 in 75% Ausbeute.

N

NN

N

NH2

HO

133

N

NN

N

NH2

135

O O

N

NN

N

NH2

136

HO

1. H2, Pd/C, MeOH, RT, 4 h2. Ph3P=CHCO2Et, IBX, Me2SO, 15 h

71%

DIBAL-H, Hexan, CH2Cl2-78 °C, 1 h

38%

N

NN

N

NH2

137

N

O

OPhthalimid,PPh3, DEAD,THF, RT, 15 h

75%

Schema 56 Synthese des Phthalimids 137.

Das Phthalimid 137 wurde in quantitativer Ausbeute mit Methylamin zum Allylamin 134 umgesetzt (Schema 57) [165].

MeNH2, EtOH,RT, 12 h

quant.

N

NN

N

NH2

137

N

O

O N

NN

N

NH2

134

H2N

Schema 57 Spaltung des Phthalimids 137 mit Methylamin zum Amin 134.

Kapitel 3 95

Reaktion von 134 mit dem N-Hydroxysuccinimidester 41 [90,95] ergab die Zielverbindung 90 in einer Ausbeute von 25%.

N

NN

N

NH2

134

H2N

N

NN

N

NH2

90

HN

O

OHHO

O2N

41, Et3N, DMF,RT, 15 h

25%

Schema 58 Reaktion des Amins 134 mit dem N-Hydroxysuccinimidester 41 zum Zielmolekül 90.

3.2.5 Synthese der Pyrrolidinderivate (–)-91 und (+)-91

3.2.5.1 Syntheseplanung

Beide enantiomeren Zielmoleküle sollten ausgehend von preiswertem trans-4-Hydroxy-L-prolin ((–)-138) dargestellt werden (Schema 59 und Schema 60). Die letzten Stufen der Synthese sollten ähnlich zu dem für 31 entwickelten Weg erfolgen, wobei die Entschützung des Nucleosid-Bausteines erst nach der Reaktion mit 41erfolgen muss, um die primäre von der sekundären Aminogruppe zu differenzieren.

Im Falle des (R,R)-Enantiomeren (+)-91 müssen bei gleich bleibendem Ausgangsmaterial zusätzlich zwei Inversionsschritte unternommen werden (Schema 60). Die übrigen Syntheseschritte sind denjenigen des (S,S)-Enantiomeren (–)-91analog.

Kapitel 3 96

NBoc

N

N N

N

NH2

H2N

(-)-146

NH

N

N N

N

NH2

NH

OO-

HO

NO2 (-)-91

41 +

NBoc

N

N N

N

NH2

HO

analog zur Synthese von 31

(-)-147

HN

NH

N N

N

NH2

HO

(-)-138

+

O

OH

Schema 59 Retrosynthetische Analyse für (–)-91.

NO

OH

O Boc

NO

OH

O BocN

N

N

N

N

NH2

O

O Boc

HNHO

OH

OHNHO

OH

O

Alkohol-inversion

Carbonsäure-inversion

(-)-139 (+)-140 (+)-144

(+)-142(-)-138

Schema 60 Retrosynthetische Analyse für (–)-139.

Kapitel 3 97

3.2.5.2 Synthese des chiralen Bausteins (–)-140

trans-4-Hydroxy-L-Prolin ((–)-138) wurde mit Thionylchlorid versetzt und das entstandene Säurechlorid in situ mit Methanol quantitativ in das Methylester-Hydrochlorid(–)-141 [202] überführt (Schema 61). Deprotonierung des Amins (–)-141 mit Triethylamin und Behandlung mit Boc2O ergab in quantitativer Ausbeute das geschützte Intermediat (–)-140 [203].

HNHO

OH

OHNO

OH

OMeOH, SOCl2,RT, 14 h

quant.

· HCl

(-)-138 (-)-141

NO

OH

O BocBoc2O, NEt3,CH2Cl2,RT, 16 h

quant.

(-)-140

Schema 61 Veresterung von trans-4-Hydroxy-L-Prolin ((–)-138) zum Methylester-Hydrochlorid (–)-141 und Einführung einer Boc-Schutzgruppe.

3.2.5.3 Synthese des Intermediates (+)-140

Durch Umsetzung von trans-4-Hydroxy-L-prolin ((–)-138) mit Essigsäureanhydrid erfolgte die Epimerisierung des die Carbonsäurefunktion tragenden Zentrums. Isolierung des gewünschten, reinen cis-4-Hydroxy-D-prolins ((+)-142) [204] in 52% Ausbeute war aufgrund dessen erheblich schlechteren Löslichkeit in Ethanol gegenüber dem diastereoisomeren trans-4-Hydroxy-L-prolins möglich (Schema 62) [204].

HNHO

OH

O

1. Ac2O, AcOH, Rückfluss, 8 h

3. NEt3, Umkristallisation aus EtOH / H2O

52 %

HNHO

OH

O2. 2 N HCl, Rückfluss, 6 h

(-)-138 (+)-142

Schema 62 Epimerisierung des säuretragenden Zentrums von trans-4-Hydroxy-L-prolin und Isolierung des cis-Isomeren (+)-142.

Analog zum erwähnten Diastereoisomeren (–)-141 wurde cis-4-Hydroxy-D-prolin ((+)-142) mit Thionylchlorid in Methanol behandelt und das Hydrochlorid (+)-143[205] nach Umkristallisation aus Et2O als farblose Kristalle in quantitativer Ausbeute

Kapitel 3 98

isoliert (Schema 63). Für dieses Isomere verlief die Amin-Schützung mit Boc-Anhydrid in Anwesenheit von Triethylamin zu (+)-144 [206] in zufriedenstellender Ausbeute von 74%.

HNHO

OH

OHNO

OH

OMeOH, SOCl2,RT, 24 h

quant.

· HCl

(+)-142 (+)-143

NO

OH

O BocBoc2O, NEt3,CH2Cl2,RT, 13 h

74%

(+)-144

Schema 63 Veresterung von cis-4-Hydroxy-D-prolin zu (+)-143 und Einführung einer Boc-Schutzgruppe.

Eine sehr effiziente Methode zur Inversion von Alkoholen wird durch die Mitsunobu-Reaktion dargestellt [152]. Grundlage dazu ist die Aktivierung des Hydroxids zu einer guten Abgangsgruppe durch Behandlung mit Triphenylphosphin und Diethylazodicarboxylat (DEAD). Der nucleophile Angriff erfolgte durch Ameisen-säure. Der gebildete Ester wurde in einem zweiten Schritt zum Alkohol (+)-140 [204] hydrolysiert (Schema 64) (88%). Das bei der Reaktion entstehende Triphenylphosphin-oxid fiel als farbloser Feststoff aus und konnte grösstenteils durch Filtrierung entfernt werden. Chromatographische Reinigung erlaubte dann die vollständige Abtrennung dieses Nebenproduktes, dessen Bildung als treibende Kraft der Reaktion dient.

NO

OH

O BocNO

OH

O Boc

(+)-144 (+)-140

1. PPh3, DEAD, HCOOH, THF, RT, 16 h2. MeOH, NH3, RT, 3 h

88%

Schema 64 Alkoholinversion zu (+)-140 unter Verwendung der Mitsunobu-Reaktion.

3.2.5.4 Einführung von Adenin in den Pyrrolidinring und Reduktion der Estergruppe

Die Überführung der Hydroxygruppe von (–)-140 und (+)-140 in eine gute Abgangsgruppe und nucleophile Substitutionsreaktion (SN2) durch Adenin zu Ester (+)-139 bzw. (–)-139 stellte den ersten kritischen Schritt dar, da die Aktivierung der Hydroxygruppe stark genug für einen nucleophilen Angriff durch Adenosin sein sollte,

Kapitel 3 99

jedoch die Bildung unerwünschter Nebenprodukte verhindert werden sollte. Daher wurden vier verschiedene Abgangsgruppen, Methylsulfonyl (Mesyl, Ms), para-Brombenzolsulfonyl (Brosyl, Bs), para-Toluolsulfonyl (Tosyl, Ts) und para-Nitrobenzolsulfonyl (Nosyl, Ns), getestet (Schema 65, Tabelle 6), die durch Umsetzung des Alkohols (–)-140 mit dem entsprechenden Sulfonsäurechlorid hergestellt wurden [204,207-209].

NO

OH

O BocNO

OR

O BocNO

N

O Boc

N N

N

NH2

R-Cl, Pyridin,

RT, bei R = Ms Bs Ts4 °C, bei R = Ns

Adenin, K2CO3,18-Krone-6,DMF, 80 °C

(-)-140 (-)-145 (+)-139

Schema 65 Aktivierung des Alkohols (–)-140 und nucleophile Substitution zu (+)-139.

Tabelle 6 Aktivierungs- und Substitutionsausbeuten für die verschiedenen Abgangsgruppen.

R Aktivierungs-ausbeute

Substitutionszeit Substitutions-ausbeute

145a Ms 98 % 25 h 36 %

145b Ts 87 % 19 h 62 %

145c Bs 53 % 7 h 56 %

145d Ns 87 % 6 h 72 %

Wie aus Tabelle 6 ersichtlich, führte die am stärksten elektronenziehende Gruppe zu den besten Substitutionsausbeuten, daher wurde bei der Synthese des (R,R)-Enantiomeren direkt Nosylat als Abgangsgruppe gewählt (Schema 66) [209]. Die Aktivierung ergab (+)-145d in 85% Ausbeute und die Substitution lieferte (–)-139 mit 60% Ausbeute.

Kapitel 3 100

NO

OH

O BocNO

ONs

O BocNO

N

O Boc

N N

N

NH2

(+)-140 (+)-145d (-)-139

NsCl,Pyridin,4 °C, 14 h

85%

Adenin, K2CO3,18-Krone-6, DMF, 80 °C, 6 h

60%

Schema 66 Aktivierung des Alkohols (+)-140 und SN2-Reaktion zu (–)-139.

Laut 13C-NMR handelt es sich beim Produkt der nucleophilen Substitution um das gewünschte N9-Isomer. Die chemischen Verschiebungen der Base entsprechen denjenigen von Adenosin [210]. Im Fall eines N7-Isomeren hätte eine Tieffeld-Verschiebung der C4-Resonanz (von 149.8 ppm auf etwa 160.7 ppm) und eine Hochfeld-Verschiebung für das C5-Signal (von 119.6 ppm auf etwa 110.2) erwartet werden müssen [211].

3.2.5.5 Synthese von Amin (–)-146 und Reaktion mit 41 zu (–)-91

Die nachfolgenden Synthesestufen waren für beide Enantiomere analog. Der Einfachheit halber wird in der folgenden Beschreibung nur die Synthese des (S,S)-Enantiomeren (–)-91 aufgeführt. Die Ausbeuten sind in den Schemata für beide Enantiomere angegeben. Vor der Einführung des Linkers zur Catecholeinheit musste die Estergruppe zum Alkohol reduziert werden. Es wurden zwei Varianten versucht. Erstaunlicherweise führte nur die Umsetzung mit NaBH4 in Anwesenheit von LiCl zum Ziel (Schema 67) [212-214]. Bei Verwendung von LiBH4 wurde keine Reaktion festgestellt [215].

NO

N

O Boc

N N

N

NH2

NHO

N

Boc

N N

N

NH2

NaBH4, LiCl,THF/EtOH 1:2,0 °C, 1 h, dann55 °C, 11 h, dannRT, 14 h

(S,S) 83 %(R,R) 85 %

(+)-139 (-)-147

LiBH4, THF

Schema 67 Reduktion der Estergruppe zum Alkohol (–)-147.

Kapitel 3 101

Mit IBX (50) wurde der Alkohol (–)-147 zum entsprechenden Aldehyd überführt, welcher in situ mit Wittig-Reagenz 52 in 54% Ausbeute zum Ester (+)-148 umgesetzt wurde (Schema 68) [162]. Die Esterreduktion erfolgte selektiv mit DIBAL-H, dabei wurde Allylalkohol (+)-149 in 50% Ausbeute erhalten. Die Umwandlung zum Phthalimid (–)-150 erfolgte mit einer guten Ausbeute von 92% in einer Mitsunobu-Reaktion [152,153].

NBoc

N

N N

N

NH2

HO NBoc

N

N N

N

NH2

O

O

DIBAL-H, Hexan,THF,-78 °C, 1 h,dann 0 °C, 2 h,

(S,S) 50 %(R,R) 68 %

NBoc

N

N N

N

NH2

HO

(-)-147

(+)-149

(+)-148

IBX, Ph3P=CHCO2Et,Me2SO, RT,42 h

(R,R) 54%(S,S) 53%

NBoc

N

N N

N

NH2

N

(-)-150

O

O (S,S) 92 %(R,R) 75 %

DEAD, PPh3,Phthalimid,THF, RT, 16 h

Schema 68 Oxidation und Wittig-Reaktion zum -ungesättigten Ester (+)-148,Reduktion mit DIBAL-H zu (+)-149 und Mitsunobu-Reaktion zu (–)-150.

Das Phthalimid (–)-150 wurde mit Methylamin in 74% Ausbeute zum Amin (–)-146 umgesetzt [165] (Schema 69). Die Reinigung des Amins erfolgte über Ionenaustausch-Chromatographie. Durch Reaktion mit dem N-Hydroxysuccinimidester 41 [90,95] und anschliessende Abspaltung der Boc-Schutzgruppe mit einem Gemisch aus H2O/TFA 2:5 wurde die Zielverbindung (–)-91 in 71% Ausbeute erhalten. Zunächst wurde versucht, das Produkt über eine Umkehrphasensäule (2 cm x 24 cm) mit C18-Umkehrphase-Kieselgel der Firma Fluka, Maschengrösse 230-400 (63-40 m),

Kapitel 3 102

zu reinigen. Das dazu verwendete Laufmittel war ein Gemisch aus MeOH/H2O/HCOOH 20:80:0.5. Es wurde jedoch keine gute Trennung erhalten, somit wurde mittels Ionenaustauschchromatographie versucht, sauberes Produkt zu bekommen. Als auch dies nichts half, wurde eine präparative Umkehrphasen-HPLC verwendet und das Produkt zuerst mit HCOOH/H2O 0.5:100 gewaschen, dann mit einem Gradienten eluiert (HCOOH/H2O/CH3CN 1:100:0 0:0:100 in 100 min). Vorhandene Ameisensäure konnte durch dreimaliges Einengen aus Wasser entfernt werden.

MeNH2, EtOH,RT, 20 h

(S,S) 74%(R,R) 74%

NBoc

N

N N

N

NH2

N

(-)-150

O

O

NBoc

N

N N

N

NH2

H2N

(-)-146

1. 41, Et3N, DMF, RT, 64 h2. H2O/TFA 2:5 RT, 2 h

(S,S) 71 % (R,R) 84 %

HN

N

N

N

N

NH2

NH

OH

HO

NO2

O

1'

2'3' 4'

5'

61

23

4

57

89

(-)-91

7'

6'8'

Schema 69 Phthalimidabbau mit MeNH2 zum Amin (–)-146, Reaktion mit 41 und Entschützung zur Zielverbindung (–)-91.

Die Zuordnung der chemischen Verschiebungen des 1H-NMR-Spektrums von (–)-91 (Tabelle 7) erfolgte durch Vergleich mit Spektren von Ausgangsverbindungen und zuvor synthetisierten Bisubstrat-Inhibitoren. Charaktarisch sind die Signale der aromatischen Catechol-Protonen, welche als Dubletts mit einer Kopplungskonstanten von 2.5 Hz bei 8.45 und 7.75 erscheinen, sowie die Signale der Nucleobase bei 8.64 (H-C(2)) und 8.53 (H-C(8)). Die Signale der Doppelbindung des Linkers erscheinen, aufgespalten durch H-C(2') und H-C(7'), als doppeltes Dublett (H-C(6')) mit Kopplungskonstanten von 16.0 und 18.0 Hz bei 5.88 und einem Multiplett (H-C(7')) von 6.00-6.11. Das sich in Nachbarschaft zu N(9) der Nucleobase befindende H-C(4')

Kapitel 3 103

ergibt ein Multiplett von 5.37-5.50. Es folgen Multipletts für H-C(2'), H-C(8') und H-C(5') in einem Bereich von 3.56-4.38 und schliesslich ein Multiplett von 2.28-2.50 für das am wenigsten entschirmte H-C(3').

HN

N

N

N

N

NH2

NH

OH

HO

NO2

O

1'

2'3' 4'

5'

61

23

4

57

89

7'

6'8'

Tabelle 7 1H-NMR-Daten der Verbindung (–)-91 bei 300 MHz in (CD3)2SO unter Zugabe von 1 Tropfen CF3CO2D (m = Multiplett, s = Singulett, d = Dublett, dd = doppeltes Dublett).

chemische Verschiebung

Signalform AnzahlProtonen

Zuordnung KopplungskonstantenJ/Hz

2.28-2.50 m 1 H-C(3') 2.68-2.84 m 1 H-C(3') 3.56-3.67 m 1 H-C(5') 3.74-3.87 m 1 H-C(5') 3.94-4.04 m 2 H-C(8') 4.24-4.38 m 1 H-C(2') 5.37-5.50 m 1 H-C(4')

5.88 dd 1 H-C(6') 16.0, 8.0 6.00-6.12 m 1 H-C(7')

7.75 d 1 H-C(Catechol) 2.5 8.45 d 1 H-C(Catechol) 2.5 8.53 s 1 H-C(8) 8.64 s 1 H-C(2)

Im 13C-Spektrum sind alle 14 Signale der sp2-hybridisierten C-Atome, sowie 5 Signale für sp3-hybridisierte C-Atome sichtbar (Tabelle 8).

Bei der Substanz handelt es sich um einen gelben Feststoff, welcher sich in einem Bereich von 217-220 °C zersetzt.

Kapitel 3 104

Im IR-Spektrum können eine breite Absorptionsbande bei 3419 cm-1 für HN-H und O-H, eine Schulter bei 3188 cm-1 für CON-H, sowie eine starke Absorption bei 1635 cm-1 für NHC=O, charakteristischen Valenzschwingungen zugeordnet werden.

Der spezifische Drehwert (-9.7°) wurde nach Zugabe von Trifluoressigsäure zu einer Lösung der Substanz in (CH3)2SO gemessen werden, welche zu einer weitgehenden Entfärbung der intensiv orange gefärbten Lösung führte.

Durch hochaufgelöste MALDI-Massenspektrometrie konnte konnte das C19H21N8O5+-Ion (MH+) bei 441.1632 detektiert werden, welches in guter Übereinstimmung mit dem berechneten Wert von 441.1629 ist.

Tabelle 8 Weitere analytische Daten von Verbindung (–)-91.

Chemische Verschiebungen im 13C-NMR-Spektrum bei 75 MHz in (CD3)2SO unter Zugabe von 1 Tropfen CF3CO2D: 36.1; 47.9; 52.1; 59.6; 64.9; 112.0; 114.0; 114.4; 118.4; 124.0; 133.7; 138.5; 142.3; 145.0; 146.8; 148.3; 150.2; 155.5; 167.7

Schmelzpunkt: 217-222 °C (Zersetzung)

Lage der Absorptionsbanden (in cm-1) im IR-Spektrum (KBr-Pressling): 3419m;3188m; 1635s; 1600m; 1473m; 1418w; 1331m; 1261s; 1076w; 982w; 901w; 825w;794w; 648w

Spezifischer Drehwert (Konzentration c = 0.3 mg/ml in CF3CO2H/(CH3)2SO 1/20, Temperatur T = 25 °C, Wellenlänge = 578 nm): -9.7°

Berechnete Masse für das C19H21N8O5+-Ion (MH+): 441.1629 Gefundene Masse im HR-MALDI-MS: 441.1632

Kapitel 3 105

3.3 Biologische Resultate

3.3.1 Bestimmung der IC50-Werte

Die IC50-Werte der Zielverbindungen mit Modifikationen der Ribose-Einheit wurden, wie in Kapitel 2.3.1 beschrieben, durch den radiochemischen Assay mit Vorinkubation von Zürcher und Da Prada [95,175] bestimmt (Tabelle 9).

Tabelle 9 IC50-Werte (relative Fehler ± 5%) der Zielmoleküle mit Modifikationen der Ribose-Einheit.

N

NN

N

NH2

NH

O

NO2

OH

HOX

O

HO

OX =

87 9089

HN

HN

(-)-91 (+)-91

Inhibitor IC50 [ M]

87 28

89 3

90 1

(–)-91 43

(+)-91 141

Das Entfernen der 2'-OH-Gruppe führte zu einem dramatischen Verlust an Bindungsaffinität. Der ternäre Komplex von COMT mit Mg2+ und 87 (IC50 = 28 M)ist über drei Grössenordnungen weniger stabil als der mit 31 (IC50 = 9 nM) gebildete Komplex. Eine weitere Reduzierung der Hydrophilie durch das Entfernen der zweiten OH-Gruppe (89: IC50 = 3 M) und den Austausch der Ribose durch einen

Kapitel 3 106

Cyclopentanring (90: IC50 = 1 M) führte, relativ zu 87, etwas besseren Bindungsaffinitäten. Die Derivate (–)-91 (IC50 = 43 M) und (+)-91 (IC50 = 141 M),bei welchen die Ribose durch einen Pyrrolidin-Ring ersetzt wurde, sind die am wenigsten aktiven Inhibitoren dieser Serie.

Die Resultate zeigen eine ausserordentliche Empfindlichkeit der Affinität der Inhibitoren auf Modifikationen der Ribose-Einheit. Eine wirksame Koordination von Glu90 scheint für eine effektive Bisubstrat-Hemmung von COMT von essentieller Bedeutung zu sein. Der Austausch der Ribose-Einheit durch einen Pyrrolidin-Ring, welcher in der protonierten Form ein Ionenpaar mit der Seitenkette von Glu90 bilden könnte, führte zu sehr niedrigen Bindungsaffinitäten der entworfenen Bisubstrat-Inhibitoren.

3.3.2 Messung der Inhibitionskinetik für die SAM-Bindungstasche

Um Aufschluss über den Inhibitionsmechanismus der neuen Inhibitoren zu erhalten, wurde für die Inhibitoren 87, 89 und 90 wie in Kapitel 2.3.3 beschrieben die Kinetik für die SAM-Bindungstasche bestimmt (Abb. 46). Für die Catechol-Bindungstasche wurden keine Kinetik-Experimente durchgeführt, da die kompetitive Besetzung der Catechol-Bindungstasche durch Nitrocatechole hinreichend beschrieben ist [90,95,105,109,114,216]. Durch globalen Fit der Parameter der Gleichungen (12), (14) und (16) (Kapitel 2.3.2) mit dem Programm Origin [178] an die Messwerte wurden die Ki-Werte ermittelt. Der potente Bisubstrat-Inhibitor 31 und die Leitstruktur 23[90,95] hatten beide gegenüber SAM eine kompetitive Kinetik gezeigt, für 31 wurde das Bindungsmodell zudem durch Röntgenstrukturanalyse belegt, so dass eine kompetitive Kinetik für die SAM-Bindungstasche als ein relativ zuverlässiger Hinweis für eine Bisubstrat-Inhibition gelten kann. Überraschenderweise wurde für den schwach bindenden Inhibitor 87 ein kompetitiver Inhibitionsmechanismus gefunden. Der berechnete Ki-Wert beträgt Ki = Kic = 14 ± 1 M. Dieses Resultat zeigt, dass 87 in der Lage ist, mit SAM zu konkurrieren, daher sollte es sich bei 87 immer noch um einen Bisubstrat-Inhibitor für COMT handeln. Andererseits wurde für Inhibitor 90, welcher in der Serie die höchste Bindungsaffinität aufwies, ein deutlich unkompetitiver Mechanismus mit einem Ki-Wert von Ki = Kiu = 0.56 ± 0.03 M gefunden, was darauf hinweist, dass 90 nur die Catechol-Bindungstasche besetzt und der Adenin-substituierte Cyclopentanring wahrscheinlich in die umgebende wässrige Lösung ragt. Für das 2',3'-Dideoxyadenosinderivat 89 wurde ein gemischter Inhibitionsmechanismus mit Ki = Kic= Kiu = 2.7 ± 0.1 M gefunden. Die unterschiedlichen Inhibitionsmechanismen von 89und 90 geben einen Hinweis darauf, dass auch das Sauerstoffatom des Furanringes der Ribose für die Bindung in die Nucleosid-Bindungstasche von Bedeutung ist.

Kapitel 3 107

a)

b)

c)

Abb. 46 Lineweaver-Burk-Diagramme der reziproken Enzymaktivität aufgetragen gegen die reziproke SAM-Konzentration bei unterschiedlichen Inhibitor-Konzentrationen für die Inhibitoren 87 (a), 89 (b) und 90 (c) bei konstanter Catechol-Konzentration. DPM = decays per minute.

Kapitel 3 108

Die Resultate zeigen auf eindrückliche Weise, dass eine Diskussion der Bindungseigenschaften von Bisubstrat-Inhibitoren nur durch Kenntnis der Inhibitionskinetik möglich ist.

3.4 Ausblick

Wie in diesem Kapitel gezeigt wurde, ist der Entwurf von Bisubstrat-Inhibitoren für COMT mit veränderter Ribose-Einheit eine grosse Herausforderung. Da nicht sicher ist, welchen Beitrag die 2'-OH-Gruppe im Vergleich zur 3'-OH-Gruppe zur Bindungsaffinität leistet, ist die Synthese des 3'-Deoxyadenosinderivats 151 interessant (Abb. 47), welches durch den Elektronenzug der 2'-OH-Gruppe im Vergleich zum 2'-Deoxyderivat stabiler sein sollte. Die Stabilität könnte auch durch Einführung eines Fluoratoms in 152 und 153 gesichert werden, durch den Elektronenzug könnte die Azidität und damit die H-Brückendonoreigenschaft der benachbarten OH-Gruppe gesteigert werden. Interessant sind auch die Strukturen 154 und 155, in welchen eine OH- duch eine NH2-Gruppe ersetzt ist und die entsprechenden Deoxyderivate 156 und 157. Aufgrund der erhöhten Stabilität gegenüber enzymatischer und hydrolytischer Spaltung sowie der erhöhten Hydrophobizität sind Carbonucleoside wie 158 und 159von Interesse. Schritte in diese Richtung sind im folgenden Kapitel beschrieben.

N

NN

N

NH2

NH

O

NO2

OH

HOX

X =

151

O

OH

O

H2N154

OH

O

HO155

NH2

O

H2N156

O

157NH2 HO

158OH

152

O

OH

O

HO153

FF

HO159

OH

Abb. 47 Weitere Modifikationen der Ribose-Einheit.

Kapitel 4 109

4 Analoga des Carbonucleosids Aristeromycin

4.1 Design

N

NH

OOH

HO

NO2

O

HO OH

X

NH2

NN

N

162

X =

161 158

160

N

HO OH

NH2

NN

N

HO

Der formale Austausch des Furanringes von Nucleosiden durch einen Cyclopentanring führt zu Carbonucleosiden, welche gegenüber enzym- und säurekatalysierter Hydrolyse stabil sind [217-221]. Aristeromycin (160), das carbonucleosidische Analogon zu Adenin, ist erstmals aus dem Bakterienschlamm von Streptomyces Citricolor isoliert worden [222]. Aristeromycin ist ein potenter Inhibitor des Enzyms Homocystein-Hydrolase (Ki = 5 nM) [223,224]. Da 160 antibakterielle [222] und antivirale [225] Eigenschaften zeigt, wurden zahlreiche Totalsynthesen von racemischem und enantiomerenreinen 160 entwickelt [217-221].

Unter Verwendung des Programms MOLOC [72] wurden, wie in Kapitel 2 beschrieben die diastereomeren Aristeromycin-Analoga 161 und 162 entworfen, welche an Stelle der Doppelbindung von 31 einen Cyclopropanring enthalten, der die konformationelle Freiheit ähnlich stark einschränken sollte, aber stabiler als die ursprüngliche Doppelbindung gegenüber möglichem oxidativem Abbau in der Leber sein sollte. Auch die Synthese von 158 wäre interessant, um den Effekt der Modifikation der Riboseuntereinheit zu untersuchen. Die Hydroxygruppen an C2' und C3', welche zwei essentielle Wasserstoffbrücken zum Glu90 (C(2')-OH 2.8 Å bei 161 /2.7 Å bei 162; C(3')-OH: 2.8 Å bei 161 / 2.9 Å bei 162) bilden (Kapitel 3), wurden beibehalten. Der Austausch des Sauerstoffs im Fünfring der Ribose gegen eine Methylengruppe erhöht die metabolische Stabilität und die Lipophilie des Moleküls, mit möglichem günstigem Effekt auf die Bioverfügbarkeit und Bindungsaffinität zum aktiven Zentrum des Enzyms. Problematisch könnte der kurze Abstand der CH2-Gruppe zum -Wasserstoffatom von Gly66 (3.0 Å bei 161 / 3.3 Å bei 162) sein (Abb. 48 und Abb. 49).

Kapitel 4 110

Bei 161 ist der Cyclopropanring in die aktive Tasche des Enzyms hinein gerichtet. Dies ermöglicht eine günstige hydrophobe Wechselwirkung mit dem Schwefelatom von Met40 (3.8 Å) und sterisch ist diese Anordnung ebenfalls günstig, da an dieser Stelle der aktiven Tasche viel Platz vorhanden ist. Der Cyclopropanring in 162 ist so augerichtet, dass durch den Kontakt mit C7 des Indolgerüstes von Trp143 (3.0 Å) dessen Seitenkette etwas herausdrehen müsste.

Abb. 48 Modelle für die Bindung der beiden Diastereoisomere 161 (oben) und 162(unten) im aktiven Zentrum von COMT (ausgewählte Abstände in Å).

Kapitel 4 111

N

N N

N

NH2

OO

NH

OO OH

NO2

Mg

O

O O

O

H2N O

O

OH

H

NHO

OO

H H

NH2

O

N

N N

N

NH2

OO

NH

OO OH

NO2

Mg

O

O O

O

H2N O

O

O

H

H

NHO

OO

H H

NH2

O

Glu90

Asp141Asp169

Asn170

Ser119

Gln120

Glu199

Trp143

NH

Glu90

Asp141Asp169

Asn170

Ser119

Gln120

Glu199

Gly66

++

162

++

161

HNO

Gly66 HNO

2.8

2 .8

2.8

3.0

2.7

2.02.1

1.9

2.0

2.0

3.0

2.8

2.8

2.9

2.6

2.02.0

1.92.0

2.0

Trp143

NH

Abb. 49 Schematische Darstellung der Diastereoisomere 161 (oben) und 162 (unten) in der aktiven Tasche von COMT.

Kapitel 4 112

4.2 Synthese

4.2.1 Versuch zur Synthese des Zielmoleküls 161

4.2.1.1 Syntheseplanung

Das Zielmolekül 161 sollte durch Reaktion von N-Hydroxysuccinimidester 41 mit dem Amin entstehen, welches durch Spaltung des Phthalimids 163 gebildet werden sollte. Das Phthalimid 163 sollte durch nucleophile Substitution am geeignet aktivierten Alkohol 164 erhalten werden. Dieser sollte nach der Umwandlung zum Phthalimid mittels einer Mitsunobu-Reaktion durch Entschützung aus dem Alkohol 165erhalten werden. Der Alkohol 165 sollte durch Michael-Addition des cyclopropanierten Linker-Bausteins (+)-166 an 167 dargestellt werden. Die Synthese der Cyclopentenon-Zwischenstufe 167, sowie des Cyclopropylstannans (+)-166, und die nachfolgende diastereoselektive Reduktion der Carbonylgruppe waren in der Literatur [226-234] beschrieben (Schema 70).

OO

O

SnBu3

H

H

TBDMSO

165 164

H

H

OO

OBn

HO

OO

OH

H

H

N

O

O

(+)-166

163

OO

H

H

N

O

O

OHHO

H

H

NH

O

NO2

HO

OH

161

167

+

N

N N

N

NH2

N

N N

N

NH2

Schema 70 Retrosynthetische Analyse für das Zielmolekül 161.

Kapitel 4 113

4.2.1.2 Synthese der Cyclopentenon-Zwischenstufe 167

D-Ribose (168) wurde mit Cyclohexanon unter Säurekatalyse in 84% Ausbeute zum Acetal 169 [235] umgesetzt und mit Pyridiniumchlorochromat (PCC) mit einer Ausbeute von 28% zum Lacton 170 [229] oxidiert (Schema 71).

OHHO

O OHHO

168

OO

O OHHO

PCC,OO

O OHO

Cyclohexanon,p-Toluolsulfonsäure, RT, 14 h 84%

CH2Cl2,RT, 16 h 28%

169 170

Schema 71 Einführen der Cyclohexyliden-Schutzgruppe und Oxidation zum Lacton 170.

Das Lacton 170 wurde mit einer Ausbeute von 32% oxidativ gespalten und der erhaltene Alkohol 171 [229] mit Isopropanol in 20% Ausbeute zum Lacton 172 [233] umgesetzt (Schema 72).

OO

O OHO

171

OO

O OHO

170

OO

O OO

172

1. 0.5 M KOH, 40 °C, 15 min

PPTS, i-PrOH,60 °C, 14 h

20%2. KIO4, 0 °C, 5 h 32%

Schema 72 Oxidative Spaltung von 170 zu 170 und Umwandlung zu 172.

Das Lacton 172 wurde in einer Wittig-Reaktion in 32% Ausbeute zum Cyclopentenon 173 [233] umgesetzt (Schema 73).

CH3PO(OCH3)2, n-BuLi, THF, -78 °C, 2.5 h

32% OO

O

173

OO

O OO

172

Schema 73 Darstellung des Cyclopentenons 173.

Kapitel 4 114

Für die Reaktion wird der folgende Mechanismus vorgeschlagen: Dimethyl-methylphosphonat wird durch Butyllithium deprotoniert, greift die Carbonylgruppe von 172 nucleophil an und öffnet den Fünfring unter Bildung eines intermediären Aldehyds, wobei Isopropanolat als basische Abgangsgruppe durch Deprotonierung das Phosphor-Ylid für die intramolekulare Wittig-Reaktion bildet (Schema 74) [236].

OO

OO

PO(OCH3)2

-

O

OO

O O

LiCH2PO(OCH3)2

OO

O

H+

-HOPO(OCH3)2

Li+

O

Li+

H

OO

OO

PO(OCH3)2H

OO

O

PO(OCH3)2

H+

-H2O

172

173

-

Schema 74 Mechanismus für die Bildung von 173.

Kapitel 4 115

Die geringe Ausbeute ist für diese Reaktion bekannt und wird damit begründet, dass statt der erwünschten irreversiblen Cycloeliminierung des Phosphorsäureesters vermutlich auch die reversible Eliminierung von H2O stattfinden kann, wenn der Phosphorsubstituent und der Sauerstoffsubstituent trans-orientiert sind [236]. Der Versuch, die wässrige Phase der Aufarbeitung kontinuierlich zu extrahieren, um durch die Hydrolyse der Doppelbindung des Nebenproduktes und anschliessende Cyclo-eliminierung zusätzliches Produkt zu gewinnen [236], brachte keinen Erfolg.

D-Mannose wurde mit Aceton und Methanol zu Methyl-2,3-O-isopropyliden-mannofuranosid umgesetzt und oxidativ in quantitativer Ausbeute zum Aldehyd 174[231] gespalten (Schema 75). Bis zum Aldehyd 174 sah die Synthese vielversprechend aus, da aufgrund der einfachen Aufarbeitung (ohne chromatographische Reinigungen) und der guten Ausbeute in relativ kurzer Zeit viel Material verfügbar war. Die nachfolgenden Reaktionen waren jedoch problematisch.

1. Aceton, Dimethoxypropan, MeOH, HCl (cat.), 80 °C, 2 h2. MeOH, HCl (cat.), RT, 3 h3. NaIO4, H2O, MeOH, 0 °C -> RT, 1 h quantitativ

O

OH

HO

HO

HOHO

O

OO

MeO

174

H

O

Schema 75 Synthese des Aldehyds 174.

Der Aldehyd 174 wurde oxidativ ins Lacton 175 überführt. Die genaue Ausführung der Literaturvorschrift [237] lieferte überhaupt kein Produkt. Nach Optimierung (Tabelle 10) stieg die Ausbeute auf maximal 40%. Auch in diesem Schritt wurde das Produkt ohne Chromatographie in reiner kristalliner Form erhalten.

Kapitel 4 116

Tabelle 10 Optimierung der Umwandlung des Aldehyds 174 ins Lacton 175.

O

OO

MeO OO

OO

CHOMeO

174 175

Reaktionsbedingungen Ausbeute

KMnO4, CuSO4·5H2O,Benzol, RT, 20 h[237]

-

1. KMnO4, CuSO4 (wasserfrei), Benzol, 60 °C, 6 h2. H2O, RT, 20 h

40%

KMnO4, CuSO4 (wasserfrei), Toluol, H2O, RT, 18 h 28%

KMnO4, Toluol, H2O, RT, 20 h -

KMnO4, CuSO4 (wasserfrei), Toluol, H2O, NaOH, RT -

Die Wittig-Reaktion zur Darstellung des Cyclopentenons 167 aus dem Lacton 175lieferte kein Produkt, obwohl die Reaktionsbedingungen denjenigen zur Umwandlung von 172 in 173 entsprachen (Schema 76) [226].

O

OO

MeO O

O O

O

175 167

CH3PO(OCH3)2, n-BuLi, - 78 °C

Schema 76 Versuch zur Umwandlung von 175 in 167.

Auch der Versuch, das Produkt kontinuierlich mit Ether aus der wässrigen Phase zu extrahieren, gelang nicht.

Kapitel 4 117

Aufgrund der Probleme bei den ersten Syntheseversuchen von 173 und 167 wurde ein neuer Syntheseweg eingeschlagen, der schliesslich mit Hilfe moderner Methoden zum Ziel führte. Der Schlüsselschritt der Synthese war eine Grubbs-Ringschlussmetathese [238] ausgehend vom Dien 176, welches über vier Stufen aus D-Ribose (168) zugänglich war (Schema 77) [234,239-241].

OHHO

O OHHO

167 177176 178

O O

O

OO

OH

OO

O O

OO

OMeI

168

Schema 77 Retrosynthetische Analyse für das Cyclopentenon 167.

D-Ribose 26 wurde geschützt und durch Redoxkondensation nach Mukaiyamazum Iodid 177 [240] umgesetzt (Schema 78). Dieses reagierte mit Butyllithium in einer reduktiven Eliminierung in nahezu quantitativer Ausbeute (99%) zum Aldehyd 178[239], während der Versuch, die reduktive Eliminierung mit Zn in MeOH durchzuführen, zu einem Gemisch führte (Schema 79) [241].

O

OO

OMeI

OHHO

O OHHO

168177

1. Aceton, MeOH, 2,2-Dimethoxypropan, HCl (cat.) RT, 50 h2. I2, PPh3, Imidazol, Toluol, CH3CN, 80 °C, 2 h 80%

Schema 78 Synthese des Iodids 177 aus D-Ribose.

Kapitel 4 118

O

OO

OMeI

177

OO

O

O O

O OMe

OO

MeOZn, MeOH,Rückfluss, 1 h

BuLi, Hexan, THF,-78 °C, 15 min 99%

178

178

Schema 79 Reduktive Eliminierung von 177 zu 178.

Die Grignard-Addition mit Vinylmagnesiumbromid zum Dien 176 [234] lief problemlos in quantitativer Ausbeute ab (Schema 80).

OO

OMgBr

OO

OH

THF, -20 °C, 1 hquantitativ

178176

Schema 80 Grignard-Addition zum Dien 176.

Schliesslich lieferte die Grubbs-Ringschlussmetathese [238], gefolgt von einer Oxidation des Allylalkohols, das Cyclopentenon 167 [234] in guter Ausbeute (64%).

O O

O

167

OO

OH

176

PCy3

Ru

PCy3

PhCl

Cl5 mol%

CH2Cl2, RT, 16 h

1.

2. MnO2, CH2Cl2, RT, 32 h

64%

Schema 81 Erfolgreiche Umwandlung zum Cyclopentenon 167.

Kapitel 4 119

4.2.1.3 Enantioselektive Cyclopropanierung

Um möglichen Schwierigkeiten (match/mismatch) bei einer nachträglichen diastereoselektiven Cyclopropanierung auszuweichen (Schema 82), war es geplant, die enantioselektive Cyclopropanierung nach Charette [242] am Vinylstannan 179 vor der Michael-Addition an das Cyclopentenon 167 durchzuführen.

SnBu3

OH

179

SnBu3

H

H

TBDMSO

SnBu3

H

H

HO

SnBu3

H

H

HO

SnBu3

H

H

TBDMSO

(+)-188(+)-166

(-)-188(-)-166

Schema 82 Retrosynthetische Analyse für die enantioselektive Cyclopropanierung mit anschliessender Umsetzung zu den Stannanen (+)-166 und (–)-166.

Der allylische Alkohol 179 wurde ausgehend von Propargylalkohol (180) durch radikalische Addition von Tributylzinnhydrid in 52% Ausbeute erhalten (Schema 83) [243].

OH

180

SnBu3

OH179

Bu3SnH, AIBN, 110 °C, 2 h

52%

Schema 83 Radikalische Addition von Tributylzinnhydrid an Propargylalkohol.

Als Hilfsstoffe für die enantioselektive Cyclopropanierung nach Charette werden die enantiomeren Dioxaborolane (+)-181 und (–)-181 eingesetzt. Diese sind über drei Stufen ausgehend von Trimethylborat zugänglich [244]. Trimethylborat (182) reagiert mit Butylmagnesiumbromid zum Boronsäurederivat 183, welches mit Diethanolamin die achirale Vorstufe 184 der Hilfsstoffe bildet. Verbindung 184 reagiert mit dem entsprechenden Enantiomer von N,N,N',N'-Tetramethylweinsäurediamid zum gewünschten Dioxaborolan (+)-181 oder (–)-181 (Schema 84) [244].

Kapitel 4 120

OB

O

CONMe2Me2NOC

Bu

OB

O

CONMe2Me2NOC

Bu

(+)-181 (-)-181

1. BuMgCl, Et2O, -78 °C -> RT, 2 h

BO

O

OB

OHHO

182

HO

HN

OH

O B

N

OBu

CONMe2Me2NOC

HO OH

CONMe2Me2NOC

HO OH

2. 10% HCl, RT, 10 min 48%

Et2O, CH2Cl2, Molekularsieb 3 Å,RT, 2 h 90%

(+)

CH2Cl2,NaCl, H2O,RT, 30 min76%

(-)

CH2Cl2,NaCl, H2O,RT, 30 min81%

183

184

Schema 84 Synthese der enantiomeren Dioxaborolane (+)-181 und (–)-181 als Hilfsstoffe für die enantioselektive Cyclopropanierung nach Charette.

Kapitel 4 121

Um eine explosionsartige, stark exotherme Reaktion von Diethylzink mit Diiodmethan zu vermeiden, wurde Diethylzink vor der Zugabe von Diiodmethan mit 1,2-Dimethoxyethan (DME) (185) zum weniger reaktiven Diethylzink·DME-Komplex 186 umgesetzt, mit dem bei Temperaturen unter -10 °C auch in grösserem Massstab sicher gearbeitet werden kann. Diiodmethan wurde dann langsam und unter Überwachung der Innentemperatur zum Diethylzink·DME-Komplex 186 zugetropft und bildete den für die Cyclopropanierung verwendeten Bis(iodmethyl)zink·DME-Komplex 187 (Schema 85) [244,245].

ZnEt2, CH2Cl2CH2I2, -20 °C, 10 min

MeO OMeMeO OMe

ZnEtEt

MeO OMeZn

CH2IIH2C

185 186 187

Schema 85 Bildung des Bis(iodmethyl)zink·DME-Komplexes 187 für die Cyclo-propanierung.

Die von Charette als Hilfsstoff für die enantioselektive Cyclopropanierung [242] entwickelten Dioxaborolane (+)-181 und (–)-181 bilden mit 179 einen Komplex, indem der Allylalkohol am Bor koordiniert. Der Komplex ist in der Lage, Bis(iodmethyl)zink als bidentaten Liganden so zu koordinieren, dass das Carben die Doppelbindung des Allylalkohols bevorzugt von der gewünschten Seite her angreift (Abb. 50) [242]. Dabei dirigiert ein Amidsauerstoff das Zinkion auf die richtige Seite der Doppelbindung.

Abb. 50 Modell für den enantioselektiven Angriff des Iodmethylzinks an die Doppelbindung bei der Umsetzung zu (–)-188.

Kapitel 4 122

Die Literaturvorschrift zur Cyclopropanierung von 179 war gut reproduzierbar und die Reaktion ergab die enantiomeren Cyclopropylstannane (+)-188 und (–)-188 mit hoher Ausbeute (Schema 86) [245].

SnBu3

H

H

HOSnBu3

OH

179

(+)-188

1. Zn(CH2I)2·DME, (+)-181, -20 °C -> RT, 20 h

2. 5 M KOH, Et2O, 4 h (+) 90% 87% ee (-) 99% 88% ee

Schema 86 Enantioselektive Cyclopropanierung zum Cyclopropylstannan (+)-188.

Zur Untersuchung der Enantioselektivität der Reaktion wurden je 10 mg der enantiomeren Cyclopropylstannane (+)-188 und (–)-188 mit (S)-(–)- Methoxy- -trifluormethylphenylessigsäure ((–)-MTPA) zu den entsprechenden diastereoisomeren Mosher-Estern umgesetzt [246]. Die Signale der diastereotopen Protonen Ha und Hb

(Schema 87) erscheinen im 500 MHz 1H-NMR Spektrum getrennt, so dass die Enantioselektivität über das Integralverhältnis bestimmt werden konnte. Der Enantiomerenüberschuss liegt mit 88% ee nahe bei dem von Charette [242] beobachteten maximalen Wert von 94% ee; zudem stimmten die gemessenen Drehwerte mit den Literaturwerten [245] überein.

SnBu3

H

H

OF3C

OO

HaHb

SnBu3

H

H

OF3C

OO

HaHb

Schema 87 Mosher-Ester zur Bestimmung der Enantioselektivität der Cyclopropanierung.

4.2.1.4 Versuche zur Michael-Addition des Cylopropropylstannanes

Obwohl in der Literatur keine Beispiele für Michael-Additionen von Cyclopropyl-stannanen gefunden wurden, wurde versucht, das geschützte Cyclopropylstannan (–)-166 an das Cyclopentenon 167 zu addieren, weil dies der kürzeste Weg zur Synthese des Zielmoleküls war. Hierzu wurde das Zinn im geschützten Stannan (–)-166 bei -78 °C gegen Lithium ausgetauscht, um dann unter verschiedenen Bedingungen [246-251] Cuprate zu bilden, mit denen die Michael-Addition an 167 versucht wurde (Tabelle 11). Leider hat sich gezeigt, dass die Michael-Addition mit dem geschützten Cyclopropylstannan (–)-166 nicht funktioniert.

Kapitel 4 123

Tabelle 11 Versuche zur Michael-Addition des Cyclopropylstannans (–)-166 an das Cyclopentenon 167.

SnBu3

H

H

TBDMSO

OO

H

H

TBDMSO

O167

(-)-166

Reaktionsbedingungen Ausbeute

Me2Cu(CN)Li2, THF, 0 °C RT, 1.5 h [250] -

1. n-BuLi, THF, Hexan, -78 °C, 15 min [249] 2. CuBr·SMe2, TMSCl, -78 °C -40 °C, 1 h -

1. n-BuLi, THF, Hexan, - 78 °C, 45 min 2. CuBr, BF3·OEt2, -78 °C -50 °C, 12 h 1,2-Addition (30%)

1. n-BuLi, THF, Hexan, -78 °C, 45 min [247] 2. CuI, PBu3, -78 °C -30 °C, 1 h -

1. n-BuLi, THF, Hexan, -78 °C, 45 min 2. CuI, PBu3, BF3·OEt2, -78 °C -30 °C, 1 h -

In einem Fall wurde das 1,2-Addukt gefunden, vermutlich weil der Austauch des Lithiums gegen Kupfer aufgrund der schlechten Löslichkeit des Kupfer(I)bromids in THF nicht stattfand. Deswegen, und aufgrund der höheren Stabilität und berichteten Selektivität, wurde bei den nächsten Versuchen ein in THF gut löslicher [CuI·PBu3]-Komplex eingesetzt [251], was aber in diesem Fall auch nicht zum Ziel führte. Auch die Aktivierung der Carbonylgruppe mit der Lewissäure BF3·OEt2 und Trimethylsilylchlorid [247] brachte keinen Erfolg. Vermutlich überwiegen radikalische Nebenreaktionen.

4.2.1.5 Michael-Addition des Vinylstannans 189 an das Cyclopentenon 167

Da alle Versuche, das Cycloproylstannan (–)-166 an das Cyclopentenon 167 zuaddieren, scheiterten, wurde nun das Vinylstannan 189 für die Michael-Addition eingesetzt. Damit wurden Ausbeuten von bis zu 55% erzielt, allerdings mit dem

Kapitel 4 124

Nachteil, dass nun über zusätzliche Stufen die Voraussetzungen für die nachträgliche diastereoselektive Cyclopropanierung am Allylalkohol 190 geschaffen werden mussten.

Der Alkohol 179 wurde mit tert-Butyldimethylsilylchlorid (TBDMSCl) in sehr guter Ausbeute von 95% zum geschützten Vinylstannan 189 [245] umgesetzt (Schema 88).

TBDMSCl, Im, DMF,0 °C -> 4 °C, 12 h

95 %

SnBu3

OH

SnBu3

TBDMSO

179 189

Schema 88 Schützen des Allylalkohols 179.

Mit [CuI·PBu3] als Kupferreagens war die Addition von 189 erfolgreich (Schema 89) [245,248]. Möglicherweise liegt das an der geringeren Tendenz des Vinylcuprats, über radikalische Nebenreaktionen abzureagieren.

OTBDMS

SnBu3

OO

O

TBDMSO1. n-BuLi, THF, Hexan, -78 °C, 45 min2. CuI, PBu33. 167, -78 °C -> -30 °C, 1 h 55%

189

191

Schema 89 Erfolgreiche Michael-Addition zum Keton 191.

Alternativ dazu wurde ein Zinn-freier Weg gefunden. Hierzu wurde die OH-Gruppe von Propargylalkohol (192) als Silylether unter Bildung von 193 geschützt (93% Ausbeute) und anschliessend die Alkingruppe von 193 [252] hydrozirkoniert (Schema 90). Das hierfür benötigte Schwartz-Reagenz 194 ist zwar kommerziell erhältlich, jedoch teuer und schlecht zu lagern, daher wurde es in situ aus [Cp2ZrCl2]dargestellt [253]. Das erhaltene Zirkoniumalkenyl 195 konnte durch Nickel-katalysierte Michael-Addition [254] an 167 mit 49% Ausbeute zu 191 umgesetzt werden.

Kapitel 4 125

TBDMSCl, Im, DMF,RT, 18 h

93 %OH TBDMSO

192 193

[Cp2ZrCl2]LiEt3BH,

THF,RT, 1 h

[Cp2ZrHCl]

194

193

THF,RT, 15 min

TBDMSO

ZrCp2

Cl

167, [Ni(AcAc)2],THF,1) -78 °C -> 0 °C, 1 h2) 4 °C, 48 h

OO

O

TBDMSO

191

49%

195

Schema 90 Schützen von Propargylalkohol (192), Hydrozirkonierung und Nickel-katalysierte Michael-Addition zum Keton 191.

4.2.1.6 Umsetzung zum Allylalkohol 190

Mit der Addition des Linkers war ein wichtiger Schritt der Synthese gelungen. Das Ziel war nun, möglichst rasch zum Allylalkohol 190 zu kommen, um die diastereoselektive Cyclopropanierung durchzuführen.

Das Keton 191 wurde mit Natriumborhydrid diastereoselektiv und in quantitativer Ausbeute zum Alkohol 196 reduziert (Schema 91) [255]. Vor der Spaltung des Silylethers in 196 wurde die Hydroxygruppe in 98% Ausbeute benzyliert [256], um zu verhindern, dass das Dioxaborolan 181 bei der Cyclopropanierung auch an dieser unerwünschten Stelle koordiniert. Der Silylether in 197 wurde mit Tetrabutyl-ammoniumfluorid (TBAF) in 90% Ausbeute gespaltet (Schema 91).

Kapitel 4 126

OO

O

TBDMSO

OO

OH

TBDMSO

NaBH4, MeOH, -10 °C, 30 min

quantitativ

196191

OO

OBn

TBDMSO

1. NaH, 0 °C, 30 min2. Bu4NI, BnBr, RT, 16 h 98%

197

OO

OBn

HO

TBAF, THF, RT, 1 h

90%

190

Schema 91 Diastereoselektive Reduktion von 191 zum Alkohol 196, Benzylierung der Hydroxygruppe in 196 und Entschützen zum Allylalkohol 190.

4.2.1.7 Diastereoselektive Cyclopropanierung des Allylalkohols 190

Die diastereoselektive Cyclopropanierung des Allylalkohols 190 wurde in Analogie zur enantioselektiven Cyclopropanierung des Vinylstannans 189 durchgeführt [242]. Die Produkte der Cyclopropanierung (Schema 92) wurden chromatographisch vorgereinigt, um mittels HPLC den Diastereoisomerenüberschuss (de) zu bestimmen. Beide Diastereoisomere wurden mit bemerkenswert hoher Ausbeute (85% bzw. quantitativ) und Diastereoselektivität gebildet. Anschliessend wurden die Diastereo-isomere chromatographisch getrennt, und die laut HPLC reinen Fraktionen vereinigt (Abb. 51).

Kapitel 4 127

OO

OBn

HO

H

H

OO

OBn

HO

OO

OBn

H

H

HO

190

165

1. Zn(CH2I)2·DME, (+)-181, -25 °C -> RT, 20 h

2. 5 M KOH, Et2O, 4 h

85%, 97% de

1. Zn(CH2I)2·DME, (-)-181, -30 °C -> RT, 20 h

2. 5 M KOH, Et2O, 4 h

quantitativ, > 99% de198

Schema 92 Diastereoselektive Cyclopropanierung des Allylalkohols 190.

5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0

Retentionszeit (min)

5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0

Retentionszeit (min)

Abb. 51 HPL-Chromatogramme der beiden reinen Diastereoisomere 198 (links) und 165 (rechts). Zur Trennung wurde eine Säule mit SiO2-Phase (Korngrösse 5 m, 25 x 4 mm, 1 ml/min, Supelcosil LC-Si, Hexan/EtOAc 2:1) verwendet.

Die Diastereoisomere 165 und 198 enthalten alle sechs Stereozentren des Zielmoleküls und sind deswegen für die Untersuchung der relativen Konformation interessant. Mit Hilfe der zweidimensionalen NMR Spektroskopie (DQF-COSY) gelang es (Abb. 52), alle Signale im 1H-NMR Spektrum den entsprechenden Kernen zuzuordnen (Tabelle 12). NOE-Untersuchungen ermöglichten die Zuordnung der relativen Konformation an C(4'). Besonders stark ist der NOE bei H-C(6'), H-C(7') und H-C(9') bei der Einstrahlung auf H-C(1') und auf das in Richtung des Cyclopropanringes ausgerichtete H-C(5'). H-C(7') zeigt einen NOE zu H-C(1'), H-C(2'), H-C(3') und H-C(5'). Auf H-C(6') und H-C(9') wurde nicht eingestrahlt, da die

tR = 8.96 min

tR = 7.05 min

Kapitel 4 128

Signale im 1H-NMR-Spektrum breit und nur schlecht voneinander getrennt sind. Über die relative Konformation des Cyclopropanringes ist aufgrund der NOE-Daten keine Aussage möglich. Vermutlich ist die Rotation um die C(4')-C(6')-Bindung bei Raumtemperatur zu schnell.

OO

OBn

H

H

HO

1'

2'3'4'

5'6'7'

8'

9'

198

Abb. 52 H,H-DQF-COSY-2D-NMR Spektrum des Alkohols 198.

Kapitel 4 129

Tabelle 12 1H-NMR-Daten der Verbindung 198 bei 400 MHz in CDCl3(m = Multiplett, s = Singulett, d = Dublett).

chemische Verschiebung

Signalform AnzahlProtonen

Zuordnung Kopplungskonstanten J/Hz

0.32-0.70 m 3 H-C(6') und H-C(9') 0.86-0.94 m 1 H-C(7') 1.17-1.37 m 4 H3C und H-C(4')

1.50 s 3 H3C1.53-1.78 m 1 H-C(5') 2.04-2.16 m 1 H-C(5') 3.32-3.57 m 2 H-C(8') 3.85-3.95 m 1 H-C(1')

4.40 d 1 H-C(3') 5.6 4.59-4.72 m 3 H-C(2') und CH2-Ph7.26-7.40 m 5 arom.

4.2.1.8 Versuche zur Einführung des Adenins

Der Alkohol 165 wurde unter Mitsunobu-Bedingungen [152,153] zum Phthalimid und dann weiter in 40% Ausbeute zum Alkohol 164 umgesetzt (Schema 93).

OO

OBn

H

H

HO

OO

OH

H

H

N

O

O

164165

1. Phthalimid, PPh3, DEAD, THF, RT, 20 h

2. 10% Pd/C, H2, MeOH, EtOAc, RT, 14 h

40 %

Schema 93 Umsetzung von 165 zum Phthalimid 164.

Die letzte schwierige Stufe der Synthese bestand in der Einführung des Adenins. Dazu sollte der Alkohol 164 in eine geeignete Abgangsgruppe überführt werden, um die nucleophile Substitution durch Adenin oder ein aktiviertes Adeninderivat [257] zu ermöglichen. In der Literatur sind viele Beispiele ähnlicher Reaktionen zu finden, wobei die berichteten Ausbeuten zwischen 10 - 30% liegen [226,258,259]. Über-raschenderweise scheiterten sämtliche Versuche, das Adenin durch nucleophile

Kapitel 4 130

Substitution einzuführen (Tabelle 13). Diese Resultate lassen sich durch den elektronenziehenden Effekt des vicinalen Acetalsauerstoffes erklären, welcher die positive Partialladung an C(1') im Übergangszustand der nucleophilen Substitution destabilisiert. Der Effekt ist so stark, dass sogar die Aktivierung mit Triflat und auch die Umsetzung unter Mitsunobu-Bedingungen [260,261] versagten. Auch der Versuch, Chlorpurin als Nucleophil einzusetzen brachte keinen Erfolg. Möglicherweise hat auch das Phthalimid einen negativen Einfluss auf die Reaktion, da es die Seite, von wo das Adenin angreifen müsste, sterisch hindert und beim starken Erwärmen die Reaktionsbedingungen nicht überlebt.

Tabelle 13 Versuche zur Einführung des Adenins durch nucleophile Substitution.

OO

OH

H

H

N

164

O

O

OO

H

H

N

O

O

a, b

N

N N

N

NH2

Aktivierung a Reaktionsbedingungen b Ausbeute

NsCl, Pyridin, 0 °C, 14 h

K2CO3 (wasserfrei),18-Krone-6, Adenin, DMF 80 °C 130 °C, 12 h

-

NsCl, Pyridin, 0 °C, 14 h

NaH, Adenin, DMF 80 °C, 12 h

-

Tf2O, Pyridin, RT, 20 min

NaH, Adenin, DMF RT, 20 h

-

Tf2O, Pyridin, - 10 °C, 40 min

NaH, Adenin, DMF 70 °C, 4 h

-

PPh3, DEAD,0 °C, 10 min

Adenin, RT, 20 h -

PPh3, DEAD,0 °C, 30 min

Chlorpurin, RT, 20 h -

Kapitel 4 131

4.3 Ausblick

Es könnte möglich sein, das Adenin ausgehend vom Alkohol 199 einzuführen(Schema 94). Die optimalen Reaktionsbedingungen dafür müssen noch gefunden werden, was im Rahmen dieser Arbeit nicht mehr möglich war.

OO

OH

TBDMSO

200

N

N N

N

NH2

OO

TBDMSO

199

H

HH

H

Schema 94 Geplante Umsetzung des Alkohols 199 zu 200.

Falls die nucleophile Substitution mit Adenin auch am Alkohol 199 scheitern sollte, besteht noch die Möglichkeit, den Alkohol 196 zum Mesylat 201 undanschliessend ins Azid 202 umzusetzen, welches zum Amin 203 reduziert würde. Das Adenin würde dann ausgehend vom Amin 203 aufgebaut werden (Schema 95). In einem Literaturbeispiel mit ähnlicher Problemstellung führte dieser Weg zum Erfolg [262].

OO

OH

H

H

TBDMSO

OO

OMs

H

H

TBDMSO

OO

N3

H

H

TBDMSO

OO

NH2

H

H

TBDMSO

203

201

N

N N

N

NH2

OO

H

H

TBDMSO

199 202

3 Stufen

204

Schema 95 Alternative Methode zur Einführung des Adenins.

Kapitel 4 132

Die restlichen Schritte zum Zielmolekül wären ausgehend von Zwischenstufe 204Entschützung mit Tetrabutylammoniumfluorid (TBAF) und nachfolgende Umsetzung zum Phthalimid 205 unter Mitsunobu-Bedingungen, die Spaltung des Phthalimids zum Amin 206, die Kupplung mit dem Nitrocatechol und die Entschützung zum Zielmolekül 161 (Schema 96).

O

O

N

N N

N

NH2

OO

H

H

NN

N N

N

NH2

OO

H

H

TBDMSO

OHHO

NH

H

N N

N

NH2

NH

O

NO2

HO

OH

204

N

N N

N

NH2

OO

H

H

H2N

161

205

206

Schema 96 Potentielle Synthese von Zielmolekül 161.

Experimenteller Teil 133

5 Experimenteller Teil

5.1 Materialien und Methoden

Lösungsmittel für Extraktionen und Säulenchromatographie waren von technischer Qualität und wurden vor Gebrauch destilliert. Reaktionen wurden in Lösungsmitteln der Qualität puriss. p. a. der Firma Fluka oder J. T. Baker oder in Lösungsmitteln vergleichbarer Qualität durchgeführt. THF wurde über Na/Benzophenon und CH2Cl2über CaH2 destilliert. Alle Reaktionen ausser denjenigen in protischen Lösungsmitteln wurden unter einer Argon-Atmosphäre durchgeführt. Lösungsmittel wurden mit einem Rotationsverdampfer in vacuo und durch Trocknen im Hochvakuum (ca. 10-2 Torr) entfernt.

Dünnschicht Chromatographie (DC) wurde mittels Kieselgelplatten 60 F254 (aufGlas) der Firma Merck durchgeführt. Die Detektion erfolgte mit UV-Licht bei 254 nm und durch Anfärben mit Kaliumpermanganat (0.5 % in 1 M NaOH) oder einer Lösung von 20 g (NH4)6Mo7O24 6H2O und 0.4 g Ce(SO4)2 in 400 ml 10 % H2SO4 (Mostain). Amine wurden mit Ninhydrin (Lösung aus 0.3 g Ninhydrin in 100 ml Butanol und 3 ml Eisessig) nachgewiesen.

Säulenchromatographie wurde mit Kieselgel 60 der Firma Fluka (Korngrösse 40-63 m) bei RT mit einem Überdruck von 0.2 – 0.4 bar durchgeführt.

Umkehrphasen-Chromatographie wurde mit Kieselgel 100 C18-Umkehrphase der Firma Fluka (Korngrösse 40-63 m) mit einem Überdruck von ca. 1 bar durchgeführt. Nach Gebrauch wurde das Kieselgel jeweils durch Behandlung mit 2% para-Toluolsulfonsäure in MeOH, MeOH und H2O regeneriert.

Analytische Umkehrphasen-HPLC wurde über eine LiChrospher C18 Säule (250 x 4 mm, 5 m, 100 Å) von Merck durchgeführt. Es wurde mit einem linearen Gradienten von 5% MeCN in Wasser mit 0.1% TFA zu 100% MeCN während 20 min und einem Fluss von 1 ml/min unter UV-Detektion bei 254 nm eluiert.

Präparative Umkehrphasen-HPLC wurde über eine Vydac 201TP C18 Säule (250 x 28 mm, 5 m, 300 Å) durchgeführt, Lösungsmittel und Gradient sind in Klammern angegeben. Nach Verwendung wurde das Kieselgel jeweils durch Behandlung mit 1% HCOOH in MeOH (~ 200 ml) und H2O (~100 ml) regeneriert.

Ionenaustauschchomatographie erfolgte auf einer mit Dowex® 50 W x 4, NH4+-Form, Maschengrösse 200-400 (40-80 m), gepackten Säule (2 cm x 24 cm). Nach

Experimenteller Teil 134

Gebrauch wurde die Säule mit 25 % NH3/MeOH 1:1 (~ 200 ml) gereinigt und mit H2O/MeOH 1:1 (~ 2 l) neutralgewaschen.

Schmelzpunkte (Fp.) wurden mit einer Büchi-510-Schmelzpunktapparatur gemessen und sind nicht korrigiert.

Spezifische Drehwerte ([ ]25) wurden mit einem Perkin-Elmer 241 Polarimeter bestimmt. Die Messungen erfolgten bei einer Wellenlänge von 589 nm (Na-D-Linie) oder bei einer Wellenlänge von 365 nm oder 578 nm (Hg-Linien) und einer Küvettenlänge von 1 dm. Die Konzentration c wird in g/100 ml angegeben.

Infrarotspektren (IR) wurden von KBr-Presslingen der Substanz mit einem Perkin-Elmer 1600-FT-Spektrometer aufgenommen. Die Lage der Absorptionsbanden ist in Wellenzahlen (cm–1) angegeben. Die Signalintensitäten werden mit s (stark), m(mittel), w (schwach) oder br (breit) bezeichnet.

NMR-Spektren (1H, 13C) wurden bei RT im angegebenen Lösungsmittel auf einem Varian-Gemini 200, Varian-Mercury 300 oder einem Bruker AMX-500 Spektrometer gemessen. Die chemischen Verschiebungen sind in -Werten (ppm) relativ zum Signal von Tetramethylsilan ( = 0) angegeben. Die Kopplungskonstanten (J) sind in Hz und die Spinmultiplizität als s = Singulett, d = Dublett, t = Triplett, m = Multiplett, br = breit angegeben.

Massenspektren (MS und HR-MS) wurden vom MS-Service des Laboratoriums für Organische Chemie der ETH Zürich auf einem IonSpec Ultima (MALDI, mit 2,5-Dihydroxybenzoesäure oder 2,4,6-Trihydroxyacetophenon/Diammoniumcitrat 2:1 als Matrix), einem VG-TRIBID (EI) und einem Finnigan MAT TSQ 7000 (ESI) gemessen.

Elementaranalysen (EA) wurden im Mikroanalytischen Laboratorium des Laboratoriums für Organische Chemie der ETH Zürich durchgefürt. Bestimmt wurden jeweils die prozentualen Anteile von C, H und N.

Röntgenstrukturanalysen wurden von Prof. Dr. V. Gramlich (KristallographischesLabor, ETH Zürich) durchgeführt. Die experimentellen Details sind im Anhang aufgeführt.

Die Nomenklatur folgt im wesentlichen den Vorschlägen des Computerprogramms ACD-Name von ACD/Labs. Die Numerierung der Atome in den Abbildungen wurde willkürlich festgelegt, um eine eindeutige Zuordnung der 1H-NMR-Signale zu ermöglichen.

Experimenteller Teil 135

5.2 Allgemeine Arbeitsvorschriften

AAV 1 für die Amidsynthese unter Verwendung von Hydroxysuccinimidester 41

Zu einer Lösung des Amins (0.34 mmol, 1 Äquiv.) in trockenem DMF (5 ml) wurden Et3N (0.1 ml, 1 mmol, 3 Äquiv.) und 41 (110 mg, 0.372 mmol, 1.1 Äquiv.) zugegeben. Die rote Lösung wurde 15 h bei 20 °C gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Wasser (100 ml) verdünnt und auf eine Säule (1 cm x 25 cm) mit Umkehrphasen-Kieselgel aufgetragen. Nach Waschen mit 1% HCOOH (200 ml) wurde das Produkt mit CH3CN/1% HCOOH (2:8 3:7) eluiert. Das Lösungsmittel wurde durch Lyophilisieren entfernt.

AAV 2 für die Oxidation und in situ Wittig-Reaktion primärer Alkohole

Zu einer Lösung des Alkohols (40 mmol, 1 Äquiv.) in Me2SO (100 ml) wurden Ph3P=CHCO2Et (42.8 g, 100 mmol, 2.5 Äquiv.) und o-Iodoxybenzoesäure (IBX) (50)(27.8 g, 100 mmol, 2.5 Äquiv.) zugegeben. Das braune Reaktionsgemisch wurde 72 h bei 20 °C gerührt. Wasser (500 ml) wurde zugegeben und mit AcOEt (2 x 500 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden getrocknet (Na2SO4), eingeengt und chromatographisch gereinigt.

AAV 3 für die Reduktion , -ungesättigter Ester zu Allylalkoholen

Der Ester (1 mmol, 1 Äquiv.) wurde in CH2Cl2 (3 ml) gelöst und auf -78 °C gekühlt. Dann wurde eine 1 M Lösung von DIBAL-H in Hexan (4 ml, 4 mmol, 4 Äquiv.) zugetropft. Das Reaktionsgemisch wurde 2 h bei -78 °C gerührt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von MeOH (5 ml) gestoppt. Eine ges. Lösung von Kaliumnatriumtartrat (Rochelle Salz, 50 ml) wurde zugegeben und das Zweiphasengemisch während 16 h bei 20 °C gerührt. Die Phasen wurden getrennt und die wässrige Phase mit AcOEt (3 x 50 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden getrocknet (Na2SO4) und eingeengt.

Experimenteller Teil 136

AAV 4 für die Mitsunobu-Reaktion von Allylalkoholen mit Phthalimid

Zu einer Suspension des Allylalkohols (1.46 mmol, 1 Äquiv.), Phthalimid (215 mg, 1.46 mmol, 1 Äquiv.) und Ph3P (383 mg, 1.46 mmol, 1 Äquiv.) in THF (7 ml) wurde DEAD (0.23 ml, 97%, 1.5 mmol, 1.02 Äquiv.) zugetropft. Das Reaktionsgemisch wurde 2.5 h bei 20 °C gerührt, wobei sich ein farbloser Niederschlag bildete.

Aufarbeitungsmethode A: Die Suspension wurde auf 0 °C gekühlt und filtriert. Der Rückstand wurde mit kaltem Et2O gewaschen und dann getrocknet.

Aufarbeitungsmethode B: Das Reaktionsgemisch wurde eingeengt und chromato-graphisch gereinigt.

AAV 5 für die Spaltung von Phthalimiden mit MeNH2

Das Phthalimid (1.91 mmol) wurde in 33% MeNH2 in EtOH (30 ml) gelöst. Das Reaktionsgemisch wurde während 16 h bei 20 °C gerührt und dann eingeengt.

Aufarbeitungsmethode A: Der Rückstand wurde in CHCl3 (25 ml) gelöst und mit 10% AcOH (30 ml) extrahiert. Die wässrige Phase wurde mit CHCl3 (3 x 25 ml) gewaschen, durch Zugabe von 2 N NaOH alkalisch eingestellt (pH > 12) und dann mit CHCl3 (4 x 25 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden getrocknet (Na2SO4)und eingeengt.

Aufarbeitungsmethode B: Der Rückstand wurde in wenig MeOH gelöst und wie in AAV 6 beschrieben durch Ionenaustausch-Chromatographie gereinigt.

AAV 6 für die Hydrolyse von Isopropylidenacetalen

Zum Isopropylidenacetal (1.45 mmol) wurde TFA/H2O (5:2, 14 ml) gegeben und die Lösung 1 h bei 20 °C gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde eingeengt. Der Rückstand wurde in Wasser (10 ml) gelöst und auf eine Säule mit Dowex® 50 Wx4 (NH4+, 1 cm x 25 cm) aufgetragen. Nach Waschen mit MeOH/H2O (1:1, 400 ml) wurde das Produkt mit MeOH/13% NH3 (1:1) eluiert. Fraktionen, die Produkt enthielten wurden nach Entfernen von MeOH durch Lyophilisieren getrocknet.

Experimenteller Teil 137

5.3 Experimentelle Daten zu Kapitel 2

2,3-Dihydroxy-5-nitrobenzoesäure (36) [150]

OH

HOOH

O

NO2

36

2-Hydroxy-3-methoxybenzoesäure (10.0 g, 59.5 mmol) wurde in CH2Cl2 (66 ml) gelöst und auf 0 °C gekühlt, dann wurde innerhalb von 15 min Nitriersäure zugetropft (6.6 ml 98% H2SO4, 5.4 ml 68% HNO3). Das Gemisch wurde 1 h bei 0 °C und anschliessend 2 h bei 20 °C weitergerührt. Das Reaktionsgemisch wurde in Eiswasser gegossen (100 ml), der Niederschlag abfiltriert und mit Eiswasser gewaschen. Zum Rohprodukt wurde 45% HBr (250 ml) zugegeben und während 18 h bei 145 °C unter Rückfluss erhitzt. Flüchtige Bestandteile wurden unter Vakuum abdestilliert, der feste Rückstand wurde mit 1 N NaOH (200 ml) gelöst, dann die dunkelrote Lösung mit Et2O (3 x 100 ml) gewaschen, mit konz. HCl angesäuert, anschliessend wurde die gelbe Suspension mit AcOEt (3 x 150 ml) extrahiert. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und am Rotationsverdampfer auf ein Volumen von ca. 20 ml eingeengt. Das Produkt wurde durch Zugabe von Hexan (1 l) ausgefällt.

Ausbeute: 7.934 g (67%). Brauner Feststoff. Fp. 213 °C (Hexan, Lit. [150]: 222 °C). 1H-NMR (300 MHz, CD3OD): 7.77 (d, J = 2.8, 1 H, arom.); 8.24 (d, J = 2.8, 1 H, arom.).

Experimenteller Teil 138

2,5-Dioxotetrahydro-1H-pyrrol-1-yl-2,3-dihydroxy-5-nitrobenzoat (41) [90,95]

OH

HOO

O

NO2

41

N

O

O

2',3'-Dihydroxy-5-nitrobenzosäure 36 (1 g, 5 mmol, 1 Äquiv.) wurde in THF (10 ml) gelöst und auf 0 °C gekühlt. Dann wurden DCC (1.04 g, 5 mmol, 1 Äquiv.) und N-Hydroxysuccinimid (578 mg, 5.0 mmol, 1 Äquiv.) zugegeben. Das Reaktions-gemisch wurde 1 h bei 0 °C gerührt, wobei ein Niederschlag ausfiel. Das Reaktionsgemisch wurde weitere 15 h bei 4 °C stehen gelassen und dann filtriert. Der Rückstand wurde mit THF (20 ml) gewaschen. Das Filtrat wurde eingeengt und der erhaltene Rückstand aus 2-Propanol umkristallisiert.

Ausbeute: 790 mg (53%). Gelber Feststoff. Fp. 204-205 °C (Lit. [90]: 209 °C). 1H-NMR (300 MHz, (CD3)2SO): 2.88 (s, 4 H, 2 x CH2); 7.83 (d, J = 2.8, 1 H, H-C(4)); 8.15 (d, J = 2.8, 1 H, H-C(6)).

2',3'-O-Isopropylidenadenosin (42) [151]

N

NN

N

NH2

O

O O

HO

42

1'3

1

2'3'

45'

4'

2

578

9

6

Zu einer gut gerührten Suspension von Adenosin (20.43 g, 76.45 mmol, 1 Äquiv.) und p-Toluolsulfonsäure-Monohydrat (16.00 g, 84.10 mmol, 1.1 Äquiv.) in Aceton (150 ml) wurde innherhalb von 15 min Triethylorthoformiat (51 ml, 45 g, 0.31 mol, 4 Äquiv.) zugetropft. Das Reaktionsgemisch wurde 68 h bei 20 °C gerührt. Wasser (450 ml) und 25%ige Ammoniak-Lösung (76 ml) wurden zugegeben. Das Lösungsmittelvolumen

Experimenteller Teil 139

wurde bis zum Einsetzen einer Trübung verringert. Die farblose Suspension wurde 1 h bei 0 °C gekühlt und dann filtriert. Der Rückstand wurde mit Eiswasser und Ether gewaschen. Die Mutterlauge wurde erneut bis zur Trübung eingeengt und dann 16 h bei 4 °C stehen gelassen, wodurch nach Filtration und Waschen mit Eiswasser und Ether weiteres Produkt erhalten wurde.

Ausbeute: 22.34 g (95%). Farblose Kristalle. Fp. 213 °C (Lit. [151]: 215 °C). 1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 1.37 (s, 3 H, CH3); 1.64 (s, 3 H, CH3); 3.75-4.00 (m, 2 H, H-C(5')); 4.54 (s, 1 H, H-C(4')); 5.11 (d, J = 5.2, 1 H, H-C(3')); 5.21 (t, J = 5.2, 1 H, H-C(2')); 5.86 (d, J = 5.2, 1 H, H-C(1')); 5.94 (br, 2 H, NH2); 6.56 (br, 1 H, OH); 7.84 (s, 1 H, H-C(8)); 8.31 (s, 1 H, H-C(2)).

5'-(1,3-Dihydro-1,3-dioxo-2H-isoindol-2-yl)-2',3'-(1-methylethyliden)-5'-deoxyadenosin (43) [153]

N

NN

N

NH2

O

O O

N

43

1'3

1

2'3'

45'

4'

2

578

9

6O

O

2',3'-O-Isopropylidenadenosin 42 (14.453 g, 47.031 mmol, 1.02 Äquiv.), Phthalimid (7.073 g, 48.11 mmol, 1.04 Äquiv.), PPh3 (12.086 g, 46.079 mmol, 1 Äquiv.) und DEAD (7.4 ml, 8.2 g, 47 mmol, 1.02 Äquiv.) wurden gemäss AAV 4 (Aufarbeitungsmethode A) innerhalb von 5 h in THF (160 ml) umgesetzt.

Ausbeute: 14.453 g (70%). Farblose Kristalle. Fp. 145 °C (Lit. [153]: 198 °C). 1H-NMR (200 MHz, CDCl3): 1.38 (s, 3 H, CH3); 1.59 (s, 3 H, CH3); 3.92-4.12 (m, 2 H, H-C(5')); 4.51-4.59 (m, 1 H, H-C(4')); 5.25 (dd, J = 6.2, 3.3, 1 H, H-C(3')); 5.55 (dd, J =6.2, 1.7, 1 H, H-C(2')); 5.66 (br, 2 H, NH2); 6.04 (d, J = 1.7, 1 H, H-C(1')); 7.68-7.84 (m, 4 H, arom. H (Phthalimid)); 7.87 (s, 1 H, H-C(8)); 8.08 (s, 1 H, H-C(2)).

Experimenteller Teil 140

5'-Amino-2',3'-(1-methylethyliden)-5'-deoxyadenosin (44) [153]

N

NN

N

NH2

O

O O

H2N

44

1'3

1

2'3'

45'

4'

2

578

9

6

Phthalimid 43 (2.432 g, 5.573 mmol, 1 Äquiv.) wurde in einem Gemisch von Hydrazin-Monohydrat (4.3 ml, 4.4 g, 89 mmol, 16 Äquiv.) und EtOH (180 ml) suspendiert und 16 h unter Rückfluss erhitzt. Nach Abkühlen wurde das Reaktionsgemisch filtriert und der Rückstand mit EtOH gewaschen. Flüchtige Bestandteile des Filtrats wurden am HV in eine Kühlfalle destilliert. Der farblose Rückstand wurde in Wasser (26 ml) gelöst und mit Essigsäure angesäuert (pH 4), wobei ein Niederschlag ausfiel, welcher abfiltriert wurde. Das Filtrat wurde mit 4 N NaOH alkalisch eingestellt (pH 10) und mit CHCl3extrahiert (4 x 45 ml). Die organische Phase wurde über MgSO4 getrocknet und eingeengt.

Ausbeute: 1.234 g (72%). Bräunlicher Feststoff. Fp. 203 °C (Lit. [153]: 203 °C). 1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 1.39 (s, 3 H, CH3); 1.61 (s, 3 H, CH3); 2.92-3.07 (m, 2 H, H-C(5')); 4.22-4.27 (m, 1 H, H-C(4')); 5.02 (dd, J = 6.5, 3.7, 1 H, H-C(3')); 5.47 (dd, J =6.5, 3.0, 1 H, H-C(2')); 5.76 (br, 2 H, NH2); 6.03 (d, J = 3.0, 1 H, H-C(1')); 7.92 (s, 1 H, H-C(8)); 8.34 (s, 1 H, H-C(2)).

5'-Amino-5'-deoxyadenosin (37) [154]

N

NN

N

NH2

O

HO OH

H2N

37

1'3

1

2'3'

45'

4'

2

578

9

6

Experimenteller Teil 141

Zu 44 (463 mg, 1.06 mmol) wurden bei 0 °C Wasser (4 ml) und Trifluoressigsäure (10 ml) gegeben. Die farblose Lösung wurde 3 h bei 0 °C gerührt und dann eingeengt. Zum Rückstand wurde EtOH (10 ml) gegeben und die entstandene Lösung erneut eingeengt. Der farblose Rückstand wurde in Wasser (50 ml) gelöst und mit CHCl3 (2 x 50 ml) gewaschen. Die wässrige Phase wurde auf eine Säule (2.5 x 24 cm) mit Dowex 1x8 Anionentaustauscher (Hydroxidform) aufgetragen und mit Wasser (100 ml) gewaschen. Das gereinigte Amin wurde mit MeOH eluiert.

Ausbeute: 274 mg (97%). Farblose Kristalle. Fp. 190 °C (MeOH/Et2O, Lit. [154]: 186 °C). 1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 2.90-3.01 (m, 2 H, H-C(5')); 4.13-4.18 (m, 1 H, H-C(4')); 4.31 (t, J = 4.8, 1 H, H-C(3')); 4.75-4.78 (m, 1 H, H-C(2')); 6.02 (d, J = 5.9, 1 H; H-C(1')); 8.17 (s, 1 H, H-C(8)); 8.26 (s, 1 H, H-C(2)).

N1-[(2R,3S,4R,5R)-5-(6-Amino-9H-purin-9-yl)-3,4-dihydroxytetrahydrofuran-2-yl]methyl-2,3-dihydroxy-5-nitrobenzen-1-carboxamid (32)

N

NN

N

NH2

O

HO OH

HN

32

OOHHO

O2N 1'3

1

2'3'

45'

4'

2

578

9

6

Das Amin 37 (89 mg, 0.34 mmol, 1 Äquiv.) wurde mit Hydroxysuccinimidester 41 (110 mg, 0.372 mmol, 1.1 Äquiv.) und Et3N (0.1 ml, 1 mmol, 3 Äquiv.) in DMF (5 ml) gemäss AAV 1 innerhalb von 15 h umgesetzt.

Ausbeute: 130 mg (86%). Orangefarbener Feststoff. Fp. 198 °C (MeOH/Et2O). HPLC: tR = 7.02 min. [ ]D20 = -27 (c = 0.33, Me2SO). IR (KBr): 3363s; 3204s;1647s; 1506s; 1473s; 1333s; 1175m; 1129m; 1072m; 855w; 825w; 769w; 743w; 649w.1H-NMR (300 MHz, (CD3)2SO, 1 Tropfen TFA-d): 3.62-3.75 (m, 2 H, H-C(5')); 4.15 (dd, J = 10.3, 5.3, 1 H, H-C(4')); 4.24 (t, J = 5.3, 1 H, H-C(3')); 4.67 (t, J = 5.3, 1 H, H-C(2')); 5.97 (d, J = 5.3, 1 H, H-C(1')); 7.72 (d, J = 2.5, 1 H, arom. H(Cat.)); 8.38 (d, J = 2.5, 1 H, arom. H(Cat.)); 8.43 (s, 1 H, H-C(8)); 8.73 (s, 1 H, H-C(2)); 9.31 (t, J = 5.0, 1 H, CONH). 13C-NMR (75 MHz, (CD3)2SO): 41.7; 71.6; 73.2; 82.9; 88.2; 111.3; 115.1;

Experimenteller Teil 142

115.7; 119.6; 137.7; 140.4; 147.3; 149.6; 152.2; 155.9; 157.3; 168.1. HR-MALDI-MS: Ber. für C17H18N7O8+ (MH+): 448.1217; Gef. 448.1208.

2-[(3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-Amino-9H-purin-9-yl)-2,2-dimethylperhydrofuro[3,4-d][1,3]dioxol-4-yl]ethannitril (46) [156]

N

NN

N

NH2

O

O O

NC

46

1'3

1

2'3'

45'

4'

2

578

9

6

Zu einer gut gerührten Suspension von 42 (758 mg, 2.47 mmol, 1 Äquiv.) und PPh3

(1.617 g, 6.166 mmol, 2.5 Äquiv.) in THF (12.4 ml) wurde Acetoncyanhydrin (0.57 ml, 6.2 mmol, 2.5 Äquiv.) zugegeben. Innerhalb von 5 min wurde bei 0 °C DEAD (0.98 ml, 97%, 6.1 mmol, 2.5 Äquiv.) zugetropft. Das Reaktionsgemisch wurde 50 min bei 0 °C und weitere 16 h bei 20 °C gerührt. Das Lösungsmittel wurde entfernt und der Rückstand chromatographisch gereinigt (SiO2, AcOEt/MeOH 96:4).

Ausbeute: 698 mg (89%). Braunes Öl. 1H-NMR (200 MHz, CDCl3): 1.42 (s, 3 H, CH3); 1.64 (s, 3 H, CH3); 2.84-3.08 (m, 2 H, H-C(5')); 4.51-4.60 (m, 1 H, H-C(4')); 5.16 (dd, J = 6.2, 3.3, 1 H, H-C(3')); 5.50 (dd, J = 6.2, 2.1, 1 H, H-C(2')); 5.71 (br, 2 H, NH2);6.12 (d, J = 2.1, 1 H, H-C(1')); 7.93 (s, 1 H, H-C(8)); 8.38 (s, 1 H, H-C(2)).

Experimenteller Teil 143

(2R,3S,4R,5R)-2-(2-Aminoethyl)-5-(6-amino-9H-purin-9-yl)tetrahydrofuran-3,4-diol (45) [263]

N

NN

N

NH2

O

HO OH

45

1'3

1

2'3'

45'

4'

2

578

9

6

H2N

6'

Zu einer 0.1 M Lösung von 46 in THF (11 ml, 1.1 mmol) wurde Essigsäure (20 ml) und PtO2 (200 mg) zugegeben. Die farblose Suspension wurde 19 h hydriert (4 bar H2).Der Katalysator wurde abfiltriert und das Filtrat eingeengt. Wasser (4 ml) und TFA (10 ml) wurden zugegeben. Die farblose Lösung wurde 2 h bei 20 °C gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Wasser (300 ml) verdünnt und mit CHCl3 extrahiert (3 x 100 ml). Die wässrige Phase wurde eingeengt. Der Rückstand wie in AAV 6beschrieben durch Ionenaustausch-Chromatographie gereinigt.

Ausbeute: 227 mg (74%). Brauner Feststoff. Fp. 178-180 °C (Zers.) (Lit. [263]: 205-209 °C (Zers.)). 1H-NMR (300 MHz, CD3OD, 1 Tropfen TFA-d): 2.14-2.18 (m, 2 H, H-C(5')); 3.10 (t, J = 6.9, 2 H, H-C(6')); 4.10-4.14 (m, 1 H, H-C(4')); 4.27 (t, J = 4.5, 1 H, H-C(3')); 4.67 (t, J = 4.5, 1 H, H-C(2')); 6.04 (d, J = 4.1, 1 H, H-C(1')); 8.40 (s, 1 H, H-C(8)); 8.44 (s, 1 H, H-C(2)).

N1-2-[(2R,3S,4R,5R)-5-(6-Amino-9H-purin-9-yl)-3,4-dihydroxytetrahydrofuran-2-yl]ethyl-2,3-dihydroxy-5-nitrobenzen-1-carboxamid (33)

N

NN

N

NH2

O

HO OH

33

1'3

1

2'3'

45'

4'

2

578

9

6

NH

6'O

OH

OH

O2N

Experimenteller Teil 144

Das Amin 45 (100 mg, 0.357 mmol, 1 Äquiv.) wurde mit N-Hydroxysuccinimidester 41(116 mg, 0.392 mmol, 1.1 Äquiv.) und Et3N (0.15 ml, 1.1 mmol, 3 Äquiv.) in DMF (5 ml) innerhalb von 14 h gemäss AAV 1 umgesetzt.

Ausbeute: 161 mg (98%). Orangefarbener Feststoff. Fp. 150 °C (Zers.) (Et2O/MeOH). HPLC: tR = 7.89 min. [ ]D20 = -11 (c = 0.5, (CH3)2SO). IR (KBr): 3332s; 1696s;1560w; 1516m; 1475w; 1420w; 1333s; 1201s; 1135m; 893w; 838w; 800w; 744w; 723m.1H-NMR (300 MHz, (CD3)2SO, 1 Tropfen TFA-d): 1.97-2.10 (m, 2 H, H-C(5')); 3.36-3.48 (m, 2 H, H-C(6')); 4.03-4.10 (m, 2 H, H-C(3') und H-C(4')); 4.61 (t, J = 4.7, 1 H, H-C(2')); 5.97 (d, J = 4.7, 1 H, H-C(1')); 7.69 (d, J = 2.5, 1 H, arom. H(Cat.)); 8.33 (d, J = 2.5, 1 H, arom. H(Cat.)); 8.45 (s, 1 H, H-C(8)); 8.65 (s, 1 H, H-C(2)). 13C-NMR (75 MHz, (CD3)2SO): 32.4; 36.3; 73.2; 73.3; 81.9; 87.9; 111.9; 114.1; 114.2; 118.9; 138.2; 141.6; 146.8; 147.6; 148.5; 152.2; 156.1; 168.0. HR-MALDI-MS: Ber. für C18H20N7O8+ (MH+): 462.1373; Gef. 462.1364.

1-Hydroxy-(1H)-benzo-1,2-iodoxol-3-on-1-oxid (IBX) (50) [157]

IO

O

O

OH

50

Eine Suspension von 2-Iodbenzoesäure (49.6 g, 200 mmol, 1 Äquiv.) in 0.73 M H2SO4

(420 ml) wurde intensiv gerührt und auf 55 °C erhitzt. Kaliumbromat (44.4 g, 266 mmol, 1.33 Äquiv.) wurde über 1 h in kleinen Portionen zugegeben. Das gebildete Brom wurde durch eine Natriumthiosulfatlösung geleitet. Das Reaktionsgemisch wurde während 3 h 45 min bei 65 °C gerührt und weiter bei 20 °C während 14 h gerührt. Das Gemisch wurde filtriert. Der Rückstand wurde mit H2O (500 ml), mit kaltem EtOH (2 x 30 ml) und mit Et2O (3 x 30 ml) gewaschen und im Hochvakuum getrocknet.

Ausbeute: 50.96 g (92%). Orangefarbener Feststoff. Fp. nicht bestimmbar, da die Substanz beim Erhitzen über 230 °C explodiert [157]. 1H-NMR (300 MHz, (CD3)2SO): 3.52 (br. s, 1 H, OH); 7.65-8.21 (m, 4 H, arom.).

Experimenteller Teil 145

[(Ethoxycarbonyl)methyl]-(triphenyl)phosphoniumbromid (54) [159]

54

Ph3PO

OBr

Zu einer Lösung von Triphenylphosphin (126 g, 479 mmol, 1.05 Äquiv.) in Toluol (580 ml) wurde innerhalb von 30 min. Bromessigsäureethylester (50 ml, 450 mmol, 1 Äquiv.) zugetropft, wobei das Reaktionsgemisch sich erwärmte und ein farbloser Niederschlag ausfiel. Nach 1 h wurden die Kristalle abfiltriert, mit Toluol gewaschen und getrocknet.

Ausbeute: 172 g (90%). Farblose Kristalle. Fp. 156 °C (Lit. [159]: 158 °C). 1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 1.02 (t, J = 7.2, 3 H, OCH2CH3); 4.00 (q, J = 7.2, 2 H, OCH2CH3); 5.49 (d, J = 13.7, 2 H, CH2P); 7.61-7.91 (m, 15 H, arom.).

[(Ethoxycarbonyl)methyl]-(triphenyl)phosphoran (52) [160]

O

OPPh3

52

Phosphoniumsalz 54 (89.3 g, 208 mmol) wurde in H2O gelöst. Zu dieser farblosen Lösung wurden unter Eisbadkühlung 2 N NaOH (105 ml) zugegeben, wobei ein Niederschlag ausfiel. Die Suspension wurde filtriert. Der Rückstand wurde mit H2Ogewaschen (3 x 50 ml) und im Hochvakuum getrocknet.

Ausbeute: 51.9 g (72%). Farbloser Feststoff. Fp. 122-123 °C (Lit. [160]: 126-127 °C). 1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 1.2 (br. s, 3 H, OCH2CH3); 2.9 (br. s, 1 H, H-CPPh3); 3.98 (br. s, 2 H, OCH2CH3); 7.40-7.74 (m, 15 H, 3 x Ph).

Experimenteller Teil 146

Ethyl-(E)-3-[(3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-amino-9H-purin-9-yl)-2,2-dimethylperhydrofuro[3,4-d][1,3]dioxol-4-yl]prop-2-enoat (49) [161]

N

NN

N

NH2

O

O O

49

1'3

1

2'3'

45'

4'

2

578

9

6

OO

6'

Alkohol 42 (12.3 g, 40 mmol, 1 Äquiv.), Ph3P=CHCO2Et (42.8 g, 100 mmol, 2.5 Äquiv.) und o-Iodoxybenzoesäure (IBX) (27.8 g, 100 mmol, 2.5 Äquiv.) in (CH3)2SO (100 ml) wurden gemäss AAV 2 innerhalb von 72 h umgesetzt. Das Produkt wurde chromatographisch gereinigt (SiO2, AcOEt/MeOH 96:4).

Ausbeute: 10.5 g (70%). Farblose Kristalle. Fp 102 °C (EtOH, Lit. [161]: 104-106 °C). 1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 1.22 (t, J = 7.2, 3 H, CH2CH3); 1.40 (s, 3 H, CH3); 1.63 (s, 3 H, CH3); 4.11 (q, J = 7.2, 2 H, CH2CH3); 4.79-4.83 (m, 1 H, H-C(4')); 5.14 (dd; J= 6.2, 3.4, 1 H, H-C(3')); 5.56 (dd, J = 6.2, 1.9, 1 H, H-C(2')); 5.81 (dd, J = 15.9, 1.7, 1 H, H-C(6')); 6.13 (d, J = 1.9, 1 H, H-C(1')); 6.96 (dd, J = 15.9, 5.6, 1 H, H-C(5')); 7.87 (s, 1 H, H-C(8)); 8.33 (s, 1 H, H-C(2)).

(E)-3-[(3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-Amino-9H-purin-9-yl)-2,2-dimethylperhydrofuro[3,4-d][1,3]dioxol-4-yl]prop-2-en-1-ol (56)

N

NN

N

NH2

O

O O

56

1'3

1

2'3'

45'

4'

2

578

9

6

HO

6'

7'

Experimenteller Teil 147

Der Ester 49 (375 mg, 1 mmol, 1 Äquiv.) in CH2Cl2 (3 ml) wurde gemäss AAV 3 mit einer 1 M Lösung von DIBAL-H in Hexan (8 ml, 8 mmol, 8 Äquiv.) während 2 h reduziert.

Ausbeute: 328 mg (98%). Farbloser Schaum. [ ]D20 = +17.8 (c = 1, CHCl3). IR (KBr): 3339s; 2982m; 2932m; 1646s; 1595m; 1472w; 1370w; 1210m; 1080m. 1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 1.40 (s, 3 H, CH3); 1.63 (s, 3 H, CH3); 4.07 (s, 2 H, H-C(7')); 4.72 (dd, J = 4.1, 2.5, 1 H, H-C(4')); 5.02 (dd, J = 6.2, 4.1, 1 H, H-C(3')); 5.54 (dd, J = 6.2, 2.2, 1 H, H-C(2')); 5.56 (s, 2 H, NH2); 5.85-5.87 (m, 2 H, H-C(5') und H-C(6')); 6.10 (d,J = 2.2, 1 H, H-C(1')); 7.88 (s, 1 H, H-C(8)); 8.37 (s, 1 H, H-C(2)). 13C-NMR (75 MHz, CDCl3): 25.3; 27.0; 61.7; 84.3; 84.6; 87.8; 90.7; 114.3; 119.8; 126.9; 134.4; 139.9; 149.2; 153.1; 155.6. HR-MALDI-MS: Ber. für C15H20N5O4+ (MH+): 334.1515; Gef. 334.1505.

2-(E)-3-[(3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-Amino-9H-purin-9-yl)-2,2-dimethylperhydrofuro[3,4-d][1,3]dioxol-4-yl]prop-2-enyl-2,3-dihydro-1H-isoindol-1,3-dion (55)

N

NN

N

NH2

O

O O

55

1'3

1

2'3'

45'

4'

2

578

9

6

N

6'

7'

O

O

Der Allylalkohol 56 (490 mg, 1.46 mmol, 1 Äquiv.) wurde gemäss AAV 4(Aufarbeitungsmethode A) mit Phthalimid (215 mg, 1.46 mmol, 1 Äquiv.), Ph3P (383 mg, 1.46 mmol, 1 Äquiv.) und DEAD (0.23 ml, 97%, 1.5 mmol, 1.02 Äquiv.) in THF (7 ml) innerhalb von 2.5 h umgesetzt.

Ausbeute: 461 mg (68%). Farblose Kristalle. Fp 215 °C (MeOH). [ ]D20 = +9.0 (c = 1, CHCl3). IR (KBr): 3304m; 3155m; 1712s; 1676s; 1603m; 1430m; 1401m; 1335m;1299m; 1207s; 1079s. 1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 1.36 (s, 3 H, CH3); 1.59 (s, 3 H, CH3); 4.19 (d, J = 5.3, 2 H, H-C(7')); 4.69 (dd, J = 6.5, 3.1, 1 H, H-C(4')); 4.98 (dd, J = 6.2, 3.1, 1 H, H-C(3')); 5.49 (dd, J = 6.2, 2.0, 1 H, H-C(2')); 5.59 (br, 2 H, NH2); 5.73 (dt, J = 15.6, 5.3, 1 H, H-C(6')); 5.84 (dd, J = 15.6, 6.5, 1 H, H-C(5')); 6.07 (d, J = 2.0, 1

Experimenteller Teil 148

H, H-C(1')); 7.71-7.76 (m, 2 H, arom. H(Phthalimid)); 7.80-7.86 (m, 3 H, arom. H(Phthalimid) und H-C(8)); 8.24 (s, 1 H, H-C(2)). 13C-NMR (75 MHz, CDCl3): 25.3; 27.1; 38.7; 84.2; 84.6; 87.2; 90.6; 114.4; 120.2; 123.4; 127.4; 130.4; 132.0; 134.0; 139.8; 149.4; 153.2; 155.6; 167.7. HR-MALDI-MS: Ber. für C23H23N6O5+ (MH+):463.1730; Gef. 463.1724.

9-(3aR,4R,6R,6aR)-6-[(E)-3-Aminoprop-1-enyl]-2,2-dimethylperhydrofuro[3,4-d][1,3]dioxol-4-yl-9H-purin-6-amin (57)

N

NN

N

NH2

O

O O

57

1'3

1

2'3'

45'

4'

2

578

9

6

H2N

6'

7'

Phthalimid 55 (885 mg, 1.91 mmol) wurde entsprechend AAV 5 (Aufarbeitungsmethode A) mit 33% MeNH2 in EtOH (30 ml) innerhalb von 16 h gespaltet.

Ausbeute: 605 mg (95%). Farbloser Schaum. [ ]D20 = +30.8 (c = 1 in CHCl3). IR (KBr): 3686m; 3414m; 2999m; 1715m; 1631s; 1469w; 1376m; 1087s. 1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 1.39 (s, 3 H, CH3); 1.62 (s, 3 H, CH3); 3.22 (d, J = 5.1, 2 H, H-C(7')); 4.68 (dd, J = 7.3, 3.4, 1 H, H-C(4')); 4.99 (dd, J = 6.2, 3.4, 1 H, H-C(3')); 5.53 (dd, J = 6.2, 2.2, 1 H, H-C(2')); 5.71 (dd, J = 15.6, 7.3, 1 H, H-C(5')); 5.83 (dt, J = 15.6, 5.1, 1 H, dt, H-C(6')); 5.87 (br, 2 H, NH2); 6.08 (d, J = 2.2, 1 H, H-C(1')); 7.87 (s, 1 H, H-(C(8)); 8.35 (s, 1 H, H-C(2)). 13C-NMR 75 MHz, CDCl3): 25.4; 27.2; 43.3; 84.2; 84.6; 87.7; 90.4; 114.4; 120.2; 126.0; 136.3; 139.7; 149.3; 153.0; 155.4. HR-MALDI-MS: Ber. für C15H21N6O3+ (MH+): 333.1675; Gef. 333.1667.

Experimenteller Teil 149

(2R,3S,4R,5R)-2-[(E)-3-Aminoprop-1-enyl]-5-(6-amino-9H-purin-9-yl)tetrahydrofuran-3,4-diol (47)

N

NN

N

NH2

O

HO OH

47

1'3

1

2'3'

45'

4'

2

578

9

6

H2N

6'

7'

Nach AAV 6 wurde 57 (481 mg, 1.45 mmol) mit TFA/H2O (5:2, 14 ml) während 1 h entschützt.

Ausbeute: 339 mg (80%). Farbloser Schaum. [ ]D20 = +65.0 (c = 1, MeOH). IR (KBr): 3286br s; 1704s; 1507m; 2429m; 1325w; 1209s; 1142s; 1052m; 975w; 838m;800m; 724s. 1H-NMR (300 MHz, D2O, 1 Tropfen TFA-d): 3.55 (d, J = 6.2, 2 H, H-C(7')); 4.28 (dd, J = 5.9, 5.0, 1 H, H-C(4')); 4.51 (t, J = 5.0, 1 H, H-C(3')); 4.68 (dd, J = 5.0, 4.1, 1 H, H-C(2')); 5.81-6.01 (m, 2 H, H-C(5') und H-C(6')); 6.05 (d, J = 4.1, 1 H, H-C(1')); 8.32 (m, 1 H, H-C(8)); 8.33 (s, 1 H, H-C(2)). 13C-NMR (75 MHz, D2O):44.2; 76.2; 76.3; 87.0; 90.4; 121.4; 129.6; 137.5; 142.4; 151.3; 155.4; 158.1. HR-MALDI-MS: Ber. für C12H17N6O3+ (MH+): 293.1362; Gef. 293.1357.

N1-(E)-3-[(2R,3S,4R,5R)-5-(6-Amino-9H-purin-9-yl)-3,4-dihydroxytetrahydrofuran-2-yl]prop-2-enyl-2,3-dihydroxy-5-nitrobenzen-1-carboxamid (31)

N

NN

N

NH2

O

HO OH31

1'3

1

2'3'

45'

4'

2

578

9

6

HN

6'

7'

OOHHO

O2N

Experimenteller Teil 150

Das Amin 47 (29 mg, 0.1 mmol, 1 Äquiv.) wurde mit N-Hydroxysuccinimidester 41 (30 mg, 0.1 mmol, 1 Äquiv.) und Et3N (0.04 ml, 0.3 mmol, 3 Äquiv.) in DMF (1 ml) innerhalb von 18 h gemäss AAV 1 umgesetzt.

Ausbeute: 39 mg (82%). Orangefarbener Feststoff. Fp. 173 °C (2-Propanol). HPLC: tR = 9.31 min. [ ]D20 = -9 (c = 0.5, Me2SO). IR (KBr): 3378br s; 3115m; 1700s;1642s; 1514m; 1473s; 1427m; 1351s; 1203s; 1131s; 1049m; 972w. 1H-NMR (300 MHz, (CD3)2SO): 3.92-4.03 (m, 2 H, H-C(7')); 4.08-4.16 (m, 1 H, H-C(4')); 4.35 (t, J = 5.3, 1 H, H-C(3')); 4.64-4.74 (m, 1 H, H-C(2')); 5.23 (br, 1 H, OH); 5.52 (br, 1 H, OH); 5.79-5.96 (m, 3 H, H-C(1'), H-C(5') und H-C(6')); 7.34 (br, 2 H, NH2); 7.65 (d, J = 2.5, 1 H, arom. H(Cat.)); 8.07 (s, 1 H, H-C(8)); 8.32 (s, 1 H, H-C(2)); 8.48 (d, J = 2.5, 1 H, arom. H(Cat.)); 9.64 (br, 1 H, NHCO). 13C-NMR (125 MHz, (CD3)2SO): 40.3; 72.8; 74.0; 84.0; 87.6; 111.0; 114.2; 115.3; 119.2; 129.0; 129.6; 137.2; 140.0; 147.2; 149.3; 152.3; 155.9; 157.7; 167.7. HR-ESI-MS: Ber. für C19H20N7O8+ (MH+): 474.1373; Gef. 474.1358.

(2R,3S,4R,5R)-2-(3-Aminopropyl)-5-(6-amino-9H-purin-9-yl)tetrahydrofuran-3,4-diol (48)

N

NN

N

NH2

O

HO OH

48

1'3

1

2'3'

45'

4'

2

578

9

6

H2N

6'

7'

Zu einer Lösung von Allylamin 57 (125 mg, 0.376 mmol) in EtOH (10 ml) wurde 10% Pd/C (100 mg) gegeben und 18 h hydriert (4 bar H2). Der Katalysator wurde abfiltriert und das Filtrat eingeengt. Der Rückstand wurde gemäss AAV 6 mit TFA/H2O (5:2, 30 ml) in 1 h umgesetzt.

Ausbeute: 94 mg (84%). Gelber Schaum. [ ]D20 = -11.3 (c = 1, MeOH). IR (KBr): 3105br s; 1695s; 1506m; 1431s; 1322m; 1206s; 1128s; 1061m; 839m; 800m; 717m. 1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 1.75-1.87 (m, 4 H, H-C(5') und H-C(6')); 2.97 (t, J = 7.5, 2 H, H-C(7')); 4.00-4.05 (m, 1 H, H-C(4')); 4.21 (t, J = 5.0, 1 H, H-C(3')); 4.78 (t, J = 5.0, 1 H, H-C(2')); 5.97 (d, J = 5.0, 1 H, H-C(1')); 8.19 (s, 1 H, H-C(8)); 8.24 (s, 1 H, H-

Experimenteller Teil 151

C(2)). 13C-NMR (75 MHz, CD3OD): 25.2; 31.1; 40.4; 74.6; 74.8; 84.9; 90.2; 120.5; 141.4; 150.4; 153.7; 157.1. HR-MALDI-MS: Ber. für C12H19N6O3+ (MH+): 295.1519; Gef. 295.1508.

N1-3-[(2R,3S,4R,5R)-5-(6-Amino-9H-purin-9-yl)-3,4-dihydroxytetrahydrofuran-2-yl]propyl-2,3-dihydroxy-5-nitrobenzen-1-carboxamid (34)

N

NN

N

NH2

O

HO OH

34

1'3

1

2'3'

45'

4'

2

578

9

6

HN

6'

7'

OOHHO

O2N

Das Amin 48 (10 mg, 0.038 mmol, 1 Äquiv.) wurde mit N-Hydroxysuccinimidester 41(11 mg, 0.038 mmol, 1 Äquiv.) und Et3N (0.02 ml, 0.1 mmol, 3 Äquiv.) gemäss AAV 1während 17 h umgesetzt.

Ausbeute: 16 mg (89%). Gelber Schaum. HPLC: tR = 9.20 min. [ ]D20 = -55 (c = 1.0, THF). IR (KBr): 3340br s; 1706s; 1646s; 1475s; 1263s; 1077m; 796w. 1H-NMR (300 MHz, (CD3)2SO, 1 Tropfen TFA-d): 1.60-1.73 (m, 4 H, H-C(5') und H-C(6')); 3.30-3.40 (m, 2 H, H-C(7')); 3.91-3.95 (m, 1 H, H-C(4')); 4.04 (t, J = 5.0, 1 H, H-C(3')); 4.58 (t, J = 5.0, 1 H, H-C(2')); 5.94 (d, J = 5.0, 1 H, H-C(1')); 7.71 (d, J = 2.5, 1 H, arom. H(Cat.)); 8.42 (d, J = 2.5, 1 H, arom. H(Cat.)); 8.49 (s, 1 H, H-C(8)); 8.69 (s, 1 H, H-C(2)); 9.21 (br, 1 H, CONH).

13C-NMR (75 MHz, (CD3)2SO, 1 Tropfen TFA-d): 25.0, 30.3, 73.0, 73.4, 83.9, 87.8, 111.8, 113.9, 114.0, 118.6, 138.2, 142.4, 144.5, 146.5, 148.0, 149.7, 155.8, 167.8.* HR-MALDI-MS: Ber. für C19H21N7O8+ ([M+Na]+): 498.1349; Gef. 498.1345.

* Ein Signal fehlt aufgrund von Signalüberlappung

Experimenteller Teil 152

4-[(3aR,4R,6R,6aR)-6-(6-Amino-9H-purin-9-yl)-2,2-dimethylperhydrofuro[3,4-d][1,3]dioxol-4-yl]butannitril (59)

N

NN

N

NH2

O

O O

59

1'3

1

2'3'

45'

4'

2

578

9

6

NC

6'

7'

Eine Lösung von Allylalkohol 56 (267 mg, 0.8 mmol, 1 Äquiv.) in EtOH (20 ml) wurde in Gegenwart von 10% Pd/C (100 mg) 3 h hydriert (6 bar H2). Der Katalysator wurde abfiltriert und das Filtrat eingeengt. Der Rückstand wurde in THF (5 ml) gelöst. PPh3

(0.51 g, 2.0 mmol, 2.5 Äquiv.) und Acetoncyanhydrin (0.18 ml, 2.0 mmol, 2.5 Äquiv.) wurden zugegeben. Innerhalb von 5 min wurde DEAD (0.3 ml, 97%, 1.9 mmol, 2.4 Äquiv.) bei 0 °C zugetropft. Die Lösung wurde 70 h bei 20 °C gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde eingeengt und der ölige Rückstand chromatographisch gereinigt (SiO2, CHCl3/MeOH 96:4).

Ausbeute: 131 mg (49%). Farbloses Öl. [ ]D20 = -2.5 (c = 1, CHCl3). IR (CHCl3):3412m; 1716m; 1632s; 1588m; 1473m; 1376m; 1156m; 1094s. 1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 1.34 (s, 3 H, CH3); 1.56 (s, 3 H, CH3); 1.63-1.88 (m, 4 H, H-C(5') und H-C(6')); 2.24-2.30 (m, 2 H, H-C(7')); 4.07-4.14 (m, 1 H, H-C(4')); 4.85 (dd, J = 6.5, 4.0, 1 H, H-C(3')); 5.44 (dd, J = 6.5, 2.3, 1 H, H-C(2')); 5.99 (d, J = 2.3, 1 H, H-C(1')); 6.49 (br, 2 H, NH2); 7.84 (s, 1 H, H-C(8)); 8.28 (s, 1 H, H-C(2)). 13C-NMR (75 MHz, CDCl3): 17.0; 21.9; 25.4; 27.2; 32.1; 83.8; 84.0; 85.9; 90.0; 114.6; 119.1; 120.1; 139.6; 149.0; 153.0; 155.8. HR-MALDI-MS: Ber. für C16H21N6O3+ (MH+): 345.1675; Gef. 345.1673.

Experimenteller Teil 153

N1-4-[(2R,3S,4R,5R)-5-(6-Amino-9H-purin-9-yl)-3,4-dihydroxytetrahydrofuran-2-yl]butyl-2,3-dihydroxy-5-nitrobenzen-1-carboxamid (35)

N

NN

N

NH2

O

HO OH35

1'3

1

2'3'

45'

4'

2

578

9

6

6'

7'NH

8'O

OH

OH

O2N

Zu einer Lösung von Nitril 59 (122 mg, 0.8 mmol, 1 Äquiv.) in Essigsäure (20 ml) wurde PtO2 (100 mg) zugegeben. Die Suspension wurde 19 h hydriert (4 bar H2). Der Katalysator wurde abfiltriert und das Filtrat eingeengt. Wasser (2 ml) und TFA (5 ml) wurden zugegeben. Die farblose Lösung wurde 2 h bei 20 °C gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Wasser (50 ml) verdünnt und mit CHCl3 extrahiert (3 x 50 ml). Die wässrige Phase wurde lyophilisiert. Der Rückstand wurde in DMF (10 ml) gelöst und gemäss AAA 1 mit 41 (243 mg, 0.82 mmol, 1.02 Äquiv.) und Et3N (0.3 ml, 2.4 mmol, 3 Äquiv.) umgesetzt.

Ausbeute: 69 mg (18%). Orangefarbener Schaum. HPLC: tR = 9.72 min. [ ]Hg57820 = +1.0 (c = 0.8, MeOH). IR (KBr): 3384br s; 2941m; 1700s; 1507m; 1473m; 1340s;1202s; 1136m; 799w 723m. 1H-NMR (300 MHz, CD3OD): 1.53-1.87 (m, 6 H, H-C(5'), H-C(6'), H-C(7')); 3.41 (t, J = 6.2, 2 H, H-C(8')); 4.01-4.07 (m, 1 H, H-C(4')); 4.14 (t, J= 5.0, 1 H, H-C(3')); 4.69 (t, J = 5.0, 1 H, H-C(2')); 5.99 (d, J = 5.0, 1 H, H-C(1')); 7.72 (d, J = 2.5, 1 H, arom. H(Cat.)); 8.27 (d, J = 2.5, 1 H, arom. H(Cat.)); 8.33 (s, 1 H, H-C(8)); 8.38 (s, 1 H, H-C(2)). 13C-NMR (75 MHz, CD3OD): 24.2; 30.0; 34.1; 40.5; 75.1; 75.4; 86.0; 90.5; 113.3; 115.5; 116.1; 120.7; 140.7; 143.6; 147.3; 148.2; 150.2; 153.2; 156.5; 169.8. HR-MALDI-MS: Ber. für C20H24N7O8+ (MH+): 490.1686; Gef. 490.1680.

Experimenteller Teil 154

2-(2,5-Dioxotetrahydro-1H-pyrrol-1-yl)essigsäure (67) [167]

N

67

O

O

HOO

Glycin (9.96 g, 129.2 mmol, 1 Äquiv.) und Bernsteinsäureanhydrid (13.46 g, 134.5 mmol, 1 Äquiv.) wurden zusammen fein gemörsert. Während einer halben Stunde wurde vorsichtig auf 100 C geheizt. Um Sublimation des Bernsteinsäureanhydrids zu vermeiden, wurde weiter auf 120 C erhitzt, diese Temperatur etwa 10 min lang gehalten und erst danach die Temperatur auf 150 C erhöht. Nachdem alles Bernsteinsäureanhydrid als Schmelze vorlag, wurde das Reaktionsgefäss auf 0.5 Torr evakuiert, wobei sich das Reaktionsgemisch gelb färbte. Unter Rühren wurde nun vorsichtig auf 160 C geheizt. Nach 2 h 30 min wurde das Gemisch auf 20 °C abgekühlt. Es wurde mit gesättigter NaHCO3-Lösung (80 ml) versetzt und mit AcOEt (50 ml) extrahiert. Die organische Phase wurde mit gesättigter NaHCO3-Lösung (3 x 50 ml) ausgeschüttelt. Die vereinigten wässrigen Phasen wurden mit 10%iger Salzsäure angesäuert und AcOEt (3 x 250 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit MgSO4 getrocknet und eingeengt. Beim Trocknen am HV kristallisierte das Produkt aus.

Ausbeute: 7.30 g (41%). Farblose Kristalle. Fp. 107-111 C (AcOEt, Lit. [167]: 117-120 °C). 1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 2.81 (s, 2 H, CH2COOH); 4.30 (s, 4 H, COCH2CH2CO).

2,3-(Dimethoxyphenyl)-trimethylsilan (69) [171]

OCH3

H3CO Si(CH3)3

69

Kalium-tert-Butanolat (4.90 g, 40.1 mmol, 2 Äquiv.) wurde in THF (80 ml) suspendiert. Veratrol (2.6 ml) wurde unter Rühren zugegeben. Die Mischung wurde auf -78 Cabgekühlt und mit n-Butyllithium (25 ml, 1.6 M Lösung in Hexan) versetzt. Zum

Experimenteller Teil 155

Reaktionsgemisch wurden nach 15 min Trimethylchlorsilan (15 ml, 13.04 g, 120 mmol, 6 Äquiv.) in THF (40 ml) zugetropft. Die Lösung färbte sich gelb. Nachdem 10 min gerührt worden war, wurde 1 M NH4Cl-Lösung (45 ml) zugegeben. Die Phasen wurden getrennt und die Wasserphase wurde mit Ether (2 x 50 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden eingeengt. Die ölige Rückstand wurde destilliert (0.1 Torr, 56-57 C).

Ausbeute: 3.09 g (72%). Farbloses Öl. 1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 0.29 (s, 9 H, Si(CH3)3); 3.89-3.84 (s, 6 H, OCH3); 6.94-7.26 (m, 3 H, arom.). 13C-NMR (75 MHz, CDCl3): -0.5; 55.5; 60.6; 113.9; 124.0; 126.3; 133.3; 151.9; 153.7.

(1-SR)-1-(2,3-Dimethoxyphenyl)ethan-1-ol ((±)-74) [172]

OCH3

H3CO

OH

(±)-74

Veratrol (5 ml, 5.43 g, 39 mmol, 1 Äquiv.) wurde in THF (40 ml) gelöst und auf -78 Cgekühlt. 1.6 M n-BuLi-Lösung in Hexan (26 ml, 41 mmol) wurde zugetropft. Das Reaktionsgemisch wurde 3 h bei 20 °C gerührt, wobei ein farbloser Niederschlag ausfiel. Die Suspension wurde auf -78 C gekühlt. Acetaldehyd (2.4 ml, 43 mmol) wurde durch eine auf 0 °C gekühlte Spritze zugetropft. das Reaktionsgemisch wurde 4 h bei 20 °C gerührt. Dabei färbte sich die Lösung tiefblau. Die Reaktion wurde durch Zugabe von Wasser (50 ml) gestoppt. Danach wurde Et2O (50 ml) zugegeben. Die organische Phase wurde mit gesättigter NaCl-Lösung (50 ml) gewaschen. Die vereinigten wässrigen Phasen wurden Ether (3 x 50 ml) extrahiert. Die organischen Phasen wurden vereinigt, mit MgSO4 getrocknet und eingeengt. Der ölige gelbe Rückstand wurde chromatographisch gereinigt (SiO2, Hexan/AcOEt 3:1).

Ausbeute: 4.35 g (61%). Farbloses Öl. 1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 1.51 (d, J = 6.3, 3 H, CHCH3); 2.25 (s, 1 H, OH); 4.10 (s, 3 H, OCH3); 4.13 (s, 3 H, OCH3); 5.15 (q, J=6.3, 1 H, CHCH3); 6.83-7.26 (m, 3 H, arom.).

Experimenteller Teil 156

1-(2,3-Dimethoxyphenyl)ethan-1-on (75) [172]

OCH3

H3CO

O

75

Eine Lösung von (±)-74 (3.5 g, 19 mmol) in Aceton (50 ml) wurde auf 5 C abgekühlt. Das Jones-Reagenz wurde hergestellt, indem CrO3 (2.7 g) in konz. H2SO4 (2.3 ml) gegeben wurde und mit Wasser auf 10 ml aufgefüllt wurde. Dieses wurde nun langsam zur Aceton-Lösung zugetropft. Dabei bildete sich ein dunkelgrüner Niederschlag. Es wurde stets darauf geachtet, dass die Temperatur des Reaktionsgemisches nicht über 10 C steigt. Es wurde soviel vom Jones-Reagenz zugegeben, bis die orange Farbe der

Lösung bestehen blieb (ca. 5 ml). Das überschüssige CrO3 wurde durch Zugabe von Isopropanol (5 ml) vernichtet. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert und mit Ether (100 ml) gewaschen. Gesättigte Hydrogencarbonat-Lösung (100 ml) wurde zur organischen Phase gegeben, und es wurde 10 min gerührt. Nach der Trennung beider Phasen wurde die wässrige Phase mit Et2O (3 x 50 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Na2SO4 getrocknet, eingeengt und am HV getrocknet.

Ausbeute: 2.80 g (81%). Farbloses Öl. 1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 2.62 (s, 3 H, CH3); 3.86 (s, 3 H, OCH3); 3.90 (s, 3 H, OCH3); 7.02-7.26 (m, 3 H, arom.);

1-(2,3-Dimethoxy-5-nitrophenyl)ethan-1-on (72) und 1-(2,3-Dimethoxy-4-nitrophenyl)ethan-1-on (76) [173]

OCH3

H3CO

O

NO2

OCH3

H3CO

O

O2N

72 76

Eine Lösung von 75 (182 mg, 1 mmol, 1 Äquiv.) in CH2Cl2 (1.1 ml) wurde auf 0 Cgekühlt. Nitriersäure (konz. H2SO4/konz. HNO3 1.2:1, 0.2 ml, 1.4 Äquiv.) wurde innerhalb von 5 min langsam zugetropft. Ein orangefarbenes Öl entstand. Es wurde 2 h gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde in Eiswasser (1.7 ml) gegeben. Diese Mischung

Experimenteller Teil 157

wurde in gesättigte NaHCO3-Lösung (25 ml) gegeben und dann mit CH2Cl2 (3 x 25 ml) extrahiert. Die organische Phase wurde über Na2SO4 getrocknet und eingeengt. Das gelbe ölige Rückstand wurde chromatographisch gereinigt (SiO2, Hexan/AcOEt 3:1).

Ausbeute an 72: 112 mg (53%). Gelbe Kristalle. Fp: 78-80 C (Hexan/AcOEt 3:1). 1H-NMR (200 MHz, CDCl3): 2.65 (s, 3 H, COCH3); 4.00 (s, 3 H, OCH3); 4.05 (s, 3 H, OCH3); 7.89 (d, J = 2.5, 1 H, arom.); 8.17 (d, J = 2.5, 1 H, arom.).

Ausbeute an 76: 76 mg (47%). Gelbe Kristalle. 1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 2.58 (s,3 H, COCH3); 3.83 (s, 3 H, OCH3); 3.99 (s, 3 H, OCH3); 6.97 (d, J = 9.3, 1 H, arom.); 8.00 (d, J = 9.3, 1 H, arom.)

2-Brom-1-(2,3-dimethoxy-5-nitrophenyl)ethan-1-on (70)

OCH3

H3CO

O

NO2

70

Br

Eine Lösung von 72 (280 mg, 1.2 mmol, 1 Äquiv.) in Eisessig (7 ml) wurde auf 55 Cerhitzt. Pyridin-Hydrobromid-Perbromid (442 mg, 1.9 mmol, 1 Äquiv.) wurde in Portionen zugegeben, bis sich die orange-rote Lösung nicht mehr gelb verfärbte. Es wurde 15 min weitergerührt. Das Reaktionsgemisch wurde in Wasser (30 ml) gegossen und dann mit AcOEt extrahiert (2 x 40 ml). Die vereinigten organischen Phasen wurden mit Wasser (2 x 40 ml) und gesättigter NaCl-Lösung (40 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde über Na2SO4 getrocknet und eingeengt.

Ausbeute: 327 mg (90%). Gelbe Kristalle. Fp. 107-110 C. IR (KBr): 1694s; 1582m;1522s; 1480m; 1430m; 1340s; 1262s; 1199w; 1184w; 1097m; 1025m; 978m; 882m;799w: 767w; 740m; 716w. 1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 4.01 (s, 3 H, OCH3); 4.13 (s,3 H, OCH3); 4.52 (s, 2 H, CH2Br); 7.92 (d, J = 2.7, 1H, arom.); 8.22 (d, J = 2.7, 1H, arom.). 13C-NMR (75 MHz, CDCl3): 35.7; 56.7; 62.1; 110.8; 117.9; 129.4; 143.4; 152.7; 153.5; 191.4. EI-MS: 305.0 (5, MH+); 211.1 (10); 210.1 (100); 164.1 (18); 76.1 (4). EA für C10H10NO5Br (304.10): Ber. C 39.50, H 3.31, N 4.61; Gef. C 39.47, H 3.36, N 4.78.

Experimenteller Teil 158

1-[2-(2,3-Dimethoxy-5-nitrophenyl)-2-oxoethyl]pyrrolidin-2,5-dion (79)

OCH3

H3CO

O

NO2

N

79

O

O

Succinimid (113 mg, 1.14 mmol, 1.2 Äquiv.) und NaH (42 mg, 1.07 mmol, 60% in Öl, 1.1 Äquiv.) wurden mit trockenem DMF (10 ml) versetzt und bei 20 °C gerührt. Die Suspension wurde innerhalb von 10 min zu einer klaren Lösung. Es wurde 1 h weitergerührt. Dann wurde 70 (287 mg, 0.94 mmol, 1 Äquiv.) in DMF (6 ml) zugegeben, wobei sich die Lösung braun färbte. Nach 40 min wurde das DMF abdestilliert. Das zurückgebliebene braune Öl wurde in CH2Cl2 (40 ml) aufgenommen und Wasser (3 x 25 ml) gewaschen. Die gelbe wässrige Phase wurde mit CH2Cl2 (3 x 25 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Na2SO4 getrocknet, eingeengt und chromatographisch gereinigt (SiO2, Hexan/AcOEt 1:1).

Ausbeute: 124 mg (41%). Gelbe Kristalle. Fp. 121-127 °C (Hexan/AcOEt 1:1). IR (KBr): 1710s; 1582m; 1533m; 1482w; 1414m; 1346m; 1271m; 1168m; 1699w; 1027m;987m; 891m; 872w; 806w; 744w; 662w. 1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 2.85 (s, 4 H, COCH2CH2CO); 4.00 (s, 3 H, OCH3); 4.14 (s, 3 H, OCH3); 4.87 (s, 2 H, COCH2N);7.93 (d, J = 2.6, 1 H, arom.); 8.29 (d, J = 2.6, 1 H, arom.). 13C-NMR (75 MHz, CDCl3): 28.4; 48.4; 56.7; 61.9; 111.0; 117.8; 129.1; 143.5 153.1; 154.6; 176.7; 190.3. HR-MALDI-MS: Ber. für C14H14N2NaO7+ ([M+Na]+): 345.0699; Gef.: 345.0695. EA für C14H14N2O7 (322.27): Ber. C 52.18, H 4.38, N 8.69; Gef. C 52.18, H 4.51, N 8.56.

1-[2-(2,3-Dihydroxy-5-nitrophenyl)-2-oxoethyl]pyrrolidin-2,5-dion (62)

OH

HO

O

NO2

N

62

O

O

Experimenteller Teil 159

Pyridiniumhydrochlorid (4.51 g) wurde mit 79 (90 mg, 0.28 mmol) vermischt, geschmolzen, und 2 h bei 160 °C gerührt. Nach Abkühlen auf 20 °C wurde 1 M NaOH (50 ml) zugegeben. Die tiefrote wässrige Phase wurde mit Ether (30 ml) gewaschen, dann mit 1 M HCl (100 ml) angesäuert, wobei sich die Lösung gelb färbte. Die Wasserphase wurde mit AcOEt (3 x 25 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Na2SO4 getrocknet und eingeengt. Das Produkt wurde in AcOEt gelöst und mit Hexan ausgefällt.

Ausbeute: 70 mg (85%). Brauner Feststoff. Fp. 166-173 °C (Zers.) (AcOEt/Hexan). IR (KBr): 3368m; 3071s; 1709s; 1639s; 1583m; 1534s; 1409m; 1332m; 1267s; 1210m;1171m; 1096m; 1051w; 1003w; 966m; 930w; 896m; 766m; 743w; 711. 1H-NMR (300 MHz, (CD3)2SO): 2.78 (s, 4 H, COCH2CH2CO); 4.86 (s, 2 H, COCH2N); 7.74 (d, J = 2.8, 1 H, arom.); 8.06 (d, J = 2.8, 1 H, arom.). 13C-NMR (125 MHz, (CD3)2SO): 29.8; 48.9; 121.2; 138.8; 147.0; 154.4; 171.4; 173.7; 196.6.* HR-MALDI-MS: Ber. für C12H11N2O7+ (MH+): 295.0566; Gef. 295.0560.

5.4 Experimentelle Daten zu Kapitel 3

Ethyl(E)-3-((2R,3S,5R)-5-(6-amino-9H-purin-9-yl)-3-{[1-(tert-butyl)-1,1-dimethylsilyl]oxy}tetrahydrofuran-2-yl)prop-2-enoat (94)

N

NN

N

NH2

O

TBDMSO

94

1'3

1

2'3'

45'

4'

2

578

9

6

OO

6'

2'-Deoyxadenosin (5 g, 19 mmol, 1 Äquiv.), IBX 50 (15.5 g, 56 mmol, 3 Äquiv.) und Wittig-Reagenz 52 (7.8 g, 22 mmol, 1.2 Äquiv.) wurden in Me2SO (55 ml) gelöst. Das Reaktionsgemisch wurde während 21 h 30 min bei 20 °C gerührt. Dann wurde mehr

* Ein Signal im aromatischen Bereich fehlt wegen Signalüberlappungen.

Experimenteller Teil 160

Wittig-Reagenz 52 (6.5 g, 19 mmol, 1 Äquiv.) zugegeben und das Reaktionsgemisch weitere 48 h bei 20 °C gerührt. H2O (900 ml) wurde zugegeben, wobei ein farbloser Niederschlag ausfiel. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert. Der Rückstand wurde mit MeOH/CH2Cl2/Et3N (9:90:1, 3 x 100 ml) gewaschen. Das Filtrat wurde mit AcOEt (8 x 500 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden getrocknet (Na2SO4)und eingeengt. Das erhaltene Rohprodukt (braunes Öl), TBDMSCl (3.36 g, 22 mmol, 1.2 Äquiv.) und Imidazol (1.52 g, 22 mmol, 1.2 Äquiv.) wurden in abs. DMF (40 ml) gelöst. Das Reaktionsgemisch wurde 17 h bei 20 °C gerührt. Anschliessend wurde mehr TBDMSCl (3.36 g, 22 mmol, 1.2 Äquiv.) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde weitere 4 h bei 20 °C gerührt. H2O (600 ml) wurde zugegeben, und die wässrige Phase wurde mit AcOEt (4 x 200 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden eingeengt und am HV gut getrocknet. Das erhaltene Öl wurde mit Et2Okristallisiert. Das erhaltene Produkt (3.31 g, 41%) wurde filtriert. Die Mutterlauge wurde eingeengt und durch Chromatographie (SiO2, CH2Cl2/MeOH/Et3N 95:4:1) wurde mehr Produkt erhalten.

Ausbeute: 5.04 g (62%). Farbloser Feststoff. Fp. 125-126 °C (Et2O). [ ]D20 = +27.0 (c = 1, CHCl3). IR (KBr): 3334s; 3162s; 2930m; 2856w; 1718s; 1667s; 1601s; 1573m;1480m; 1442m; 1365s; 1328m; 1306m; 1252s; 1206m; 1191m; 1098s; 1052s; 984m;951m; 926w; 864w; 834m; 776m; 724w; 654w. 1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 0.11 (s, 6 H, 2 x SiCH3); 0.92 (s, 9 H, t-Bu); 1.28 (t, J = 7.1, 3 H OCH2CH3); 2.40-2.48 (m, 1 H, H-C(2')); 2.85-2.95 (m, 1 H, H-C(2')); 4.20 (q, J = 7.1, 2 H, OCH2CH3); 4.50-4.58 (m, 2 H, H-C(3') und H-C(4')); 5.85 (br, 2 H, NH2); 6.07 (dd, J = 15.6, 1.6, 1 H, H-C(6')); 6.43 (t, J = 6.5, 1 H, H-C(1')); 7.04 (dd, J = 15.6, 5.3, 1 H, H-C(5')); 7.93 (s, 1 H, H-C(8)); 8.36 (s, 1 H, H-C(2)). 13C-NMR (75 MHz, CDCl3): -4.8; 14.2; 18.0; 25.8; 39.7; 60.8; 75.6; 84.8; 86.3; 120.6; 122.8; 139.4; 144.1; 150.0; 153.4; 155.8; 166.3 (CO). HR-MALDI-MS: Ber. für C20H32N5O4Si+ (MH+): 434.2224; Gef. 434.2228. EA für C20H31N5O4Si (433.58): Ber. C 55.40, H 7.21, N 16.15; Gef. C 55.58, H 7.20, N 16.16.

Experimenteller Teil 161

(E)-3-((2R,3S,5R)-5-(6-Amino-9H-purin-9-yl)-3-{[1-(tert-butyl)-1,1-dimethylsilyl]oxy}tetrahydrofuran-2-yl)prop-2-en-1-ol (96)

N

NN

N

NH2

O

TBDMSO

96

1'3

1

2'3'

45'

4'

2

578

9

6

HO

6'

7'

Ester 94 (4.39 g, 10 mmol, 1 Äquiv.) wurde in CH2Cl2 (50 ml) mit einer 1 M Lösung von DIBAL-H in Hexan (40 ml, 40 mmol, 4 Äquiv.) gemäss AAV 3 während 4 h reduziert. Das Produkt wurde chromatographisch gereinigt (SiO2, CH2Cl2/MeOH 9:1).

Ausbeute: 2.90 g (73%). Gelber Feststoff. Fp. 74-76 °C. [ ]D20 = +30.6 (c = 1, CHCl3). IR (KBr): 3443s; 3322s; 3178s; 2929s; 2856s; 2356w; 1664s; 1602m; 1473m;1422m; 1372m; 1337m; 1306m; 1253m; 1156m; 1102m; 1036m; 836s; 778m. 1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 0.09 (s, 6 H, 2 x CH3); 0.91 (s, 9 H, t-Bu); 1.95 (br. s, 1 H, OH); 2.43 (ddd, J = 13.2, 6.3, 4.2, 1 H, H-C(2')); 2.84 (dt, J = 13.2, 6.3, 1 H, H-C(2')); 4.19 (d, J = 3.7, 2 H, H-C(7')); 4.39-4.48 (m, 2 H, H-C(3') und H-C(4')); 5.83 (br. s, 2 H, NH2); 5.89-6.00 (m, 2 H, H-C(5') und H-C(6')); 6.38 (t, J = 6.3, 1 H, H-C(1')); 7.94 (s, 1 H, H-C(8)); 8.34 (s, 1 H, H-C(2)). 13C-NMR (75 MHz, CDCl3): -4.7; 18.1; 25.8; 40.0; 62.3; 75.9; 84.5; 87.6; 120.1; 127.9; 133.4; 139.1; 149.5; 153.0; 155.6. HR-MALDI-MS: Ber. für C18H29N5O3SiNa+ ([M+Na]+): 414.1937; Gef. 414.1936. EA für C18H29N5O3Si (391.54): Ber. C 55.22, H 7.47, N 17.89; Gef. C 55.27, H 7.37, N 17.71.

2-[(E)-3-((2R,3S,5R)-5-(6-Amino-9H-purin-9-yl)-3-{[1-(tert-butyl)-1,1-dimethylsilyl]oxy}tetrahydrofuran-2-yl)prop-2-enyl]isoindoline-1,3-dion (97)

N

NN

N

NH2

O

TBDMSO

97

1'3

1

2'3'

45'

4'

2

578

9

6

N

6'

7'

O

O

Experimenteller Teil 162

Allylalkohol 96 (1.451 g, 3.7 mmol, 1 Äquiv.) wurde gemäss AAV 4 (Aufarbeitungsmethode A) mit Phthalimid (655 mg, 4.5 mmol, 1.2 Äquiv.), PPh3 (1.167 g, 4.5 mmol, 1.2 Äquiv.) in THF (10 ml) mit DEAD (0.7 ml, 4.5 mmol, 1.2 Äquiv.) innerhalb 12 h umgesetzt. Durch Einengen des Filtrats und chromatographische Reinigung (SiO2, CH2Cl2/MeOH 19:1) des Rückstandes wurde weiteres Produkt isoliert.

Ausbeute: 1.628 g (84%). Farbloser Feststoff. Fp. 219 °C (Zers.). [ ]D20 = +21.9 (c = 1, CHCl3). IR (KBr): 3313m; 3200m; 2928m; 2856m; 1764m; 1711s; 1676m; 1601m;1467w; 1398m; 1257m; 1107m; 1055m; 936w; 836m; 777w; 722w. 1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 0.05 (s, 6 H, 2 x CH3); 0.85 (s, 9 H, t-Bu); 2.40 (ddd, J = 13.0, 6.5, 4.7, 1 H, H-C(2')); 2.74-2.83 (dt, J = 13.0, 6.5, 1 H, H-C(2')); 4.30 (d, J = 3.7, 2 H, H-C(7')); 4.33-4.45 (m, 2 H, H-C(3') und H-C(4')); 5.85-5.87 (m, 2 H, H-C(5') und H-C(6')); 6.00 (br. s, 2 H, NH2); 6.36 (t, J = 6.5, 1 H, H-C(1')); 7.71, 7.85 (AA'BB', J = 5.4, 3.0, 4 H, arom. H (Phthalimid)); 7.92 (s, 1 H, H-C(8)); 8.25 (s, 1 H, H-C(2)). 13C-NMR (75 MHz, CDCl3): -4.8; 18.0; 25.7; 38.8; 39.9; 75.7; 84.4; 87.0; 120.3; 123.4; 127.0; 131.3; 132.0; 134.1; 139.1; 149.6; 153.0; 155.6; 167.8 (CO). HR-MALDI-MS: Ber. für C26H32N6O4SiNa+ ([M+Na]+): 543.2152; Gef. 543.2140. EA für C26H32N6O4Si(520.66): Ber. C 59.98, H 6.19, N 16.14; Gef. C 60.01, H 6.02, N 16.14.

(2R,3S,5R)-2-[(E)-3-Aminoprop-1-enyl]-5-(6-amino-9H-purin-9-yl)tetrahydrofuran-3-ol (93)

N

NN

N

NH2

O

HO

93

1'3

1

2'3'

45'

4'

2

578

9

6

H2N

6'

7'

Phthalimid 97 (579 mg, 1.1 mmol, 1 Äquiv.) wurde mit 33% MeNH2 in EtOH (25 ml) gelöst. Das Reaktionsgemisch wurde 35 h bei 20 °C gerührt, dann eingeengt. Zum Rückstand wurde 1 M Bu4NF in THF (11 ml, 11.0 mmol, 10 Äquiv.) zugegeben und die Lösung 16 h bei 20 °C gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde eingeengt. Der Rückstand wurde unter Eisbadkühlung in einer wässrigen Phosphat-Pufferlösung (pH = 7.2), die NaClO4 enthielt, gelöst. Der gebildete Niederschlag wurde abfiltriert. Das

Experimenteller Teil 163

Filtrat wurde zweimal mit CH2Cl2 gewaschen. Die wässrige Phase wurde wie in AAV 6beschrieben durch Ionenaustausch-Chromatographie gereinigt.

Ausbeute: 300 mg (quantitativ). Braunes Öl. [ ]D20 = +15.0 (c = 1, MeOH). IR (KBr): 3354s; 1652s; 1600s; 1578s; 1477s; 1333m; 1300m; 1250m; 1091m; 1033m;967w; 928w; 649m. 1H-NMR (300 MHz, CD3OD): 2.44 (ddd, J = 13.7, 6.5, 4.6, 1 H, H-C(2')); 2.82 (dt, J = 13.7, 6.5, 1 H, H-C(2')); 3.24 (d, J = 4.4, 2 H, H-C(7')); 4.35 (t, J= 4.3, 1 H, H-C(4')); 4.43 (m, 1 H, H-C(3')); 5.81-5.85 (m, 2 H, H-C(5') und H-C(6')); 6.40 (t, J = 6.5, 1 H, H-C(1')); 8.18 (s, 1 H, H-C(8)); 8.24 (s, 1 H, H-C(2)). 13C-NMR(75 MHz, CD3OD): 40.2; 43.6; 75.9; 85.3; 88.7; 120.6; 130.0; 134.3; 141.0; 150.5; 153.9; 157.4. HR-ESI-MS: Ber. für C12H16N6O2Na+ ([M+Na]+): 299.1227; Gef. 299.1233.

N1-{(E)-3-[(2R,3S,5R)-5-(6-Amino-9H-purin-9-yl)-3-hydroxytetrahydrofuran-2-yl]prop-2-enyl}-2,3-dihydroxy-5-nitrobenzamid (87)

N

NN

N

NH2

O

HO

87

1'3

1

2'3'

45'

4'

2

578

9

6

HN

6'

7'

OOHHO

O2N

Amin 93 (28 mg, 0.1 mmol, 1 Äquiv.) und NaHCO3 (17 mg, 0.2 mmol, 2 Äquiv.) wurden in H2O (0.8 ml) gelöst. Eine Lösung von Hydroxysuccinimidester 41 (30 mg, 0.1 mmol, 1 Äquiv.) in abs. DME (1 ml) wurde zugetropft. Das Reaktionsgemisch wurde 20 h bei 20 °C gerührt, anschliessend wurde das DME abdestilliert. Die erhaltene wässrige Phase wurde wie in AAV 1 beschrieben durch Umkehrphasen-Chromatographie gereinigt.

Ausbeute: 12 mg (26%). Gelber Feststoff. Fp. 172 °C (Zers.). [ ]D20 = -29.0 (c = 0.5, MeOH). IR (KBr): 3370s; 1689w; 1638s; 1594m; 1561m; 1477m; 1417w; 1294s;1264s; 1081w; 1039w; 972w. 1H-NMR (300 MHz, (CD3)2SO): 2.25-230 (m, 1 H, H-C(2')); 2.80-2.88 (m, 1 H, H-C(2')); 3.94 (t, J = 5.3, 2 H, H-C(7')); 4.25-4.36 (m, 2 H, H-C(3') und H-C(4')); 5.52 (br. s, 1 H, OH); 5.72-5.90 (m, 2 H, H-C(5') und H-C(6')); 6.32 (t, J = 6.7, 1 H, H-C(1')); 7.29 (br. s, 2 H, NH2); 7.38-7.41 (m, 1 H, arom. H(Cat.)); 8.10

Experimenteller Teil 164

(s, 1 H, H-C(8)); 8.31 (s, 1 H, H-C(2)); 8.36 (d, J = 2.8, arom. H(Cat.)); 9.43 (t, J = 5.3, CONH). 13C-NMR (75 MHz, (CD3)2SO): 73.8; 74.1 83.3; 86.8; 111.9; 114.2; 114.4; 128.6; 129.8; 138.3; 141.2; 146.9; 147.8; 148.4; 152.4; 156.1; 167.8 (CO).* HR-MALDI-MS: Ber. für C19H19N7O7Na+ ([M+Na]+): 480.1244; Gef. 480.1230.

(2R,3R,4S,5R)-2-(6-Amino-9H-purin-9-yl)-5-({[1-(tert-butyl)-1,1-diphenylsilyl]oxy}methyl)tetrahydrofuran-3,4-diol (100) [186,187]

N

NN

N

NH2

O

HO OH

TBDPSO

100

1'3

1

2'3'

45'

4'

2

578

9

6

Adenosin (23.8 g, 89 mmol, 1 Äquiv.) wurde in Pyridin (100 ml) gelöst. TBDPSCl (25 ml, 98 mmol, 1.1 Äquiv.) wurde zugegeben, das Reaktionsgemisch wurde während 13 h bei 20 °C gerührt und anschliessend eingeengt. Toluol (100 ml) wurde zweimal zugegeben und wieder eingeengt. Der Rückstand wurde in AcOEt gelöst und H2Ozugegeben. Die Phasen wurden getrennt und die organische Phase wurde mit H2O und dann ges. NaCl-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Na2SO4getrocknet und dann eingeengt. Der erhaltene Rückstand wurde dreimal mit Et2O(jeweils 250 ml) gewaschen und anschliessend am HV getrocknet.

Ausbeute: 35.32 g (78%). Farbloser Feststoff. Fp. 185-187 °C (Et2O, Lit. [187] 185-186 °C). 1H-NMR (200 MHz, (CD3)2SO): 1.00 (s, 9 H, t-Bu); 3.80 (dd, J = 11.2, 4.6, 1 H, H-C(5')); 3.96 (dd, J = 11.2, 3.7, 1 H, H-C(5'); 4.03-4.07 (m, 1 H, H-C(4')); 4.37 (q, J= 5.2, 1 H, H-C(3')); 4.68 (q, J =5.2, 1 H, H-C(2')); 5.27 (d, J = 5.2, 1 H, HO-C(3')); 5.57 (d, J = 5.2, 1 H, HO-C(2')); 5.96 (d, J = 5.2, 1 H, H-C(1')); 7.31-7.66 (m, 10 H, 2 x Ph); 8.12 (s, 1 H, H-C(8)); 8.27 (s, 1 H, H-C(2)).

* Ein Signal im aliphatischen Bereich fehlt.

Experimenteller Teil 165

(2R,3R,4R,5R)-5-(6-Amino-9H-purin-9-yl)-2-({[1-(tert-butyl)-1,1-diphenylsilyl]oxy}methyl)-4[(methylsulfonyl)oxy]tetrahydrofuran-3-ylmethansulfonat (101) [187]

N

NN

N

NH2

O

MsO OMs

TBDPSO

101

1'3

1

2'3'

45'

4'

2

578

9

6

Das geschützte Nucleosid 100 (20 g, 40 mmol, 1 Äquiv.) wurde in Pyridin (300 ml) gelöst und auf 0 °C gekühlt. MsCl (8.3 ml, 107 mmol, 2.7 Äquiv.), gelöst in Pyridin (200 ml), wurde zugetropft. Das Reaktionsgemisch wurde während 14 h bei 20 °C gerührt und anschliessend eingeengt. Toluol (200 ml) wurde zweimal zugegeben und wieder eingeengt. Der Rückstand wurde aus Et2O umkristallisiert.

Ausbeute: 21.67 g (83%). Farbloser Feststoff. Fp. 151-152 °C (Et2O, Lit. [187]: 153-155 °C). 1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 1.07 (s, 9 H, t-Bu); 3.07 (s, 3 H, Ms); 3.17 (s, 3 H, Ms); 3.92 (dd, J = 12.0, 2.9, 1 H, H-C(5')); 4.04 (dd, J = 12.0, 2.9, 1 H, H-C(5')); 4.43-4.47 (m, 1 H, H-C(4')); 5.70-5.75 (m, 3 H, NH2 und H-C(3')); 6.10 (t, J = 5.4, 1 H, H-C(2')); 6.25 (d, J = 5.4, 1 H, H-C(1')); 7.30-7.67 (m, 10 H, 2 x Ph); 7.98 (s, 1 H, H-C(8)); 8.18 (s, 1 H, H-C(2)).

9-[(2R,5S)-5-({[1-(tert-Butyl)-1,1-diphenylsily]oxy}methyl]-2,5-dihydrofuran-2-yl]-9H-purin-6-amin (102) [187,264]

N

NN

N

NH2

OTBDPSO

102

1'3

1

2'3'

45'

4'

2

578

9

6

Naphthalin (1 g, 7.8 mmol, 1 Äquiv.) und Natrium (180 mg, 7.8 mmol, 1 Äquiv.)

wurden in entgastem THF (5 ml) suspendiert. Das Reaktionsgemisch wurde mit

Experimenteller Teil 166

Ultraschall während 5 min beschallt und dann mehr entgastes THF (8 ml) zugegeben.

Das Reaktionsgemisch wurde weiter während 20 min beschallt, wobei eine dunkelgrüne

Lösung entstand. Das Mesylat 101 (120 mg, 0.2 mmol, 1 Äquiv.) wurde in THF (5 ml)

gelöst. Das Reaktionsgemisch wurde auf –60 °C gekühlt und während 45 min im

Ultraschall durch Durchleiten von Ar-Gas entgast. Die grüne Naphthalenid-

Radikalanion-Lösung (5 ml) wurde zugetropft. Das Reaktionsgemisch wurde während

5 min bei -60 °C gerührt und dann ges. NH4Cl Lösung (10 ml) zugegeben. Die

wässrige Phase wurde mit Wasser (90 ml) verdünnt und dann mit AcOEt (3 x 100 ml)

extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Na2SO4 getrocknet,

eingeengt und chromatographisch gereinigt (SiO2, MeOH/CHCl3 5:95).

Ausbeute: 53 mg (62%). Farbloser Feststoff. Fp. 154-155 °C (Lit. [187]: 154-156 °C). 1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 1.06 (s, 9 H, t-Bu); 3.75-3.86 (m, 2 H, H-C(5')); 5.01-5.03 (m, 1 H, H-C(4')); 5.59 (br. s, 2 H, NH2); 6.07 (dt, J = 6.1, 1.8, 1 H, H-C(2')); 6.45 (dt, J = 6.1, 1.8, 1 H, H-C(3')); 7.08-7.10 (m, 1 H, H-C(1')); 7.29-7.63 (m, 10 H, 2 x Ph); 7.88 (s, 1 H, H-C(8)); 8.37 (s, 1 H, H-C(2)). HR-MALDI-MS: Ber. für C26H29N5O2SiNa+ ([M+Na]+): 494.1988; Gef. 494.1984.

6-Amino-9-((2R,3R,4R,5R)-5-({[1-(tert-butyl)-1,1-diphenylsilyl]oxy}methyl)-3,4-di{[(methylsulfanyl)carbothioyl]oxy}tetrahydrofuran-2-yl)-9H-purin (105)

N

NN

N

NH2

O

O O

TBDPSO

105

1'3

1

2'3'

45'

4'

2

578

9

6

S

S

S

S

Das geschützte Nucleosid 100 (506 mg, 1 mmol, 1 Äquiv.) wurde in abs. Me2SO (6 ml) gelöst. CS2 (0.3 ml, 5 mmol, 5 Äquiv.) und 5 N NaOH (5 ml) wurden nacheinander zugetropft. Das Reaktionsgemisch wurde während 2 h bei 20 °C gerührt. MeI (0.3 ml, 5 mmol, 5 Äquiv.) wurde zugegeben und das Reaktionsgemisch weiter während 3 h bei 20 °C gerührt. AcOEt (40 ml) und H2O (40 ml) wurden zugegeben. Die Phasen

Experimenteller Teil 167

wurden getrennt und die wässrige Phase mit AcOEt (3 x 40 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Na2SO4 getrocknet, eingeengt und chromatographisch gereinigt (SiO2, Hexan/AcOEt 1:2).

Ausbeute: 213 mg (31%). Gelber Schaum. Fp. 65-67 °C. [ ]D20 = +3 (c = 1, CHCl3).IR (KBr): 3311; 3167; 2928; 2844; 1644; 1596; 1472; 1427; 1371; 1328; 1294; 1200; 1083; 822; 797; 694; 500. 1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 1.11 (s, 9 H, t-Bu); 2.53 (s, 3 H, SCH3); 2.59 (s, 3 H, SCH3); 3.99 (dd, J = 11.5, 2.6, 1 H, H-C(5')); 4.05 (dd, J = 11.5, 2.6, 1 H, H-C(5')); 4.50 (q, J = 2.6, 1 H, H-C(4')); 6.29 (br. s, 2 H, NH2); 6.54 (d,J = 5.9, 1 H, H-C(1')); 6.62-6.68 (m, 2 H, H-C(2') und H-C(3')); 7.32-7.70 (m, 10 H, 2 x Ph); 8.07 (s, 1 H, H-C(8)); 8.31 (s, 1 H, H-C(2)). 13C-NMR (75 MHz, CDCl3): 19.5; 27.0; 63.5; 78.0; 80.2; 83.9; 84.7; 119.7; 128.0; 130.0; 132.2; 132.5; 135.6; 138.5; 150.1; 153.4; 155.8; 214.3 (CS); 214.6 (CS).* HR-MALDI-MS: Ber. für C30H36N5O4SiS4+ (MH+): 686.1419; Gef. 686.1419. EA für C30H35N5O4SiS4

(685.99): Ber. C 52.53, H 5.14, N 10.21; Gef. C 52.45, H 5.35, N 9.99.

[(2R,3S,4S,5R)-4-(Acetyloxy)-5-(6-amino-9H-purin-9-yl)-3-bromotetrahydrofuran-2-yl]methylacetat (106) [192]

N

NN

N

NH2

O

Br OAc

AcO

106

1'3

1

2'3'

45'

4'

2

578

9

6

Adenosin (20 g, 75 mmol, 1 Äquiv.) wurde in Essigsäure (100 ml) gelöst. Trimethylorthoacetat (11.7 ml, 90 mmol, 1.2 Äquiv.) wurde zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde während 3 h bei 30 °C gerührt und anschliessend eingeengt. Der Rückstand wurde in 100 ml MeCN gelöst und Acetoxybromid (22 ml, 299 mmol, 4 Äquiv.) wurde bei 10 °C (Kryostat) innerhalb 1 h zugetropft (Spritzenpumpe). Das Reaktionsgemisch wurde während 2 h bei 15 °C gerührt. Ges. NaHCO3 Lösung (150 ml) und festes NaHCO3 wurden zugegeben bis ein pH-Wert von 7 erreicht wurde. Das

* Ein Signal fehlt im aliphatischen Bereich.

Experimenteller Teil 168

Reaktionsgemisch wurde filtriert und das Filtrat MeCN (4 x 100 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Na2SO4 getrocknet, eingeengt und chromatographisch gereinigt (SiO2, CHCl3/MeOH 95:5).

Ausbeute: 26.36 g (85%). Farbloser Schaum. Fp. 149-152 °C (Lit. [192]: 163-164 °C). 1H-NMR (300 MHz, (CD3)2SO): 2.01 (s, 3 H, Ac); 2.06 (s, 3 H, Ac); 4.31-4.33 (m, 2 H, H-C(5')); 4.46-4.54 (m, 1 H, H-C(4')); 4.88 (dd, J = 4.7, 2.5, 1 H, H-C(3')); 5.86 (dd,J = 3.4, 2.5, 1 H, H-C(2')); 6.12 (d, J = 3.4, 1 H, H-C(1')); 7.33 (br. s, 2 H, NH2); 8.12 (s, 1 H, H-C(8)); 8.26 (s, 1 H, H-C(2)).

N,N'-Dioctyl-4,4'-bipyridiniumdibromid (108) [265]

NN

Br Br108

4, 4'-Bipyridyl (5.06 g, 32 mmol, 1 Äquiv) wurde in abs. DMF (200 ml) gelöst. 1-Bromoctan (40 ml, 227 mmol, 4 Äquiv) wurde zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde während 10 h zum Rückfluss erhitzt, wobei ein grüner Niederschlag entstand. Das Reaktionsgemisch wurde filtriert und der Rückstand wurde mit Aceton gewaschen.

Ausbeute: 14.93 g (93%). Grüne Kristalle. Fp. > 300 °C (Zers.) (Lit. [265]: > 300 °C). 1H-NMR (200 MHz, (CD3)2SO): 0.85 (t, J = 6.7, 6 H, 2 x Me); 1.25-1.31 (m, 20 H, aliph. H); 1.98 (m, 4 H, 2 x NCH2CH2); 4.74 (t, J = 7.3, 4 H, 2 x NCH2); 8.86, 9.48 (AA'BB', J = 6.9, 8 H, arom. H).

[(2S,5R)-5-(6-Amino-9H-purin-9-yl)-2,5-dihydrofuran-2-yl]methylacetat (107)

N

NN

N

NH2

OAcO

107

1'3

1

2'3'

45'

4'

2

578

9

6

Experimenteller Teil 169

Methode A [194]:

Das Acetoxybromid 106 (500 mg, 1.2 mmol, 1 Äquiv.), Na2S2O4 (2.09 g, 12 mmol, 10 Äquiv.) und K2CO3 (995 mg, 7.2 mmol, 6 Äquiv.) wurden in H2O (15 ml) suspendiert und CH2Cl2 (35 ml) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde während 1 h unter Rühren mit Ar entgast. Dann wurde das Bipyridiniumdibromid 108 (326 mg, 0.6 mmol, 0.5 Äquiv.) zugegeben. Das Zweiphasengemisch wurde während 21 h bei 20 °C gerührt. Na2SO4 (418 mg, 2.4 mmol, 2 Äquiv.), K2CO3 (330 mg, 2.4 mmol, 2 Äquiv.) und mehr Bipyridiniumdibromid 108 (130 mg, 0.2 mmol, 0.2 Äquiv.) wurden zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde weitere 48 h bei 20 °C gerührt. Anschliessend wurden die Phasen getrennt und die wässrige Phase mit CH2Cl2 (3 x 50 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Na2SO4 getrocknet, eingeengt und chromatographisch gereinigt (SiO2, MeOH/CHCl3 5:95).

Ausbeute: 258 mg (78%). Farbloser Schaum. Fp. 66-67 °C (Lit. 83-84 °C (2-Propanol)). 1H-NMR (200 MHz, (CD3)2SO): 2.01 (s, 3 H, OAc); 4.21 (d, J = 4.2, 2 H, H-C(5')); 5.11-5.12 (m, 1 H, H-C(4')); 6.26-6.30 (m, 1 H, H-C(2')); 6.52 (dt, J = 5.8, 1.8, 1 H, H-C(3')); 6.96-6.99 (m, 1 H, H-C(1')); 7.31 (br. s, 2 H, NH2); 8.10 (s, 1 H, H-C(8)); 8.19 (s, 1 H, H-C(2)).

Methode B [193]:

Cu(OAc)2 H2O (43 mg, 0.2 mmol, 0.2 Äquiv.) wurde in Essigsäure (2.7 ml) gelöst und vorsichtig zum Sieden erhitzt. Zinkstaub (650 mg, 10.0 mmol, 10 Äquiv.) wurde zur warmen Lösung zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde während 5 min bei 20 °C gerührt, dekantiert und der Rückstand mit THF (2 x 5 ml) gewaschen. Das Acetoxybromid 106 (414 mg, 1.0 mmol, 1 Äquiv.), gelöst in THF (4.7 ml), EtOH (4.7 ml) und Essigsäure (0.13 ml) wurden zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde während 24 h bei 20 °C gerührt und anschliessend über Celite filtriert. Das Celite wurde mit CH2Cl2 gewaschen. Die vereinigten organischen Phasen wurden eingeengt und chromatographisch gereinigt (SiO2, MeOH/CHCl3 5:95).

Ausbeute: 202 mg (73%). Farbloser Schaum.

Experimenteller Teil 170

[(2S,5R)-5-(6-Amino-9H-purin-9-yl)-2,5-dihydrofuran-2-yl]methanol (98) [195]

N

NN

N

NH2

OHO

98

1'3

1

2'3'

45'

4'

2

578

9

6

Der Acetylester 107 (815 mg, 3.0 mmol, 1 Äquiv.) wurde in MeOH (60 ml), gesättigt mit NH3, gelöst und während 13 h bei 20 °C gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde dann eingeengt und chromatographisch gereinigt (SiO2, MeOH/CHCl3 10:90).

Ausbeute: 586 mg (85%). Farbloser Feststoff. Fp. 188-189 °C (MeOH, Lit. [190]: 194-195 °C). 1H-NMR (300 MHz, (CD3)2SO): 3.58 (br. s, 2 H, H-C(5')); 4.88-4.90 (m, 1 H, H-C(4')); 5.05 (br. s, 1 H, OH); 6.14 (ddd, J = 5.9, 2.2, 1.6, 1 H, H-C(3')); 6.47 (dt, J= 5.9, 1.6, 1 H, H-C(2')); 6.93-6.95 (m, 1 H, H-C(1')); 7.28 (br. s, 2 H, NH2); 8.15 (s, 1 H, H-C(8)); 8.17 (s, 1 H, H-C(2)).

[(2S,5R)-5-(6-Amino-9H-purin-9-yl)tetrahydrofuran-2-yl]methanol (111)

N

NN

N

NH2

OHO

111

1'3

1

2'3'

45'

4'

2

578

9

6

Methode A [192]:

Das Acetoxybromid 106 (8 g, 19 mmol, 1 Äquiv.) wurde in MeCN (400 ml) gelöst. Na2CO3 (2.25 g, 21 mmol, 1.1 Äquiv.), gelöst in H2O (80 ml), sowie AcONa 3H2O(5.78 g, 42 mmol, 2.2 Äquiv.) und 10% Pd/C (960 mg, 0.9 mmol, 0.05 Äquiv.) wurden zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde während 24 h unter Wasserstoffatmosphäre (4 bar) gerührt und anschliessend über Celite filtriert. Das Celite wurde gründlich mit CH2Cl2 gewaschen. Das Filtrat wurde eingeengt und der so erhaltene Rückstand wurde mit 10% NaOH (100 ml) versetzt, 1 h bei 20 °C gerührt und anschliessend mit 5% HCl

Experimenteller Teil 171

neutralisiert. Das Reaktionsgemisch wurde eingeengt und chromatographisch gereinigt (SiO2, MeOH/CHCl3 5:95).

Ausbeute: 1.86 g (41%). Farbloser Feststoff. Fp. 175 °C (MeOH, Lit. [192]: 187-189 °C). 1H-NMR (300 MHz, D2O): 2.02-2.11 (m, 1 H, H-C(3')); 2.18-2.29 (m, 1 H, H-C(3')); 2.46-2.67 (m, 2 H, H-C(2')); 3.66 (dd, J = 12.5, 5.0, 1 H, H-C(5')); 3.83 (dd, J = 12.5, 3.1, 1 H, H-C(5')); 4.32-4.40 (m, 1 H, H-C(4')); 6.28 (dd, J = 3.4, 3.1, 1 H, H-C(1')); 8.16 (s, 1 H, H-C(8)); 8.30 (s, 1 H, H-C(2)).

Methode B [188,195]:

Der Acetylester 107 (434 mg, 1.6 mmol, 1 Äquiv.) wurde in MeOH (30 ml), gesättigt mit NH3, gelöst und während 12 h bei 20 °C gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde dann eingeengt und der Rückstand in EtOH (150 ml) gelöst. 10% Pd/C (290 mg, 0.3 mmol, 0.2 Äquiv.) wurden zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde während 24 h bei 20 °C unter Wasserstoffatmosphäre (4.5 bar) gerührt und anschliessend über Celite filtriert. Das Celite wurde gründlich mit CH2Cl2 gewaschen. Die vereinigten organischen Phasen wurden eingeengt und chromatographisch gereinigt. (MeOH/CHCl3 5:95).

Ausbeute: 130 mg (35%). Farbloser Feststoff.

Ethyl(E)-3-[(2S,5R)-5-(6-amino-9H-purin-9-yl)tetrahydofuran-2-yl]prop-2-enoat (113)

N

NN

N

NH2

O

113

1'3

1

2'3'

45'

4'

2

578

9

6

OO

6'

2',3'-Dideoxyadenosin 111 (1.856 g, 7.9 mmol, 1 Äquiv.) wurde gemäss AAV 2 mit o-Iodoxybenzoesäure 50 (6.590 g, 23.7 mmol, 3 Äquiv.) und Ph3P=CHCO2Et (52) (4.120 g, 11.8 mmol, 1.5 Äquiv.) in Me2SO (24 ml) während 37 h umgesetzt. Dann wurde H2O (200 ml) zum Reaktionsgemisch zugegeben, wobei ein farbloser Niederschlag

Experimenteller Teil 172

entstand. Die Suspension wurde filtriert. Der Rückstand wurde mit MeOH/CH2Cl2/Et3N 5:94:1 (3 x 100ml) gewaschen. Das Filtrat wurde mit AcOEt (8 x 200 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Na2SO4getrocknet, eingeengt und chromatographisch gereinigt (SiO2, MeOH/CH2Cl2/Et3N).

Ausbeute: 1.36 g (57%). Farbloser Feststoff. Fp. 103-105 °C (CHCl3/Hexan 1:2). [ ]D20 = +16.8 (c = 1, CHCl3). IR (KBr): 3310m; 3116s; 2978m; 1718s; 1648s; 1600s;1479m; 1415m; 1371m; 1302s; 1257m; 1180m; 1089m; 1045m; 977m; 799w; 644w.1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 1.29 (t, J = 7.2, 3 H, OCH2CH3); 2.03-2.10 (m, 1 H, H-C(3')); 2.32-2.42 (m, 1 H, H-C(3')); 2.56-2.63 (m, 2 H, H-C(2')); 4.21 (q, J = 7.2, 2 H, OCH2CH3); 4.76-4.79 (m, 1 H, H-C(4')); 5.86 (br. s, 2 H, NH2); 6.07 (dd, J = 15.6, 1.6, 1 H, H-C(6')); 6.37 (t, J = 4.8, 1 H, H-C(1')); 7.04 (dd, J = 15.6, 5.1, 1 H, H-C(5')); 7.97 (s, 1 H, H-C(8)); 8.36 (s, 1 H, H-C(2)). 13C-NMR (75 MHz, CDCl3): 14.2; 30.1; 32.6; 60.7; 80.0; 85.6; 120.1; 122.1; 138.7; 145.2; 149.3; 152.4; 155.1; 166.0 (CO). HR-MALDI-MS: Ber. für C14H17N5O3Na+ ([M+Na]+): 326.1229; Gef. 326.1206. EA für C14H17N5O3 (303.32): Ber. C 55.44, H 5.65, N 23.09; Gef. C 55.51, H 5.74, N 23.03.

(E)-3-[(2S,5R)-5-(6-Amino-9H-purin-9-yl)tetrahydrofuran-2-yl]prop-2-en-1-ol (114)

N

NN

N

NH2

O

114

1'3

1

2'3'

45'

4'

2

578

9

6

HO

6'

7'

Ester 113 (702 mg, 2.3 mmol, 1 Äquiv.) in CH2Cl2 (11 ml) mit einer 1 M Lösung von DIBAL-H in Hexan (9.3 ml, 9.3 mmol, 4 Äquiv.) entsprechend AAV 3 innerhalb von 1 h umgesetzt. Das Reaktionsprodukt wurde chromatographisch gereinigt (SiO2,MeOH/CHCl3 8:92).

Ausbeute: 407 mg (67%). Farbloser Feststoff. Fp. 141-143 °C. [ ]D20 = +18.0 (c = 1, MeOH). IR (KBr): 3306s; 3131s; 1671s; 1605s; 1574m; 1474m; 1421m; 1375m;1338m; 1301m; 1215m; 1048m; 958m; 862w; 797m. 1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 1.87-1.94 (m, 1 H, H-C(3')); 2.19-2.27 (m, 1 H, H-C(3')); 2.49-2.56 (m, 2 H, C-(2')); 3.4 (br. s, 1 H, OH); 4.21 (d, J = 4.1, 2 H, H-C(7')); 4.60-4.67 (m, 1 H, H-C(4')); 5.85-6.00

Experimenteller Teil 173

(m, 2 H, H-C(5') und H-C(6')); 6.17 (br. s, 2 H, NH2); 6.30 (t, J = 4.5, H-C(1')); 7.97 (s,1 H, H-C(8)); 8.31 (s, 1 H, H-C(2)). 13C-NMR (75 MHz, CDCl3): 30.2; 33.1; 62.2; 81.9; 85.6; 120.0; 129.3; 133.2; 138.5; 149.1; 153.0; 155.6. HR-MALDI-MS: Ber. für C12H16N5O2+ (MH+): 262.1304; Gef. 262.1300.

2-{(E)-3-[(2S,5R)-5-(6-Amino-9H-purin-9-yl)tetrahydrofuran-2-yl]prop-2-enyl}isoindoline-1,3-dion (115)

N

NN

N

NH2

O

115

1'3

1

2'3'

45'

4'

2

578

9

6

N

6'

7'

O

O

Allylalkohol 114 (134 mg, 0.5 mmol, 1 Äquiv.), Triphenylphosphin (160 mg, 0.6 mmol, 1.2 Äquiv.) und Phthalimid (90 mg, 0.6 mmol, 1.2 Äquiv.) wurden in THF (2 ml) gemäss AAV 4 (Aufarbeitungsmethode B) mit DEAD (92 l, 0.6 mmol, 1.2 Äquiv.) innerhalb 18 h umgesetzt. Das Reaktionsprodukt wurde chromatographisch gereinigt (SiO2, MeOH/CHCl3 5:95).

Ausbeute: 192 mg (96%). Farbloser Feststoff. Fp. 169-170 °C. [ ]D20 = +26.3 (c = 1, CHCl3). IR (KBr): 3385s; 3156s; 1765m; 1709s; 1654s; 1598s; 1468m; 1397s; 1338m;1295m; 1212m; 1062m; 935m; 800w; 723m; 654m; 529m. 1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 1.89-1.97 (m, 1 H, H-C(3')); 2.20-2.26 (m, 1 H, H-C(3')); 2.48-2.55 (m, 2 H, H-C(2')); 4.32 (d, J = 4.4, 2 H, H-C(7')); 4.57-4.64 (m, 1 H, C-H(4')); 5.82-5.96 (m, 2 H, H-C(5') und H-C(6')); 6.10 (br. s, 2 H, NH2); 6.29 (t, J = 4.7, 1 H, H-C(1')); 7.71, 7.87 (AA'BB', J = 5.4, 3.0, 4 H, arom. H(Phthalimid)); 7.96 (s, 1 H, C-(8)); 8.31 (s, 1 H, H-C(2)). 13C-NMR (75 MHz, CDCl3): 30.1; 33.0; 38.9; 81.2; 85.5; 120.2; 123.5; 126.7; 132.0; 132.8; 134.1; 138.6; 149.2; 153.0; 155.6; 167.9 (CO). HR-MALDI-MS: Ber. für C20H19N6O3+ (MH+): 391.1519; Gef. 391.1507. EA für C20H18N6O3 (390.40): Ber. C 61.53, H 4.65, N 21.53; Gef. C 61.27, H 4.77, N 21.52.

Experimenteller Teil 174

9-{(2R,5S)-5-[(E)-3-Aminoprop-1-enyl]tetrahydrofuran-2-yl}-9H-purin-6-amin (112)

N

NN

N

NH2

O

112

1'3

1

2'3'

45'

4'

2

578

9

6

H2N

6'

7'

Phthalimid 115 (561 mg, 1.7 mmol, 1 Äquiv.) wurde nach AAV 5 (Aufarbeitungsmethode B) mit 33% MeNH2 in EtOH (26 ml) während 16 h gespaltet.

Ausbeute: 363 mg (83%). Farbloser Feststoff. Fp. 110-115 °C. [ ]D20 = +21.0 (c = 1, CHCl3). IR (KBr): 3355s; 3167s; 1652s; 1596s; 1474s; 1330m; 1303m; 1246m; 1210m;1055m; 796w; 696m; 649m. 1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 1.86-1.99 (m, 1 H, H-C(3')); 2.17-2.27 (m, 1 H, H-C(3')); 2.45-2.60 (m, 2 H, H-C(2')); 3.39 (d, J = 5.1, 2 H, H-C(7')); 4.61 (q, J = 6.9, 1 H, H-C(4')); 5.75 (dd, J = 15.4, 6.9, 1 H, H-C(5')); 5.92 (dt, J = 15.4, 5.1, 1 H, H-C(6')); 6.30 (dd, J = 5.5, 3.6, 1 H, H-C(1')); 7.98 (s, 1 H, H-C(8)); 8.33 (s, 1 H, H-C(2)). 13C-NMR (75 MHz, CDCl3): 30.3; 33.1; 43.2; 82.2; 85.5; 120.2; 128.3; 135.6; 138.6; 149.2; 153.0; 155.5. HR-MALDI-MS: Ber. für C12H16N6ONa+

([M+Na]+): 283.1283; Gef. 283.1282.

N1-{(E)-3-[(2S,5R)-5-(6-Amino-9H-purin-9-yl)tetrahydrofuran-2-yl]prop-2-enyl}-2,3-dihydroxy-5-nitrobenzamid (89)

N

NN

N

NH2

O

89

1'3

1

2'3'

45'

4'

2

578

9

6

HN

6'

7'

OOHHO

O2N

Allylamin 112 (219 mg, 0.84 mmol, 1.1 Äquiv.) wurde gemäss AAV 1 mit Hydroxysuccinimidester 41 (235 mg, 0.79 mmol, 1 Äquiv.) in abs. DMF (15 ml) innerhalb von 16 h umgesetzt. Statt Säure wurde der Wasserkomponente für die

Experimenteller Teil 175

Umkehrphasen-Chromatographie jedoch ein flüchtiger Triethylammonium-carbonatpuffer (pH 8, eingestellt durch Durchblasen von CO2 durch eine wässrige 0.3 MEt3N Lösung) zugesetzt. Nach dem Lyophilisieren wurde der Rückstand in MeOH/H2O (50 ml) gelöst, über eine Ionentauscher-Säule (2 cm x 45 cm, DOWEX 50W x 2, NH4+, MeOH) filtriert, eingeengt, in H2O aufgenommen (25 ml) und erneut lyophilisiert.

Ausbeute: 219 mg (63%). Gelber Feststoff. Fp. 125 °C (2-Propanol/Et2O). [ ]D20 = -20 (c = 0.5, MeOH). IR (KBr): 3367s; 3211s; 1639s; 1544m; 1478m; 1439m; 1333m;1249s; 1077m; 977w; 794w; 699w; 644w; 560w. 1H-NMR (300 MHz, CD3OD): 1.97-2.10 (m, 1 H, H-C(3')); 2.22-2.31 (m, 1 H, H-C(3')); 2.45-2.55 (m, 2 H, H-C(2')); 4.08 (d, J = 2.8, 2 H, H-C(7')); 4.62-4.67 (m, 2 H, H-C(4')); 5.93-5.95 (m, 2 H, H-C(5') und H-C(6')); 6.30 (dd, J = 6.5, 2.8, 1 H, H-C(1')); 7.49 (d, J = 2.8, 1 H, arom. H(Cat.)); 8.18 (s, 1 H, H-C(8)); 8.26 (s, 1 H, H-C(2)); 8.50 (d, J = 2.8, 1 H, arom. H(Cat.)). 13C-NMR(75 MHz, CD3OD): 31.5; 33.8; 41.4; 83.4; 86.7; 108.5; 116.7; 120.8; 121.7; 131.1; 132.1; 133.8; 140.8; 150.3; 150.8; 154.1; 157.6; 168.8; 170.0 (CO). HR-MALDI-MS: Ber. für C19H19N7O6Na+ ([M+Na]+): 464.1294; Gef. 464.1293.

(2S)-2-Amino-3-phenylpropan-1-ol (121) [197]

OH

NH2

121

Eine Lösung aus Lithiumaluminiumhydrid (8.0 g, 210 mmol, 1.15 Äquiv.) in THF (400 ml) wurde auf 0 °C gekühlt. Innerhalb von 30 min wurde L-Phenylalanin (30.06 g, 182 mmol, 1 Äquiv.) hinzugefügt und das Gemisch während 2 h bei 0 °C gerührt. Danach wurde zum Sieden erhitzt und 16 h unter Rückfluss weitergerührt. Anschliessend wurde das Gemisch auf 0 °C gekühlt und mit Ether (330 ml) verdünnt, bevor nacheinander H2O (15 ml), 15% NaOH (15 ml) und nochmals H2O (40 ml) dazugegeben wurden. Das Gemisch wurde über Celite filtriert, das Filtrat eingeengt und schlussendlich destilliert (0.4 Torr, 110 °C).

Ausbeute: 18.05 g (66%). Farblose Kristalle. Fp. 88-90 °C (Lit. [197]: 92-94 °C). D20 = -23.7 (c = 1, EtOH) (Lit.[197]: D20 = -23.1). 1H-NMR (CDCl3, 200 MHz):

1.83 (br, 3 H, NH2 und OH); 2.52 (dd, J = 13.4, 8.7, 1 H, Ph-CH2); 2.80 (dd, J = 13.4,

Experimenteller Teil 176

5.3, 1 H, Ph-CH2); 3.08-3.16 (m, 1 H, CHN); 3.38 (dd, J = 10.6, 7.2, 1 H, CH2O); 3.64 (dd, J = 10.6, 4.1, 1 H, CH2O); 7.18-7.34 (m, 5 H, arom.).

(4S)-4-Benzyl-1,3-oxazolidin-2-thion (119) [198]

HN O

S

13 2

119

L-Phenylalaninol (2.313 g, 15.3 mmol, 1 Äquiv.) wurde in 1 N Natriumcarbonat (30 ml) gelöst, dann wurde Schwefelkohlenstoff (1.4 ml, 1.8 g, 23.2 mmol, 1.5 Äquiv.) dazugegeben. Die Lösung wurde während 15 min unter Rückfluss (unter Verwendung eines Energiekühlers) gerührt. Danach wurde die Lösung auf Raumtemperatur gekühlt, mit CH2Cl2 (3 x 40 ml) extrahiert, über Natriumsulfat getrocknet und anschliessend eingeengt. Es wurde ein gelbliches Öl erhalten, das chromatographisch gereinigt wurde (SiO2, Hexan/AcOEt 2:1).

Ausbeute: 2.29 g (77%). Gelbliches Öl. D20 = -118.5 (c = 1, CH2Cl2) (Lit. [198] 20D = -93.0). 1H-NMR (CDCl3, 200 MHz): 2.93-2.96 (m, 2 H, H-C(3)); 4.25-4.46

(m, 2 H, H-C(1)); 4.66-4.74 (m, 1 H, H-C(2)); 7.17-7.41 (m, 5 H, arom.); 7.90 (br, 1 H, NH).

(4S)-4-(Benzyl)-2-oxazolidinon (118) [199]

HN O

O

123

118

Experimenteller Teil 177

Eine Suspension von Kaliumcarbonat (1.1 g, 80 mmol, 1 Äquiv.) und L-Phenylalaninol(12.080, 80 mmol, 1 Äquiv.) in Diethylcarbonat (20 ml, 19.5 g, 165 mmol, 2.1 Äquiv.) wurde bei 140 °C gerührt und entstehendes EtOH über eine Vigreux-Kolonneabdestilliert. Nach 2 h wurden 9 ml EtOH erhalten. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurde CH2Cl2 (100 ml) zugegeben und das Gemisch filtriert. Das Filtrat wurde mit ges. NaHCO3-Lösung (100 ml) gewaschen, über MgSO4 getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wurde aus AcOEt/Hexan umkristallisiert.

Ausbeute: 11.935 g (84%). Farblose Kristalle. Fp. 87-88 °C (Lit. [199]: 87.0-88.5 °C). D20 = +5.7 (c = 1.1, EtOH) (Lit. [199]: D20 = +4.9). 1H-NMR (CDCl3, 200

MHz): 2.86-2.90 (m, 2 H, H-C(3)); 4.03-4.21 (m, 2 H, H-C(1)); 4.43-4.53 (m, 1 H, H-C(2)) ; 5.42 (br, 1 H, NH); 7.19-7.42 (m, 5 H, arom.).

(4S)-1-(4-Benzyl-2-thiooxazolidin-3-yl)pent-4-en-1-on (124) [196]

NO

SO

123

124

Zu einer auf -78 °C gekühlten Lösung aus Allylessigsäure (1.38 ml, 1.35 g, 13.5 mmol, 1.5 Äquiv.) und Triethylamin (1.88 ml, 1.37 g, 13.5 mmol, 1.5 Äquiv.) in THF (45 ml) wurde Pivaloylchlorid (1.55 ml, 1.52 g, 12.6 mmol, 1.4 Äquiv.) zugegeben. Nach 5 min wurde das Aceton-Trockeneis-Kühlbad durch ein Eis-Wasser-Bad ersetzt und das Gemisch während 2 h bei 0 °C gerührt. In der Zwischenzeit wurde in einem anderen Reaktionsgefäss (S)-4-Benzyl-1,3-oxazolidin-2-thion (119) (1.734 g, 9.0 mmol, 1 Äquiv.) in THF (9 ml) gelöst und auf -78 °C gekühlt bevor eine 1.6 M Lösung von n-Butyllithium in Hexan (6.75 ml, 4.73 g, 10.8 mmol, 1.2 Äquiv.) dazugetropft wurde. Diese Lösung wurde während 10 min gerührt, bevor sie über eine Teflonkanüle zur auf -78 °C abgekühlten Lösung des gemischten Anhydrids überführt wurde. Dieses Gemisch wurde 15 min bei -78 °C gerührt, dann auf 0 °C erwärmt und für 1 h weitergerührt. Danach wurde H2O (200 ml) hinzugefügt, die Phasen getrennt und die wässrige Phase mit Ether (3 x 220 ml) extrahiert, mit ges. NaCl gewaschen, über

Experimenteller Teil 178

Na2SO4 getrocknet und eingeengt. Das Produkt wurde chromatographisch gereinigt (SiO2, Hexan/AcOEt 4:1).

Ausbeute: 1.412 g (57%). Gelber Feststoff. Fp.: 56-58 °C. D20 = +113.1 (c = 1, CH2Cl2) (Lit. [196]: D20 = +119.8). 1H-NMR (CDCl3, 200 MHz): 2.43-2.55 (m, 2 H, CH2-C=O); 2.72-2.84 (dd, 1 H, J = 13.3, 10.0, CH-CH2-CH2); 3.15-3.62 (m, 3 H, H-C(3), CH-CH2-CH2);. 4.24-4.42 (m, 2 H, H-C(1)); 4.89-5.00 (m, 1 H, H-C(2)); 5.02-5.19 (m, 2 H, H2C=CH); 5.82-6.02 (m, 1 H, H2C=CH); 7.17-7.39 (m, 5 H, arom.).

(4S)-Benzyl-3-pent-4-enoyloxazolidin-2-on (128) [196]

NO

OO

123

128

Zu einer auf -78 °C abgekühlten Lösung aus 97%-iger Allylessigsäure (5.3 ml, 5.18 g, 50.2 mmol, 1.5 Äquiv.) und Triethylamin (7.0 ml, 5.08 g, 50.2 mmol, 1.5 Äquiv.) in THF (150 ml) wurde Pivaloylchlorid (5.8 ml, 5.66 g, 46.9 mmol, 1.4 Äquiv.) zugegeben. Nach 5 min wurde das Aceton-Trockeneis-Kühlbad mit einem Eis-Wasser-Bad ersetzt und das Gemisch während 2 h bei 0 °C gerührt. In der Zwischenzeit wurde in einem anderen Reaktionsgefäss (4S)-4-(Phenylmethyl)-2-oxazolidinon 118 (5.94 g, 33.5 mmol, 1 Äquiv.) in THF (40 ml) gelöst und auf -78 °C gekühlt bevor eine 1.6 MLösung von n-Butyllithium in Hexan (25.1 ml, 40.2 mmol, 1.2 Äquiv.) dazugetropft wurde. Diese Lösung wurde während 10 min gerührt, bevor sie über eine Teflonkanüle zur auf -78 °C abgekühlten Lösung des gemischten Anhydrids überführt wurde. Dieses Gemisch wurde 15 min bei -78 °C gerührt, dann auf 0 °C erwärmt und für 2 h weitergerührt. Danach wurde H2O (200 ml) hinzugefügt, die Phasen getrennt und die wässrige Phase mit AcOEt (200 ml) extrahiert, über Na2SO4 getrocknet, eingeengt und über Kieselgel filtriert (Hexan/AcOEt 3:1).

Ausbeute: 10.292 g (77%). Farbloses Öl. 1H-NMR (CDCl3, 200 MHz): 2.41-2.53 (m,2 H, CH2-C=O); 2.77(dd, J = 13.3, 9.6, 1 H, CH-CH2-CH2); 3.02-3.17 (m, 2 H, H-C(3)); 3.31 (dd, J = 13.3, 3.3, 1 H, CH-CH2-CH2); 4.11-4.26 (m, 2 H, H-C(1)); 4.63-

Experimenteller Teil 179

4.75 (m, 1 H, H-C(2)); 5.02-5.17 (m, 2 H, H2C=CH); 5.80-6.00 (m, 1 H, H2C=CH);7.19-7.40 (m, 5 H, arom.).

[3(2S,3R),4S]-3-(2-Allyl-3-hydroxy-4-methylhex-4-enoyl)-4-benzyloxazolidin-2-thion (125) [196]

NO

SOHO

1'

2' 3'

4'5'6'

7'

8'

12

3

125

Thiooxazolidinon 124 (220 mg, 0.8 mmol, 1 Äquiv.) wurde in CH2Cl2 (3.3 ml) gelöst und auf 0 °C gekühlt, dann wurde Titantetrachlorid (0.1 ml, 167 mg, 0.8 mmol, 1.1 Äquiv.) hinzugefügt, dabei färbte sich die Lösung gelb. Nach 5 min wurde (–)-Spartein (0.46 ml, 469 mg, 2.0 mmol, 2.5 Äquiv.) hinzugefügt. Die Lösung färbte sich dunkelrot und wurde noch 20 min gerührt, bevor sie auf -78 °C gekühlt wurde. Dann wurde Crotonaldehyd (0.1 ml, 84 mg, 1.2 mmol, 1.5 Äquiv.) zugetropft und weitere 30 min bei -78 °C gerührt, danach wurde die Reaktion mit halbgesättigter Ammonium-chloridlösung (25 ml) gestoppt, mit CH2Cl2 (4 x 25 ml) extrahiert, über Magnesiumsulfat getrocknet und am Rotationsverdampfer eingeengt. Das Produkt wurde chromatographisch gereinigt (SiO2, Hexan/AcOEt 2:1).

Ausbeute: 168 mg (61%). Gelbliches Öl. 1H-NMR (CDCl3, 200 MHz): 1.71 (d, J = 6.2, 3 H, H-C(8')); 2.45-2.57 (m, 2 H, H-C(3)); 2.71 (dd, J = 13.3, 10.0, 1 H, H-C(3')); 3.24 (dd, J = 13.3, 3.3, 1 H, H-C(3')); 4.16-4.32 (m, 2 H, H-C(1)); 4.42 (t, J = 5.5, 1 H, H-C(5')); 4.87-4.99 (m, 1 H, H-C(2)); 5.02-5.19 (m, 2 H, H-C(1')); 5.33 (dt, J = 9.1, 5.5, 1 H, H-C(4')); 5.53-6.02 (m, 3 H, H-C(2'), H-C(6'), H-C(7')); 7.19-7.37 (m, 5 H, arom.).

Experimenteller Teil 180

[3(2S,3R),4S]-3-(2-Allyl-3-hydroxy-4-methylhex-4-enoyl)-4-benzyloxazolidin-2-on (129) [196]

NO

OOHO

1'

2' 3'

4'5'6'

7'

12

3

129

Eine Lösung von Oxazolidinon 128 (4.272 g, 16.6 mmol, 1 Äquiv.) in CH2Cl2 (80 ml) wurde auf 0 °C gekühlt, dann wurde Titantetrachlorid (2.1 ml, 3.62 g, 19.1 mmol, 1.15 Äquiv.) hinzugetropft. Es bildete sich ein gelber Niederschlag. Nach 5 min wurde eine Lösung von (–)-Spartein (9.9 ml, 10.10 g, 43.1, 2.6 Äquiv.) in CH2Cl2 (10 ml) über eine Teflonkanüle zu dieser Suspension transferiert, dabei entstand eine dunkelrote Lösung, die 20 min bei 0 °C gerührt und dann auf -78 °C gekühlt wurde. Danach wurde frisch destilliertes Acrolein (1.7 ml, 1.44 g, 25.7 mmol, 1.55 Äquiv.) in CH2Cl2 (2 ml) langsam zugetropft, die Lösung auf 0 °C erwärmt und während 1 h gerührt. Dann wurden halbgesättigte Ammoniumchloridlösung (100 ml) hinzugefügt, dabei bildete sich ein Niederschlag, der über Celite filtriert wurde. Die Phasen wurden getrennt und die wässrige Phase mit CH2Cl2 (2 x 100 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Das Produkt wurde chromatographisch gereinigt (SiO2, Hexan/AcOEt 3:1).

Ausbeute: 3.676 g (70%). Farbloses Öl. 1H-NMR (CDCl3, 200 MHz): 2.45-2.62 (m, 2 H, H-C(3)); 2.67 (dd, J = 13.3, 10.0, 1 H, H-C(3')); 3.10 (dd, J = 13.3, 3.3, 1 H, H-C(3')); 4.09-4.33 (m, 3 H, H-C(1), H-C(4')); 4.46-4.51 (m, 1 H, H-C(5')); 4.67-4.77 (m,1 H, H-C(2)); 5.05-5.42 (m, 4 H, H-C(1'), H-C(7')); 5.79-6.02 (m, 2 H, H-C(2'), H-C(6')); 7.22-7.41 (m, 5 H, arom.).

Experimenteller Teil 181

(2R,3S,4E)-2-Allylhex-5-en-1,3-diol (126) [196]

HOHO

3'

2' 1'

234

5

6

126

1

Eine Lösung von Oxazolidinthion 125 (345 mg, 1 mmol, 1 Äquiv.) in THF (10 ml) wurde auf 0 °C gekühlt und mit MeOH (0.1 ml, 79 mg, 2.5 mmol, 2.5 Äquiv.) versetzt. Danach wurde eine 2 M Lösung von LiBH4 (1.1 ml, 2.2 mmol, 2.2 Äquiv.) in THF hinzugefügt und während 1 h bei 0 °C weitergerührt. Die Reaktion wurde mit 10% NaOH (3 ml) gestoppt und mit Wasser (50 ml) und Ether (50 ml) versetzt. Die Phasen wurden getrennt und die wässrige Phase mit AcOEt (3 x 50 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen wurden Phasen über Natriumsulfat getrocknet und am Rotationsverdampfer eingeengt. Das Produkt wurde chromatographisch gereinigt (SiO2, Hexan/AcOEt 2:1).

Ausbeute: 79 mg (51%). Gelbliches Öl. 1H-NMR (CDCl3, 200 MHz): 1.73 (d, J = 5.8, 3H, H-C(6)); 1.82-2.12 (m, 3 H, H-C(1'), H-C(2)); 2.70 (br, 2 H, OH); 3.63-3.79 (m, 2 H, H-C(1)); 4.28-4.34 (m, 1 H, H-C(3)); 5.01-5.11 (m, 2 H, H-C(3')); 5.51-5.91 (m, 3 H, H-C(2'), H-C(4), H-C(5)).

(2R,3R,4E)-3-(Acetyloxy)-2-allylhex-4-enylacetat (127) [196]

OO

3'

2' 1'

234

5

6

OO

1

127

Eine Lösung von Diol 126 (50 mg, 0.32 mmol, 1 Äquiv.) in CH2Cl2 (1 ml) wurde auf 0 °C gekühlt. Unter Rühren wurde Triethylamin (0.1 ml, 72 mg, 0.71 mmol, 2.2 Äquiv.) zugegeben und danach Essigsäureanhydrid (0.1 ml, 98 mg, 0.96 mmol, 3 Äquiv.)

Experimenteller Teil 182

zugetropft. Zusätzlich wurde eine Spatelspitze Dimethylaminopyridin (DMAP) hinzugegeben und das Gemisch während 2 h bei 0 °C gerührt, bevor die Reaktion mit 5%-iger HCl-Lösung (5 ml) gestoppt wurde. Es wurden Wasser (10 ml) und CH2Cl2(10 ml) dazugegeben, die Phasen getrennt und die organische Phase dreimal mit ges. Natriumhydrogencarbonat-Lösung, dann einmal mit ges. Natriumchlorid-Lösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und eingeengt.

Ausbeute: 34 mg (44%). Farbloses Öl. 1H-NMR (CDCl3, 200 MHz): 1.72 (dd, J = 6.2, 0.8, 3 H, H-C(6)); 1.99-2.09 (m, 7 H, H-C(2), CH3CO); 2.21-2.28 (m, 2 H, H-C(1')); 3.96-4.14 (m, 2 H, H-C(1)); 5.03-5.12 (m, 2 H, H-C(3')); 5.20 – 5.28 (m, 2 H, H-C(3), H-C(5)); 5.67-5.85 (m, 2 H, H-C(2'), H-C(4)).

[3(1R,2R)4S]-4-Benzyl-3-(2-hydroxycyclopent-3-encarbonyl)oxazolidin-2-on (130) [196]

NO

OOHO

1'

2'

3'4'

5' 12

3

130

Zu einer Lösung von 129 (3.588 g, 11.38 mmol, 1 Äquiv.) in CH2Cl2 (70 ml) wurde Grubbs-Katalysator [(Cy3P)2Cl2Ru=CHPh] (50 mg, 61 mol, 0.005 Äquiv.) zugegeben. Nach 2 h wurde mehr Ruthenium-Katalysator (52 mg, 63 mol, 0.005 Äquiv.) hinzugefügt. Da nach einer weiteren Stunde das Edukt noch nicht abreagiert hatte, wurde nochmals Katalysator (63 mg, 77 mol, 0.007 Äquiv.) dazugegeben. Nach insgesamt 4 h wurde über Nacht Luft durch das Reaktionsgemisch geblasen. Der Rückstand wurde chromatographisch gereinigt (SiO2, Hexan/AcOEt 1:1).

Ausbeute: 2.439 g (75%). Farbloses Öl. 1H-NMR (CDCl3, 200 MHz): 1.63-1.79 (br, 1 H, OH); 2.47-2.60 (m, 1 H, CH2-Ph); 2.81 (dd, J = 13.3, 10.0, 1 H, H-C(5')); 3.19-3.25 (m, 1 H, CH2-Ph); 3.37 (dd, J = 13.3, 3.3, 1 H, H-C(5')); 4.09-4.31 (m, 2 H, H-C(1)); 4.46-4.57 (m, 1 H, H-C(3')); 4.69-4.81 (m, 1 H, H-C(2)); 5.13 (m, 1 H, H-C(4')); 5.78-5.84 (m, 1 H, H-C(2')); 6.05-6.10 (m, 1 H, H-C(1')).

Experimenteller Teil 183

(1R, 5R)-5-Hydroxymethyl-2-cyclopenten-1-ol (131) [196]

HO

HO1

23

456

131

Eine Lösung von 130 (2.400 g, 8.4 mmol, 1 Äquiv.) in THF (80 ml) wurde auf 0 °C gekühlt, bevor MeOH (1.0 ml, 807 mg, 25.2 mmol, 3 Äquiv.) dazugegeben wurde. Dann wurde eine 2 M Lösung von LiBH4 in THF (12.6 ml, 25.2 mmol, 3 Äquiv.) dazugetropft und während 2 h bei 0 °C gerührt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 10%-iger Natriumhydroxid-Lösung (50 ml) gestoppt und mit Ether (50 ml) versetzt. Die Phasen wurden getrennt und die wässrige Phase mit AcOEt (6 x 50 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden getrocknet (Na2SO4) und dann eingeengt. Das Produkt wurde chromatographisch gereinigt (SiO2, AcOEt/Hexan 2:1).

Ausbeute: 637 mg (66%). Gelbliches Öl. 1H-NMR (CDCl3, 200 MHz): 2.21-2.37 (m,1 H, H-C(5)); 2.41-2.53 (m, 1 H, H-C(5)); 2.60-2.63 (br, 1 H, H-C(4)); 3.81 (br, 2 H, H-C(6)); 4.91 (m, 1 H, H-C(3)); 5.79-5.85 (m, 1 H, H-C(2)); 5.98-6.03 (m, 1 H, H-C(1)).

[(1R,2R)-2-(Acetyloxy)cyclopent-3-enyl]methylacetat (116) [196]

O

O

O

O

4

32

1 51'

116

Methode A

Diacetat 127 (7.565 g, 31.5 mmol, 1 Äquiv.) wurde in CH2Cl2 gelöst, [(Cy3P)2Cl2Ru=CHPh] (Grubbs-Katalysator) (259 mg, 0.32 mmol, 0.01 Äquiv.) wurde zugegeben und das Reaktionsgemisch bei Raumtemperatur während 1 h 30 min gerührt. Laut DC war immer noch Edukt vorhanden, daher wurde nochmals Ruthenium-Katalysator (259 mg 0.32 mmol, 0.01 Äquiv.) zugegeben und 1 h 30 min weitergerührt.

Experimenteller Teil 184

Danach wurde versucht, den Katalysator über eine Filtration über Silicagel abzutrennen, das Ergebnis war jedoch nicht befriedigend. Das Produkt konnte jedoch durch Kugelrohrdestillation gereinigt werden (100 °C, ~0.4 Torr; Aceton-Trockeneis als Kühlung).

Ausbeute: 2.477 g (40%). Leichtflüchtiges, farbloses Öl. D20 = -163.0 (c = 0.48, CHCl3) (Lit. [196]: D20 = -178, [266]: D20 = -143). 1H-NMR (CDCl3, 200 MHz): 2.00 (s, 3 H, CH3); 2.05 (s, 3 H, CH3); 2.24-2.31 (m, 1 H, H-C(5)); 2.41-2.55 (m,1 H, H-C(5)); 2.60-2.79 (m, 1 H, H-C(1)); 4.08-4.27 (m, 2 H, H-C(1')); 5.72-5.77 (m, 1 H, H-C(2)); 5.81-5.88 (m, 1 H, H-C(3)); 6.07-6.12 (m, 1 H, H-C(4)).

Methode B

Eine Lösung von Diol 131 (595 mg, 5.2 mmol, 1 Äquiv.) in CH2Cl2 (20 ml) wurde auf 0 °C gekühlt, dann wurde Triethylamin (1.6 ml, 1.16 g, 11.5 mmol, 2.2 Äquiv.) hinzugetropft. Essigsäureanhydrid (2.46 ml, 2.65 g, 26 mmol, 5 Äquiv.) und eine Spatelspitze DMAP wurden hinzugefügt und 3 h bei 0 °C gerührt. Nach der Zugabe von 5% HCl (20 ml) wurden die Phasen getrennt und die wässrige Phase mit CH2Cl2 (2 x 20 ml) rückextrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden dann mit ges. Natriumhydrogencarbonat-Lösung (20 ml) und ges. Natriumchlorid-Lösung (20 ml) gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Das Produkt wurde durch Kugelrohrdestillation gereinigt (100 °C, 0.4 Torr; Aceton Trockeneis als Kühlung).

Ausbeute: 820 mg (80%). Leichtflüchtiges, farbloses Öl. D20 = -161.3° (c = 0.46, CH2Cl2).

[(1S,4R)-4-(6-Amino-9H-purin-9-yl)cyclopent-2-enyl]methanol (133) [201]

N

NN

N

NH2

HO

133

1'3

1

2'3'

46'

4'

2

578

9

6

5'

Natriumhydrid (66%ig in Mineralöl, 96 mg, 2.4 mmol, 1.2 Äquiv.) und Adenin (364 mg, 2.6 mmol, 1.3 Äquiv.) wurden in entgastem (CH3)2SO (6 ml) suspendiert und während 15 min bei 45 °C gerührt, bevor eine Lösung von Tetrakis(triphenyl-

Experimenteller Teil 185

phosphin)palladium (112 mg, 0.1 mmol, 0.05 Äquiv.) und Diacetat 116 (396 mg, 2 mmol, 1 Äquiv.) in entgastem THF (6 ml) hinzugefügt wurde. Das Gemisch wurde 3 h bei 45 °C weitergerührt, dann wurde die Reaktion mit Wasser (25 ml) gestoppt und mit AcOEt (9 x 30 ml) extrahiert. Die organischen Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet und dann eingeengt. Das Rohprodukt wurde in THF/MeOH (1:1, 50 ml) aufgelöst, dann wurde 1 M NaOH (5 ml) hinzugefügt und während 45 min bei Raumtemperatur gerührt. Wasser (200 ml) wurde hinzugegeben, die Phasen wurden getrennt und die wässrige Phase mit AcOEt (8 x 250 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Das Rohprodukt wurde auf Celite aufgezogen, dann chromatographisch gereinigt (SiO2,MeOH/Chloroform 1:9).

Ausbeute: 265 mg (55%). Farbloser Feststoff. Fp. 183-185 °C (MeOH/CHCl3) (Lit. [267]: 183-186 °C). 1H-NMR (CD3OD, 200 MHz): 1.71 (dt, J = 13.7, 5.6, 1 H, H-C(5')); 2.78 (dt, J = 13.7, 8.7, 1 H, H-C(5')); 2.99-3.05 (m, 1 H, H-C(4')); 3.49-3.70 (m,2 H, H-C(6')); 5.65-5.73 (m, 1 H, H-C(1')); 5.92-5.97 (m, 1 H, H-C(3')); 6.20-6.24 (m, 1 H, H-C(2')); 8.13 (s, 1 H, H-C(8)); 8.20 (s, 1 H, H-C(2)).

Ethyl(E)-3-[(1R,3S)-3-(6-amino-9H-purin-9-yl)cyclopentyl]prop-2-enoat (135)

N

NN

N

NH2

135

1'3

1

2'3'

46'

4'

2

578

9

6

5'O

O

7'

Zu einer Lösung von 133 (503 mg, 2.18 mmol, 1 Äquiv.) in MeOH (45 ml) wurde 10%iger Pd/C Katalysator (145 mg) zugegeben. Die Suspension wurde während 3 h bei 20 °C hydriert (6 bar H2). Dann wurde über Celite filtriert, um den Katalysator abzutrennen, und das Filtrat eingeengt. Das Rohprodukt (509 mg) wurde entsprechend AAV 2 mit o-Iodoxybenzoesäure (IBX) (1.831 g, 6.54 mmol, 3 Äquiv.) und Ph3P=CHCO2Et (1.519 g, 4.36 mmol, 2 Äquiv.) in abs. (CH3)2SO (22 ml) während 15 h umgesetzt. Das Produkt wurde chromatographisch gereinigt (SiO2, CH2Cl2/MeOH/Et3N 94:5:1).

Experimenteller Teil 186

Ausbeute: 467 mg (71%). Braunes Öl. D20 = +6.6 (c = 1.0, CHCl3). IR (CHCl3): 3412w; 2995m; 1710m; 1630s; 1472w; 1437w; 1265m; 1048m; 693w. 1H-NMR (CDCl3, 300 MHz): 1.26 (t, J = 7.2, 3 H, CH2CH3); 1.85-2.18 (m, 4 H, H-C(2'), H-C(3')); 2.29-2.46 (m, 2 H, H-C(5')); 2.81-2.89 (m, 1 H, H-C(4')); 4.17 (q, 2 H, J = 7.2, CH2CH3); 4.91-4.97 (m, 1 H, H-C(1')); 5.85 (d, 1 H, J = 15.6, H-C(7')); 5.94 (br, 2 H, NH2); 7.00 (dd, J = 15.6, 7.8, 1 H, H-C(6')); 7.84 (s, 1 H, H-C(8)); 8.31 (s, 1 H, H-C(2)). 13C-NMR (75 MHz, CDCl3): 14.3; 30.0; 31.7; 38.9; 40.9; 55.5; 60.5; 121.1; 129.6; 133.8; 138.8; 150.8; 153.1; 155.9; 166.8 (CO). HR-MALDI-MS: Ber. für C15H20N5O2+ (MH+): 302.1617; Gef.: 302.1613.

(E)-3-[(1R,3S)-3-(6-Amino-9H-purin-9-yl)cyclopentyl]prop-2-en-1-ol (136)

N

NN

N

NH2

136

1'3

1

2'3'

46'

4'

2

578

9

6

5'HO

7'

8'

Eine Lösung von 135 (381 mg, 1.47 mmol, 1 Äquiv.) in CH2Cl2 (10 ml) wurde entsprechend AAV 3 mit einer 1 M DIBAL-H-Lösung in Hexan (5.92 ml, 5.92 mmol, 4 Äquiv.) während 1 h umgesetzt. Das Produkt wurde chromatographisch gereinigt (SiO2, MeOH/CHCl3 1:9).

Ausbeute: 143 mg (38%). Farbloser Feststoff. Fp. 118-121 °C. D20 = +23.8 (c = 0.48, MeOH). IR (KBr): 3197m; 1667m; 1606w; 1566w; 1479w; 1414w; 1340w;1310w; 1256w; 985w; 668w. 1H-NMR (CDCl3, 300 MHz): 1.73-2.13 (m, 4 H, H-C(2'), H-C(3')); 2.29-2.52 (m, 2 H, H-C(5')); 2.70-2.76 (m, 1 H, H-C(4')); 4.14 (d, J = 5.0, 2 H, H-C(8')); 4.92-4.98 (m, 1 H, H-C(1')); 5.68-5.83 (m, 4 H, H-C(6'), H-C(7'), NH2); 7.87 (s, 1 H, H-C(8)); 8.35 (s, 1 H, H-C(2)). 13C-NMR (75 MHz, CD3OD): 31.8; 32.5; 40.6; 42.6; 57.1; 63.6; 120.5; 130.0; 135.9; 141.0; 150.7; 153.5; 157.3. HR-MALDI-MS: Ber. für C13H18N5O+ (MH+): 260.1511; Gef.: 260.1505.

Experimenteller Teil 187

2-{(E)-3-[(1R,3S)-3-(6-Amino-9H-purin-9-yl)cyclopentyl}prop-2-enyl}isoindolin-1,3-dion (137)

N

NN

N

NH2

137

1'3

1

2'3'

46'

4'

2

578

9

6

5'N

7'

8'

O

O

Allylalkohol 136 (26 mg, 0.1 mmol, 1 Äquiv.) wurde entsprechend AAV 4(Aufarbeitungsmethode B) mit Phthalimid (18 mg, 0.12 mmol, 1.2 Äquiv.), Triphenylphosphin (31 mg, 0.12 mmol, 1.2 Äquiv.) und DEAD (19 l, 21 mg, 0.12 mmol, 1.2 Äquiv.) in THF (1 ml) innerhalb 15 h umgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde eingeengt und chromatographisch gereinigt (SiO2, CHCl3/MeOH 9:1).

Ausbeute: 29 mg (75%). Farblose Kristalle. Fp. 207-209 °C. D20 = +21.1 (c = 0.37, MeOH). IR (KBr): 3111br; 1716m; 1672w; 1603w; 1396w; 725w. 1H-NMR (CDCl3,200 MHz): 1.65-2.06 (m, 4 H, H-C(2'), H-C(3')); 2.21-2.45 (m, 2 H, H-C(5')); 2.61-2.67 (m, 1 H, H-C(4')); 4.22 (d, J = 5.9, 2 H, H-C(8')); 2.82-4.93 (m, 1 H, H-C(1')); 5.50-5.82 (m, 2 H, H-C(6'), H-C(7')); 6.39 (br, 2 H, NH2); 7.65-7.69 (m, 2 H, Phthalimid); 7.76-7.81 (m, 2 H, Phthalimid); 7.82 (s, 1 H, H-C(8)); 8.27 (s, 1 H, H-C(2)). 13C-NMR (75 MHz, CDCl3): 168.3; 156.0; 153.0; 150.3; 138.7; 137.4; 134.2; 132.4;123.5; 123.2;120.1; 55.3; 40.9; 39.5; 39.4; 31.9; 30.4. HR-MALDI-MS: Ber. für C21H21N6O2+ (MH+): 389.1726; Gef.: 389.1718.

9-{(1S,3R)-3-[(E)-3-aminoprop-1-enyl]cyclopentyl}-9H-purin-6-amin (134)

N

NN

N

NH2

134

1'3

1

2'3'

46'

4'

2

578

9

6

5'H2N

7'

8'

Experimenteller Teil 188

Phthalimid 137 (200 mg, 0.51 mmol) wurde nach AAV 5 (Aufarbeitungsmethode A) mit 33% MeNH2 in EtOH (20 ml) wurde während 12 h gespaltet.

Ausbeute: 144 mg (quantitativ). Farbloses Öl. D20 = +20.1 (c = 1, MeOH). IR (KBr): 3329br; 1647m; 1594m; 1475m; 1414w; 1303w; 1250w; 972w; 798w; 650w.1H-NMR (CD3OD, 300 MHz): 1.76-2.15 (m, 4H, H-C(2'), H-C(3')); 2.25-2.44 (m, 2H, H-C(5')); 2.69-2.73 (m, 1H, H-C(4')); 3.18-3.31 (m, 2H, H-C(8')); 4.84-4.98 (m, 1H, H-C(1')); 5.58-5.74 (m, 2H, H-C(6'), H-C(7')); 8.19 (s, 1H, H-C(8)); 8.21 (s, 1H, H-C(2)). 13C-NMR (75 MHz, CD3OD): 31.9; 32.5; 40.6; 42.7; 44.2; 57.1; 120.5; 130.4; 135.6; 141.0; 150.7; 153.5; 157.3. HR-MALDI-MS: Ber. für C13H19N6+ (MH+): 259.1671; Gef.: 259.1669.

N1-{(E)-3-[(1R,3S)-3-(6-Amino-9H-purin-9-yl)cyclopentyl]prop-2-enyl}-2,3-dihydroxy-5-nitrobenzamid (90)

N

NN

N

NH2

90

1'3

1

2'3'

46'

4'

2

578

9

6

5'HN

7'

8'

OHHOO

O2N

Amin 134 (26 mg, 0.1 mmol, 1 Äquiv.) wurde nach AAA 1 mit N-Hydroxysuccinimidester 41 (30 mg, 0.1 mmol, 1 Äquiv.) in trockenem DMF (1.5 ml) während 15 h umgesetzt.

Ausbeute: 11 mg (25%). Gelber Feststoff. 208-209 °C (Zers.). D20 = +11.8 (c = 1, (CH3)2SO). IR (KBr): 3398s; 3100s; 1700s; 1617m; 1513m; 1422w; 1339s; 1278m;1200s; 1133m; 967w; 889w; 833w; 794w; 723m. 1H-NMR (CD3OD, 300 MHz): 1.75-2.08 (m, 4 H, H-C(2'), H-C(3')); 2.18-2.36 (m, 2 H, H-C(5')); 2.67-2.73 (m, 1 H, H-C(4')); 3.90-3.95 (m, 2 H, H-C(8')); 4.91-4.96 (m, 1 H, H-C(1')); 5.59 (dt, J = 15.3, 5.3, 1 H, H-C(7')); 5.76 (dd, J = 15.3, 7.2, 1 H, H-C(6')); 7.71 (d, J = 2.5, 1 H, arom. H(Cat.)); 8.34 (s, 1 H, H-C(8)); 8.46 (d, J = 2.5, 1 H, arom. H(Cat.)); 8.49 (s, 1 H, H-C(2)). 13C-NMR (125 MHz, (CD3)2SO): 30.3; 31.1; 40.7; 40.8; 48.6; 55.3; 112.0; 114.3; 114.5; 118.7; 124.8; 135.2; 138.4; 146.9; 148.6; 151.7; 156.2; 158.1; 158.3; 167.8 (CO). HR-MALDI-MS: Ber. für C20H22N7O5+ (MH+): 440.1682; Gef.: 440.1681.

Experimenteller Teil 189

(2S,4S)-4-Hydroxytetrahydro-1H-pyrrol-2-carbonsäure ((+)-142) [204]

N

OH

O

OH H1

2

3 4

5

(+)-142

Zu einer auf 50 °C erwärmten Lösung aus Essigsäureanhydrid (4.7 ml, 50 mmol, 5.3 Äquiv.) in Essigsäure (15 ml) wurde trans-4-Hydroxy-L-prolin ((–)-138) (1.25 g, 9.5 mmol, 1 Äquiv.) zugegeben und anschliessend während 8 h unter Rückfluss gerührt. Dann wurde das Gemisch am Rotationsverdampfer eingeengt. Es verblieb ein bräunliches Öl, das in 2 N Salzsäure (15 ml) aufgenommen und während 6 h unter Rückfluss gerührt wurde. Der noch warmen Lösung wurde Aktivkohle hinzugefügt, das Gemisch durch Celite filtriert und am Rotationsverdampfer eingeengt. Dem öligen Rückstand wurde Et2O zugegeben, dabei entstand ein Niederschlag, der abfiltriert wurde. Der Rückstand (2.259 g) wurde in Wasser (9 ml) und Triethylamin (4.5 ml) gelöst, dann mit EtOH (180 ml) versetzt. Nach 1 h 30 min wurden die entstandenen, farblosen Nadeln abfiltriert und mit Et2O und EtOH gewaschen, dann zweimal mit H2O/EtOH (je 9 ml/180 ml) umkristallisiert.

Ausbeute: 650 mg (52%). Farblose Nadeln. Fp. 247-249 °C (EtOH/H2O (Zers.), Lit. [204]: 250-254 °C (Zers.)). [ ]D20 = +58.5 (c = 2, H2O) (Lit. [204]: [ ]D20 = +58.6 (c= 2, H2O)). 1H-NMR (300 MHz, D2O): 2.24 (d, J = 14.5, 1 H, H-C(3)); 2.50 (ddd, J = 14.5, 10.5, 4.7, 1 H, H-C(3)); 3.35 (dd, J = 12.3, 3.7, 1 H, H-C(5)); 3.45 (d, J = 12.3, 1 H, H-C(5)); 4.19 (dd, J = 10.5, 3.7, 1 H, H-C(2)); 4.57 (br, 1 H, H-C(4)).

Methyl(2R,4R)-4-Hydroxytetrahydro-1H-pyrrol-2-carboxylat Hydrochlorid ((+)-143) [205]

N

OH

O

O H1

2

3 4

5 · HCl

(+)-144

Experimenteller Teil 190

trans-4-Hydroxy-L-prolin (–)-138 (500 mg, 3.81 mmol, 1 Äquiv.) wurde in MeOH (16 ml) gelöst und auf 0 °C gekühlt, dann wurde Thionylchlorid (420 l, 5.80 mmol, 1.52 Äquiv.) zugetropft, das Gemisch auf 20 °C erwärmen gelassen und während 21 h weitergerührt. Die farblose Lösung wurde am Rotationsverdampfer eingeengt. Das erhaltene Öl wurde mit Et2O auskristallisiert, die Kristalle abfiltriert und mit Et2Ogewaschen.

Ausbeute: 679 mg (98%). Farblose Kristalle. Fp. 127 °C (Et2O, Lit. [205]: 121-123 °C). [ ]D20 = +10.8 (c = 1, MeOH)*. 1H-NMR (300 MHz, (CD3)2SO): 2.05-2.16 (m,1 H, H-C(3)); 2.26-2.35 (m, 1 H, H-C(3)); 3.13-3.24 (m, 2 H, H-C(5)); 3.74 (s, 3 H, OCH3); 4.36 (br, 1 H, H-C(4)); 4.48 (dd, J = 10.0, 4.0, 1 H, H-C(2)); 5.49 (br, 1 H, OH); 9.50-9.95 (br, 2 H, NH2).

Methyl(2S,4R)-4-Hydroxytetrahydro-1H-pyrrol-2-carboxylat Hydrochlorid ((–)-141) [202]

N

OH

O

O H1

2

3 4

5 · HCl

(-)-141

trans-4-Hydroxy-L-prolin (–)-138 (14.9 g, 114 mmol, 1 Äquiv.) wurde in MeOH (480 ml) gelöst und auf 0 °C gekühlt, dann wurde über einen Tropftrichter Thionylchlorid (12.6 ml, 173 mmol, 1.52 Äquiv.) zugetropft, das Gemisch auf 20 °C erwärmen gelassen und während 14 h weitergerührt. Die farblose Lösung wurde am Rotations-verdampfer eingeengt, wobei das Produkt auskristallisierte.

Ausbeute: 20.7 g (quantitativ). Farblose Nadeln. Fp. 168 °C (Lit. [202]: 162-164 °C). [ ]D20 = -24.1 (c = 1.05, MeOH) (Lit. [202]: [ ]D20 = -24.3 (c = 1.05, MeOH)). 1H-NMR (300 MHz, (CD3)2SO): 2.05-2.24 (m, 2 H, H-C(3)); 3.06 (d, J = 12.1, 1 H, H-C(5)); 3.37 (dd, J = 12.4, 4.3, 1 H, H-C(5)); 3.73 (s, 3 H, OCH3); 4.40-4.48 (m, 2 H, H-C(2) und H-C(4)); 5.58 (br, 1 H, OH); 9.00-10.60 (br, 2 H, NH2).

* Lit. Drehwert nicht vorhanden.

Experimenteller Teil 191

1-(1,1-Dimethylethyl)-2-methyl(2R,4R)-4-hydroxytetrahydro-1H-pyrrol-1,2-dicarboxylat ((+)-144) [206]

N

OH

O

O Boc1

2

34

5

(+)-144

Hydrochlorid (+)-143 (14.814 g, 81.6 mmol, 1 Äquiv.) wurde in CH2Cl2 (86 ml) suspendiert, dann NEt3 (48 ml, 342 mmol, 3 Äquiv.) hinzugefügt, bevor das Gemisch in einem Eis-Salz-Bad gekühlt wurde. Danach wurde Boc2O (21.389 g, 98 mmol, 1.2 Äquiv.) zugegeben, nach 15 min das Kühlbad entfernt und während 19 h bei 20 °C weitergerührt. Das Gemisch wurde mit 10% Zitronensäure (2 x 100 ml), NaHCO3 (100 ml) und mit ges. NaCl (100 ml) gewaschen, über Na2SO4 getrocknet und eingeengt.

Ausbeute: 16.762 (84%). Farbloser Feststoff. Fp. 83 °C (Lit. [206]: 78-79 °C). [ ]D20

= +60.1 (c = 1, MeOH) (Lit. [206]: [ ]D20 = +63.8 (c = 2.21, EtOH)). 1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 1.41 und 1.45 (2 x s, 9 H, Boc (Rotamere)); 2.02-2.13 (m, 1 H, H-C(3)); 2.24-2.39 (m, 1 H, H-C(3)); 3.46-3.71 (m, 2 H, H-C(5)); 3.76 und 3.78 (2 x s, 3 H, OCH3(Rotamere)); 4.25-4.38 (m, 2 H, H-C(2) und H-C(4)).

1-(1,1-Dimethylethyl)-2-methyl(2S,4R)-4-hydroxytetrahydro-1H-pyrrol-1,2-dicarboxylat ((–)-140) [203]

N

OH

O

O Boc1

2

3 4

5

(-)-140

Hydrochlorid (–)-141 (20.7 g, 114 mmol, 1 Äquiv.) wurde in CH2Cl2 (120 ml) suspendiert, dann NEt3 (48 ml, 342 mmol, 3 Äquiv.) hinzugefügt, bevor das Gemisch mit einem Eis-Salz-Bad gekühlt wurde. Danach wurde langsam Boc2O (30.0 g, 137

Experimenteller Teil 192

mmol, 1.2 Äquiv.) zugegeben, wobei das Reaktionsgemisch heftig aufschäumte. Nach 15 min wurde das Kühlbad entfernt und das Gemisch während 16 h bei 20 °C weitergerührt. Dann wurde das Reaktionsgemisch mit 10% Zitronensäure (2 x 100 ml), ges. NaHCO3-Lösung (100 ml) und mit ges. NaCl-Lösung (100 ml) gewaschen, über Na2SO4 getrocknet und am Rotationsverdampfer eingeengt.

Ausbeute: 27.9 g (quantitativ). Rosafarbenes Öl. [ ]D20 = -66.5 (c = 1, MeOH) (Lit. [203]: [ ]D20 = -64.9 (c = 0.98, CHCl3)). 1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 1.38 und 1.42 (2 x s, 9 H, Boc (Rotamere)); 2.00-2.06 (m, 1 H, H-C(3)); 2.24-2.35 (m, 1 H, H-C(3)); 3.40-3.63 (m, 2 H, H-C(5)); 3.70 (s, 3 H, OCH3); 4.33-4.44 (m, 2 H, H-C(2) und H-C(4)).

1-(1,1-Dimethylethyl)-2-methyl(2R,4S)-4-hydroxytetrahydro-1H-pyrrol-1,2-dicarboxylat ((+)-140) [204]

N

OH

O

O Boc1

2

3 4

5

(+)-140

Zu einer auf -15 °C gekühlten Lösung aus Alkohol (+)-144 (16.762 g, 68.3 mmol, 1 Äquiv.), PPh3 (20.984 g, 80.0 mmol, 1.17 Äquiv.) und Ameisensäure (3.02 ml, 80.0 mmol, 1.17 Äquiv.) in THF (395 ml) wurde DEAD (12.6 ml, 80.0 mmol, 1.17 Äquiv.) zugetropft. Die Lösung wurde auf 20 °C erwärmen gelassen und 18 h gerührt, dann am Rotationsverdampfer eingeengt. Bei der Reaktion entstandenes Triphenylphosphinoxid wurde mit Et2O auskristallisiert und abfiltriert. Das Filtrat wurde am Rotations-verdampfer eingeengt und chromatographisch gereinigt (SiO2, CH2Cl2/Aceton 20:1). Der farblose ölige Rückstand wurde in MeOH (256 ml) aufgenommen, mit 25% Ammoniaklösung (3.2 ml) versetzt, und dann 3 h bei 20 °C gerührt. Anschliessend wurde die Lösung eingeengt und der Rückstand chromatographisch gereinigt (SiO2,AcOEt).

Ausbeute: 15.962 g (95%). Farbloses Öl. [ ]D20 = +75.1 (c = 1, MeOH) (Lit. [204]: [ ]D20 = +78.7 (c = 0.63, MeOH)). 1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 1.38 und 1.42 (2 x s,

Experimenteller Teil 193

9 H, Boc (Rotamere)); 1.93-2.09 (m, 1 H, H-C(3)); 2.14-2.33 (m, 1 H, H-C(3)); 3.38-3.64 (m, 2 H, H-C(5)); 3.70 (s, 3 H, OCH3); 4.31-4.49 (m, 2 H, H-C(2) und H-C(4)).

1-(1,1-Dimethylethyl)-2-methyl(2S,4R)-4-[(methylsulfonyl)oxy]tetrahydro-1H-pyrrol-1,2-dicarboxylat ((–)-145a) [268]

N

O

O

O Boc

S

O

O

123

4

5

(-)-145a

Der Alkohol (–)-140 (620 mg, 2.53 mmol, 1 Äquiv.) wurde in Pyridin (5 ml) gelöst und auf 0 °C gekühlt, dann wurde Methylsulfonsäurechlorid (0.4 ml, 5.14 mmol, 2 Äquiv.) zugegeben und das Gemisch über Nacht (14 h) auf 20 °C erwärmen gelassen. Die Reaktion wurde dann mit H2O (5 ml) gestoppt, AcOEt (50 ml) zugegeben und die org. Phase mit 0.5 N HCl, H2O und ges. NaCl-Lösung (je 1 x 50 ml) gewaschen, über Na2SO4 getrocknet und am Rotationsverdampfer eingeengt. Der Rückstand wurde aus Et2O/Pentan umkristallisiert.

Ausbeute: 729 mg (89%). Rötlicher Feststoff. Fp. 76 °C (Et2O/Pentan, Lit. [268]: 85-86 °C). [ ]D20 = -45.0 (c = 1, CHCl3) (Lit. [268]: [ ]D20 = -52.3 (c = 1.6, CHCl3)).1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 1.39 und 1.43 (2 x s, 9 H, Boc (Rotamere)); 2.09-2.23 (m,1 H, H-C(3)); 2.42-2.72 (m, 1 H, H-C(3)); 2.84-3.18 (m, 2 H, H-C(5)); 3.68 (s, 3 H, OCH3); 4.21-4.54 (m, 1 H, H-C(2)); 5.22 (br, 1 H, H-C(4)).

Experimenteller Teil 194

1-(1,1-Dimethylethyl)-2-methyl(2S,4R)-4-{[(4-methylphenyl)sulfonyl]oxy}tetrahydro-1H-pyrrol-1,2-dicarboxylat ((–)-145b) [204]

N

O

O

O Boc

S

O

O

1'2'

3' 4'

5'32

56

1 4

(-)-145b

Der Alkohol (–)-140 (620 mg, 2.53 mmol, 1 Äquiv.) wurde in Pyridin (5 ml) gelöst und auf 0 °C gekühlt, dann wurde para-Toluolsulfonsäurechlorid (980 mg, 5.14 mmol, 2 Äquiv.) zugegeben und das Gemisch über Nacht (14 h) auf 20 °C erwärmen gelassen. Die Reaktion wurde mit H2O (5 ml) gestoppt, AcOEt (50 ml) zugegeben und die org. Phase mit 0.5 N HCl, H2O und ges. NaCl-Lösung (je 1 x 50 ml) gewaschen, über Na2SO4 getrocknet und am Rotationsverdampfer eingeengt.

Ausbeute: 876 mg (87%). Farbloses Öl. [ ]D20 = -36.3 (c = 1, CHCl3) (Lit. [204]: [ ]D20 = -37.4 (c = 0.7, CHCl3)). 1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 1.36 und 1.39 (2 x s, 9 H, Boc (Rotamere)); 2.03-2.17 (m, 1 H, H-C(3')); 2.34-2.54 (m, 1 H, H-C(3')); 2.43 (s, 3 H, ArCH3); 3.53-3.61 (m, 2 H, H-C(5')); 3.69 (s, 3 H, OCH3); 4.30-4.39 (m, 1 H, H-C(2')); 4.95-5.05 (m, 1 H, H-C(4')); 7.33, 7 76 (AA'BB', J = 8.1, 4 H, arom).

1-(1,1-Dimethylethyl)-2-methyl(2S,4R)-4-{[(4-bromophenyl)sulfonyl]oxy}tetrahydro-1H-pyrrol-1,2-dicarboxylat ((–)-145c)

N

O

O

O Boc

S

O

O

Br

1'2'

3' 4'

5'32

56

1 4

(-)-145c

Experimenteller Teil 195

Der Boc-geschützte Alkohol (–)-140 (490 mg, 2 mmol, 1 Äquiv.) wurde in Pyridin (4 ml) gelöst und auf 0 °C gekühlt, dann wurde para-Brombenzolsulfonsäurechlorid (715 mg, 2.8 mmol, 1.4 Äquiv.) zugegeben und das Gemisch über Nacht (14 h) auf 20 °C erwärmen gelassen. Die Reaktion wurde dann mit H2O (4 ml) gestoppt, AcOEt (50 ml) zugegeben und die org. Phase mit 0.5 N HCl, H2O und ges. NaCl-Lösung (je 1 x 50 ml) gewaschen, über Na2SO4 getrocknet und am Rotationsverdampfer eingeengt. Der Rückstand wurde aus Et2O/Pentan umkristallisiert.

Ausbeute: 489 mg (53%). Farblose Kristalle. Fp. 87 °C (Et2O/Pentan). [ ]D20 = -25.0 (c = 1, CHCl3). IR (KBr): 3434br; 1699s; 1409m; 1356m; 1181m; 1044m; 827m; 616w.1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 1.39 und 1.42 (2 x s, 9 H, Boc (Rotamere)); 2.09-2.23 (m,1 H, H-C(3')); 2.38-2.60 (m, 1 H, H-C(3')); 3.62-3.65 (m, 2 H, H-C(5')); 3.72 (s, 3 H, OCH3); 4.32-4.42 (m, 1 H, H-C(2')); 5.04-5.12 (m, 1 H, H-C(4')); 7.71, 7.76 ((AA'BB', J= 7.4, 4 H, arom). 13C-NMR (75 MHz, CDCl3): 28.2 und 28.3 (Boc, Rotamere); 36.1 und 37.3 (Rotamere); 51.9 und 52.3 (Rotamere); 57.0 und 57.3 (Rotamere); 78.9 und 79.6 (Rotamere); 80.9 (Boc); 129.0; 129.4; 132.7; 135.3; 153.0 und 153.6 (Boc-CO, Rotamere); 172.3 und 172.5 (Ester, Rotamere). ESI (%): 487 ([M+Na]+, 100). EA für C17H22NO7SBr (464.33): Ber. C 43.97, H 4.78, N 3.02; Gef. C 43.81, H 4.87, N 3.17.

1-(1,1-Dimethylethyl)-2-methyl(2S,4R)-4-{[(4-nitrophenyl)sulfonyl]oxy}tetrahydro-1H-pyrrol-1,2-dicarboxylat ((–)-145d) und

1-(1,1-Dimethylethyl)-2-methyl(2R,4S)-4-{[(4-nitrophenyl)sulfonyl]oxy}tetrahydro-1H-pyrrol-1,2-dicarboxylat ((+)-145d)

N

O

O

O Boc

S

O

O

NO2

N

O

O

O Boc

S

O

O

NO2

1'2'

3' 4'

5'32

56

1 4

1'2'

3' 4'

5'32

56

1 4

(-)-145d (+)-145d

Der Alkohol (–)-140 (12.264 g, 50 mmol, 1 Äquiv.) wurde in Pyridin (90 ml) gelöst und auf 0 °C gekühlt, dann wurde para-Nitrobenzolsulfonsäurechlorid (18.395 g, 83 mmol, 1.66 Äquiv.) zugegeben und das Gemisch über Nacht (14 h) in den Kühlschrank bei 4

Experimenteller Teil 196

°C gestellt. Die Reaktion wurde mit H2O (90 ml) gestoppt, AcOEt (250 ml) zugegeben und die org. Phase mit 0.5 N HCl, H2O und ges. NaCl-Lösung (je 1 x 250 ml) gewaschen, über Na2SO4 getrocknet und am Rotationsverdampfer eingeengt. Der Rückstand wurde aus Et2O/Pentan umkristallisiert.

(–)-145d: Ausbeute: 18.77 g (87%). Rötliche Kristalle. Fp. 96 °C (Et2O/Pentan).[ ]D20 = -31.9 (c = 1, CHCl3). IR (KBr): 2975w; 1741s; 1700s; 1533s; 1405s; 1288m;1184s; 1044m; 912m; 747m; 687w; 620m; 577m; 464w. 1H-NMR (300 MHz, CDCl3):1.36 und 1.40 (2 x s, 9 H, Boc (Rotamere)); 2.16-2.25 (m, 1 H, H-C(3')); 2.40-2.61 (m, 1 H, H-C(3')); 3.58-3.66 (m, 2 H, H-C(5')); 3.71 (s, 3 H, OCH3); 4.31-4.41 (m, 1 H, H-C(2')); 5.15 (s, 1 H, H-C(4')); 8.08, 8.39 (AA'BB', J = 8.7, 4 H, arom). 13C-NMR (75 MHz, CDCl3): 28.2 und 28.3 (Boc, Rotamere); 36.1 und 37.3 (Rotamere); 51.8 und 52.2 (Rotamere); 52.4 und 52.6 (Rotamere); 57.0 und 57.3 (Rotamere); 79.9 und 80.4 (Rotamere); 81.0 (Boc); 124.6; 129.0; 142.0; 150.7; 153.0 und 153.6 (Boc-CO, Rotamere); 172.3 (Ester). ESI (%): 453 (MNa+, 100). EA für C17H22N2O9S (430.43): Ber. C 47.44, H 5.15, N 6.51; Gef. C 47.58, H 5.26, N 6.45.

(+)-145d: Ausbeute: 23.84 g (85%) ausgehend von (+)-140 (15.962, 65 mmol). Rötliche Kristalle. Fp. 93-95 °C (Et2O/Pentan). [ ]D20 = +30.8 (c = 1, CHCl3).

1,1-Dimethyl(2S,4S)-4-(6-amino-9H-purin-9-yl)tetrahydro-1H-pyrrol-1,2-dicarboxylat ((+)-139) und

1,1-Dimethyl(2R,4R)-4-(6-amino-9H-purin-9-yl)tetrahydro-1H-pyrrol-1,2-dicarboxylat ((–)-139)

NO

O Boc

N

N

N

N

NH2

NO

O Boc

N

N

N

N

NH2

1'2'

3' 4'5'

61

23

4

57

89

1'2'

3' 4'5'

61

23

4

57

89

(+)-139 (-)-139

Experimenteller Teil 197

Adenin (337 mg, 2.5 mmol, 2.5 Äquiv.), Kaliumcarbonat (346 mg, 2.5 mmol, 2.5 Äquiv.), 18-Krone-6 (105 mg, 0.4 mmol, 0.4 Äquiv.) und Nitrobenzolsulfat (–)-145d(430 mg, 1 mmol, 1 Äquiv.) wurden in trockenem DMF (5 ml) suspendiert und während 6 h bei 80 °C gerührt. Nach Zugabe von CHCl3 und H2O (je 25 ml) wurden die Phasen getrennt und die wässrige Phase mit CHCl3 (25 ml) extrahiert, über Na2SO4 getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wurde chromatographisch gereinigt (SiO2, MeOH/ CH2Cl2 8:100) und dann aus AcOEt/Hexan umkristallisiert.

(+)-139: Ausbeute: 261 mg (72%). Farblose Kristalle. Fp. 187 °C (AcOEt/Hexan). [ ]D20 = +17.3 (c = 1, CHCl3). IR (KBr): 3325m; 3176m; 2976w; 1749s; 1699s; 1598s;1475m; 1401s; 1300m; 1257m; 1158s; 896w; 798w; 727w; 648w. 1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 1.39 (s, 9 H, Boc); 2.34-2.54 (m, 1 H, H-C(3')); 2.75-2.90 (m, 1 H, H-C(3')); 3.59 (s, 3 H, OCH3); 3.75-3.99 (m, 1 H, H-C(5')); 4.03-4.17 (m, 1 H, H-C(5')); 4.31-4.49 (m, 1 H, H-C(2')); 5.05-5.18 (m, 1 H, H-C(4')); 6.33 (s, 2 H, NH2); 7.93 (s, 1 H, H-C(8)); 8.27 (s, 1 H, H-C(2)). 13C-NMR (125 MHz, CDCl3): 28.1 und 28.2 (Boc, Rotamere); 35.1 und 36.3 (Rotamere); 50.2 und 50.9 (Rotamere); 51.6; 52.3 und 52.5 (Rotamere); 57.3 und 57.8 (Rotamere); 81.0 (Boc); 119.6 und 120.0 (Rotamere); 138.3; 149.8 und 150.0 (Rotamere); 152.9; 153.2 und 153.8 (Boc-CO, Rotamere); 155.8; 172.3 (Ester). ESI (%): 363 (MH+, 100). EA für C16H22N6O4 (362.39): Ber. C 53.03, H 6.12, N 23.19; Gef. C 53.15, H 6.31, N 23.13.

(–)-139: Ausbeute: 12.051 g (60%) ausgehend von (+)-145d (23.709 g, 55.1 mmol). Fp. 183-187 °C (AcOEt/Hexan). [ ]D20 = -13.0 (c = 1, CHCl3).

1,1-Dimethyl(2S,4S)-4-(6-amino-9H-purin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)tetrahydro-1H-pyrrol-1,2-dicarboxylat ((–)-147) und

1,1-Dimethyl(2R,4R)-4-(6-amino-9H-purin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)tetrahydro-1H-pyrrol-1,2-dicarboxylat ((+)-147)

NHO

Boc

N

N

N

N

NH2

1'2'

3' 4'5'

61

23

4

57

89

NHO

Boc

N

N

N

N

NH2

1'2'

3' 4'5'

61

23

4

57

89

(-)-147 (+)-147

Experimenteller Teil 198

Methylester (+)-139 (257 mg, 0.7 mmol, 1 Äquiv.) wurde in THF (2 ml) gelöst und auf 0 °C gekühlt, dann wurden LiCl (89 mg, 2.1 mmol, 3 Äquiv.) und NaBH4 (79 mg, 2.1 mmol, 3 Äquiv.) hinzugefügt. EtOH (4 ml) wurde zugegeben und das Gemisch während 1 h bei 0 °C gerührt, dann während 11 h bei 55 °C gerührt und über Nacht (14 h) bei 20 °C weitergerührt. Dem Gemisch wurde dann 10% Essigsäure (15 ml) zugegeben, bevor es am Rotationsverdampfer eingeengt und chromatographisch (SiO2,MeOH/CH2Cl2 7:93 -> 10:90) gereinigt wurde. Umkristallisation aus Et2O/Hexan ergab das gewünschte Produkt.

(–)-147: Ausbeute: 208 mg (89%). Farblose Kristalle. Fp. 110 °C (Et2O/Hexan).[ ]D20 = -8.5 (c = 1, MeOH). IR (KBr): 3329m; 3176m; 2975w; 1651m; 1598w;1475w; 1418m; 1163m. 1H-NMR (300 MHz, CD3OD): 1.48 (s, 9 H, Boc); 2.48-2.63 (m, 1 H, H-C(3')); 2.64-2.77 (m, 1 H, H-C(3')); 3.59-3.69 (m, 1 H, CH2OH); 3.70-3.89 (m, 2 H, H-C(5') und CH2OH); 3.98-4.09 (m, 1 H, H-C(5')); 4.19-4.28 (m, 1 H, H-C(2')); 4.97-5.10 (m, 1 H, H-C(4')); 8.19 (s, 1 H, H-C(8)); 8.23 (s, 1 H, H-C(2)). 13C-NMR (75 MHz, CD3OD): 28.5 (Boc); 33.8 und 34.6 (Rotamere); 51.7 und 52.0 (Rotamere); 53.3; 59.0; 63.7; 81.4 (Boc); 120.0; 140.4; 150.4; 153.3; 155.8 (Boc-CO); 156.9. ESI (%): 335 (MH+, 100). EA für C15H22N6O3 (334.38): Ber. C 53.88, H 6.63, N 25.13; Gef. C 53.88, H 6.69, N 25.27.

(+)-147: Ausbeute: 9.344 g (85%) ausgehend von (–)-139 (11.879 g, 32.8 mmol). Farblose Kristalle. Fp. 107-109 °C (Et2O/Hexan). [ ]D20 = +8.1 (c = 1, MeOH).

1,1-Dimethyl(2S,4S)-4-(6-amino-9H-purin-9-yl)-2-[(E)-3-(ethyloxy)-3-oxoprop-1-enyl]tetrahydro-1H-pyrrol-1-carboxylat ((+)-148) und

1,1-Dimethyl(2R,4R)-4-(6-amino-9H-purin-9-yl)-2-[(E)-3-(ethyloxy)-3-oxoprop-1-enyl]tetrahydro-1H-pyrrol-1-carboxylat ((–)-148)

NBoc

N

N

N

N

NH2

O

O1'

2'

3' 4'5'

61

23

4

57

89

NBoc

N

N

N

N

NH2

O

O1'

2'

3' 4'5'

61

23

4

57

89

(+)-148 (-)-148

6'

7'7'

6'

Experimenteller Teil 199

Alkohol (–)-147 (321 mg, 0.96 mmol, 1 Äquiv.) wurde gemäss AAV 2 mit o-Iodoxybenzoesäure 50 (IBX) (806 mg, 2.88 mmol, 3 Äquiv.) und Ph3P=CHCO2Et (669 mg, 1.92 mmol, 2 Äquiv.) in (CH3)2SO (3.9 ml) innerhalb von 42 h umgesetzt. Das Produkt wurde chromatographisch gereinigt (SiO2, MeOH/AcOEt 10:90).

(+)-148: Ausbeute: 208 mg (54%). Farblose Kristalle. Fp. 97 °C (CH2Cl2/Pentan). [ ]D20 = +11.3 (c = 1, CHCl3). IR (KBr): 3328m; 3179m; 2978w; 1699s; 1645s;1597m; 1475m; 1394s; 1368m; 1301m; 1265m; 1162m; 1125w; 1040w; 980w; 865w;798w; 648w. 1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 1.20 (t, J = 7.2, 3 H, CH2CH3); 1.38 (s, 9 H, Boc); 2.36-2.46 (m, 1 H, H-C(3')); 2.68-2.77 (m, 1 H, H-C(3')); 3.79-3.69 (m, 1 H, H-C(5')); 4.08-4.20 (m, 3 H, H-C(5') und CH2CH3); 4.50 (br, 1 H, H-C(2')); 4.95-5.05 (m, 1 H, H-C(4')); 5.86 (d, J = 15.5, 1 H, H-C(7')); 6.48 (s, 2 H, NH2); 6.83 (dd, J = 15.5, 6.7, 1 H, H-C(6')); 7.82 (s, 1 H, H-C(8)); 8.26 (s, 1 H, H-C(2)). 13C-NMR (75 MHz, CDCl3): 14.4; 28.5 (Boc); 37.6; 50.3; 52.3; 57.0; 60.7; 81.0 (Boc); 120.1; 121.7; 138.3; 147.6; 150.2; 153.1; 154.2 (Boc-CO); 156.0; 166.2 (Ester). HR-MALDI-MS: Ber. für C19H26N6O4Na+ ([M+Na]+): 425.1913; Gef. 425.1906. EA für C19H26N6O4

(402.45): Ber. C 56.70, H 6.51, N 20.88; Gef. C 56.85, H 6.42, N 20.79.

(–)-148: Ausbeute: 3.844 g (53%) ausgehend von Alkohol (+)-149 (6.000 g, 17.9 mmol). Farblose Kristalle. Fp. 98 °C (CH2Cl2/Pentan). [ ]D20 = -12.6 (c = 1, CHCl3).

1,1-Dimethyl(2S,4S)-4-(6-amino-9H-purin-9-yl)-2-[(E)-3-hydroxyprop-1-enyl]tetrahydro-1H-pyrrol-1-carboxylat ((+)-149) und

1,1-Dimethyl(2R,4R)-4-(6-amino-9H-purin-9-yl)-2-[(E)-3-hydroxyprop-1-enyl]tetrahydro-1H-pyrrol-1-carboxylat ((–)-149)

NBoc

N

N

N

N

NH2

HO1'

2'

3' 4'5'

61

23

4

57

89

NBoc

N

N

N

N

NH2

HO1'

2'

3' 4'5'

61

23

4

57

89

(+)-149 (-)-149

7'7'

8' 8' 6'6'

Experimenteller Teil 200

Ethylester (+)-148 (5.6 g, 13.9 mmol, 1 Äquiv.) wurde in THF (60 ml) gelöst und gemäss AAV 3 mit 1 M DIBAL-H-Lösung in Hexan (73.9 ml, 73.9 mmol, 5.3 Äquiv.) innerhalb von 1 h reduziert. Das Produkt wurde chromatographisch gereinigt (SiO2,MeOH/AcOEt 15:85 18:82).

(+)-149: Ausbeute: 2.51 g (50%). Farbloser Schaum. [ ]D20 = +20.9 (c = 1, CHCl3).IR (KBr): 3326m; 3181m; 2976m; 1690s; 1645s; 1598m; 1576m; 1476m; 1411s;1366m; 1331m; 1301m; 1256m; 1162m; 1117w; 1013w; 976w; 874w; 798w; 649w. 1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 1.42 (s, 9 H, Boc); 2.28-2.39 (m, 1 H, H-C(3')); 2.61-2.73 (m,1 H, H-C(3')); 3.73-3.83 (m, 1 H, H-C(5')); 4.08-4.18 (m, 3 H, H-C(5') und H-C(8')); 4.44 (br, 1 H, H-C(2')); 5.01 (t, J = 7.5, 1 H, H-C(4')); 5.66 (br, 2 H, H-C(6') und H-C(7')); 6.15 (br, 2 H, NH2); 7.85 (s, 1 H, H-C(8)); 8.28 (s, 1 H, H-C(2)). 13C-NMR (75 MHz, CDCl3): 28.6 (Boc); 38.0; 50.8; 52.7; 57.5; 62.6; 80.6 (Boc); 120.0; 130.7; 131.5; 138.7; 150.2; 153.2; 154.6 (Boc-CO); 155.8. HR-MALDI-MS: Ber. für C17H24N6O3Na+ ([M+Na]+): 383.1813; Gef. 383.1815.

(–)-149: Ausbeute: 2.287 g (68%) ausgehend von (–)-148 (3.760 g, 9.3 mmol). Farbloser Schaum. [ ]D20 = -19.6 (c = 1, CHCl3).

1,1-Dimethyl(2S,4S)-4-(6-amino-9H-purin-9-yl)-2-[(E)-3-(1,3-dioxo-2,3-dihydro-1H-isoindol-2-yl)prop-1-enyl]tetrahydro-1H-pyrrol-1-carboxylat ((–)-150) und

1,1-Dimethyl(2R,4R)-4-(6-amino-9H-purin-9-yl)-2-[(E)-3-(1,3-dioxo-2,3-dihydro-1H-isoindol-2-yl)prop-1-enyl]tetrahydro-1H-pyrrol-1-carboxylat ((+)-150)

NBoc

N

N

N

N

NH2

N

O

O

1'2'

3' 4'5'

61

23

4

57

89

NBoc

N

N

N

N

NH2

N

O

O

1'2'

3' 4'5'

61

23

4

57

89

(-)-150 (+)-150

7'7'

8'6'8'

6'

Alkohol (+)-149 (360 mg, 1 mmol, 1 Äquiv.), Phthalimid (177 mg, 1.2 mmol, 1.2 Äquiv.) und PPh3 (315 mg, 1.2 mmol, 1.2 Äquiv.) wurden in THF (4 ml) gelöst und gemäss AAA 4 (Aufarbeitungsmethode B) mit DEAD (187 l, 1.2 mmol, 1.2 Äquiv.)

Experimenteller Teil 201

während 16 h umgesetzt. Das Produkt wurde chromatographisch gereinigt (SiO2,MeOH/AcOEt 10:90).

(–)-150: Ausbeute: 452 mg (92%). Gelblicher Schaum. Fp. 98-107 °C. [ ]D20 = -3.9 (c = 1, CHCl3). IR (KBr): 3324m; 3175m; 2976m; 2930w; 1772m; 1717s; 1638s;1595m; 1574m; 1469m; 1394s; 1366m; 1330m; 1299m; 1252m; 1162s; 1112m; 1046w;956w; 874w; 798w; 722m; 648w. 1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 1.38 (s, 9 H, Boc); 2.28-2.40 (m, 1 H, H-C(3')); 2.65-2.77 (m, 1 H, H-C(3')); 3.68-3.77 (m, 1 H, H-C(5')); 4.12-4.32 (m, 3 H, H-C(5') und H-C(8')); 4.41 (br, 1 H, H-C(2')); 5.00 (t, J = 7.5, 1 H, H-C(4')); 5.57-5.76 (m, 2 H, H-C(6') und H-C(7')); 6.17 (br, 2 H, NH2); 7.70, 7.84 (AA'BB', J = 5.6, 3.1, 4 H, arom. H(Phthalimid)); 7.84 (s, 1 H, H-C(8)); 8.29 (s, 1 H, H-C(2)). 13C-NMR (75 MHz, CDCl3): 28.3 (Boc); 37.8; 38.8; 50.5; 52.1; 57.2; 80.4 (Boc); 119.8; 123.2; 124.5; 131.9; 133.9; 134.2; 138.2; 149.9; 152.8; 154.0 (Boc-CO); 155.5; 167.6 (Imid). HR-MALDI-MS: Ber. für C25H27N7O4Na+ ([M+Na-Boc]+):390.1673; Gef. 390.1675.

(+)-150: Ausbeute: 2.25 g (75%) ausgehend von (–)-149 (2.194 g, 6.1 mmol). Gelblicher Schaum. Fp. 101-110 °C. [ ]D20 = +3.2 (c = 1, CHCl3).

1,1-Dimethyl(2S,4S)-2-[(E)-3-aminoprop-1-enyl]-4-(6-amino-9H-purin-9-yl)tetrahydro-1H-pyrrol-1-carboxylat ((–)-146) und

1,1-Dimethyl(2R,4R)-2-[(E)-3-aminoprop-1-enyl]-4-(6-amino-9H-purin-9-yl)tetrahydro-1H-pyrrol-1-carboxylat ((+)-146)

NBoc

N

N

N

N

NH2

H2NNBoc

N

N

N

N

NH2

H2N 1'2'

3' 4'5'

61

23

4

57

89

1'2'

3' 4'5'

61

23

4

57

89

(-)-146 (+)-146

7' 7'

8'8' 6' 6'

Phthalimid (–)-150 (1.000 g, 2.04 mmol) wurde gemäss AAV 5 (Aufarbeitungsmethode B) mit 33% Methylamin in EtOH (47 ml) während 20 h umgesetzt.

Experimenteller Teil 202

(–)-146: Ausbeute: 542 mg (74%). Farbloser Feststoff. Fp. 127-134 °C (Et2O). [ ]Hg36520 = -1.7 (c = 1, MeOH). IR (KBr): 3322m; 3171m; 2975w; 2919w; 2359m;2336m; 1681s; 1650s; 1597m; 1572m; 1471m; 1399s; 1365m; 1329m; 1298m; 1253m;1158m; 1110w; 965w; 870w; 772w; 724w; 646w. 1H-NMR (300 MHz, CD3OD): 1.46 (s, 9 H, Boc); 2.43-2.53 (m, 1 H, H-C(3')); 2.66-2.77 (m, 1 H, H-C(3')); 3.20 (d, J = 6.0, 2 H, H-C(8')); 3.82 (dd, J = 11.0, 9.0, 1 H, H-C(5')); 4.16 (dd, J = 11.0, 7.0, 1 H, H-C(5')); 4.42 (dd, J = 13.0, 7.5, 1 H, H-C(2')); 4.97-5.08 (m, 1 H, H-C(4')); 5.54-5.73 (m,2 H, H-C(6') und H-C(7')); 8.19 (s, 1 H, H-C(8)); 8.19 (s, 1 H, H-C(2)). 13C-NMR (75 MHz, CD3OD): 28.6 (Boc); 38.2; 43.5; 51.0; 53.8; 58.9; 81.3 (Boc); 120.1; 131.9; 140.6; 150.4; 153.3; 155.8; 156.9.* HR-MALDI-MS: Ber. für C17H26N7O2+ ([MH-Boc]+): 260.1618; Gef. 260.1620.

(+)-146: Ausbeute: 600 mg (74%) ausgehend von (+)-150 (1.100 g, 2.25 mmol). Farbloser Feststoff. Fp. 126 °C (MeOH/Et2O). [ ]Hg36520 = +1.6 (c = 1, MeOH).

N1-{(E)-3-[(2S,4S)-4-(6-Amino-9H-purin-9-yl)tetrahydro-1H-pyrrol-2-yl]prop-2-enyl}-2,3-dihydroxy-5-nitrobenzol-1-carboxamid ((–)-91) und

N1-{(E)-3-[(2R,4R)-4-(6-Amino-9H-purin-9-yl)tetrahydro-1H-pyrrol-2-yl]prop-2-enyl}-2,3-dihydroxy-5-nitrobenzol-1-carboxamid ((+)-91)

HN

N

N

N

N

NH2

NH

OH

HO

NO2

O

HN

N

N

N

N

NH2

NH

OH

HO

NO2

O

1'2'

3' 4'5'

61

23

4

57

89

1'2'

3' 4'5'

61

23

4

57

89

(-)-91 (+)-91

7' 7'

6'8' 8' 6'

(–)-146 (50 mg, 0.14 mmol, 1 Äquiv.) wurde in DMF (3 ml) gelöst, NEt3 (58 l, 0.42 mmol, 3 Äquiv.) und N-Hydroxysuccinimidester 41 (41 mg, 0.14 mmol, 1 Äquiv.)

* Zwei Signale im aromatischen Bereich überlappen sich, deswegen sind nur 14 der erwarteten 15 Signale sichtbar.

Experimenteller Teil 203

wurden zugefügt und bei 20 °C während 20 h gerührt, danach wurde das Gemisch am Rotationsverdampfer eingeengt. H2O (0.8 ml) und TFA (2.0 ml) wurden zugegeben und die Lösung während 2 h bei 20 °C gerührt, am Rotationsverdampfer eingeengt, der Rückstand in 25% NH3/H2O 1:10 (45 ml) aufgenommen und mittels Umkehrphasen-HPLC gereinigt (200 ml 0.5% HCOOH in H2O, dann 1% HCOOH in H2O/CH3CN 1:0 -> 0:1 in 100 min). Nach Einengen der Fraktionen wurde der Rückstand in H2O (3 x 20 ml) aufgenommen und wieder eingeengt, um verbleibende Ameisensäure zu entfernen. Das Produkt wurde aus MeOH/Et2O umkristallisiert.

(–)-91: Ausbeute: 44 mg (71%). Gelber Feststoff. Fp. 217-222 °C (Zers., MeOH/Et2O). [ ]Hg57820 = -9.7 (c = 0.3, TFA/(CH3)2SO 1:20). IR (KBr): 3419m;3188m; 1635s; 1600m; 1473m; 1418w; 1331m; 1261s; 1076w; 982w; 901w; 825w;794w; 648w. 1H-NMR (300 MHz, (CH3)2SO, 1 Tropfen TFA-d): 2.28-2.50 (m, 1 H, H-C(3')); 2.68-2.84 (m, 1 H, H-C(3')); 3.56-3.67 (m, 1 H, H-C(5')); 3.74-3.87 (m, 1 H, H-C(5')); 3.94-4.04 (m, 2 H, H-C(8')); 4.24-4.38 (m, 1 H, H-C(2')); 5.37-5.50 (m, 1 H, H-C(4')); 5.88 (dd, J = 16.0, 8.0, 1 H, H-C(6'); 6.00-6.12 (m, 1 H, H-C(7')); 7.75 (d, J = 2.5, 1 H, arom. H(Cat.)); 8.45 (d, J = 2.5, 1 H, arom. H(Cat.)); 8.53 (s, 1 H, H-C(8)); 8.64 (s, 1 H, H-C(2)). 13C-NMR (75 MHz, (CH3)2SO, 1 Tropfen TFA-d): 36.1; 47.9; 52.1; 59.6; 64.9; 112.0; 114.0; 114.4; 118.4; 124.0; 133.7; 138.5; 142.3; 145.0; 146.8; 148.3; 150.2; 155.5; 167.7. HR-MALDI-MS: Ber. für C19H21N8O5+ (MH+): 441.1629; Gef. 441.1632.

(+)-91: Ausbeute: 104 mg (84%) ausgehend von (+)-146 (100 mg, 0.28 mmol). Farbloser Feststoff. Fp. 217-225 °C (Zers., MeOH/Et2O). [ ]Hg57820 = +9.7 (c = 0.3, TFA/(CH3)2SO 1:20).

5.5 Experimentelle Daten zu Kapitel 4

2,3-O-Cyclohexyliden-D-ribose (169) [235]

OO

O OHHO

169

1'

2'3'4'

5'

Experimenteller Teil 204

Zu einer Lösung von D-Ribose (20.82 g, 0.139 mol, 1 Äquiv.) in Cyclohexanon (140 ml) wurde para-Toluolsulfonsäure-Monohydrat (0.5 g, 2.6 mmol, 2 mol%) zugegeben und während 14 h bei 20 °C gerührt. Dann wurde AcOEt (350 ml) zugegeben und mit H2O (220 ml) extrahiert. Die organische Phase wurde mit MgSO4 getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wurde chromatographisch gereinigt (SiO2, AcOEt/Hexan 2:1).

Ausbeute: 25.0 g (84%). Farbloses Öl. [ ]D20 = -17.2 (c = 1, CHCl3) (Lit. [235]: [ ]D20 = -20.0 (c = 1, CHCl3)). 1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 1.29-1.79 (m, 10 H, Cyclohexyliden); 3.66-3.79 (m, 2 H, H-C(5')); 4.33-4.41 (s, 1 H, H-C(4')); 4.55 (d, J =5.6, 1 H, H-C(2')); 4.80 (d, J = 5.6, 1 H, H-C(3')); 5.39 (d, J = 5.6, 1 H, H-C(1')).

2,3-O-Cyclohexyliden-D-ribonolacton (170) [229]

OO

O OHO

170

1'

2'3'4'

5'

Zu einer Lösung von 169 (3.07 g, 13.3 mmol, 1 Äquiv.) in CH2Cl2 (40 ml) wurde unter starkem Rühren Pyridiniumchlorochromat (PCC) (5.7 g, 26.6 mmol, 2 Äquiv.) zugegeben und 16 h bei 20 °C gerührt. Es bildete sich eine schwarze Suspension. Das Reaktionsgemisch wurde über Kieselgel filtriert und mit AcOEt/Hexan (2:1, 1000 ml) eluiert. Ausbeute: 840 mg (28%). Farbloses Öl. [ ]D20 = -52.0 (c = 1, CHCl3) (Lit. [269]: [ ]D20 = -54.6 (c = 0.99)). 1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 1.29-1.69 (m, 10 H, Cyclohexyliden); 2.24 (br, 1 H, HO-C(5')), 3.79 (d, J = 11.7, 1 H, H-C(5')); 3.97 (d, J = 11.7, 1 H, H-C(5')); 4.61 (s, 1 H, H-C(4')); 4.74 (d, J = 4.2, 1 H, H-C(2')); 4.81 (d, J = 4.2, 1 H, H-C(3')).

Experimenteller Teil 205

2,3-O-Cyclohexyliden-D-erythruronolacton (171) [229]

OO

O OHO

171

1'

2'3'

4'

170 (6.09 g, 26.6 mmol, 1 Äquiv.) wurde während 15 min bei 40 °C mit 0.5 M KOH (60 ml) gerührt, wobei sich eine gelbe Lösung bildete. Nach Abkühlen auf 0 °C wurde eine Lösung von wasserfreiem Kaliumperiodat (6.73 g, 29.39 mmol, 1.1 Äquiv.) in H2O (40 ml) zugegeben und 5 h bei 0 °C gerührt. Nach der Zugabe von Bariumchloriddihydrat (2 g) in H2O (20 ml) wurde mit 2 M HCl (60 ml) auf pH 3 angesäuert und mit AcOEt extrahiert (3 x 200 ml). Der pH der wässrigen Phase wurde nach jedem Extraktions-schritt kontrolliert und gegebenenfalls auf pH 3 eingestellt. Die vereinigten organischen Phasen wurden über MgSO4 getrocknet und eingeengt.

Ausbeute: 152 mg (32%). Farblose Kristalle. Fp. 102 °C (Lit. [269]: 106-108 °C). [ ]D20 = -32.7 (c = 1, CHCl3) (Lit. [229]: [ ]D20 = -43.3 (c = 1.60, CHCl3)). 1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 1.29-1.73 (m, 10 H, Cyclohexyliden); 4.57 (d, J = 4.8, 1 H, H-C(3')), 4.87 (d, J = 4.8, 1 H, H-C(2')); 5.79 (br. s, 1 H, H-C(4')).

2,3-O-Cyclohexyliden-4-(2-propyloxy)-butyrolacton (172) [233]

OO

O OO

172

1'

2'3'

4'

Eine Lösung von 171 (150 mg, 0.7 mmol, 1 Äquiv.) und Pyridinium-para-toluolsulfonsäure (PPTS) (18 mg, 0.07 mmol, 10 mol%) in Isopropanol (7.5 ml) wurde während 14 h bei 60 °C gerührt, eingeengt und chromatographisch gereinigt (SiO2,Et2O/Hexan, 15:85). Ausbeute: 35 mg (20%). Farbloses Öl. [ ]D20 = +49.0 (c = 1,

Experimenteller Teil 206

MeOH) (Lit. [226]: [ ]D20 = -45.5 (c = 5.75, MeOH, Enantiomeres)). 1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 1.18 (d, J = 5.8, 6 H, (H3C)2-C); 1.29-1.73 (m, 10 H, Cyclohexyliden); 3.99 (Heptett, J = 5.8, 1 H, H-C(CH3)2); 4.48 (d, J = 5.4, 1 H, H-C(3')); 4.78 (d, J = 5.4, 1 H, H-C(2')); 5.51 (s, 1 H, H-C(4')).

2,3-O-Cyclohexyliden-4-cyclopentenon (173) [233]

OO

O

173

1'

2'3'4'

5'

Zu einer Lösung von Dimethylmethylphosphonat (0.169 ml, 197 mg, 1.54 mmol, 1 Äquiv.) in THF (10 ml) wurde bei -78 °C eine 1.6 M Lösung von n-Butyllithium in Hexan (0.971 ml, 1.54 mmol, 1 Äquiv.) zugespritzt und 15 min bei -78 °C gerührt. Anschliessend wurde 172 (395 mg, 1.54 mmol, 1 Äquiv.) zugegeben. Nach 2.5 h wurde die Reaktionsmischung während 30 min auf 20 °C erwärmen gelassen. Die Reaktion wurde mit H2O (5 ml) gestoppt und mit Et2O (2 x 25 ml) extrahiert. Die kombinierten organischen Phasen wurden mit ges. NaCl-Lösung (30 ml) gewaschen, über MgSO4 getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wurde chromatographisch gereinigt (SiO2, Et2O/Hexan 4:1). Ausbeute: 92 mg (32%). Farblose Kristalle. Fp. 96 °C (Et2O/Hexan, Lit. [226]: 65 °C). [ ]D20 = -73.5 (c = 3, CHCl3) (Lit. [226]: [ ]D20 = -74 (c =3, MeOH)). 1H-NMR (300 MHz, (CDCl3): 1.29-1.73 (m, 10 H, Cyclohexyliden); 4.42 (d, J = 5.7, 1 H, H-C(2')); 5.23 (dd, J = 5.7, 2.5, 1 H, H-C(3')); 6.16 (d, J = 5.7, 1 H, H-C(5')); 7.58 (dd, J = 5.7, 2.5, 1 H, H-C(4')).

Experimenteller Teil 207

(3aS,4R,6aS)-2,2-Dimethyl-6-(methyloxy)perhydrofuro[3,4-d][1,3]dioxol-4-carbaldehyd (174) [231]

O

OO

MeOH

O

174

1'

2' 3'

4'

Zu einer Lösung von D-Mannose (25g, 0.138 mol, 1 Äquiv.) in Aceton (83 ml) wurde MeOH (83 ml), 2,2-Dimethoxypropan (85 ml) und konz. HCl (2.5 ml) zugegeben und während 2 h bei 80 °C unter Rückfluss gerührt. Zur kupferfarbenen Lösung wurde Wasser (250 ml) zugegeben und bei 20 °C bei 20 mbar (das Produkt ist leicht flüchtig) während 1 h eingeengt, wobei die Lösung trüb wurde. Dann wurden MeOH (250 ml) und konz. HCl (6.25 ml) zugegeben und 3 h bei 20 °C gerührt. Durch Zugabe von ges. NaHCO3-Lösung (250 ml) wurde die Lösung alkalisch eingestellt (pH 8) und dann bei 80 °C zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wurde in siedendem CHCl3 (600 ml) aufgeschlämmt und über Celite filtriert. Einengen und Trocknen am HV ergab als Zwischenprodukt Methyl-2,3-O-isopropyliden-mannofuranosid. Ausbeute: 32.5 g (quantitativ), als gelbes Öl.

Zu einer Lösung von Methyl-2,3-O-isopropyliden-mannofuranosid (32.5 g, 0.138 mol, 1 Äquiv.) in MeOH (260 ml) wurde während 1 h via Tropftrichter Natriumperiodat (35.4 g, 0.165 mol, 1.2 Äquiv.) in H2O (260 ml) zugetropft und die Mischung während 1 h bei 20 °C intensiv gerührt. Die Lösung wurde eingeengt, der Rückstand mit siedendem CHCl3 gelöst und über Celite filtriert.

Ausbeute: 27.8 g (quantitativ). Gelbes Öl. [ ]D20 = +63.6 (c = 1, MeOH) (Lit. [270]: [ ]D23 = -61.0 (c = 1.2, CHCl3)). 1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 1.26 (s, 3 H, H3C-C);1.40 (s, 3 H, H3C-C); 3.33, 3.34 (2 x s, 3 H, epimere H3C-O); 4.35 (d, J = 4.0, 1 H, H-C(4')); 4.58 (d, J = 6.2, 1 H, H-C(2')); 4.99-5.08 (m, 2 H, H-C(3') und H-C(1')); 9.63 (s,1 H, CHO).

Experimenteller Teil 208

(3aR,6aS)-2,2-Dimethyl-6-(methyloxy)perhydrofuro[3,4-d][1,3]dioxol-4-on (175) [227]

O

OO

O O

175

1'

2' 3'

Zu einer Lösung von 174 (529 mg, 2.96 mmol, 1 Äquiv.) in Toluol (25 ml) und H2O(3.75 ml) wurde Kaliumpermanganat (4g, 25.2 mmol, 8.5 Äquiv.) und Kupfer(II)sulfat (1.3 g, 8.14 mmol, 2.75 Äquiv.) zugegeben und bei 20 °C während 16 h gerührt. Die Suspension wurde mit AcOEt (75 ml) extrahiert und die organische Phase mit H2O (50 ml) gewaschen, über MgSO4 getrocknet und eingeengt.

Ausbeute: 218 mg (38%). Farblose Kristalle. Fp. 80-81 °C (Lit. [227]: 75-76 °C). [ ]D20 = +49.0 (c = 2, CHCl3) (Lit. [227]: [ ]D20 = -51.0 (c = 2, CHCl3)). 1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 1.37 (s, 3 H, H3C-C); 1.45 (s, 3 H, H3C-C); 3.52, 3.53 (2 x s, 3 H, epimere H3C-O); 4.54 (d, J = 5.6, 1 H, H-C(2')); 4.79 (d, J = 5.6, 1 H, H-C(3')); 5.33 (s,1 H, H-C(1')).

(3aR,4R,6S,6aR)-6-(Iodomethyl)-2,2-dimethylperhydrofuro[3,4-d][1,3]dioxol-4-ylmethyl ether (177) [240]

O

OO

OMeI

177

1'

2'3'4'

5'

Eine Lösung von D-Ribose (50g, 0.276 mol, 1 Äquiv.) in Aceton, MeOH und 2,2-Dimethoxypropan (je 200 ml), wurde mit konz. HCl (5 ml) während 50 h bei 20 °C gerührt. Anschliessend wurde Pyridin zugegeben (100 ml) und eingeengt. Der Rückstand wurde in H2O (500 ml) gelöst, mit Et2O (400 ml, 2 x 200 ml) extrahiert, die vereinigten organischen Phasen über MgSO4 getrocknet und eingeengt. Das erhaltene rohe Methyl-2,3-O-isopropyliden- -D-ribofuranosid (66.9 g, 0.270 mol, 1 Äquiv.)

Experimenteller Teil 209

wurde mit Triphenylphosphin (103.8 g, 0.324 mol, 1.2 Äquiv.) und Imidazol (33.6 g, 0.649 mol, 2.4 Äquiv.) in CH3CN (220 ml) gelöst und unter Rühren auf 80 °C erhitzt. Bei Erreichen dieser Temperatur wurde Iod (100g, 0.394 mol, 1.5 Äquiv.) zugegeben und während 2 h gerührt. Die Lösung wurde auf 20 °C abkühlen gelassen, Et2O (600 ml) zugegeben, mit 10% Na2S2O3 (400 ml), H2O (400 ml) und ges. NaCl-Lösung (400 ml) gewaschen, über NaSO4 getrocknet und eingeengt. Der gelbe Rückstand wurde in Hexan/AcOEt (95:5, 400 ml) suspendiert, über SiO2 filtriert und mit Hexan/AcOEt (95:5) herausgewaschen.

Ausbeute: 84.1 g (80%). Farbloses Öl. [ ]D20 = -73.3 (c = 1.5, CHCl3) (Lit. [240]: [ ]D = -72.0 (c = 1.95, CH2Cl2)). 1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 1.29 (s, 3 H, H3C-C); 1.45 (s, 3 H, H3C-C); 3.13 (t, J = 10.4, 1 H, H-C(5')); 3.25 (dd, J = 10.4, 6.0, 1 H, H-C(5')); 3.34 (s, 3 H, H3C-O); 4.40 (dd, J = 10.4, 6.0, 1 H, H-C(4')); 4.59 (d, J = 6.0, 1 H, H-C(3')); 4.73 (d, J = 6.0, 1 H, H-C(2')); 5.02 (s, 1 H, H-C(1')).

(4R,5R)-5-Eth-1-enyl-2,2-dimethyl-1,3-dioxolan-4-carbaldehyd (178) [239]

OO

O

178

1

23

45

Zu einer Lösung von 177 (3.14 g, 10.0 mmol, 1 Äquiv.) in THF (50 ml) wurde bei -78 °C während 15 min eine 1.6 M Lösung von n-Butyllithium in Hexan (12.5 ml, 20 mmol, 2 Äquiv.) zugetropft und während 15 min gerührt. Anschliessend wurde NH4Cl (2 g) zugegeben, und die Lösung wurde auf -40 °C erwärmen gelassen, mit H2O (50 ml) verdünnt, mit AcOEt (3 x 50 ml) extrahiert, die vereinigten organischen Phasen über MgSO4 getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wurde chromatographisch gereinigt (SiO2, Et2O/Hexan 1:3). Ausbeute: 1.55 g, (99%). Farbloses Öl. [ ]D20 = -3.0 (c = 1, CHCl3) (Lit. [239]: [ ]D20 = -3.1 (c = 1.9, CHCl3)). 1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 1.44 (s, 3 H, H3C-C); 1.62 (s, 3 H, H3C-C); 4.41 (dd, J = 7.1, 3.3, 1 H, H-C(2)); 4.86 (t, J = 7.1, 1 H, H-C(3)); 5.32 (d, J = 10.4, 1 H, H-C(5)); 5.46 (d, J = 17.1, 1 H, H-C(5)); 5.76 (ddd, J = 17.1, 10.4, 7.1, 1 H, H-C(4)); 9.55 (d, J = 3.3, 1 H, CHO).

Experimenteller Teil 210

(1SR)-1-[(4S,5R)-5-Eth-1-enyl-2,2-dimethyl-1,3-dioxolan-4-yl]prop-2-en-1-ol (176) [234]

OO

OH

176

1

23

45

67

Zu einer Lösung von 178 (509 mg, 3.26 mmol, 1 Äquiv.) in trockenem THF (12 ml) wurde bei -78 °C Vinylmagnesiumbromid (1 M in THF, 3.9 ml, 3.9 mmol, 1.2 Äquiv.) zugetropft und 1 h bei -20 °C gerührt. Die Reaktion wurde mit ges. NH4Cl-Lösung (30 ml) gestoppt. Das Reaktionsgemisch wurde mit AcOEt (3 x 30 ml) extrahiert, die vereinigten organischen Phasen über MgSO4 getrocknet, eingeengt und chromato-graphisch gereinigt (SiO2, AcOEt/ Hexan 4:1).

Ausbeute: 17.0 g (94%). Leicht gelbes Öl. 1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 1.36-1.63 (m,6 H, (H3C)2-C); 4.00-4.22 (m, 2 H, H-C(3) und H-C(4)); 4.57-4.72 (m, 1 H, H-C(5)); 5.20-5.49 (m, 4 H, H2C(1), und H2C(7)); 5.79-6.12 (m, 2 H, H-C(2) und H-C(6)).

(3aR,6aR)-2,2-Dimethyl-4,6a-dihydro-3aH-cyclopenta[d][1,3]dioxol-4-on (167) [234]

O O

O

167

1'

2'3'4'

5'

Eine Lösung von 176 (8.0 g, 43 mmol, 1 Äquiv) und [(Cy3P)2Cl2Ru=CHPh] (Grubbs-Katalysator) (180 mg, 0.5 mol%) in trockenem, entgastem CH2Cl2 (100 ml) wurde über Nacht (16 h) bei 20 °C gerührt. Dann wurde MnO2 (37.4 g, 0.43 mol, 10 Äquiv.) zugegeben und während 30 h gerührt. Anschliessend wurde das Reaktionsgemisch eingeengt und chromatographisch gereinigt (SiO2, AcOEt/Hexan 1:4).

Experimenteller Teil 211

Ausbeute: 4.8 g (72%). Farblose Kristalle. Fp. 70 °C (Lit. [234]: 68.6-70.1 °C). [ ]D20 = -71.0 (c = 1, CHCl3) (Lit. [234]: [ ]D20 = -70.4 (c = 0.92, CHCl3)). 1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 1.41 (s, 3 H, H3C-C); 1.57 (s, 3 H, H3C-C); 4.46 (d, J = 5.6, 1 H, H-C(2')); 5.26 (dd, J = 5.6, 2.2, 1 H, H-C(3')); 6.22 (d, J = 5.9, 1 H, H-C(5')); 7.60 (dd,J = 5.9, 2.2, 1 H, H-C(4')).

Butylborsäure (183) [244]

BHO OH

183

Zu einer Lösung von Trimethylborat (9.26 g, 89.2 mmol, 1 Äquiv.) in Et2O (220 ml) wurde bei -78 °C BuMgCl (2.0 M in Et2O, 44 ml, 88 mmol, 0.98 Äquiv.) zugetropft und 2 h bei -70 °C gerührt, wobei sich ein farbloser Niederschlag bildete. Die Reaktionsmischung wurde auf 20 °C aufwärmen gelassen und während 10 min 10% HCl (100 ml) zugetropft, wobei sich der Niederschlag löste. Die wässrige Phase wurde mit Et2O (2 x 50 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über MgSO4 getrocknet und eingeengt. Umkristallisieren aus H2O (25 ml) ergab farblose Kristalle. Ausbeute: 4.33 g (48%). Fp. 70-75 °C (Lit. [244]: 95-97 °C ). 1H-NMR(300 MHz, (CD3)2SO): 0.56 (t, J = 7.2, 2 H, Bu); 0.83 (t, J = 7.2, 3 H, Bu); 1.15-1.35 (m, 4 H, Bu); 7.34 (s, 2 H, OH).

2-Butyl-1,3,6,2-dioxazaborozan (184) [244]

N

B OOBu

184

Eine Lösung von 183 (4.34 g, 42.5 mmol, 1 Äquiv.) und Diethanolamin (4.47 g, 42.5 mmol, 1 Äquiv.) in Et2O (85 ml) und CH2Cl2 (45 ml) wurde während 2 h über Molekularsieb (3 Å, 10 g) bei 20 °C gerührt. Dann wurde CH2Cl2 (50 ml) zugegeben,

Experimenteller Teil 212

filtiriert, mit CH2Cl2 (2 x 50 ml) nachgewaschen und eingeengt. Das Rohprodukt wurde in siedendem CH2Cl2 (20 ml) gelöst und durch Zugabe von Et2O (20 ml) bei 0 °C umkristallisiert.

Ausbeute: 6.60 g (90%). Farblose Kristalle. Fp. 136 °C (CH2Cl2/Et2O) (Lit. [244]: 145-148 °C (CH2Cl2/Et2O)). 1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 0.46 (t, J = 7.5, 2 H, B-CH2-(CH2)2-CH3); 0.87 (t, J = 7.5, 3 H, B-CH2-(CH2)2-CH3); 1.18-1.38 (m, 4 H, B-CH2-(CH2)2-CH3); 2.73-2.85 und 3.17-3.33 (m, 4 H, N-(CH2)2); 3.80-4.07 (m, 4 H, H2C-O).

N4,N4,N5,N5-Tetramethyl-(4R,5R)-2-butyl-1,3,2-dioxaborolan-4,5-dicarboxamid((+)-181) und

N4,N4,N5,N5-Tetramethyl-(4S,5S)-2-butyl-1,3,2-dioxaborolan-4,5-dicarboxamid((–)-181) [244]

OB

O

Bu

O

N

O

N

(-)-181

OB

O

Bu

O

N

O

N

(+)-181

Eine Lösung von 184 (2.76 g, 16.1 mmol, 1 Äquiv.) und (R,R)-(+)-N,N,N',N'-Tetramethylweinsäurediamid (4.27 g, 20.9 mmol, 1.3 Äquiv.) in CH2Cl2 (90 ml) und ges. NaCl-Lösung (30 ml) wurde bei 20 °C während 30 min gerührt. Die wässrige Phase wurde mit CH2Cl2 (50 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden mit ges. NaCl-Lösung (50 ml) gewaschen, über MgSO4 getrocknet und eingeengt.

(+)-181: Ausbeute: 3.29 g (76%). Farbloses Öl. [ ]D20 = -99.0 (c = 1, CHCl3) (Lit. [244]: [ ]D20 = -104.4 (c = 1.7, CHCl3)). 1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 0.82-0.90 (m,5 H, B-(CH2)2-CH2-CH3); 1.23-1.45 (m, 4 H, B-(CH2)2-CH2-CH3); 2.98 (s, 6 H, H3C-N); 3.20 (s, 6 H, H3C-N); 5.53 (s, 2 H, CHCO).

(–)-181: Ausbeute: 3.21 g (81%), ausgehend von 184 (2.49 g, 14.5 mmol) und (S,S)-(–)-N,N,N',N'-Tetramethylweinsäurediamid (3.86 g, 18.8 mmol). [ ]D20 = +98.0 (c = 1, CHCl3) (Lit. [244]: [ ]D20 = +104.4 (c = 1.7, CHCl3)).

Experimenteller Teil 213

(E)-3-(1,1,1-Tributylstannanyl)prop-2-en-1-ol (179) [243]

SnBu3

HO

179

Zu einer Lösung von Propargylalkohol (5.0 ml, 85.9 mmol, 1 Äquiv.) und Tributylzinnhydrid (30 ml, 112 mmol, 1.3 Äquiv.) wurde unter Rühren bei 20 °C Azobis(isobutyronitril) (AIBN) (705 mg, 4.3 mmol, 0.05 Äquiv.) zugegeben. Die Lösung wurde langsam unter Rückfluss auf 110 °C erhitzt, wobei eine starke Gasentwicklung beobachtet wurde. Nach 2 h wurde die Lösung auf 20 °C abkühlen gelassen, eingeengt und chromatographisch gereinigt (SiO2, AcOEt/Hexan 1:19).

Ausbeute: 15.3 g (52%). Farblose Flüssigkeit. 1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 0.74-0.98 (m, 15 H, CH2-CH3); 1.20-1.37 (m, 6 H, CH2); 1.37-1.53 (m, 6 H, CH2); 4.14 (br. s, 2H, H2COH); 6.12-6.18 (m, 2 H, H-C(sp2)).

[(1R,2S)-2-(1,1,1-Tributylstannanyl)cyclopropyl]methanol ((+)-188) und

[(1S,2R)-2-(1,1,1-Tributylstannanyl)cyclopropyl]methanol ((–)-188) [245]

SnBu3

H

H

HO

(+)-188

SnBu3

H

H

HO

(-)-188

12

312

3

Zu einer Lösung von 1,2-Dimethoxypropan (DME) (3.92 ml, 37.7 mmol, 5.8 Äquiv.) in CH2Cl2 (23 ml) wurden unter Ar bei -15 °C (Innentemperatur) Diethylzink (1 M inHexan, 32.5 ml, 32.5 mmol, 5 Äquiv.) und anschliessend während 5 min Methyleniodid (6.0 ml, 74 mmol, 11.4 Äquiv.) zugetropft. Diese Lösung wurde während 40 min via Kanüle zu einer auf -20 °C gekühlten Lösung von 179 (2.27 g, 6.5 mmol, 1 Äquiv.) und (–)-181 (3.21 g, 11.8 mmol, 1.8 Äquiv.) in CH2Cl2 (2 ml) über Molekularsieb (4 Å, 1.33 g) getropft, wobei die Temperatur im Bereich zwischen -18 °C und -10 °C gehalten wurde. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht auf 20 °C aufwärmen gelassen, wobei sich eine farblose Suspension bildete. Der Reaktionsverlauf wurde mit 1H-NMR

Experimenteller Teil 214

überwacht, indem Proben (ca. 0.5 ml) entnommen, mit Et2O (5 ml) über Kieselgel filtriert und dann eingeengt wurden. Nach 14 h Rühren wurde die Reaktion mit ges. NH4Cl-Lösung (40 ml) gestoppt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Et2O (2 x 100 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden während 4 h mit 5 M KOH (100 ml) intensiv gerührt, mit 10% HCl, ges. NaHCO3-Lösung, H2O und ges. NaCl-Lösung (je 100 ml) gewaschen, über MgSO4 getrocknet, eingeengt und chromatographisch gereinigt (SiO2, Hexan/AcOEt 95:5).

(–)-188: Ausbeute: 2.32 g (99%), 88% ee. Farbloses Öl. [ ]D20 = -15.0 (c = 1, CHCl3)(Lit. [245]: [ ]D21 = +17.2 (c = 0.96, CHCl3, 96% ee)). 1H-NMR (300 MHz, CDCl3):-0.46 - -0.28 (m, 1 H, H-C(1)); 0.50-0.55 (m, 2 H, HC(2)); 0.78-0.91 (m, 15 H, Bu); 1.02-1.13 (m, 1 H, H-C(3)); 1.23-1.40 (m, 6 H, Bu); 1.40-1.60 (m, 6 H, Bu); 3.34-3.60 (m, 2 H, H2COH). Eine analytische Probe von (–)-188 (18 mg, 50 mol, 1 Äquiv.) wurde mit Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) (16 mg, 75 mol, 1.5 Äquiv.), (S)-(–)-

Methoxy- -trifluormethylphenylessigsäure ((–)-MTPA) (17.5 mg, 75 mol, 1.5 Äquiv.) und einem Kristall 4-(Dimethylamino)pyridin (DMAP) während 12 h bei 20 °C in Et2O (2 ml) gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde über Kieselgel filtriert, mit Et2O(5 ml) nachgewaschen und eingeengt. Die Signale bei = 4.20 ppm im 1H-NMR Spektrum (500 MHz, CDCl3) zeigten eine Aufspaltung im Verhältnis 94:6.

(+)-188: Ausbeute: 460 mg (90%), 87% ee ausgehend von 179 (500 mg, 1.44 mmol). Farbloses Öl. [ ]D20 = +14.8 (c = 1, CHCl3) (Lit. [245]: [ ]D21 = +17.2 (c = 0.96, CHCl3, 96% ee)).

1-(1,1-Dimethylethyl)-1,1-dimethylsilyl [(E)-3-(1,1,1-tributylstannanyl)prop-2-enyl]ether (189) [245]

SnBu3

TBDMSO

189

1 2

3

Zu einer Lösung von 179 (4.5 g, 12.9 mmol, 1 Äquiv.) und Imidazol (1.76 g, 26 mmol, 2 Äquiv.) in trockenem DMF (70 ml) wurde bei 0 °C eine Lösung von TBDMSCl (3.90 g, 26 mmol, 2 Äquiv.) in DMF (20 ml) zugetropft und während 30 min bei 0 °C gerührt. Die Lösung wurde über Nacht (12 h) bei 4 °C im Kühlschrank stehen gelassen. Die Reaktion wurde mit H2O (200 ml) gestoppt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Et2O (2

Experimenteller Teil 215

x 200 ml) extrahiert, eingeengt und chromatographisch gereinigt (SiO2, Hexan/AcOEt 10:1).

Ausbeute: 5.65 g (95%). Farbloses Öl. 1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 0.07 (s, 6 H, (H3C)2Si); 0.85-0.93 (m, 24 H, Sn((CH2)2CH2CH3)3 und (H3C)3C); 1.24-1.36 (m, 6 H, Bu); 1.44-1.54 (m, 6 H, Bu); 4.20 (dd, J = 4.0, 1.4, 2 H, H2C(1)); 6.04 (dt, J = 19.0, 4.0, 1 H, H-C(2)); 6.18 (dt, J = 19.0, 1.4, 1 H, H-C(3)).

1-(1,1-Dimethylethyl)-1,1-dimethylsilyl (1-Propin-3-yl)ether (193) [252]

TBDMSO

193

Zu einer Lösung von Propargylalkohol (2.4 ml, 40 mmol, 1 Äquiv.) und Imidazol (3.4 g, 50 mmol, 1.3 Äquiv.) in trockenem DMF (4 ml) wurde TBDMSCl (7.5 g, 50 mmol, 1.3 Äquiv.) zugegeben. Die Lösung wurde 18 h bei RT gerührt. Die Reaktion wurde mit H2O (50 ml) gestoppt und mit Et2O (3 x 50 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über MgSO4 getrocknet und eingeengt. Zum öligen Rückstand wurde K2CO3 (1 g) zugegeben und das Produkt durch Destillation gereinigt (Sdp.: 104-104 °C, 170 Torr).

Ausbeute: 6.4 g (93%). Farbloses Öl. 1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 0.12 (s, 6 H, (H3C)2Si); 0.90 (s, 9 H, (H3C)3C); 2.82 (t, J = 2.5, 1.4, 1 H, C CH); 4.30 (d, J = 2.5, 2 H, H2CC C).

Experimenteller Teil 216

(3aR,6R,6aR)-6-((E)-3-[1-(1,1-Dimethylethyl)-1,1-dimethylsilyl]oxyprop-1-enyl)-2,2-dimethylperhydrocyclopenta[d][1,3]dioxol-4-one (191)

OO

O

TBDMSO

191

1'

2'3'4'

5'6'

7'

8'

Methode A:

Kupfer(I)iodid (98%, 13 g, 68 mmol) und Kaliumiodid (130 g, 0.78 mol) wurden in H2O (100 ml) gelöst. Dann wurde Aktivkohle (1 g) zugegeben, während 10 min gerührt und über Celite filtriert. Die farblose Mutterlauge wurde mit H2O (400 ml) verdünnt, der entstandene Niederschlag abfiltriert und mit H2O (4 x 100 ml) und Aceton (4 x 80 ml) gewaschen. Das gereinigte CuI wurde während 12 h bei 20 °C und anschliessend während 4 h bei 90 °C am HV getrocknet. Ausbeute: 10 g (75%), farblose Kristalle.

Zu einer Lösung von 189 (5.84 g, 12.6 mmol, 1.5 Äquiv.) in trockenem THF (44 ml) wurde bei -78 °C eine 1.6 M Lösung von n-Butyllithium (1.6 M in Hexan, 6.85 ml, 10.9 mmol, 1.3 Äquiv.) zugetropft und während 45 min gerührt. Dann wurde eine auf -50 °C vorgekühlte Lösung von CuI (2.08 g, 10.9 mmol, 1.3 Äquiv.) und Tributylphosphin (5.7 ml, 21.8 mmol, 2.6 Äquiv.) in THF (45 ml) via Kanüle langsam zugetropft und bei -78 °C gerührt, wobei sich die Lösung gelb färbte. Nach 30 min wurde via Kanüle eine Lösung von 167 (1.30 g, 8.4 mmol, 1 Äquiv.) in THF (22 ml) zugetropft, wobei sich die Lösung sofort rot färbte. Die Lösung wurde während 10 min bei -78 °C, dann während 1 h bei -30 °C gerührt. Die Reaktion wurde mit ges. NH4Cl-Lösung (250 ml) gestoppt. Das Reaktionsgemisch wurde mit AcOEt (2 x 250 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über MgSO4 getrocknet, eingeengt und chromatographisch gereinigt (SiO2, Hexan/AcOEt 4:1).

Ausbeute: 1.51 g (55%). Farbloses Öl. [ ]D20 = -125.9 (c = 1.18, CHCl3). IR (CHCl3): 2992m; 2930m; 2857m; 1754s; 1472w; 1376m; 1153m; 1121m; 1066s; 979m;837s. 1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 0.05 (s, 6 H, (H3C)2Si); 0.90 (s, 9 H, (H3C)3-C); 1.35 (s, 3 H, H3C); 1.44 (s, 3 H, H3C); 2.22-2.24 (m, 1 H, H-C(5')); 2.80-2.89 (m, 1 H, H-C(5')); 3.09-3.14 (m, 1 H, H-C(4')); 4.13-4.14 (m, 2 H, H-C(8')); 4.19-4.21 (m, 1 H, H-C(3')); 4.61-4.63 (m, 1 H, H-C(2')); 5.61-5.65 (m, 2 H, H-C(6') und H-C(7')). 13C-

Experimenteller Teil 217

NMR (75 MHz, CDCl3): -5.1; 18.5; 25.0; 26.0; 26.9; 38.7; 39.1; 63.0; 77.9; 81.7; 109.8; 112.3; 128.4; 131.2; 213.1. EI-MS: 325.1 ([M - H]+); 311.2 ([M - CH3]+); 269.1 ([M - t-Bu]+); 211.1 ([M - t-Bu - (CH3)2CO]+). EA für C17H30O4Si (326.51): Ber. C 62.54, H 9.26; Gef. C 62.66, H 9.17.

Methode B:

Zu einer Lösung von [Cp2ZrCl2] (438 mg, 1.5 mmol, 1.5 Äquiv.) in THF (8 ml) wurde innerhalb von 2 min eine 1 M Lösung von LiEt3BH in THF (1.3 ml, 1.3 mmol, 1.3 Äquiv.) zugetropft. Das Reaktionsgemisch wurde 1 h bei RT gerührt und dann abgedunkelt. Eine Lösung von 193 (204 mg, 1.2 mmol, 1.2 Äquiv.) in THF (1 ml) wurde zugetropft und das Reaktionsgemisch 15 min in der Dunkeln bei RT gerührt. Die Mischung wurde auf -78 °C abgekühlt und 167 (154 mg, 1 mmol, 1 Äquiv.), gefolgt von [Ni(AcAc)2] (30 mg, 0.1 mmol, 0.1 Äquiv.) zugegeben. Die Lösung wurde innerhalb von ca. 1 h auf 0 °C erwärmen gelassen und anschliessend 48 h in den Kühlschrank bei 4 °C gestellt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von ges. NH4Cl-Lösung (50 ml) gestoppt und wie bei Methode A beschrieben aufgearbeitet.

Ausbeute:160 mg (49%).

(3aS,4S,6R,6aR)-6-((E)-3-[1-(1,1-Dimethylethyl)-1,1-dimethylsilyl]oxyprop-1-enyl)-2,2-dimethylperhydrocyclopenta[d][1,3]dioxol-4-ol (196)

OO

OH

TBDMSO

196

1'

2'3'4'

5'6'

7'

8'

Zu einer Lösung von 191 (1.22 g, 3.7 mmol, 1 Äquiv.) in MeOH (60 ml) wurde bei -10 °C (Eis/NaCl) NaBH4 (141 mg, 3.7 mmol, 1 Äquiv.) zugegeben und während 30 min gerührt. Die Reaktion wurde mit Aceton (20 ml), ges. NH4Cl-Lösung (100 ml) und H2O (100 ml) gestoppt. Das Produkt wurde mit CH2Cl2 (2 x 200 ml) extrahiert und zur Trockne eingeengt.

Ausbeute: 1.20 g (99%). Farbloses Öl. [ ]D20 = -5.2 (c = 1, CHCl3). IR (CHCl3): 3620m; 3473w; 2959s; 2858s; 1462m; 1376s; 1161m; 1082s; 1048s; 973m. 1H-NMR

Experimenteller Teil 218

(300 MHz, CDCl3): 0.06 (s, 6 H, (H3C)2Si); 0.90 (s, 9 H, (H3C)3-C); 1.35 (s, 3 H, H3C); 1.50 (s, 3 H, H3C); 1.83-1.96 (m, 1 H, H-C(5')); 2.40-2.43 (m, 1 H, H-C(5')); 2.70-2.80 (m, 1 H, H-C(4')); 4.02-4.13 (m, 3 H, H-C(3') und H-C(8')); 4.43-4.50 (m, 2H, H-C(1') und H-C(2')); 5.56-5.59 (m, 2 H, H-C(6') und H-C(7')). 13C-NMR (75 MHz, CDCl3): -5.1; 18.5; 24.4; 26.0; 26.1; 36.4; 43.2; 63.5; 71.1; 78.9; 84.6; 111.5; 129.5; 130.1. HR-EI-MS: Ber. für C13H23O4Si+ ([M - tBu]+): 271.1366; Gef. 271.1358.

[((E)-3-(3aR,4R,6S,6aS)-2,2-Dimethyl-6-[(phenylmethyl)oxy]perhydrocyclopenta[d][1,3]dioxol-4-ylprop-2-enyl)oxy](1,1-dimethylethyl)dimethylsilane (197)

OO

OBn

TBDMSO

1'

2'3'4'

5'6'

7'

8'

197

Eine Suspension von 196 (300 mg, 0.9 mmol, 1 Äquiv.) und Natriumhydrid (60% in Mineralöl, 76.7 mg, 1.91 mmol, 2.1 Äquiv.) in trockenem THF (15 ml) wurde während 30 min bei 0 °C gerührt. Dann wurde Tetrabutylammoniumiodid (168 mg, 0.45 mmol, 0.5 Äquiv.) und Benzylbromid (468 mg, 0.325 ml, 3 Äquiv.) zugegeben und die Suspension wurde über Nacht (16 h) auf 20 °C erwärmen gelassen. Die Reaktion wurde mit H2O (25 ml) gestoppt. Die Reaktionsmischung wurde mit AcOEt (2 x 50 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über MgSO4 getrocknet, eingeengt und chromatographisch gereinigt (SiO2, AcOEt/Hexan 1:10 1:4). Ausbeute: 366 mg (98%). Farbloses Öl. [ ]D20 = -35.7 (c = 1.15, CHCl3). IR (CHCl3): 3620m; 3457w; 3008s; 2959s; 2930s; 2858s; 1455m; 1373m; 1163m; 1106s;1046s; 875m. 1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 0.04 (s, 6 H, (H3C)2Si); 0.89 (s, 9 H, (H3C)3-C); 1.33 (s, 3 H, H3C); 1.53 (s, 3 H, H3C); 1.77-1.83 (m, 1 H, H-C(5')); 2.04-2.16 (m, 1 H, H-C(5')); 2.66-2.68 (m, 1 H, H-C(4')); 3.75-3.85 (m, 1 H, H-C(1')); 4.05-4.07 (m, 2 H, O-CH2-Ar); 4.36-4.42 (m, 1 H, H-C(3')); 4.53-4.72 (m, 3 H, H-C(2') und H2C(8')); 5.44-5.57 (m, 2 H, H-C(6') und H-C(7')); 7.26-7.39 (m, 5 H, arom.). 13C-NMR (75 MHz, CDCl3): -5.0; 18.5; 24.4; 26.0; 26.3; 32.4; 43.0; 63.5; 71.8; 78.0; 78.3; 84.3; 110.8; 127.5; 127.7; 128.2; 129.7; 130.1; 138.3. HR-MALDI-MS: Ber. für C24H38NaO4Si+ ([M+Na]+): 441.2437; Gef. 441.2442.

Experimenteller Teil 219

(E)-3-(3aR,4R,6S,6aS)-2,2-Dimethyl-6-[(phenylmethyl)oxy]perhydrocyclopenta[d][1,3]dioxol-4-ylprop-2-en-1-ol (190)

OO

OBn

HO

1'

2'3'4'

5'6'

7'

8'

190

Zu einer Lösung von 197 (330 mg, 0.79 mmol, 1 Äquiv) in THF (3.5 ml) wurde Tributylammoniumfluorid (TBAF) (1 M in THF, 1.18 ml, 1.18 mmol, 1.5 Äquiv.) zugegeben und während 1 h bei 20 °C gerührt. Dann wurde H2O (20 ml) zugegeben und mit AcOEt (2 x 50 ml) extrahiert, über MgSO4 getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wurde chromatographisch gereinigt (SiO2, AcOEt/Hexan 1:1).

Ausbeute: 217 mg (90%). Farbloses Öl. [ ]D20 = -52.2 (c = 1, CHCl3). IR (CHCl3): 3618m; 3458w; 3007s; 2963s; 2930s; 2873s; 1455m; 1374m; 1163m; 1106s; 1046s;876m. 1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 1.33 (s, 3 H, H3C); 1.53 (s, 3 H, H3C); 1.76-1.83 (m, 1 H, H-C(5')); 2.04-2.17 (m, 1 H, H-C(5')); 2.67-2.71 (m, 1 H, H-C(4')); 3.75-3.85 (m, 1 H, H-C(1')); 4.05-4.07 (m, 2 H, O-CH2-Ar); 4.37-4.39 (m, 1 H, H-C(3')); 4.54-4.72 (m, 3 H, H-C(2') und H2C(8')); 5.49-5.64 (m, 2 H, H-C(6') und H-C(7')); 7.25-7.34 (m, 5 H, arom.). 13C-NMR (75 MHz, CDCl3): 24.5; 26.4; 43.3; 63.5; 72.0; 78.1; 78.5; 84.5; 111.3; 127.8; 128.0; 128.5; 129.8; 132.3; 138.6. HR-MALDI-MS: Ber. für C18H24NaO4+ ([M+Na]+): 327.1572; Gef. 327.1553. EA für C18H24O4 (304.38): Ber. C 71.03, H 7.95; Gef. C 71.00, H 7.97.

Experimenteller Teil 220

((1R,2R)-2-(3aR,4R,6S,6aS)-2,2-Dimethyl-6-[(phenylmethyl)oxy]perhydrocyclopenta[d][1,3]dioxol-4-ylcyclopropyl)methanol (198)

OO

OBn

H

H

HO

1'

2'3'4'

5'6'7'

8'

9'

198

Zu einer Lösung von 1,2-Dimethoxypropan (DME) (0.22 ml, 2.07 mmol, 5.8 Äquiv.) in CH2Cl2 (1.25 ml) wurde unter Ar bei -30 °C (Innentemperatur) Diethylzink (1 M inHexan, 3.56 ml, 3.56 mmol, 5 Äquiv.) und anschliessend Diiodmethan (0.33 ml, 4.08 mmol, 11.4 Äquiv.) zugetropft. Diese Lösung wurde während 5 min via Kanüle zu einer Lösung von 190 (100 mg, 0.36 mmol, 1 Äquiv.) und (–)-181 (175 mg, 0.65 mmol, 1.8 Äquiv.) in CH2Cl2 (1 ml) über Molekularsieb (4 Å, 0.1 g) getropft, wobei die Temperatur zwischen -25 °C und -30 °C gehalten wurde. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht auf 20 °C aufwärmen gelassen, wobei sich eine farblose Suspension bildete. Nach 18 h Rühren wurde die Reaktion mit ges. NH4Cl-Lösung (20 ml) gestoppt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Et2O (2 x 100 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden während 4 h mit 5 M KOH (100 ml) intensiv gerührt, mit 10% HCl, ges. NaHCO3-Lösung, H2O und ges. NaCl-Lösung (je 100 ml) gewaschen, über MgSO4 getrocknet, eingeengt und chromatographisch gereinigt (SiO2,Hexan/AcOEt 1:1). Die Reinheit der Fraktionen wurde mit HPLC (SiO2, Korngrösse 5 m, 25 x 4 mm, 1 ml/ min, Supelcosil LC-Si, Hexan/AcOEt 2:1, tR = 7.05 min) überprüft.

Ausbeute: 118 mg (quantitativ). Farbloses Öl. [ ]D20 = -39.0 (c = 1, CHCl3). IR (CHCl3): 3685w; 3619w; 2927m; 2930s; 1521m; 1423m; 1374m; 1107m; 1106s; 1046s;929s; 627m;. 1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 0.32-0.70 (m, 3 H, H-C(6') und H-C(9')); 0.86-0.94 (m, 1 H, H-C(7')); 1.17-1.37 (m, 4 H, H3C und H-C(4')); 1.50 (s, 3 H, H3C);1.53-1.78 (m, 1 H, H-C(5')); 2.04-2.16 (m, 1 H, H-C(5')); 3.32-3.57 (m, 2 H, H-C(8')); 3.85-3.95 (m, 1 H, H-C(1')); 4.40 (d, J = 5.6, 1 H, H-C(3')); 4.59-4.72 (m, 3 H, H-C(2') und O-CH2-Ph); 7.26-7.40 (m, 5 H, arom.). 13C-NMR (100 MHz, CDCl3): 9.9; 20.0; 21.5; 24.3; 26.3; 33.3; 45.9; 66.4; 71.8; 78.3; 78.5; 84.3; 111.0; 127.7; 128.0; 128.4; 138.4. HR-MALDI-MS: Ber. für C19H24NaO4+ ([M+Na]+): 341.1723; Gef. 341.1724.

Experimenteller Teil 221

((1S,2S)-2-(3aR,4R,6S,6aS)-2,2-Dimethyl-6-[(phenylmethyl)oxy]perhydrocyclopenta[d][1,3]dioxol-4-ylcyclopropyl)methanol (165)

OO

OBn

H

H

HO

1'

2'3'4'

5'6'7'

8' 9'

165

Zu einer Lösung von 1,2-Dimethoxypropan (DME) (0.43 ml, 4.13 mmol, 5.8 Äquiv.) in CH2Cl2 (2.5 ml) wurde unter Ar bei -30 °C (Innentemperatur) Diethylzink (1 M in Hexan, 3.56 ml, 3.56 mmol, 5 Äquiv.) und anschliessend Diiodmethan (0.66 ml, 8.16 mmol, 11.4 Äquiv.) zugetropft. Diese Lösung wurde während 10 min via Kanüle zu einer Lösung von 190 (217 mg, 0.71 mmol, 1 Äquiv.) in CH2Cl2 (2 ml) und (+)-181(346 mg, 1.2 mmol, 1.8 Äquiv.) über Molekularsieb (4 Å, 0.3 g) getropft, wobei die Temperatur zwischen -25 °C und -30 °C gehalten wurde. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht auf 20 °C aufwärmen gelassen, wobei sich eine farblose Suspension bildete. Nach 18 h Rühren wurde die Reaktion mit ges. NH4Cl-Lösung (20 ml) gestoppt. Das Reaktionsgemisch wurde mit Et2O (2 x 100 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden während 4 h mit 5 M KOH (100 ml) intensiv gerührt, mit 10% HCl, ges. NaHCO3-Lösung, H2O und ges. NaCl-Lösung (je 100 ml) gewaschen, über MgSO4 getrocknet, eingeengt und chromatographisch gereinigt (SiO2,Hexan/AcOEt 1:1). Die Reinheit der Fraktionen wurde mit HPLC (SiO2, Korngrösse 5 m, 25 x 4 mm, 1 ml/ min, Supelcosil LC-Si, Hexan/AcOEt 2:1, tR = 8.96 min) überprüft.

Ausbeute: 190 mg (85%). Farbloses Öl. [ ]D20 = -18.1 (c = 1, CHCl3). IR (CHCl3): 3007w; 2927m; 2873w; 1455w; 1374m; 1108m; 1008m; 909w. 1H-NMR (400 MHz, CDCl3): 0.30-0.42 (m, 3 H, H-C(6') und H-C(9')); 0.86-0.99 (m, 1 H, H-C(7')); 1.23-1.35 (m, 4 H, H3C und H-C(4')); 1.50 (s, 3 H, H3C); 1.76-1.80 (m, 1 H, H-C(5')); 2.00-2.10 (m, 1 H, H-C(5')); 3.30-3.35 (m, 1 H, H-C(8')); 3.37-3.50 (m, 1 H, H-C(8')); 3.88-3.92 (m, 1 H, H-C(1')); 4.37-4.41 (m, 1 H, H-C(3')); 4.58-4.72 (m, 3 H, H-C(2') und O-CH2-Ph); 7.26-7.40 (m, 5 H, arom.). 13C-NMR (100 MHz, CDCl3): 10.0; 20.0; 21.2; 24.3; 26.3; 32.8; 45.8; 66.3; 71.7; 78.3; 84.5; 111.0; 127.8; 128.4, 128.5; 138.5. HR-MALDI-MS: Ber. für C19H24NaO4+ ([M+Na]+): 341.1723; Gef. 341.1720.

Experimenteller Teil 222

2-((1S,2S)-2-[(3aR,4R,6S,6aS)-6-Hydroxy-2,2-dimethylperhydrocyclopenta[d][1,3]dioxol-4-yl]cyclopropylmethyl)-2,3-dihydro-1H-isoindole-1,3-dione (164)

OO

OH

H

H

N

164

1'

2'3'4'

5'6'7'

8' 9'

O

O

Alkohol 165 (1.27 g, 4.0 mmol, 1 Äquiv.), Phthalimid (1.18 g, 8.0 mmol, 2 Äquiv.) und Tripenylphosphin (2.10 g, 8.0 mmol, 2 Äquiv.) in trockenem THF (19 ml) wurden gemäss AAV 4 (Aufarbeitungsmethode B) während 20 h mit DEAD (1.2 ml, 8.0 mmol, 2 Äquiv.) umgesetzt. Das Produkt wurde chromatographisch gereinigt (SiO2, AcOEt/ Hexan 1:3). Ausbeute: 1.60 g. Farbloses Öl, verunreinigt mit Phthalimid.

Eine Suspension des Rohproduktes (1.473 g) und Pd/C (645 mg, 10% Pd auf Aktivkohle) in MeOH (40 ml) und AcOEt (20 ml) wurde während 14 h unter einer H2-Atmosphäre (Ballon) gerührt. Der Katalysator wurde über Celite abfiltriert. Die abfiltrierte Lösung wurde eingeengt und chromatographisch gereinigt (AcOEt/Hexan 1:2).

Ausbeute: 566 mg (43%). Farbloses Öl. [ ]Hg36520 = -8.0 (c = 1, CHCl3). IR (CHCl3): 2936m; 1770m; 1713s; 1435m; 1395s; 909s. 1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 0.38-0.43 (m, 1 H, H-C(6')); 0.60-0.65 (m, 2 H, H-C(9')); 1.00-1.08 (m, 1 H, H-C(7') ); 1.16 (s, 1 H, H3C); 1.33-1.40 (m, 4 H, H3C und H-C(4')); 1.75-1.79 (m, 2 H, H-C(5')); 2.37 (d, J = 8.4, 1 H, OH); 3.43 (dd, J = 14.0, 7.8, 1 H, H-C(8')); 3.67 (dd, J = 14.0, 6.5, 1 H, H-C(8')); 4.07-4.17 (m, 1 H, H-C(1')); 4.26 (dd, J = 5.9, 1.6, 1 H, H-C(3')); 4.45 (t, J =5.9, 3 H, H-C(2')); 7.69-7.87 (m, 4 H, arom.). 13C-NMR (75 MHz, CDCl3): 168.6; 134.2; 132.3; 123.4; 111.5; 84.8; 79.0; 71.6; 45.6; 41.9; 36.7; 26.1; 24.1; 20.8; 18.0; 10.6. HR-MALDI-MS: Ber. für C20H23NNaO5+ ([M+Na]+): 380.1468; Gef. 380.1464.

Experimenteller Teil 223

5.6 Enzymatische Studien

Bestimmung der IC50-Werte

Zunächst wurde aus der zu testenden Verbindung mit (CH3)2SO je eine Verdünnungsreihe hergestellt, die zwölf verschiedene Konzentrationen im Bereich von 1x10-3 M bis zu 1x10-9 M umfasste. Je 25 l dieser Lösungen wurden in Reihen einer Multititerplatte (12 x 8) mit entfernbaren 1 ml Reaktionsgefässen verteilt.

Zusätzlich wurden benötigt: ein Kaliumphosphatpuffer (0.1 M, pH = 7.6), eine Magnesiumchlorid-Lösung (0.1 M), eine Brenzcatechin-Lösung (50 mM in 0.001 N

HCl), eine Dithiothreitol-Lösung (DTT) (10 mg/ml), eine 3H-Methyl-S-adenosylmethionin-Lösung (5.5 mM, 3.64 Ci/mol), ein Leberhomogenat (1:5 mit Wasser verdünnt), eine Guajakol-Lösung (100 g/ml in HOAc (5.7 %)) und eine Scintillationslösung aus 2-(4'-tert-Butylphenyl)-5-(4''-biphenyl)-1,3,4-oxadiazol (Butyl-PBD) (0.5% in Toluol/n-Hexan 1:4).

Es wurden jeweils dreimal folgende Proben zusammengestellt:

Blindprobe: (CH3)2SO (25 l), Kaliumphosphatpuffer (130 l), Wasser (25 l), MgCl2-Lösung (10 l), DTT (10 l).

Kontrollprobe: (CH3)2SO (25 l), Kaliumphosphatpuffer (130 l), Enzym-Lösung (5 l), Wasser (20 l), MgCl2-Lösung (10 l), DTT (10 l).

Inhibitorprobe: Inhibitor-Lösung aus der oben aufgeführten Verdünnungsreihe (25 l), Kaliumphosphatpuffer (130 l), Enzym-Lösung (5 l), Wasser (20 l), MgCl2-Lösung(10 l), DTT (10 l).

Diese Proben wurden während 15 min bei 37.5 °C vorinkubiert, dann wurden jeweils eine Lösung aus Kaliumphosphatpuffer (70 l), Wasser (5 l), Brenzcatechinsäure-Lösung (15 l) und 3H-SAM-Lösung (10 l) zugegeben und nochmals für 15 min bei 37.5 °C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe der Guajakol-Essigsäure-Lösung (200 l) gestoppt. Die Reaktionsgefässe wurden aus der Multititerplatte entfernt und in Scintillationszählgefässe mit je 3 ml Scintillationslösung gegeben und 5 min maschinell gerüttelt. Die Radioaktivität wurde mit einem -Zähler (Beckmann LS 6000 TA)bestimmt. Exemplarisch ist in Abb. 53 und Tabelle 14 die Darstellung und Auswertung der Messresultate für den Bisubstrat-Inhibitor 31 gezeigt.

Experimenteller Teil 224

-4 -3 -2 -1 0 1 20

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

IC50 = 9 nM

DP

M

log(c / 1 M)

Abb. 53 Radioaktivität des extrahierten markierten Reaktionsproduktes in Abhängigkeit der Inhibitorkonzentration im Enzymassay mit Vorinkubation für den Bisubstrat-Inhibitor 31.

Tabelle 14 Nichtlineare Kurvenanpassung der Messdaten an )})4(3exp{1/()12(1 PxPPPPy

Parameter Werte für 31

2 3121095

P1 1629 740

P2 63492 1603

P3 -3.7 0.3

P4 -2.06 0.03

IC50 = 10P4 [ M] 0.009

Experimenteller Teil 225

Bestimmung der Ki-Werte.

Es wurde wie bei der Bestimmung der IC50-Werte vorgegangen, wobei auf den Vorinkubationsschritt verzichtet und die Reaktion durch Zugabe der Enzym-Lösung gestartet wurde.

Für die Bestimmung des Inhibitionsmechanismus für die SAM-Bindungstasche wurde die Konzentration von 3H-Methyl-S-adenosylmethionin (3.64 Ci/mol) in folgendem Bereich variiert: 17 M, 20 M, 25 M, 33 M, 50 M und 100 M.

Der Inhibitionsmechanismus für die Catechol-Bindungstasche wurde durch Variation der Konzentration des Substrats Benzol-1,2-diol in folgendem Bereich bestimmt: 0.08 mM, 0.1 mM, 0.13 mM, 0.17 mM, 0.25 mM und 0.5 mM.

Experimenteller Teil 226

Anhang 227

6 Anhang

6.1 Abkürzungen

Å Ångström (1 Å = 10-10 m)

abs. absolut

Ac Acetyl

AIBN Azo-bis-isobutyronitril

Äquiv. Äquivalent(e)

aliph. aliphatisch

arom. aromatisch

Ber. Berechnet

Bn Benzyl

n-Bu n-Butyl

Boc tert-Butoxycarbonyl

Bs Brosyl (para-Brombenzolsulfonyl)

Bz Benzoyl

Cat. Catechol

COSY Correlated Spectroscopy

d Tag(e)

DCC Dicyclohexylcarbodiimid

DEAD Diethylazodicarboxylat

DIBAL-H Diisobutylaluminiumhydrid

DMAP 4-Dimethylaminopyridin

DME 1,2-Dimethoxyethan

DMF N,N-Dimethylformamid

DPM Decays Per Minute

EI Elektronen-Ionisation

ESI Electron Spray Ionisation

Et Ethyl

Fp. Schmelzpunkt

Gef. Gefunden

ges. gesättigt

Anhang228

h Stunde(n)

HPLC High Performance Liquid Chromatography

HR High Resolution

IBX ortho-Iodoxybenzoesäure

Im Imidazol

IR Infrarotspektroskopie, Infrarotspektrum

Lit. Literaturreferrenz

M Molekülion

MALDI Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation

Me Methyl

min Minute(n)

MS Massenspektrometrie, Massenspektrum

Ms Mesyl (Methylsulfonyl)

NMR Kernresonanz/-spektrum (Nuclear Magnetic Resonance)

NOE Nuclear Overhauser Enhancement

Ns Nosyl (para-Nitrobenzolsulfonyl)

p Para

PCC Pyridiniumchlorochromat

PPTS Pyridinium-4-toluolsulfonat

Ph Phenyl

i-Pr iso-Propyl

quant. quantitativ

RT Raumtemperatur

TBAF Tetrabutylammoniumfluorid

TBDMS tert-Butyldimethylsilyl

TBDPS tert-Butyldiphenylsilyl

t-Bu tert-Butyl

TFA Trifluoressigsäure

THF Tetrahydrofuran

Ts Tosyl (para-Toluolsulfonylsulfonyl)

Zers. Zersetzung

Anhang 229

6.2 Daten zur Kristallstrukturanalyse von 55

Table 1. Crystal data and structure refinement

Identification code clb35

Empirical formula C23 H22 N6 O5

Formula weight 462.47

Temperature 293(2) K

Wavelength 1.54178 A

Crystal system Monoclinic

Space group P2(1)

Unit cell dimensions a = 6.933(5) A alpha = 90 deg.

b = 8.123(10) A beta = 91.86(14) deg.

c = 19.48(5) A gamma = 90 deg.

Volume 1096(3) A^3

Z 2

Density (calculated) 1.401 Mg/m^3

Absorption coefficient 0.846 mm^-1

F(000) 484

Crystal size 0.4 x 0.1 x 0.015 mm

Theta range for data collection 2.27 to 49.95 deg.

Index ranges -6<=h<=6, 0<=k<=8, 0<=l<=19

Reflections collected 1205

Independent reflections 1205 [R(int) = 0.0000]

Absorption correction None

Refinement method Full-matrix least-squares on F^2

Data / restraints / parameters 1205 / 1 / 308

Goodness-of-fit on F^2 1.082

Final R indices [I>2sigma(I)] R1 = 0.0417, wR2 = 0.0909

R indices (all data) R1 = 0.0812, wR2 = 0.1102

Absolute structure parameter 0.1(7)

Extinction coefficient 0.0018(6)

Largest diff. peak and hole 0.190 and -0.173 e.A^-3

Anhang230

Table 2. Atomic coordinates ( x 10^4) and equivalent isotropic

displacement parameters (A^2 x 10^3). U(eq) is defined

as one third of the trace of the orthogonalized Uij tensor.

________________________________________________________________

x y z U(eq)

________________________________________________________________

N(1) 1061(9) 8678(7) 5756(3) 43(2)

C(1') 2953(11) 5035(9) 7844(4) 42(2)

C(1") -3523(11) -1674(10) 6314(4) 44(2)

C(2') 1847(11) 6071(9) 8330(4) 41(2)

C(2") -3799(12) -1903(10) 5631(4) 56(2)

C(2) 1499(11) 9012(10) 6410(4) 49(2)

N(3) 1903(10) 8039(7) 6947(3) 44(2)

C(3') 1060(12) 4859(11) 8861(4) 50(2)

C(3") -3792(12) -3549(12) 5392(5) 61(3)

C(4) 1875(11) 6450(9) 6735(4) 36(2)

C(4') 1307(12) 3176(9) 8525(4) 50(2)

C(4") -3519(11) -4811(11) 5844(5) 56(2)

C(5) 1442(11) 5902(9) 6074(4) 35(2)

C(5") -3218(12) -4574(10) 6542(5) 48(2)

C(5') -538(13) 2580(11) 8203(4) 59(2)

C(6") -3212(10) -2954(10) 6774(4) 42(2)

C(6) 1035(10) 7072(10) 5560(4) 37(2)

C(6') -1230(15) 1084(12) 8247(4) 61(3)

N(7) 1502(10) 4195(8) 6053(3) 48(2)

C(7") -2938(11) -2310(10) 7462(5) 47(2)

C(7') -3145(13) 524(11) 7987(5) 66(3)

O(8') 2860(7) 3361(6) 8074(3) 49(1)

N(8") -3109(10) -577(8) 7406(4) 51(2)

C(8) 1976(12) 3798(10) 6688(4) 49(2)

N(9) 2187(8) 5072(7) 7138(3) 39(2)

C(9") -3529(11) -112(12) 6736(5) 52(2)

O(9') 3096(9) 7115(7) 8728(3) 61(2)

O(10') 2332(8) 5059(7) 9438(3) 64(2)

N(10) 611(8) 6728(8) 4916(3) 46(2)

O(10") -3796(11) 1262(7) 6542(4) 83(2)

O(11") -2621(8) -2991(8) 8008(3) 61(2)

C(11') 3000(12) 6753(10) 9424(4) 56(2)

C(12') 1542(18) 7830(13) 9767(5) 96(4)

C(13') 4941(16) 6804(14) 9760(5) 99(4)

________________________________________________________________

Anhang 231

Table 3. Bond lengths [A] and angles [deg].

________________________________________________________________

N(1)-C(2) 1.328(10)

N(1)-C(6) 1.359(10)

C(1')-O(8') 1.434(9)

C(1')-N(9) 1.458(10)

C(1')-C(2') 1.496(11)

C(1")-C(2") 1.350(11)

C(1")-C(6") 1.385(11)

C(1")-C(9") 1.513(13)

C(2')-O(9') 1.424(9)

C(2')-C(3') 1.542(11)

C(2")-C(3") 1.417(12)

C(2)-N(3) 1.334(10)

N(3)-C(4) 1.355(10)

C(3')-O(10') 1.415(9)

C(3')-C(4') 1.528(11)

C(3")-C(4") 1.360(13)

C(4)-N(9) 1.380(9)

C(4)-C(5) 1.386(10)

C(4')-O(8') 1.419(9)

C(4')-C(5') 1.488(12)

C(4")-C(5") 1.384(12)

C(5)-N(7) 1.388(10)

C(5)-C(6) 1.404(10)

C(5")-C(6") 1.391(12)

C(5')-C(6') 1.310(12)

C(6")-C(7") 1.446(12)

C(6)-N(10) 1.310(9)

C(6')-C(7') 1.477(13)

N(7)-C(8) 1.310(10)

C(7")-O(11") 1.212(9)

C(7")-N(8") 1.416(11)

C(7')-N(8") 1.443(11)

N(8")-C(9") 1.381(11)

C(8)-N(9) 1.361(10)

C(9")-O(10") 1.191(11)

O(9')-C(11') 1.391(10)

O(10')-C(11') 1.453(11)

C(11')-C(13') 1.477(12)

C(11')-C(12') 1.509(13)

Anhang232

C(2)-N(1)-C(6) 117.8(7)

O(8')-C(1')-N(9) 107.2(6)

O(8')-C(1')-C(2') 107.8(6)

N(9)-C(1')-C(2') 113.9(6)

C(2")-C(1")-C(6") 123.2(7)

C(2")-C(1")-C(9") 130.4(8)

C(6")-C(1")-C(9") 106.3(7)

O(9')-C(2')-C(1') 111.4(6)

O(9')-C(2')-C(3') 103.7(6)

C(1')-C(2')-C(3') 105.4(7)

C(1")-C(2")-C(3") 116.9(8)

N(1)-C(2)-N(3) 131.9(7)

C(2)-N(3)-C(4) 109.0(7)

O(10')-C(3')-C(4') 111.5(7)

O(10')-C(3')-C(2') 103.6(6)

C(4')-C(3')-C(2') 103.7(6)

C(4")-C(3")-C(2") 120.0(8)

N(3)-C(4)-N(9) 126.8(7)

N(3)-C(4)-C(5) 126.1(7)

N(9)-C(4)-C(5) 107.0(6)

O(8')-C(4')-C(5') 115.6(7)

O(8')-C(4')-C(3') 105.6(6)

C(5')-C(4')-C(3') 111.4(8)

C(3")-C(4")-C(5") 123.0(8)

C(4)-C(5)-N(7) 110.1(7)

C(4)-C(5)-C(6) 118.6(7)

N(7)-C(5)-C(6) 131.4(8)

C(4")-C(5")-C(6") 116.7(8)

C(6')-C(5')-C(4') 125.8(9)

C(1")-C(6")-C(5") 120.1(8)

C(1")-C(6")-C(7") 110.0(7)

C(5")-C(6")-C(7") 129.9(8)

N(10)-C(6)-N(1) 118.3(7)

N(10)-C(6)-C(5) 125.0(7)

N(1)-C(6)-C(5) 116.7(7)

C(5')-C(6')-C(7') 126.2(9)

C(8)-N(7)-C(5) 102.9(6)

O(11")-C(7")-N(8") 122.2(9)

O(11")-C(7")-C(6") 131.5(8)

N(8")-C(7")-C(6") 106.3(8)

N(8")-C(7')-C(6') 114.9(8)

C(4')-O(8')-C(1') 109.7(6)

C(9")-N(8")-C(7") 111.1(8)

Anhang 233

C(9")-N(8")-C(7') 124.2(8)

C(7")-N(8")-C(7') 124.0(8)

N(7)-C(8)-N(9) 116.1(7)

C(8)-N(9)-C(4) 103.8(6)

C(8)-N(9)-C(1') 128.3(7)

C(4)-N(9)-C(1') 126.8(6)

O(10")-C(9")-N(8") 125.7(9)

O(10")-C(9")-C(1") 128.1(8)

N(8")-C(9")-C(1") 106.3(8)

C(11')-O(9')-C(2') 111.0(6)

C(3')-O(10')-C(11') 106.5(6)

O(9')-C(11')-O(10') 104.1(6)

O(9')-C(11')-C(13') 110.7(8)

O(10')-C(11')-C(13') 107.7(7)

O(9')-C(11')-C(12') 111.3(7)

O(10')-C(11')-C(12') 108.8(7)

C(13')-C(11')-C(12') 113.7(8)

________________________________________________________________

Table 4. Anisotropic displacement parameters (A^2 x 10^3).

The anisotropic displacement factor exponent takes the form:

-2 pi^2 [ h^2 a*^2 U11 + ... + 2 h k a* b* U12 ]

_______________________________________________________________________

U11 U22 U33 U23 U13 U12

_______________________________________________________________________

N(1) 61(5) 22(4) 46(4) -1(3) -3(3) -6(3)

C(1') 52(5) 28(5) 44(4) 3(4) -7(4) 2(4)

C(1") 46(5) 28(5) 58(6) 5(5) -1(4) 4(4)

C(2') 44(5) 35(5) 43(4) 3(4) -1(4) 5(4)

C(2") 65(6) 38(6) 65(6) 9(5) 4(5) 1(5)

C(2) 69(6) 11(4) 66(6) -5(5) -4(5) -8(4)

N(3) 63(5) 21(5) 47(4) -2(3) -4(3) 0(3)

C(3') 68(6) 36(5) 47(5) -3(4) -1(4) -5(4)

C(3") 62(6) 60(7) 60(6) -11(6) -2(5) -5(5)

C(4) 39(5) 22(6) 48(6) 3(4) 6(4) -9(4)

C(4') 74(6) 29(5) 46(4) 15(4) -13(5) -15(5)

C(4") 58(6) 35(6) 76(6) -11(6) 3(5) 3(5)

C(5) 47(5) 19(5) 40(5) -3(4) -3(4) 0(4)

C(5") 44(5) 26(6) 74(6) 7(5) 3(4) 4(4)

C(5') 74(7) 39(6) 63(6) 7(5) -9(5) -6(5)

C(6") 41(5) 24(6) 60(6) 2(5) -2(4) -3(4)

Anhang234

C(6) 34(5) 29(5) 47(5) -1(5) 5(4) -5(4)

C(6') 80(7) 38(6) 65(6) 3(5) -8(5) -9(5)

N(7) 80(5) 17(4) 48(5) -7(3) 0(4) 4(3)

C(7") 42(5) 27(6) 71(7) 5(5) -1(4) -6(4)

C(7') 63(7) 46(6) 90(7) -28(5) 4(5) -14(5)

O(8') 64(4) 22(3) 61(3) 7(3) 4(3) 4(3)

N(8") 58(5) 36(5) 58(5) -5(4) 0(4) -9(4)

C(8) 80(6) 10(5) 56(6) -3(4) -6(5) -2(4)

N(9) 54(4) 15(3) 48(4) -1(4) 2(3) -4(3)

C(9") 44(6) 34(7) 78(7) -4(6) 2(4) -10(5)

O(9') 95(4) 40(4) 48(4) -7(3) 0(3) -23(3)

O(10') 100(5) 42(4) 50(3) 7(3) -20(3) -14(4)

N(10) 72(5) 24(4) 42(4) 6(3) -4(3) -3(4)

O(10") 124(6) 18(4) 107(5) 11(4) 0(4) 2(3)

O(11") 69(4) 45(4) 68(4) 2(4) -5(3) -3(3)

C(11') 77(7) 39(6) 53(6) -10(5) -8(5) -7(5)

C(12') 159(11) 62(7) 69(6) -13(6) 27(7) 10(7)

C(13') 109(8) 52(7) 132(9) -11(7) -63(8) -5(7)

_______________________________________________________________________

Table 5. Hydrogen coordinates ( x 10^4) and isotropic

displacement parameters (A^2 x 10^3).

________________________________________________________________

x y z U(eq)

________________________________________________________________

H(1'A) 4303(11) 5395(9) 7853(4) 50

H(2'A) 811(11) 6690(9) 8093(4) 49

H(2"A) -3986(12) -1020(10) 5332(4) 67

H(2A) 1529(11) 10130(10) 6512(4) 59

H(3'A) -285(12) 5089(11) 8969(4) 60

H(3"A) -3972(12) -3768(12) 4925(5) 73

H(4'A) 1706(12) 2391(9) 8885(4) 60

H(4"A) -3537(11) -5883(11) 5675(5) 67

H(5"A) -3029(12) -5454(10) 6842(5) 58

H(5'A) -1265(13) 3337(11) 7946(4) 71

H(6'A) -441(15) 301(12) 8462(4) 73

H(7'A) -3790(13) -25(11) 8358(5) 79

H(7'B) -3908(13) 1483(11) 7858(5) 79

H(8A) 2157(12) 2710(10) 6824(4) 58

H(10A) 358(8) 7509(8) 4629(3) 56

H(10B) 585(8) 5721(8) 4780(3) 56

Anhang 235

H(12A) 1507(18) 7553(13) 10246(5) 145

H(12B) 289(18) 7656(13) 9555(5) 145

H(12C) 1901(18) 8964(13) 9719(5) 145

H(13A) 4844(16) 6552(14) 10239(5) 148

H(13B) 5481(16) 7884(14) 9710(5) 148

H(13C) 5758(16) 6009(14) 9549(5) 148

________________________________________________________________

6.3 Daten zur Kristallstrukturanalyse von 94

Table 1. Crystal data and structure refinement.

Identification code rsa13

Empirical formula C20 H31 N5 O4 Si

Formula weight 433.59

Temperature 293(2) K

Wavelength 1.54178 A

Crystal system Orthorhombic

Space group P2(1)2(1)2(1)

Unit cell dimensions a = 8.473(5) A alpha = 90 deg.

b = 16.350(12) A beta = 90 deg.

c = 17.753(12) A gamma = 90 deg.

Volume 2459(3) A^3

Z 4

Density (calculated) 1.171 Mg/m^3

Absorption coefficient 1.117 mm^-1

F(000) 928

Crystal size 0.4 x 0.2 x 0.1 mm

Theta range for data collection 3.68 to 50.03 deg.

Index ranges 0<=h<=8, 0<=k<=16, 0<=l<=17

Reflections collected 1465

Independent reflections 1460 [R(int) = 0.0294]

Absorption correction None

Refinement method Full-matrix least-squares on F^2

Data / restraints / parameters 1460 / 0 / 272

Goodness-of-fit on F^2 0.870

Final R indices [I>2sigma(I)] R1 = 0.0401, wR2 = 0.1039

R indices (all data) R1 = 0.0425, wR2 = 0.1081

Absolute structure parameter -0.10(6)

Extinction coefficient 0.0008(3)

Largest diff. peak and hole 0.198 and -0.190 e.A^-3

Anhang236

Table 2. Atomic coordinates ( x 10^4) and equivalent isotropic

displacement parameters (A^2 x 10^3). U(eq) is defined

as one third of the trace of the orthogonalized Uij tensor.

________________________________________________________________

x y z U(eq)

________________________________________________________________

N(1) 4803(4) 7499(2) -4104(2) 54(1)

C(2) 5156(5) 7693(3) -3396(2) 59(1)

N(3) 4262(4) 8009(2) -2859(2) 56(1)

C(4) 2788(5) 8137(2) -3118(2) 45(1)

C(5) 2244(4) 7974(2) -3828(2) 43(1)

C(6) 3312(5) 7636(2) -4348(2) 46(1)

N(7) 658(4) 8185(2) -3897(2) 51(1)

C(8) 307(5) 8474(2) -3228(2) 54(1)

N(9) 1537(4) 8459(2) -2725(2) 48(1)

N(10) 2955(4) 7449(2) -5056(2) 59(1)

O(11) 2300(3) 9516(2) -1929(2) 56(1)

O(12) 1377(4) 9024(2) -335(2) 75(1)

Si(13) 1316(2) 9029(1) 586(1) 67(1)

C(14) 1646(11) 7967(3) 942(4) 127(3)

C(15) 2893(9) 9699(4) 956(4) 111(2)

C(16) -688(7) 9420(3) 818(3) 85(2)

C(17) -1929(9) 8920(5) 397(4) 127(2)

C(18) -948(12) 9349(7) 1675(4) 168(4)

C(19) -839(11) 10308(4) 569(5) 137(3)

O(20) 8149(4) 9684(2) -1851(2) 87(1)

O(21) 8144(4) 10951(2) -1366(2) 90(1)

C(22) 9819(7) 11048(4) -1521(5) 107(2)

C(23) 10100(11) 11299(5) -2292(5) 133(3)

C(1') 1475(5) 8765(2) -1961(2) 50(1)

C(2') 2222(6) 8223(3) -1381(2) 60(1)

C(3') 2706(6) 8818(3) -780(2) 64(1)

C(4') 3202(5) 9563(3) -1246(2) 58(1)

C(5') 4920(5) 9591(3) -1449(3) 59(1)

C(6') 5819(5) 10218(3) -1305(3) 66(1)

C(7') 7483(6) 10234(3) -1548(3) 70(1)

________________________________________________________________

Anhang 237

Table 3. Bond lengths [A] and angles [deg].

_____________________________________________________________

N(1)-C(2) 1.331(5)

N(1)-C(6) 1.354(5)

C(2)-N(3) 1.323(5)

N(3)-C(4) 1.347(5)

C(4)-N(9) 1.374(5)

C(4)-C(5) 1.369(5)

C(5)-N(7) 1.393(5)

C(5)-C(6) 1.406(5)

C(6)-N(10) 1.327(5)

N(7)-C(8) 1.312(5)

C(8)-N(9) 1.373(5)

N(9)-C(1') 1.446(5)

O(11)-C(1') 1.413(5)

O(11)-C(4') 1.435(5)

O(12)-C(3') 1.417(5)

O(12)-Si(13) 1.636(3)

Si(13)-C(14) 1.867(6)

Si(13)-C(16) 1.860(6)

Si(13)-C(15) 1.849(6)

C(16)-C(19) 1.523(9)

C(16)-C(18) 1.543(8)

C(16)-C(17) 1.527(9)

O(20)-C(7') 1.191(6)

O(21)-C(7') 1.339(6)

O(21)-C(22) 1.455(7)

C(22)-C(23) 1.448(9)

C(1')-C(2') 1.499(6)

C(2')-C(3') 1.501(6)

C(3')-C(4') 1.531(6)

C(4')-C(5') 1.500(6)

C(5')-C(6') 1.303(6)

C(6')-C(7') 1.475(7)

C(2)-N(1)-C(6) 118.2(4)

N(3)-C(2)-N(1) 130.2(4)

C(2)-N(3)-C(4) 110.2(3)

N(3)-C(4)-N(9) 127.0(3)

N(3)-C(4)-C(5) 126.6(4)

N(9)-C(4)-C(5) 106.4(3)

N(7)-C(5)-C(4) 111.0(3)

Anhang238

N(7)-C(5)-C(6) 131.3(4)

C(4)-C(5)-C(6) 117.7(4)

N(10)-C(6)-N(1) 118.5(4)

N(10)-C(6)-C(5) 124.4(4)

N(1)-C(6)-C(5) 117.1(4)

C(8)-N(7)-C(5) 103.2(3)

N(7)-C(8)-N(9) 114.3(4)

C(4)-N(9)-C(8) 105.2(3)

C(4)-N(9)-C(1') 129.5(3)

C(8)-N(9)-C(1') 125.2(3)

C(1')-O(11)-C(4') 110.2(3)

C(3')-O(12)-Si(13) 125.7(3)

O(12)-Si(13)-C(14) 109.2(2)

O(12)-Si(13)-C(16) 104.5(2)

C(14)-Si(13)-C(16) 112.4(3)

O(12)-Si(13)-C(15) 109.5(3)

C(14)-Si(13)-C(15) 108.8(4)

C(16)-Si(13)-C(15) 112.2(3)

C(19)-C(16)-C(18) 110.2(6)

C(19)-C(16)-C(17) 108.1(6)

C(18)-C(16)-C(17) 110.1(6)

C(19)-C(16)-Si(13) 109.9(5)

C(18)-C(16)-Si(13) 108.8(5)

C(17)-C(16)-Si(13) 109.6(4)

C(7')-O(21)-C(22) 117.2(4)

C(23)-C(22)-O(21) 111.7(6)

O(11)-C(1')-N(9) 108.7(3)

O(11)-C(1')-C(2') 106.1(3)

N(9)-C(1')-C(2') 115.1(3)

C(3')-C(2')-C(1') 102.7(3)

O(12)-C(3')-C(2') 109.5(4)

O(12)-C(3')-C(4') 109.3(4)

C(2')-C(3')-C(4') 102.0(3)

O(11)-C(4')-C(5') 108.4(4)

O(11)-C(4')-C(3') 105.4(3)

C(5')-C(4')-C(3') 114.9(4)

C(6')-C(5')-C(4') 122.9(4)

C(5')-C(6')-C(7') 121.0(4)

O(20)-C(7')-O(21) 124.9(4)

O(20)-C(7')-C(6') 124.9(5)

O(21)-C(7')-C(6') 110.2(4)

_____________________________________________________________

Anhang 239

Table 4. Anisotropic displacement parameters (A^2 x 10^3).

The anisotropic displacement factor exponent takes the form:

-2 pi^2 [ h^2 a*^2 U11 + ... + 2 h k a* b* U12 ]

______________________________________________________________________

U11 U22 U33 U23 U13 U12

______________________________________________________________________

N(1) 32(2) 77(2) 52(2) -9(2) 3(2) 4(2)

C(2) 37(2) 85(3) 55(3) -12(2) -8(2) 7(2)

N(3) 36(2) 86(2) 45(2) -12(2) -1(2) 9(2)

C(4) 34(2) 57(2) 43(2) -4(2) 3(2) 1(2)

C(5) 30(2) 55(2) 42(2) -5(2) -1(2) 0(2)

C(6) 38(3) 55(2) 45(2) -7(2) 2(2) -4(2)

N(7) 37(2) 66(2) 49(2) -8(2) 1(2) -1(2)

C(8) 36(2) 68(2) 58(3) -7(2) -3(2) 5(2)

N(9) 32(2) 66(2) 46(2) -8(2) 1(2) 6(2)

N(10) 37(2) 93(2) 48(2) -17(2) 5(2) 1(2)

O(11) 50(2) 66(2) 53(2) -6(1) -7(2) 6(2)

O(12) 54(2) 124(2) 46(2) -15(2) 7(2) 12(2)

Si(13) 80(1) 75(1) 44(1) -8(1) 5(1) -9(1)

C(14) 164(7) 100(4) 116(5) 13(4) 14(5) 12(5)

C(15) 108(5) 126(5) 99(4) -30(4) -19(4) -21(4)

C(16) 89(4) 99(4) 68(3) -18(3) 34(3) -15(3)

C(17) 78(4) 151(6) 150(6) 3(5) 25(4) -22(5)

C(18) 174(9) 247(10) 81(4) -18(5) 72(5) 8(8)

C(19) 148(7) 93(4) 171(7) -15(4) 24(6) 24(5)

O(20) 46(2) 83(2) 130(3) -15(2) 2(2) 14(2)

O(21) 54(2) 79(2) 136(3) -14(2) 5(2) 2(2)

C(22) 55(4) 102(4) 166(7) -23(4) 1(4) 3(3)

C(23) 115(6) 135(5) 149(7) -2(5) 45(6) 14(5)

C(1') 38(2) 66(2) 45(2) -8(2) 3(2) 2(2)

C(2') 60(3) 71(2) 48(2) -2(2) 10(2) 6(2)

C(3') 51(3) 97(3) 45(2) -3(2) 2(2) 13(3)

C(4') 50(3) 75(3) 49(2) -17(2) -6(2) 10(2)

C(5') 43(3) 74(3) 59(3) -13(2) -3(2) 15(2)

C(6') 48(3) 80(3) 69(3) -13(2) -3(2) 10(3)

C(7') 46(3) 71(3) 92(4) -7(3) -9(3) 13(3)

______________________________________________________________________

Anhang240

Table 5. Hydrogen coordinates ( x 10^4) and isotropic

displacement parameters (A^2 x 10^3).

__________________________________________________________________

x y z U(eq)

__________________________________________________________________

H(2A) 6233(5) 7596(3) -3253(2) 89

H(8A) -729(5) 8669(2) -3103(2) 81

H(10A) 1972(4) 7540(2) -5227(2) 89

H(10B) 3692(4) 7236(2) -5364(2) 89

H(14A) 820(11) 7619(3) 759(4) 190

H(14B) 2646(11) 7771(3) 763(4) 190

H(14C) 1641(11) 7965(3) 1483(4) 190

H(15A) 2732(9) 10248(4) 780(4) 166

H(15B) 2887(9) 9694(4) 1496(4) 166

H(15C) 3891(9) 9501(4) 777(4) 166

H(17A) -2953(9) 9130(5) 522(4) 190

H(17B) -1756(9) 8972(5) -136(4) 190

H(17C) -1869(9) 8354(5) 537(4) 190

H(18A) -1979(12) 9546(7) 1808(4) 252

H(18B) -861(12) 8782(7) 1810(4) 252

H(18C) -163(12) 9658(7) 1942(4) 252

H(19A) -1878(11) 10502(4) 689(5) 206

H(19B) -69(11) 10634(4) 828(5) 206

H(19C) -669(11) 10347(4) 36(5) 206

H(22A) 10327(7) 10531(4) -1438(5) 161

H(22B) 10269(7) 11437(4) -1179(5) 161

H(23A) 11217(11) 11346(5) -2372(5) 200

H(23B) 9669(11) 10906(5) -2636(5) 200

H(23C) 9611(11) 11821(5) -2375(5) 200

H(1'A) 393(5) 8858(2) -1825(2) 74

H(2'A) 3122(6) 7947(3) -1590(2) 90

H(2'B) 1494(6) 7824(3) -1189(2) 90

H(3'A) 3564(6) 8619(3) -478(2) 96

H(4'A) 2920(5) 10052(3) -979(2) 87

H(5'A) 5368(5) 9116(3) -1684(3) 88

H(6'A) 5401(5) 10670(3) -1022(3) 98

__________________________________________________________________

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Lebenslauf

1972 Geboren am 26. Januar 1972 in Buenos Aires, Argentinien.

1992 Theodor Heuss Gymnasium Schopfheim, Deutschland, Allgemeine Hochschulreife.

1992-1993 Kreiskrankenhaus Kehl, Deutschland, 15 Monate Zivildienst.

1993-1995 Albert-Ludwigs Universität Freiburg i. Brsg., Deutschland,Chemie Grundstudium, Vordiplom.

1995-1996 Albert-Ludwigs Universität Freiburg i. Brsg., Deutschland,Fortgeschrittenenpraktika in Organischer Chemie, Anorganischer Chemie und Biochemie. Vertiefungspraktikum in Organischer Chemie in den Arbeitsgruppen von Prof. Dr. H. Prinzbach undProf. Dr. Dr. h.c. C. Rüchardt.

1996 Hoffmann-La Roche AG, Basel, Schweiz, Industriepraktikum in einem Forschungslabor, Wirkstoffsynthese, Betreuung durch Dr. Geo Adam.

1996-1999 ETH Zürich, Schweiz, Chemie-Hauptstudium mit Vertiefung in Organischer Chemie und Computergestützter Chemie als Wahlfach. Forschungspraktikum in Bioorganischer Chemie: "Synthese von Formacetal verbrückten Dinucleosiden" bei Dr. S. Pitsch und Dr. R. Allemann. Diplomarbeit in Organischer Chemie bei Prof. Dr. François Diederich: "Synthese neuer, nichtpeptidischer Thrombin-Inhibitoren".

2000-2003 ETH Zürich, Schweiz, Promotionsarbeit im Arbeitskreis von Prof. Dr. François Diederich: "Strukturbasiertes Design, Synthese und in vitroBewertung von Bisubstrat-Inhibitoren der Catechol-O-Methyltransferase(COMT)",Betreuung von Übungen, Fortgeschrittenenpraktika und drei Diplomanden. UNIX Systemadministration (Silicon Graphics).

Zürich, Januar 2003

Christian Daniel Lerner