RICARDO DE NARDI FONOFF - USP · Aos amigos do GOU Água Viva (Grupo de Oração Universitário)...

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Universidade de São Paulo Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”

Fosfito de potássio no controle de Phytophthora spp. em citros e faia e seu modo de ação

Dalilla Carvalho Rezende

Tese apresentada para obtenção do título de Doutora em Ciências. Área de concentração: Fitopatologia

Piracicaba 2014

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Dalilla Carvalho Rezende Engenheira Agrônoma


Orientador: Prof. Dr. SÉRGIO FLORENTINO PASCHOLATI

Tese apresentada para obtenção do título de Doutora em Ciências. Área de concentração: Fitopatologia

Piracicaba 2014

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação

DIVISÃO DE BIBLIOTECA - DIBD/ESALQ/USP

Rezende, Dalilla Carvalho Fosfito de potássio no controle de Phytophthora spp. em citros e faia e seu modo

de ação / Dalilla Carvalho Rezende. - - Piracicaba, 2014. 108 p. : il.

Tese (Doutorado) - - Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, 2014.

1. Controle alternativo 2. Fosfito de potássio 3. Modo de ação 4. Citros 5. Faia I. Título

CDD 634.3 R467f

“Permitida a cópia total ou parcial deste documento, desde que citada a fonte – O autor”

3

À Deus

OFEREÇO

Aos meus pais, Irani e Geraldo, e

minha irmã Sheila por todo amor,

cuidado, incentivo e presença

constante mesmo a mares de

distância.

DEDICO

5

AGRADECIMENTOS

À Deus, por dar a oportunidade da vida e a conhecer tantas coisas. Por sua infinita

misericórdia e amor e por sonhar comigo o meu sonho.

À Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz” ESALQ/USP por ser berço de

conhecimento e crescimento profissional e pessoal.

Ao Conselho Nacional de Pesquisa Científica (CNPq) pela concessão da bolsa de

doutorado e à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

(CAPES) pela concessão da bolsa de doutorado sanduíche.

Ao Professor Sérgio F. Pascholati pelos ensinamentos, ajuda, paciência, exemplo,

confiança e amizade. Serei sempre grata por suas palavras de apoio, pela acolhida

e pela boa convivência durante esse período.

Aos Professores do Departamento de Fitopatologia e Nematologia da ESALQ/USP

pelos ensinamentos, boa convivência e pronta ajuda quando necessário.

Aos colegas do Laboratório de Fisiologia e Bioquímica Fitopatológica Dra Silvia

Blumer, Dra Rafaela Roma, Dra Nívea Tonuci, Kaira Pauli, Caio Beraquet, Cynthia

Sá, Sara Mondoni, Carla Pelizari, Simone Brand e Thiago Anchieta pelos

ensinamentos, ajuda, carinho e pelas longas conversas que muito me ajudaram

profissional e pessoalmente. De modo especial ao estagiário Dayson Brandão que

trabalhou junto comigo durante todo o doutorado, obrigada pela ajuda,

companheirismo, compreensão e amizade.

Aos colegas da pós-graduação pelo companheirismo, ajuda, ensinamentos e boa

convivência, especialmente os colegas do Laboratório de Epidemiologia: Isabela,

Juliana, Ana Raquel, Paula, Meyriele, Antônio, Renan, Ricardo, Josi, a técnica Silvia

Lourenço e à Dra Maria Cândida pelos ensinamentos, paciência e amizade.

À equipe do Laboratório de Micologia do Departamento de Fitopatologia

ESALQ/USP, pela utilização dos equipamentos em especial à Juliana Ramiro pela

pronta ajuda nas análises moleculares.

Aos funcionários do Departamento de Fitopatologia e Nematologia ESALQ/USP,

pela ajuda e boa convivência, em especial à Fabiana, Heloísa e Iraídes.

Ao Prof. Francisco Tanaka pelos ensinamentos e amizade e ao técnico Renato pela

ajuda e disponibilidade durante as análises ao microscópio eletrônico de varredura

no NAP/MEPA/ESALQ-USP.

6

Ao Prof. Osswald e sua equipe pela ajuda e disponibilização do laboratório para

realização dos ensaios com faia na Alemanha. Ao Dr. Ronaldo Dalio pelas

sugestões, apoio e disponibilização de materiais para os ensaios.

Ao FUNDECITRUS e ao APTA/IAC pela disponibilização das sementes de tangerina

‘Sunki’.

Às queridas amigas Caroline Rabelo, Simone Brand, Roberta Ferreira e Livia

Cezarino pelas conversas, ajuda, companheirismo e amizade.

Aos amigos do GOU Água Viva (Grupo de Oração Universitário) pela amizade,

companheirismo e orações que me fizeram uma pessoa ainda mais feliz durante

esses anos. Obrigada por caminharmos juntos em busca de um mesmo sonho!

Aos amigos que fiz na Alemanha: Laura, Jéssica, Edson, Eduardo, Gustavo, Hudson

pelo convívio, ajuda e amizade que foram essenciais durante esse período. De

modo especial à querida Lia Wentzel que me acolheu com muito carinho e me

ajudou muito.

À equipe do Laboratório de Genética Molecular do Departamento de Fitopatologia

ESALQ/USP, principalmente à Mariana pela ajuda nas análises de qPCR.

À Stoller do Brasil, pelo fornecimento do Phytogard® como fonte de fosfito de

potássio.

Ao Prof. Fabrício Rodrigues e a equipe do Laboratório da Interação Planta-Patógeno

(UFV), em especial à Vivian Carré Missio por terem me despertado o amor pela

fitopatologia e pela oportunidade de trabalhar e aprender essa ciência durante a

graduação.

Aos meus pais Irani e Geraldo, minha irmã Sheila e minha família de coração Pedro,

Lena, Pedro Henrique, Allysson pela confiança, ajuda e por dizerem que tudo ficaria

bem, aconteça o que acontecer.

Ao Leonardo Chagas pelo carinho, apoio, compreensão e companheirismo. Ao José

Carlos e a Castanha pelo apoio e pela carinhosa acolhida.

Aos meus amigos de Viçosa Anderson, Dalila, Andreza, Josi, Felipe, Valéria, Nane,

Patrick, Matarazzo, Camilinha, Patrícia, Renata, Chris, Carolzinha pelos encontros,

visitas e telefonemas que nos fizeram estar sempre juntos em coração.

Às minhas amigas de infância em especial à Polyana, Michele, Fernanda, Greicy,

Tassy, Flavinhas por me apoiarem e terem sempre uma palavra de conforto e

otimismo durante toda essa jornada.

7

À todos que de alguma forma contribuíram para realização desse trabalho pois as

conquistas nunca são individuais ...

MUITO OBRIGADA!

9

“Um pouco de ciência nos afasta de Deus. Muito, nos aproxima.”

Louis Pasteur

“Feliz o homem que encontrou a sabedoria, e alcançou o entendimento,

porque a sabedoria vale mais que a prata,

e dá mais lucro que o ouro. Ela é mais valiosa que as pérolas,

e não existe objeto precioso que se compare a ela”

Provébios 3, 13-15

11

SUMÁRIO

RESUMO ................................................................................................................... 13

ABSTRACT ............................................................................................................... 15

1 INTRODUÇÃO GERAL ......................................................................................... 17

REFERÊNCIAS ........................................................................................................ 18

2 FOSFITO DE POTÁSSIO NO CONTROLE DE Phytophthora spp. EM CITROS E

FAIA .......................................................................................................................... 21

Resumo ..................................................................................................................... 21

Abstract ..................................................................................................................... 22

2.1 Introdução ........................................................................................................... 23

2.2 Revisão Bibliográfica ........................................................................................... 24

2.2.1 Citros e as doenças causadas por Phytophthora ............................................. 24

2.2.2 Faia (Fagus sylvatica) e as doenças causadas por Phytophthora ................... 26

2.2.3 Manejo de doenças causadas por Phytophthora spp ....................................... 27

2.2.4 Fosfito na agricultura ........................................................................................ 28

2.3 Material e métodos .............................................................................................. 30

2.4 Resultados .......................................................................................................... 39

2.5 Discussão ............................................................................................................ 53

2.6 Conclusões .......................................................................................................... 64

Referências ............................................................................................................... 64

3 MECANISMOS DE AÇÃO DO FOSFITO DE POTÁSSIO SOBRE Phytophthora

nicotianae e Phytophthora plurivora .......................................................................... 75

Resumo ..................................................................................................................... 75

Abstract ..................................................................................................................... 75

3.1 Introdução ........................................................................................................... 76

3.2 Revisão Bibliográfica ........................................................................................... 78

3.2.1 Phythophthora nicotianae e Phythophthora plurivora: classificação e morfologia

.................................................................................................................................. 78

3.2.2 Fosfito e seus efeitos sobre patógenos de plantas .......................................... 79

3.3 Material e métodos .............................................................................................. 80

3.4 Resultados .......................................................................................................... 87

3.5 Discussão ............................................................................................................ 97

3.6 Conclusões ........................................................................................................ 103

Referências ............................................................................................................. 104

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RESUMO


A citricultura brasileira ocupa lugar de destaque no agronegócio nacional,

sendo o país o maior produtor de laranja e suco de laranja do mundo. A faia (Fagus sylvatica) é uma das principais espécies das florestas na Europa, sendo usada como ornamental e por possui alto valor econômico devido à produção de madeira. Um dos principais entraves no cultivo dessas espécies é a ocorrência de doenças principalmente as causadas por espécies de Phytophthora que além de causar grandes prejuízos, os métodos de controle são difíceis e onerosos. Existem trabalhos na literatura que apontam os fosfitos como alternativa sustentável, eficaz e economicamente viável para o controle de doenças causadas por oomicetos. Entretanto, o Comitê de Ação a Resistência à Fungicidas (FRAC) classifica os fosfitos, como produtos com ingrediente ativo sem mecanismo de ação definido. Neste contexto, este trabalho teve como objetivo avaliar o produto comercial à base de fosfito de potássio, Phytogard® no controle das doenças causadas por Phytophthora nicotianae em citros e Phytophthora plurivora em faia, bem como avaliar através de análises bioquímicas se esse produto induz resistência em plântulas de citros. Além disso, foram realizados estudos in vitro para avaliar o efeito direto do Phytogard® sobre o desenvolvimento de P. nicotianae e P. plurivora e verificar os possíveis mecanismos de ação desse produto sobre esses patógenos. Foram utilizadas plântulas de citros e faia que foram aspergidas com diferentes concentrações de Phytogard® e, posteriormente, inoculadas com os patógenos. Foram avaliadas a incidência das doenças, o consumo de água e a quantidade de DNA dos patógenos nos tecidos das raízes dos hospedeiros. Ao final do experimento, foram realizadas análises bioquímicas dos tecidos das plântulas de citros. Nos experimentos in vitro, o micélio dos patógenos foi exposto a concentrações crescentes de Phytogard® sendo determinado o crescimento micelial, produção de massa fresca de micélio e de zoósporos. Avaliou-se a perda de eletrólitos, peroxidação de lipídios e a atividade da enzima β-1,3 glucanase do micélio exposto ao produto. Foi avaliada também a morfologia das hifas tratadas ou não com o Phytogard® através da técnica de Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV). Os resultados mostraram que o Phytogard®, em todas as concentrações aplicadas controla de maneira preventiva as doenças causadas por P. nicotianae e P. plurivora em citros e faia, respectivamente. Em citros, o produto altera a atividade de algumas proteínas relacionadas à patogênese, mas não é possível concluir que o controle seja mediado por indução de resistência. O Phytogard® inibe o crescimento micelial e a produção de zoósporos de P. nicotianae e P. plurivora. Além disso, o produto modifica a morfologia das hifas, atua na permeabilidade de membrana e na síntese de parede celular do micélio dos patógenos.

Palavras-chave: Controle alternativo; Fosfito de potássio; Modo de ação; Citros; Faia

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ABSTRACT

Potassium phosphite in the control of Phytophthora spp. in citrus and beech plants and its mode of action

The Brazilian citrus production is important to national agribusiness, and the country is the largest orange and orange juice world producer. Beech (Fagus sylvatica) is one of the main forest species in Europe and is used as ornamental and also it has a high economic value due to the production of wood. One of the main problems in the cultivation of these species is the occurrence of diseases, mainly caused by Phytophthora species. Besides causing extensive damage control methods are difficult and costly. There are studies in the literature that show phosphites as a sustainable alternative, effective and economically viable for the control of diseases caused by oomycetes. However, the Fungicide Resistance Action Committee (FRAC), classifies the phosphites as products with the active ingredient with no defined mode of action. In this context, this work aimed to evaluate the commercial product based on potassium phosphite Phytogard® on the control of diseases caused by Phytophthora nicotianae in citrus plants and Phytophthora plurivora in beech plants and evaluate through biochemical assays whether this product induces resistance in citrus seedlings. In addition, in vitro studies were carried out to evaluate the direct effect of Phytogard® on the development of P. nicotianae and P. plurivora and to understand the possible mode of action of the product on these pathogens. Citrus seedlings were sprayed with different concentrations of Phytogard® and then inoculated with the pathogen. We evaluated the diseases incidence, water uptake and the amount of pathogens DNA in the host roots. At the end of the experiment, biochemical assays with citrus seedlings were made. In in vitro experiments, the pathogen mycelium was exposed to increasing concentrations of Phytogard® and mycelial growth, production of fresh mycelium and zoospores by these pathogens were determined. We also evaluated the electrolyte leakage, lipid peroxidation and the β-1,3 glucanase activity in the mycelium exposed to the product. It was also evaluated the hyphae morphology from mycelium treated or not with Phytogard® by using scanning electron microscopy. The results showed that in all concentrations of Phytogard® preventively controled diseases caused by P. nicotianae and P. plurivora in citrus and beech plants, respectively. In citrus, the product changed the activities of some pathogenesis-related proteins, but it is not possible to conclude that the control was mediated by resistance induction. The Phytogard® inhibited mycelial growth and zoospore production by P. nicotianae and P. plurivora. Furthermore, the product modified the hyphae morphology, changed membrane permeability and mycelium cell wall synthesis in the pathogens. Keywords: Alternative control; Potassium phosphite; Mode of action; Citrus; Beech

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1 INTRODUÇÃO GERAL

Introduzida no Brasil logo no início da colonização, a laranja encontrou no país

melhores condições para vegetar e produzir do que nas próprias regiões de origem

(sul asiático), expandindo-se por todo o território nacional, destacando-se em vários

Estados, sendo São Paulo o maior estado produtor seguido por Bahia e Minas

Gerais (NEVES et al., 2010). A citricultura nacional é responsável pela maior

produção de laranja e de suco de laranja do mundo, com produção de mais de 18

milhões de toneladas de laranja e 1 milhão de toneladas métricas de suco de laranja

na safra 2012/13 (AGRIANUAL, 2014). Entretanto, a citricultura brasileira,

particularmente a paulista, enfrenta problemas que envolvem ordem política,

econômica e fitossanitária. Dentre a ocorrência de doenças, a gomose causada por

diferentes espécies do gênero Phytophthora é considerada uma das mais

importantes (GRAHAM; TIMMER, 1994).

A faia (Fagus sylvatica) é uma importante espécie arbórea e devido a sua alta

tolerância a diferentes condições climáticas é considerada uma das principais

espécies ocorrendo nas florestas da Europa (PACKHAM, 2012). Essa espécie

vegetal é frequentemente usada como árvore ornamental em parques e possui alto

valor econômico devido à produção de madeira (SCHLINK, 2010). No entanto, entre

os diferentes fatores prejudiciais ao desenvolvimento da faia, patógenos do gênero

Phytophthora estão associadas à morte dessas árvores na Europa (BRASIER et al.,

2009; JUNG et al., 2005; WEILAND et al., 2010).

Ainda é um desafio para os fitopatologistas proteger as plantas contra

patógenos, principalmente espécies de Phytophthora (DALIO et al., 2014). Devido

ao fato de Phytophthora spp. produzirem estruturas de resistência, a eliminação

desses patógenos do solo é praticamente impossível após a introdução dos mesmos

na área. Desse modo, a exclusão é o principal método de controle de doenças

provocadas por espécies desse gênero (FEICHTENBERGER et al., 2005).

Os fosfitos são compostos produzidos a base de fósforo (P), e apesar de serem

absorvidos pelas folhas e raízes, os fosfitos não são oxidados ou metabolizados

pelas plantas (GUEST; GRANT, 1991; CARSWELL et al., 1996; VARADARAJAN et

al., 2002). Após a descoberta de que fosfito era eficiente no controle de várias

doenças causadas por patógenos de solo como oomicetos, o interesse aumentou

18

rapidamente e atualmente, existem inúmeras marcas comerciais de fosfitos em

diversas formulações no mercado brasileiro (DALIO et al., 2012).

Existem na literatura vários trabalhos que relatam a influência negativa dos

fosfitos no desenvolvimento dos fitopatógenos, como crescimento micelial e

esporulação (DALIO et al., 2012; DERCKS; BUCHENAUER, 1987; FENN; COFFEY,

1984; SMILIE et al., 1989). Alguns autores relataram que o tratamento com fosfito

tem levado algumas espécies de hospedeiro ao estado de priming, que é a

potencialização de enzimas ligadas ao sistema de defesa da planta e no aumento de

compostos fenólicos e fitoalexinas no sítio de infecção, mostrando significativas

reduções na doença após a inoculação com o patógeno (DALIO et al., 2014;

ESHRAGHI et al., 2011). Portanto, é possível que o fosfito atue de duas formas

sobre o patógeno: inibindo diretamente o desenvolvimento do microrganismo e/ou

induzindo mecanismos de defesa do hospedeiro contra o fitopatógeno (DALIO et al.,

2012; JACKSON et al., 2000).

Considerando o baixo risco à saúde exibido por produtos que contém resíduos

de fosfito (EUROPEAN COMISSION, 2013) e o efeito deste produto no controle de

doenças e que o uso desses produtos torna-se uma alternativa ambiental, social e

economicamente vantajosa, já que os fosfitos são produtos de baixo custo, os

objetivos desse trabalho foram: a) estudar o efeito do Phytogard® no controle

preventivo contra P. nicotianae e P. plurivora em plantas de citros e faia; b)

determinar a concentração ideal para o controle da gomose em plântulas de citros;

c) avaliar através de análises bioquímicas, se esse produto induz resistência em

citros contra P. nicotianae; d) verificar in vitro possíveis mecanismos de ação do fosfito

do potássio sobre P. nicotianae e P. plurivora.

REFERÊNCIAS

AGRIANUAL, 2014. Mercados & Perspectivas. Anuário da Agricultura. São Paulo: FNP, 2014. p.244-250. BRASIER, C.M. Phytophthora biodiversity: how many Phytophthora species are there? In: GOHEEN, E.M.; FRANKEL, S.J. (Ed.). Phytophthoras in Forests and Natural Ecosystems. USDA Forest Service: General Technical Report, Albany

v.221, p. 101-115, 2009. CARSWELL, S.C.; GRANT, B.R.; THEODOROU, M.E.; HARRIS, J.; NIERE, J.O. ;PLAXTON,W.C. The fungicide phosphonate disrupts the phosphate starvation response in Brassica nigra seedlings. Plant Physiology, Waterbury, v.110, p.105-110, 1996.

19

DALIO, R.J.D.; RIBEIRO JUNIOR, P.M.; RESENDE, M.L.V.; SILVA, A.C.; BLUMER, S.; PEREIRA, V.F.; OSSWALD, W.; PASCHOLATI, S.F. O triplo modo de ação dos fosfitos em plantas. In: LUZ, W.C. (Org.). Revisão Anual de Patologia de Plantas. - RAPP, Passo Fundo, v. 20, p. 206-242, 2012. DALIO, R.J.D.; FLEISCHMANN, F.; HUMEZ, M.; WOLFGANG, O. Phosphite protects Fagus sylvatica seedlings towards Phytophthota plurivora via local toxicity, priming and facilitation of pathogen recognition. Plos One, California.

www.plosone.org, v.9, 2014. DERCKS, W.; BUCHENAUER, H. Comparative studies on the mode of action of aluminium ethyl phosphite in four Phytophthora species. Crop Protection, Guildford,

v. 6, p. 82-89, 1987. ESHRAGHI, L.;ANDERSON, J.; ARYAMANESH, N.; SHEARER, B.; MCCOMB, J.; HARDY, G.E.S.;O’BRIEN, P.A. Phosphite primed defence responses and enhanced expression of defence genes in Arabidopsis thaliana infected with Phytophthora cinnamomi . Plant Pathology, London, v. 60, p. 1086-1095, 2011.

EUROPEAN COMISSION. Health & Consumers Directorate-General. Review report for the active substance potassium phosphonates. Brussels. 2013. 9p. FEICHTENBERGER, E.; BASSANEZI, R.B.; SPÓSITO, M.B.; BELASQUE JÚNIOR, J. Doenças dos Citros. In: KIMATI, H.; AMORIM, L.; REZENDE, J.A.M.; BERGAMIN FILHO, A.; CAMARGO, L.E.A. (Ed.). Manual de Fitopatologia. São Paulo: Editora Agronômica Ceres, v.2, p. 239-269, 2005. FENN, M.E.; COFFEY, M.D. Studies on the in vitro and in vivo antifungal activity of fosetyl-Al and phosphorous acid. Phytopathology, St. Paul, v. 74, p. 606-611, 1984. GUEST, D.; GRANT, B.R. The complex action of phosphonates as antifungal agents. Biological Review, Cambridge, v. 66, p. 159-187, 1991.

GRAHAM, J.H.;TIMMER, L.W. Phytophthora diseases of Citrus. Soil and Science Department, Florida Cooperative Extension Service, Institute of Food and Agricultural Sciences, University of Florida. SL 127, http://edis.ifas.ufl.edu/CH087, 1994. JACKSON, T.J.; BURGESS, T.; COLQUHOUN, I.; HARDY, G.E.S.; JACKSON, T.J. Action of the fungicide phosphite on Eucalyptus marginata inoculated with Phytophthora cinnamomi. Plant Pathology, St. Paul, v. 49, p. 147-154, 2000.

JUNG, T. Beech decline in Central Europe driven by the interaction between Phytophthora infections and climatic extremes. Forest Pathology, Hamburg, v.39, p.73-94, 2009. NEVES, M.F.; TROMBIN, V.G.; MILAN, P.; LOPES, F.F.; CRESSONI, F.; KALAKI, R. O retrato da citricultura brasileira. São Paulo: CitrusBR, 2010. 137p.

20

PACKHAM, J.R.; Thomas P.A.; ATKINSON, M.D.; DEGEN, T. Biological flora of the british isles: Fagus sylvatica. Journal of Ecology, London, v. 100, p. 1557-1608, 2012. SMILIE, R.; GRANT, B.R.; GUEST, D. The mode of action of phosphate: evidence for both direct and indirect modes of action on three Phytophthora spp. in plants. Phytopathology, St. Paul, v. 79, p. 921-926, 1989.

SCHLINK, K. Down-regulation of defense genes and resource allocation into infected roots as factors for compatibility between Fagus sylvatica and Phytophthora citricola. Functional & Integrative Genomics, Berlin, v.10, p. 253-264, 2010.

VARADARAJAN, D. K.; KARTHIKEYAN, A. S.; MATILDA, P. D.; RAGHOTHAMA, K. G. Phosphite, an analog of phosphate suppresses the coordinated expression of genes under phosphate starvation. Plant Physiology, Rockville, v.129, p. 1232-

1240, 2002. WEILAND, J. E.; NELSON, A. H.; HUDLER G. W. Agressiveness of Phytophthora cactorum, P. citricola and P. plurivora from European beech. Plant Disease, St.

Paul, v. 94, p. 1009-1014.

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2 FOSFITO DE POTÁSSIO NO CONTROLE DE Phytophthora spp. EM CITROS E

FAIA

Resumo

A citricultura é um dos principais segmentos do agronegócio brasileiro sendo que dentre os problemas enfrentados pelo setor, destaca-se a ocorrência de doenças onde a gomose, causada por Phytophthora spp., é uma das principais. Outra espécie que também é seriamente afetada por espécies de Phytophthora é a faia (Fagus sylvatica), uma das árvores mais importantes das florestas naturais e manejadas do norte da Europa. Os métodos de controle disponíveis para esses fitopatógenos são poucos e onerosos. Trabalhos apontam os fosfitos como uma das alternativas potenciais para o controle, pois possuem baixo custo e baixa toxicidade ao

homem e ao ambiente. Desta forma, os objetivos deste estudo foram (i) avaliar o efeito do Phytogard®, no controle preventivo contra doenças causadas por Phytophthora nicotianae em citros e Phytophthora plurivora em faia; (ii) determinar a concentração ideal para o controle da gomose em plântulas de citros; (iii) avaliar através de análises bioquímicas se esse produto induz resistência no hospedeiro. Foram utilizadas mudas de tangerina ‘Sunki’ e faia que foram acondicionadas em tubos plásticos contendo água e fechados com filme plástico. O produto foi aspergido nas folhas das plantas em várias concentrações e posteriormente, foi realizada a inoculação com P. nicotianae em citros e P. plurivora em faia. As plantas foram alocadas em câmara controlada (25ºC, 12h luz/escuro) e os tubos foram pesados diariamente para o monitoramento do consumo de água. No final do experimento, foi avaliada a incidência da doença e as coletas para as análises bioquímicas e moleculares. O consumo de água aumentou em todos os tratamentos com o Phytogard® em relação ao controle nas duas espécies de plantas. A incidência da doença em citros e faia foi reduzida em 100% nas doses de 5 e 2 mL L-1, respectivamente, em relação a de 0 mL L-1. A concentração de DNA de ambos patógenos foi menor em todos os tratamentos com fosfito comparado às não tratadas nas raízes de citros e faia. Mesmo não havendo diferença significativa, mudas de faia tratadas com Phytogard® e inoculadas apresentaram maiores valores de fluorescência de clorofila comparada com as plantas apenas inoculadas e não pulverizadas com o produto. Maiores valores de fenóis totais, bem como a atividade da enzima fenilalanina amônia-liase foram apresentados pelas raízes das plântulas não inoculadas com P. nicotianae. Entre as plântulas inoculadas, maiores concentrações de proteínas totais e atividade da β-1,3 glucanase foram encontradas nas raízes de plântulas tratadas com Phytogard® nas doses 0 e 5 mL L-1. Diferenças significativas na atividade da guaiacol peroxidase só foram observadas nas raízes das plantas não inoculadas em que a concentração de 5 mL L-1 apresentou valores menores comparado às demais. Pode-se concluir que o Phytogard®, em todas as concentrações aplicadas, controla de maneira preventiva doenças causadas por P. nicotianae e P. plurivora em citros e faia, respectivamente. Em citros, o produto altera a atividade de algumas proteínas relacionadas à patogênese, mas não é possível concluir que o controle seja mediado por indução de resistência.

Palavras-chave: Controle alternativo; Fosfito de potássio; Citros; Faia

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Abstract

The citrus production is one of the main segments of the Brazilian agribusiness and one of the problems is the occurrence of diseases such as gummosis caused by Phytophthora spp. Another species that is also seriously affected by Phytophthora species is beech (Fagus sylvatica), one of the most important trees of natural and managed forests in northern Europe. Control methods available for these pathogens are few and costly. Studies pointed out phosphites as one of the potential alternatives to control these pathogens, because it has low cost and low toxicity to humans and the environment. Thus, the objectives of this study were: (i) evaluate the effect of Phytogard® as preventive control against diseases caused by Phytophthora nicotianae and Phytophthora plurivora in citrus and beech plants; (ii) determine the optimal concentration for the control of root rot caused in citrus; (iii) evaluate through biochemical assays if this product act as a resistance inducer. Citrus and beech seedlings were used and placed inside plastic tubes containing distilled water and closed with plastic film. The product was sprayed on to the plant leaves in different concentrations and subsequently inoculated with P. nicotianae (citrus plants) and with P. plurivora (beech plants). The plants were placed inside growth chamber (25° C, 12 h light / dark) and the tubes were weighed daily to obtain the results of water uptake. At the end of the experiment, we evaluated the disease incidence and samples were taken for biochemical and molecular assays. Water uptake increased in all treatments with Phytogard® compared to the control in both plant species. Disease incidence in citrus and beech was reduced in 100% at 2 and 5 mL L-1 phosphite concentrations when compared to 0 mL L-1. The DNA concentration of both pathogens citrus and beech roots were lower in all treatments when compared to roots untreated with phosphite. Even with no significant differences, beech seedlings treated with Phytogard® and inoculated with the pathogen had higher chlorophyll fluorescence values compared to only inoculated plants and not sprayed with the product. Higher total phenolic compound values as well as phenylalanine ammonia-lyase activity in seedlings roots without inoculation with P. nicotianae was detected. Among the inoculated seedlings, higher concentrations of total protein and β-1,3-glucanase activity were found in the roots treated with Phytogard® at 0 and 5 mL L-1 concentrations. Significant differences in guaiacol peroxidase activity were only observed in roots not inoculated in the 5 mL L-1 concentration compared to the other treatments. We can conclude that the Phytogard® at all concentrations when sprayed preventively can control diseases caused by P. nicotianae and P. plurivora in citrus and beech plants, respectively. In citrus plants, the product changed the activities of some pathogenesis-related proteins, but it is not possible to conclude that the control is mediated by resistance induction. Keywords: Alternative control; Potassium phosphite; Citrus; Beech

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2.1 Introdução

A cadeia citrícola pode ser considerada como um dos segmentos mais

importantes do agronegócio brasileiro, sendo responsável pela maior produção de

laranja e de suco de laranja do mundo. Entretanto, a citricultura nacional apresenta

inúmeras pragas e doenças que limitam sua produção e comprometem a segurança

alimentar. Dentre as várias doenças que atacam o citros em todo o mundo, a

gomose, causada por espécies do gênero Phytophthora, se encontra entre as mais

importantes (GRAHAM; TIMMER, 1994). É importante destacar que, devido ao fato

de Phytophthora spp. produzirem estruturas de resistência, a eliminação desses

patógenos do solo é praticamente impossível após a introdução dos mesmos na

área. Desse modo, a exclusão é o principal método de controle de doenças

provocadas por espécies desse gênero (FEICHTENBERGER et al., 2005). Segundo

o FUNDECITRUS (2004), além da exclusão outras medidas de controle são

recomendadas, como o uso de porta-enxerto resistente e evitando-se o plantio em

áreas de alta umidade e sujeita a encharcamento. O controle curativo dessa doença

é difícil e oneroso e pode ser realizado com controle químico utilizando-se fosetil-Al

ou fosfitos (FEICHTENBERGER et al., 2005).

Outra espécie vegetal que também é seriamente afetada por espécies de

Phytophthora é a faia (Fagus sylvatica), uma das árvores mais importantes das

florestas naturais e manejadas do norte da Europa (PACKHAM, 2012). Mudanças

climáticas associadas com a disseminação de Phytophthora tem aumentado

drasticamente o número de árvores infectadas nos últimos anos. Inúmeras vezes

demonstrou-se que várias espécies de Phytophthora já estavam presentes em

plantas mantidas em condições de viveiro, as quais eram posteriormente vendidas

(JUNG; BLASCHKE, 2004; IVORS et al., 2006; DART; CHASTANGER, 2007). Essas

observações mostram claramente que a contaminação por esse patógeno, na

maioria dos casos, começa nos viveiros.

Muitos trabalhos apontam os fosfitos como uma das alternativas potenciais

para o controle de diversas doenças, principalmente para aquelas causadas por

oomicetos. Esses produtos são constituídos de sais inorgânicos originados do ácido

fosforoso (H3PO3), sendo utilizados como alternativa aos fosfatos na fertilização do

solo (DALIO et al., 2012). O fósforo (P) é um elemento essencial ao funcionamento

da celula vegetal, pois é componente de ácidos nucléicos, enzimas, além de mediar

importantes processos metabólicos na produção de energia. Muitos produtos

24

comerciais possuem o fosfito como fonte de fósforo, entretanto, apesar de serem

absorvidos pelas folhas e raízes, os fosfitos não são oxidados ou metabolizados

pelas plantas (GUEST; GRANT, 1991; CARSWELL et al., 1996; VARADARAJAN et

al., 2002) e por isso são inúteis como fonte de P (CARSWELL et al., 1996;

FORSTER et al., 1998; SCHROETTER et al., 2006). A grande vantagem da

utilização dos fosfitos refere-se a sua capacidade de ação fungicida na planta sem

apresentar fitotoxidez (COHEN; COFFEY, 1986). Produtos a base de fosfitos são

comercializados no Brasil como fertilizantes foliares possuindo ação no controle de

várias doenças (NASCIMENTO et al., 2008; PASCHOLATI et al., 2014).

Proteger as plantas contra patógenos, como espécies de Phytophthora, ainda é

um desafio (DALIO et al., 2014). Portanto, trata-se de um grande avanço o

tratamento de plantas, principalmente em condições de viveiro, contra diferentes

espécies de Phytophthora e outros patógenos de importância no Brasil e Alemanha,

através do uso de produtos menos tóxicos ao ambiente, como é o caso dos fosfitos.

Desta forma, os objetivos deste estudo foram avaliar o efeito do Phytogard®,

fosfito de potássio disponível comercialmente, no controle preventivo contra P.

nicotianae e P. plurivora em plantas de citros e faia. Além de se determinar qual a

concentração ideal para o controle da gomose em plântulas de citros, bem como

avaliar, através de análises bioquímicas, se esse produto induz resistência no

hospedeiro.

2.2 Revisão Bibliográfica

2.2.1 Citros e as doenças causadas por Phytophthora

Introduzida no Brasil logo no início da colonização, a laranja encontrou no país

melhores condições para vegetar e produzir do que nas próprias regiões de origem

(sul asiático), expandindo-se por todo o território nacional, destacando-se em vários

Estados, sendo São Paulo o maior estado produtor seguido por Bahia e Minas

Gerais (NEVES et al., 2010).

A cadeia citrícola pode ser considerada como um dos segmentos mais

importantes do agronegócio brasileiro. A citricultura nacional é responsável pela

maior produção de laranja e de suco de laranja do mundo, com produção de mais de

18 milhões de toneladas de laranja e 1 milhão de toneladas métricas de suco de

laranja na safra 2012/13 (AGRIANUAL, 2014), tendo gerado cerca de 230 mil

25

empregos diretos e indiretos. De cada cinco copos de suco de laranja consumidos

no mundo, três são produzidos no Brasil (NEVES et al., 2010).

A citricultura brasileira, particularmente a paulista, enfrenta problemas que

envolvem ordem política, econômica e fitossanitária. Essas interferências atingem o

setor e muitas vezes forçam o produtor a migrar para outro segmento, como por

exemplo, a cana de açúcar (PANOSSO, 2014; MENDES, 2014). Dentre os principais

problemas que afetam a citricultura no estado de São Paulo temos a ocorrência de

doenças, sendo a cultura do citros hospedeira de uma ampla gama de patógenos,

entre eles fungos, oomicetos, bactérias, vírus e outros. Uma das principais doenças

da cultura é a gomose, causada por diferentes espécies do gênero Phytophthora

(GRAHAM; TIMMER, 1994).

Das várias manifestações da doença, a podridão do pé e as podridões de

raízes e radicelas são as mais comuns, principalmente em plantas jovens, devido à

utilização de mudas contaminadas na implantação dos pomares

(FEICHTENBERGER et al., 2005). Embora diferentes espécies tenham sido

associadas às culturas de citros, como Phytophthora palmivora Butler, Phytophthora

citrophthora Smith & Smith e Phytophthora nicotianae Breda de Haan (Syn P.

parasitica) (ERWIN; RIBEIRO, 1996; TIMMER; MENGE, 1993), no Brasil, as

espécies mais comuns são P. nicotianae e P. citrophthora (FUNDECITRUS, 2009).

Os sintomas podem variar dependendo da espécie ou cultivar de citros, da

idade da planta, dos órgãos onde ocorre o ataque ou das condições ambientais

prevalecentes. No campo, os sintomas envolvem a morte dos tecidos internos da

epiderme e do floema, formação de calos, exudação de goma, rachaduras e fendas

longitudinais no tronco, podridões do colo e raízes, clorose e baixo desenvolvimento

das folhas, murcha, desfolha e, por fim, morte da planta (ERWIN; RIBEIRO, 1996;

FEICHTENBERGER et al., 2005; FUNDECITRUS, 2004; TIMMER; MENGE, 1993).

É importante lembrar que, como Phytophthora spp. produzem estruturas de

resistência, a eliminação desses patógenos dos solos é extremamente difícil. Assim,

a exclusão é o principal método de controle de doenças provocadas por

Phytophthora spp (BELTRAME, 2010). Segundo o FUNDECITRUS (2004), além da

exclusão as principais medidas de controle são uso de porta-enxerto resistente e

evitar o plantio em áreas de alta umidade e/ou sujeita a encharcamento. Outras

medidas importantes de controle são altura de enxertia, evitar ferimentos de tronco e

raízes, utilizar água de irrigação livre do patógeno e utilizar adubos orgânicos para

26

favorecer a microbiota antagônica a Phytophthora spp. O controle curativo dessa

doença pode ser realizada com controle químico utilizando-se fosetil-Al ou fosfitos

(FEICHTENBERGER et al., 2005).

2.2.2 Faia (Fagus sylvatica) e as doenças causadas por Phytophthora

A faia (Fagus sylvatica Linné (1753)), é uma importante espécie arbórea e

devido a sua alta tolerância a diferentes condições climáticas é considerada uma das

principais espécies ocorrendo nas florestas da Europa (PACKHAM, 2012). Essa

espécie vegetal é frequentemente usada como árvore ornamental em parques e

possui alto valor econômico devido à produção de madeira (SCHLINK, 2010).

Nos últimos anos, por consequência das mudanças climáticas e a

disseminação de Phytophthora, o número de árvores infectadas aumentou

drasticamente (DALIO, 2013). Entre os diferentes fatores prejudiciais ao

desenvolvimento da faia, como insetos e fungos, vários oomicetos, como patógenos

do gênero Phytophthora, estão associadas à morte dessas árvores na Europa

(BRASIER et al., 2009; JUNG et al., 2005; WEILAND et al., 2010).

A patogenicidade de espécies de Phytophthora foi estudada utilizando-se

plântulas de faia, e diferenças notáveis puderam ser observadas com relação à

agressividade e desenvolvimento de sintomas. Por exemplo, P. citricola e P.

cambivora foram identificadas como as espécies mais agressivas, causando redução

massiva do sistema radicular (FLEISCHMANN et al., 2002, 2004). Segundo Jung

(2009), em combinação com condições climáticas extremas, o declínio severo da

faia na Europa central é causado principalmente pelas espécies Phytophthora

citricola e Phytophthora cambivora, tendo P. citricola sido renomeada como

Phytophthora plurivora por Jung e Burgess (2009).

P. plurivora é o patógeno mais frequente encontrado nas raízes de muitas

espécies decíduas em florestas de clima temperado como faia, carvalho e freixo em

ecossistemas naturais, florestas, viveiros e plantações (JUNG; BURGESS, 2009;

ORLIKOWSKI et al., 2011). Devido à persistência das estruturas de resistência

produzidas por esse patógeno, esse organismo pode ser disseminado facilmente por

raízes e solo contaminado, o que corresponde um grande risco às espécies

suscetíveis (MILENKOVIÉ et al., 2012).

Inúmeras vezes demonstrou-se que várias espécies de Phytophthora já

estavam presentes em plantas mantidas em condições de viveiro, as quais eram

27

posteriormente vendidas (JUNG; BLASCHKE, 2004; IVORS et al., 2006; DART;

CHASTANGER, 2007). Essas observações mostram claramente que o “Problema –

Phytophthora”, na maioria dos casos, começa nos viveiros. Portanto, seria um

grande avanço, a utilização de produtos menos tóxicos ao ambiente, como é o caso

dos fosfitos, em condições de viveiros para o controle de espécies de Phytophthora

em faia.

2.2.3 Manejo de doenças causadas por Phytophthora spp

O controle de doenças causadas por patógenos veiculados pelo solo, como é o

caso de P. nicotianae e P. plurivora, é tarefa difícil, pois o solo é um ambiente

complexo, onde medidas de controle têm sua eficiência bastante prejudicada ou sua

aplicação dificultada (BEDENDO, 2011). Além disso, devido ao fato de Phytophthora

spp. produzirem estruturas de resistência, a eliminação desses patógenos do solo é

praticamente impossível após a introdução dos mesmos na área. Desse modo, entre

as principais medidas de controle de doenças provocadas por espécies desse

gênero estão a exclusão e o uso variedades resistentes, quando disponíveis. É

importante também realizar o plantio em solos com boa drenagem, evitando-se

encharcamento e controlar a irrigação, além da utilização de material propagativo

livre do patógeno (FEICHTENBERGER et al., 2005; BELTRAME, 2010;

FUNDECITRUS, 2004).

Mesmo após aproximadamente 150 anos desde que o gênero foi descrito, o

controle de doenças causadas por espécies de Phytophthora ainda é um desafio

para os fitopatologistas em todo o mundo (DALIO, 2013). Attard et al. (2008) afirmou

em sua publicação que "até o presente, os pesticidas, que são utilizados para

prevenir ou curar doenças causadas por oomicetos não existem" e isso se deve às

diferenças bioquímicas entre esses microrganismos e os fungos verdadeiros

(classificados dentro do Reino Fungi). Os principais alvos dos fungicidas são os

esteróis e a quitina e visto que Phytophthora spp não sintetizam esteróis e suas

paredes celulares são compostas por β-glucanas, os fungicidas comumentes

utilizados na agricultura são ineficazes para o controle desses patógenos.

No ano de 1977, o Metalaxyl, fungicida capaz de controlar Phytophthora spp,

foi liberado e passou a ser amplamente utilizado na agricultura mundial. Esse grupo

de fungicidas tem como alvo a RNA polimerase 1 e por consequência, compromete

a síntese de proteínas dos patógenos (SUKUL; SPITELLER, 2000). Por atuarem tão

28

especificamente no microrganismo alvo, quatro anos após o emprego do Metalaxyl

na agricultura, foram relatados os primeiros casos de resistência (DALIO, 2013).

Vários outros produtos vem sendo testados para o controle de Phytophthora

spp., e além disso, variedades de plantas resistentes também tem sido estudadas

nos dias atuais. Nesse sentido, os fosfitos e produtos derivados estão sendo

utilizados como produtos alternativos para o controle de muitas enfermidades,

principalmente as causadas por oomicetos (DALIO et al., 2014). Muitas

investigações tem mostrado que diferentes sais derivados do ácido fosforoso são

efetivos no controle de Phythophthora spp., como é o caso da injeção de fosfito em

tronco, que controlou com sucesso Phytophthora ramorum, causador da morte

súbita do carvalho (GARBELOTTO et al., 2007). Estudos de campo também

demonstraram que por vários anos, o tratamento com fosfito de Eucalyptus e

Banksia, importantes espécies arbóreas de regiões temperadas e tropicais, é uma

prática alternativa para o controle de infeção de raízes causadas por Phytophthora

cinnamomi (HARDY et al., 2001; SHEARER et al., 2006) . Entretanto, relatos de

resistência e o modo de ação desses produtos ainda são praticamente

desconhecidos (DALIO, 2013).

2.2.4 Fosfito na agricultura

O fósforo (P) é um macronutriente essencial requerido para o metabolismo e

crescimento dos organismos vivos. Por ser altamente reativo, o P combina

rapidamente com oxigênio e hidrogênio e por isso não é encontrado naturalmente

como elemento disponível (MCDONALD et al; 2001).

Os fosfitos são compostos produzidos a base de P. O ácido fosforoso (H3PO3)

é o precursor do fosfito, que ao reagir com uma base, como por exemplo, hidróxido

de potássio (KOH), origina o sal fosfito de potássio. Apesar de serem absorvidos

pelas folhas e raízes, os fosfitos não são oxidados ou metabolizados pelas plantas

(GUEST; GRANT, 1991; CARSWELL et al., 1996; VARADARAJAN et al., 2002).

Buscando alternativas para adubação fosfatada, os fosfitos foram estudados

inicialmente como fertilizantes, entre os anos 1930 e 1940, nos EUA e Alemanha.

Infelizmente, os resultados desses estudos apontaram que os fosfitos não se

tratavam de fontes eficientes de P para as plantas devido à conversão lenta do

fosfito em P no solo. Com base nesses resultados, juntamente com o fato de que é

muito mais caro fornecer o fosfito do que o P na forma de superfosfatos para as

29

plantas, os fosfitos foram relatados como compostos irrelevantes para agricultura

(GUEST; GRANT, 1991). Por sua vez na década de 1970, pesquisadores franceses

descobriram as propriedades fungicidas apresentadas por esse composto no

controle de doenças de plantas (DALIO et al; 2012). Pesquisas apontaram que o

fosfito, quando reagia com etanol e produzia etilfosfonados, o mesmo era eficiente

no controle de várias doenças causadas por patógenos de solo como oomicetos,

particularmente Phytophthora sp (GUEST; GRANT, 1991; SMILIE et al., 1989). Após

essa descoberta, a partir da década de 1980, o interesse pelo fosfito aumentou

rapidamente iniciando-se a formulação e a comercialização do Fosetil-Al, produto

constituído por três moléculas de etil-fosfonato ligadas ao alumínio denominado

Aliette®, e do ácido fosforoso conhecido pela ação direta no patógeno e indução de

resistência em plantas a patógenos (GUEST; GRANT, 1991; FENN; COFFEY,

1984). Logo que a patente para o Fosetil-Al expirou, vários fabricantes de fungicidas

e fertilizantes iniciaram a fabricação de produtos á base de fosfito, pela reação do

ácido fosforoso com hidróxido de potássio, sódio, amônio alumínio zinco e cobre.

Atualmente, existem inúmeras marcas comerciais de fosfitos em diversas

formulações no mercado brasileiro (DALIO et al., 2012).

Os interesses no uso do fosfito como fertilizante foram renovados no início dos

anos 90, quando Lovatt (1999) descobriu que a deficiência de P causava trocas no

metabolismo do nitrogênio e a aplicação foliar de fosfito de potássio recuperava o

crescimento normal de plantas cítricas. Dessa maneira, em função de suas

características, os fosfitos podem ser registrados como fungicidas ou fertilizantes.

Atualmente, a maioria dos produtos à base de fosfito encontrados no mercado é

registrada como fertilizantes, já que o processo de registro é menos oneroso e

demorado do que o registro como fungicidas. Além disso, muitos dos fosfitos

comerciais são descritos como bioestimulantes. Entretanto, os estudos a respeito do

uso de fosfitos como fonte de P para as plantas tem encontrado controvérsias e

muita confusão entre a indústria e os produtores. Alguns trabalhos apontam que

embora os fosfitos sejam facilmente absorvidos pelas folhas e raízes das plantas, o

P na forma de fosfito não é metabolizado pelas mesmas e, que nenhuma enzima

vegetal é capaz de oxidar fosfito a fosfato para ser metabolizado como nutriente

(CARSWELL et al., 1996; FORSTER et al., 1998; SCHROETTER et al., 2006;

LOVATT; MIKKELSEN, 2006; Smilie et al., 1989). No entanto, os compostos que

acompanham essa molécula nos produtos à base de fosfitos podem atuar na

30

nutrição, como o potássio (fosfito de potássio), cálcio (fosfito de cálcio), manganês

(fosfito de manganês), cobre (fosfito de cobre) e zinco (fosfito de zinco) (DALIO et

al., 2012).

2.3 Material e métodos

Os ensaios com citros foram realizados no Laboratório de Fisiologia e

Bioquímica Fitopatológica e no campo experimental do Departamento de

Fitopatologia e Nematologia da Escola Superior de Agricultura ‘Luiz de Queiroz’,

Universidade de São Paulo em Piracicaba SP, Brasil. Os experimentos com faia

foram conduzidos na Seção de Fitopatologia de Plantas Lenhosas no Departamento

de Ecologia da Universidade Técnica de Munique em Freising, Alemanha.

2.3.1 Obtenção e manutenção dos isolados de Phytophthora spp.

O isolado de P. nicotianae foi cedido pelo Dr. Ronaldo Dalio (APTA/IAC). O

mesmo foi mantido em meio de cenoura-ágar (200 g de cenoura e 20 g de ágar L-1

de água destilada) a 28 ºC, no escuro, a fim de propiciar condições para o

desenvolvimento do patógeno. Para reativação do patógeno foi necessário proceder

ao reisolamento em laranja. Para isso, os frutos foram previamente imersos por 15

min em solução de hipoclorito de sódio ao 2,5%, seguido de lavagem em água

destilada esterilizada. Com auxilio de um furador de rolha (12 mm de diâmetro)

flambado, o fruto foi furado penetrando-se a casca e o albedo, sendo removidas

estas camadas e adicionado no local um disco de meio cenoura-ágar, contendo o

micélio do isolado. O orifício foi novamente coberto com a casca inicialmente

removida e protegido com esparadrapo. Os frutos de laranja foram mantidos durante

17 dias em incubadora tipo BOD à 25ºC, no escuro. Após esse período, as

sementes foram coletadas e transferidas para meio ágar-água, a fim de propiciar

condições para o desenvolvimento do patógeno. Após a observação do crescimento

característico de Phytophthora, um fragmento do patógeno foi transferido para meio

cenoura-ágar para a obtenção de cultura pura.

O isolado de P. plurivora foi cedido pelo grupo de pesquisa coordenado pelo

Prof. Dr. Wolfgang Osswald da Universidade Técnica de Munique (Freising,

Alemanha). O mesmo foi mantido em meio V8-ágar (obtido a partir de 100 mL de

suco caldo de vegetais, 3 g de CaCO3 , 16 g de ágar e 900 mL de água) a 20 ºC no

escuro.

31

2.3.2 Produção de zoósporos

Para a produção de zoósporos de P. nicotianae, 10 discos de micélio com 5

mm de diâmetro foram retirados de bordas de colônias com sete dias de crescimento

em meio cenoura-ágar, e transferidos para placas de Petri de poliestireno contendo

10 mL de meio cenoura-líquido diluído (2 mL de meio cenoura-líquido e 8 mL de

água destilada autoclavada). As placas foram mantidas em câmara tipo BOD a 25 ºC

sob luz constante e após 48 h, para proporcionar estresse nutricional e produção de

esporângios, o meio de cenoura-líquido diluído foi removido das placas e substituído

por 10 mL de água destilada autoclavada por 72h, trocando-se a água destilada a

cada 48h. Posteriormente, para a obtenção dos zoósporos, as placas foram

mantidas no interior de geladeira a 4º C por 60 minutos e em seguida a temperatura

ambiente por 60 minutos (BELTRAME, 2010).

Placas contendo meio V8-ágar foram utilizadas para o cultivo de P. plurivora.

Após sete dias de crescimento, foi adicionado um volume de água destilada

suficiente para cobrir a colônia. A cada 24 horas o volume de água foi trocado. A

troca de água foi paralisada no momento em que foi possível visualizar a presença

de esporângios por toda a placa. Para a liberação dos zoósporos, as placas foram

mantidas com água por 60 minutos, em geladeira à 4 °C. Após este período, as

placas foram mantidas em temperatura ambiente por 60 minutos onde foi possível

visualizar intensa mobilidade dos zoósporos (DALIO, 2013).

2.3.3 Obtenção e cultivo das plantas hospedeiras

Sementes de tangerina ‘Sunki’ foram cedidas pelo Fundecitrus (Araraquara) e

APTA/IAC (Cordeirópolis) e semeadas em bandejas plásticas contendo uma mistura

de substrato comercial Plantmax® e solo autoclavado na proporção 2:1 (v/v). As

plantas foram mantidas em casa de vegetação com condições de temperatura

variando entre 18 e 30º C.

As sementes de faia (Fagus sylvatica), foram obtidas na Seção de Fitopatologia

de Plantas Lenhosas no Departamento de Ecologia da Universidade Técnica de

Munique em Freising, Alemanha, e a semeadura foi realizada em bandejas

contendo vermiculita e mantidas em geladeira à 4 °C por 30 dias. Posteriormente, as

plântulas foram transferidas para bandejas plásticas maiores contendo o mesmo

substrato, onde se desenvolveram em sala climatizada à 25 °C.

32

2.3.4 Uso de Phytogard® no controle de P. nicotianae em plântulas de tangerina

‘Sunki’

2.3.4.1 Fosfito de Potássio

A fonte de fosfito de potássio utilizada nesse trabalho foi o produto Phytogard®,

produzido comercialmente pela Stoller do Brasil LTDA. Este produto possui 28% de

P2O5, cuja fonte é o ácido fosforoso e 26% de K2O, com densidade de 1,51 g L-1,

sendo que o pH do produto é 7.

2.3.4.2 Consumo de água

As concentrações de Phytogard® utilizadas neste ensaio e seus respectivos

valores em fosfito de potássio estão detalhadas na Tabela 1.

Tabela 1 - Concentrações de Phytogard® e seus respectivos valores em fosfito de potássio

Phytogard®

(mL L-1)

Fosfito de potássio

(g L-1)

0 (controle) 0

0,5 0,24

2* 0,95

5 2,38

*Dose recomendada pelo fabricante como fertilizante foliar para mudas cítricas

Para determinação do consumo de água, foram utilizadas plântulas de

tangerina ‘Sunki’, com aproximadamente 50 dias de idade, obtidas como descrito no

item 2.3.3. As mesmas foram transferidas para tubos de ensaio de plástico (8 mL) e

preenchidos com água destilada esterilizada. Os tubos foram vedados com filme

plástico e mantidos no interior de câmara tipo BOD a 25 °C e fotoperíodo de 12 h

luz/escuro.

O Phytogard® foi aplicado via aspersão foliar nas concentrações já

mencionadas (Tabela 1) no volume de 1 mL por planta. No tratamento controle as

plantas foram borrifadas somente com água. Decorridos seis dias da aplicação do

produto, as plantas foram inoculadas com P. nicotianae. A suspensão de zoósporos

foi transferida para os tubos, na concentração final de 1x105 zoósporos mL-1, tendo

33

sido obtida conforme o item 2.3.2. Os tubos foram novamente vedados com filme

plástico e mantidos em câmara tipo BOD nas mesmas condições anteriores.

Após a inoculação de P. nicotianae, as plântulas de cada tratamento tiveram o

consumo (transpiração + evaporação) de água quantificado através da determinação

da diferença diária das massas dos conjuntos (tubos + plântulas) (FLEISCHMANN et

al., 2005).

Para cada concentração utilizada havia tubos inoculados e não inoculados com

P. nicotianae. O ensaio foi instalado em delineamento inteiramente casualizado,

onde cada concentração constituiu um tratamento. Cada tratamento foi constituído

de seis repetições, sendo cada repetição representada por um tubo contendo uma

planta.

Ao final do experimento foram avaliadas a incidência da doença e a massa

fresca da parte aérea e raiz das plantas. Posteriormente, o material vegetal foi

coletado e utilizado para a realização das análises bioquímicas e moleculares.

2.3.4.3 Fenóis

Para a determinação da concentração de fenóis nas raízes e folhas das

plântulas de tangerina ‘Sunki’, foram preparadas soluções do reagente Folin-

Ciocalteau 0,25N, carbonato de sódio (Na2CO3) 1N e metanol 80%. O tecido

liofilizado (0,025 g) foi macerado em nitrogênio líquido, e posteriormente,

homogeneizado em 1,5 mL de metanol 80% em mesa rotativa 100 rpm por 24h em

temperatura ambiente. Em seguida, o material foi centrifugado a velocidade de

12.000 g por 4 minutos e 150 µL do sobrenadante foi transferido para um novo tubo

e adicionado 150 µL da solução de Folin-Ciocalteau. Os tubos foram submetidos à

agitação manual e deixados em repouso por 3 minutos e em seguida adicionou-se

150 µL da solução de Na2CO3. Os tubos foram submetidos novamente à agitação

manual e deixados em repouso por 10 minutos em temperatura ambiente. Em

seguida, adicionou-se 1000 µL de água destilada esterilizada, misturou-se e a

amostra ficou em repouso por 30 minutos. Posteriormente, foi retirada uma amostra

de 500 µL e a absorbância determinada em espectofotômetro a 725 nm.

2.3.4.4 Proteínas totais

A extração das proteínas solúveis totais foi efetuada à partir da maceração do

tecido fresco das plântulas (parte aérea e raiz) na presença de nitrogênio líquido,

34

seguido pela adição de tampão fosfato de potássio 100 mM (pH 7,5) contendo 1 mM

de EDTA, na proporção de 3 mL de tampão para cada 1g de tecido fresco. O

material foi centrifugado a 4 ºC durante 45 min a 15.000 g, sendo o sobrenadante

considerado o extrato proteico que foi armazenado a -20º C para a realização das

demais análises bioquímicas.

Utilizou-se o reagente Protein Assay (BioRAD®), diluido cinco vezes, para a

determinação de proteínas totais, com base no método de Bradford (1976). Para

cada amostra foram utilizados 1000 μL da solução do reagente preparada e 20 μL

do extrato proteico diluído sete vezes. A curva padrão foi determinada utilizando-se

albumina de soro bovino (ASB).

O extrato proteico foi obtido a partir do experimento instalado em delineamento

inteiramente casualizado com oito tratamentos (concentrações de fosfito em plantas

inoculadas e não inoculadas com P. nicotianae) e cinco repetições onde cada

plântula inserida no tubo de ensaio com água constituiu uma repetição, totalizando

45 plântulas. Os dados foram expressos em mg de proteína g tecido fresco-1. O

experimento foi realizado duas vezes.

2.3.4.5 Atividade de β-1,3 glucanase

Para se avaliar a atividade de β-1,3-glucanase em plântulas de tangerina

‘Sunki’, utilizou-se o substrato laminarina, um polissacarídeo obtido da alga

Laminaria digitata, o qual reage com a enzima e libera moléculas de glicose. As

amostras foram compostas do extrato proteico obtido como descrito no item 2.3.4.4.

Foi utilizado o ácido 3,5-dinitrosalicílico (ADNS) (MILLER, 1959) para a

quantificação de açúcares redutores. A reação foi preparada com 150 μL de

laminarina (4 mg mL-1) dissolvida em tampão acetato de sódio 100 mM (pH 5,0) e

100 μL do extrato proteico. Ao branco da reação foi adicionado apenas laminarina e,

ainda, para cada amostra avaliada, também foi preparada uma reação controle

composta de laminarina, extrato da amostra e reagente ADNS (ABELES; FOENCE,

1970).

Após a incubação por 2 horas à 40º C, a reação foi paralisada com a adição de

125 μL de ADNS, sendo a reação, em seguida, aquecida por 5 minutos em banho

maria a 95º C. Em seguida, a reação foi resfriada em banho de gelo e, ao volume da

reação foram adicionados 1125 μL de água destilada. Após homogeneização, a

leitura foi realizada em espectrofotômetro à 540 nm. A atividade enzimática foi

35

expressa em mg de glicose liberada h-1 mg proteína-1, com base em curva padrão de

glicose.

2.3.4.6 Atividade de guaiacol peroxidase

Para a determinação da atividade de guaiacol peroxidase, foi utilizado 1,5 mL

do tampão da reação 100 mL de tampão fosfato de potássio 100 mM (pH 7,5)

acrescido de 250 μL de guaiacol e 306 μL de peróxido de hidrogênio e 1,5 mL do

extrato proteico obtido conforme o item 2.3.4.4 (RONCATO & PASCHOLATI,1998).

Como branco da reação foi utilizado 1,5 mL de tampão da reação e 1,5 mL do

tampão de extração (fosfato de potássio 100 mM (pH 7,5). O tempo de reação foi de

um minuto, na qual foi quantificada em espectrofotômetro a conversão do guaiacol à

tetraguaiacol.

Para o cálculo da atividade enzimática foi utilizado Δ Abs470 nm (diferença, em

absorbância, aos 0 e 60 segundos da amostra), sendo os resultados expressos em

Δ Abs470 nm min-1 mg proteína-1.

2.3.4.7 Atividade de fenilalanina amônia-liase

A atividade da fenilalanina amônia-liase foi determinada pela quantificação do

ácido trans-cinâmico liberado a partir da fenilalanina (UMESHA, 2006). Para isso,

400 μL de tampão Tris-HCl 25 mM (pH 8,8) e 500 μL de L-fenilalanina 50 mM foram

adicionados em tubos para microcentrífuga e incubados a 40 ºC por 5 minutos.

Posteriormente, foi adicionado 100 μL de extrato proteico, obtido conforme o item

2.3.4.4 e incubados por mais 2h a 40ºC. Para paralisar a reação, foi adicionado 50

μL de HCl 5M. A absorbância foi determinada a 290 nm, a qual foi subtraída da

absorbância do controle, composto por 500 μL de L-fenilalanina, 400 μL de tampão

Tris-HCl 25 mM (pH 8,8) e 100 μL de tampão fosfato de potássio aquecidos a 40 ºC

por 2 h e acrescido de 50 μL de HCl 5 M. A atividade enzimática foi expressa em

unidades da absorbância a 290 nm mg-1 de proteína.

2.3.4.8 Detecção e quantificação do inóculo de P. nicotianae em raízes de

citros

2.3.4.8.1 Extração do DNA

O DNA total foi obtido a partir da extração de amostras de raízes utilizando-se

do DNeasy® Plant Mini Kit (Qiagen), conforme as recomendações do fabricante. O

36

sistema radicular das plantas foi liofilizado e, em seguida transferido para tubo de

microcentrifuga, juntamente com duas bolas de inox de 4 mm de diâmetro.

Posteriormente, em um equipamento chamado “Ball-mill”, as raízes foram trituradas

por meio de intensa agitação por 10 minutos, de forma que as raízes tornaram-se

pó.

Em seguida, cerca de 20 mg deste pó foi transferido para um novo tubo para

microcentrífuga, ao qual foram adicionados 400 μL do tampão AP1 (Qiagen) e 4 μL

de RNAse. O material foi mantido em “banho-maria” por 10 minutos a 65 ºC.

Posteriormente, foram adicionados 130 μL do tampão AP2 (Qiagen) e, depois, os

tubos foram incubados a -20 ºC por 5 minutos. Em seguida, o material foi

centrifugado a 13000 rpm por 5 minutos. O sobrenadante foi recuperado e

adicionado a outro microtubo que possui uma coluna (função de “filtro de

impurezas”) em seu interior. Novamente foi realizada centrifugação a 13000 rpm por

2 minutos e o material filtrado foi recolhido em um novo microtubo e foram

adicionados 675 μL de tampão AP3 (Qiagen). Uma alíquota de 650 μL foi adicionada

a um microtubo contendo outra coluna (filtro “retenção do DNA”), sendo em seguida

centrifugada a 8000 rpm por 1 minuto.

O mesmo procedimento foi realizado com o restante do material presente no

microtubo onde foi adicionado AP3. Descartou-se o material que passou pela coluna

e nesse mesmo tubo foram adicionados 500 μL de AW (Qiagen) e centrifugado a

8000 rpm por 1 minuto, sendo que, esta etapa foi realizada duas vezes, porém, na

segunda vez a centrifugação foi a 14000 rpm por 2 minutos. A coluna, contendo

DNA, foi transferida para outro microtubo e 100 μL de AE (Qiagen) foram

adicionados no centro da coluna e incubados por 5 minutos a temperatura ambiente

e centrifugados a 8000 rpm por 1 minuto para lavagem do DNA. Esta etapa também

foi realizada duas vezes, sendo o DNA obtido armazenado a -80 ºC.

2.3.4.8.2 qPCR

O PCR quantitativo foi realizado de acordo com o método proposto por

IPPOLITO, SCHENA, NIGRO (2002). Como reagentes foram utilizados o SyBr

master-mix universal para PCR, o qual continha tampão 10X, cloreto de magnésio

(25 mM), dNTP-mix (5mM) e Taq polimerase (5U/μL). As sequências de iniciadores

utilizadas foram:

37

Pn5B: GAACAATGCAACTTATTGGACGTTT

Pn6: AACCGAAGCTGCCACCCTAC

As reações foram realizadas em placas com 96 cavidades, específicas para

este tipo de análise. Em cada cavidade foram depositados 12,5 μL do master-mix

universal, 1,0 μL de cada um dos iniciadores, 5,5 μL de água e 5 μL do DNA da

amostra, a qual foi diluída 10 vezes. Assim, o volume total utilizado por reação foi de

25 μL.

Para a realização da curva padrão, uma amostra de DNA de P. nicotianae,

com concentração de DNA previamente conhecida, foi diluída de forma seriada nas

seguintes proporções: 1:10, 1:100, 1:1000, 1:10000, 1:1000000 (v/v). As condições

de PCR empregadas foram 15 min à 95 °C para uma desnaturação inicial, seguido

por 40 ciclos de 15 s à 95 °C, 30 s à 60 °C e 15 min à 72 °C.

2.3.5 Uso de Phytogard® no controle de P. plurivora em mudas de faia


A determinação do consumo de água foi realizada de maneira semelhante a

realizada com citros, descrita no item 2.3.4.2 Para tanto, foram utilizadas mudas de

faia, com aproximadamente três meses de idade, obtidas como descrito no item

2.3.3, sendo as mesmas transferidas para tubos plásticos (50mL). O Phytogard® foi

aplicado via aspersão foliar nas concentrações de 0 e 2mL L-1. Decorridos seis dias

da aplicação do produto, as plantas foram inoculadas com suspensão de P. plurivora

na concentração de 1x106 zoósporos mL-1, obtida conforme o item 2.3.2. Os tubos

foram novamente vedados com filme plástico e mantidos em incubadora nas

mesmas condições anteriores.

O ensaio foi instalado em delineamento inteiramente casualizado constituído

por quatro tratamentos (concentrações 0 e 2 mL L-1 inoculadas e não inoculadas

com o patógeno) e dez repetições, sendo cada repetição representada por um tubo

contendo uma planta.

Ao final do experimento foi avaliada a incidência da doença. Posteriormente, o

material vegetal foi coletado e utilizado para a realização das análises moleculares.

2.3.5.2 Fluorescência de clorofila

Para esse ensaio, utilizou-se o fluorômetro MINI-PAM (Heinz Walz, Effeltrich,

GmbH, Alemanha) com a finalidade de se determinar a eficiência quântica do

38

fotossistema II (PSII) (Fv/Fm). A produtividade efetiva do fotossistema (FS) II (Y)

infere a capacidade efetiva da planta em converter energia luminosa em química.

Um pulso de saturação intensa (F´), com duração de 0,8 segundos, foi aplicado à

amostra, o qual levou à completa saturação do FS II. Assim, a fluorescência máxima

(Fm´) foi emitida desde que a energia excessiva não pôde ser utilizada pela

fotossíntese. A produtividade do FS II foi calculada de acordo com Genty et al.

(1989), sendo os dados de rendimento (Y) automaticamente fornecidos pelo

equipamento.

2.3.5.3 Detecção e quantificação do inóculo de P. plurivora em raízes de faia

2.3.5.3.1 Extração e purificação de DNA

A extração do DNA foi realizada como descrito no item 2.3.4.8.1.

Para a purificação do extrato de DNA utilizou-se o kit “Wizard DNA clean up

System” da Promega e, para tanto, foram seguidas as recomendações do fabricante.

Em tubo para microcentrífuga foram transferidos 100 μL do extrato de DNA e 1 mL

da resina “Clean up” e, posteriormente, o tubo foi vagarosamente agitado para

homogeneização. Em seguida, uma seringa foi instalada a uma coluna Wizard à qual

foi adaptada à um tubo de 2 mL. A mistura extrato de DNA + resina foi passada pela

coluna pela pressão no embolo da seringa. Após esta etapa, 2 mL de isopropanol

(80%) foram adicionados e pressionados contra a coluna para lavagem do DNA.

Para secagem, o embolo da seringa foi pressionado apenas com ar. A coluna foi

transferida para um novo tubo e submetido a centrifugação por 2 minutos à 12500

rpm. Posteriormente, 50 μL de água à 65 °C foram adicionados à coluna e

incubados por 1 minuto e, logo após procedeu-se a centrifugação. Esta última etapa

foi realizada duas vezes e, em seguida, o material foi armazenado à -80 °C.

2.3.5.3.2 qPCR

Como reagentes foram utilizados o master-mix universal para PCR, o qual

contém tampão 10X, cloreto de magnésio (25 mM), dNTP-mix (10mM) e Taq

polimerase (5U/μL).

As sequências de iniciadores utilizadas foram:

P5 – 5´ TCAACCCTTTTAGTTGGGGGTC 3´

P6 – 5´TTTAAAACAAAAAGCTACTAGCCCAGAC 3´

Já a sequência da sonda fluorogênica fosforilada foi

39

F3 – 5´CTTTTTTTGCGAGCCCTATCATGGCG 3´

As reações foram realizadas em placas com 96 cavidades específicas para

este tipo de análise. Em cada cavidade foram depositados 12,5 μL do máster-mix

universal, 0,5 μL do fluoróforo, 0,75 μL de cada um dos iniciadores, 5,5 μL de água e

5 μL do DNA da amostra, a qual foi diluída em 10 vezes. Assim, o volume total

utilizado por reação foi de 25 μL.

Para realização da curva padrão, uma amostra de DNA de P. plurivora foi

diluída de forma seriada nas seguintes proporções: 1:10, 1:100, 1:1000, 1:10000,

1:1000000 (v/v).

As condições de PCR empregadas foram 15 minutos à 95 °C para uma

desnaturação inicial, seguido por 40 ciclos de 15 segundos à 95 °C, 1 minuto à 62

°C, 5 minutos à 72 °C.

2.4 Resultados

2.4.1 Uso de Phytogard® no controle de P. nicotianae em plântulas de tangerina

‘Sunki’


O tratamento com Phytogard® em plântulas de tangerina ‘Sunki’ foi promissor

no controle da doença (Tabela 2) e no aumento do consumo de água mesmo em

plântulas não inoculadas, quando observamos os resultados referentes às plântulas

tratadas com o produto (Figura 1). Para as plantas inoculadas, houve diferença

significativa entre todas as concentrações utilizadas comparadas à concentração de

0 mL L-1. Além disso, as plântulas que receberam o fosfito de potássio nas doses de

2 e 5 mL L-1 apresentaram valores significativamente maiores de consumo de água

sendo comparadas ao controle (plantas não inoculadas e não tratadas com

Phyogard®) (Figura 1 A). Com relação às plântulas não inoculadas, mas que foram

tratadas com Phytogard®, todas exibiram valores estatisticamente maiores quando

comparadas à dose 0 mL L-1 (Figura 1B). Embora a análise estatística tenha sido

realizada somente com os dados referentes ao último de dia de avaliação, podemos

observar que o incremento do consumo diário das plântulas pulverizadas com fosfito

de potássio foi maior em todas as concentrações tanto nas plantas inoculadas

quanto nas não inoculadas com o patógeno.

40

Figura 1 - Consumo de água de plântulas de tangerina ‘Sunki’ tratadas com Phytogard® (fosfito de

potássio: P2O5 = 28%; K2O = 26%) nas concentrações de 0; 0,5; 2 e 5 mL L-1

e inoculados (A) ou não inoculados (B) com Phytophthora nicotianae para avaliação do efeito protetor do produto. Tratamento controle não foi inoculado com P. nicotianae. A inoculação com o patógeno foi realizada seis dias após a aspersão do produto. Linhas seguidas da mesma letra, não diferem entre si pelo teste de Scott-Knott a 5% de probabilidade na última avaliação. As barras indicam o erro padrão da média (n=6)

2.4.1.2 Incidência

Como pode ser observado na Tabela 2 e Figura 2, o tratamento preventivo com

Phytogard® foi eficaz no controle de P. nicotianae em plântulas de tangerina ‘Sunki’.

Embora a concentração recomendada para citros, segundo o fabricante seja de 2

mL L-1, a concentração de 0,5 mL L-1, quatro vezes menor, foi capaz de reduzir em

84% a incidência da doença e diminuir os danos causados pela infecção com o

patógeno quando comparado ao controle. Além disso, podemos verificar também

que as plântulas pulverizadas com as concentrações de 2 e 5 mL L-1 apresentaram

incidência zero de doença.

A B

41

Tabela 2 - Incidência da gomose (Phytophthora nicotianae) em plântulas de tangerina ‘Sunki’ tratadas com Phytogard

® (fosfito de potássio: P2O5 = 28%; K2O = 26%) nas concentrações de 0;

0,5; 2 e 5 mL L-1

para avaliação do efeito protetor do produto. A inoculação com o patógeno foi realizada seis dias após a aspersão do produto e a avaliação ocorreu aos treze dias após a inoculação. Cada tratamento consistiu de seis repetições

Concentração de

Phytogard®

(mL L-1

)

Incidência

(%)

Inoculadas Não inoculadas

0 100 0

0,5 16 0

2 0 0

5 0 0

42

Figura 2 - Ilustração de um experimento para avaliação do efeito do Phytogard® (fosfito de potássio:

P2O5 = 28%; K2O = 26%) aplicado por aspersão nas concentrações de 0; 0,5; 2 e 5 mL L-1

em plântulas de tangerina ‘sunki’ inoculadas ou não com P. nicotianae. A inoculação com o patógeno foi realizada aos seis dias após a aspersão do produto e foto corresponde ao 13º dia após a inoculação com o patógeno (A, B, C e D correspondem as plantas não inoculadas e pulverizadas com concentrações de Phytogard

® de 0; 0,5; 2 e 5 mL L

-1,

respectivamente. E, F, G e H correspondem as plantas inoculadas e pulverizadas com concentrações de Phytogard

® de 0; 0,5; 2 e 5 mL L

-1, respectivamente)

43

2.4.1.3 Massa fresca

Observando-se a Figura 3, notamos que a parte aérea de plântulas tratadas

com o fosfito de potássio em todas as concentrações e inoculadas com P. nicotianae

exibiram valores estatisticamente maiores de massa fresca de parte aérea quando

comparadas à dose 0 mL L-1. Embora não haja diferença significativa quanto a

massa fresca de raízes de plântulas tratadas com Phytogard® e inoculadas com o

patógeno, podemos verificar que esses valores aumentaram à medida que as

concentrações do produto eram maiores.

Figura 3 - Massa fresca de parte aérea (A) e raiz (B) de plântulas de tangerina ‘Sunki’ tratadas com Phytogard

® (fosfito de potássio: P2O5 = 28%; K2O = 26%) nas concentrações de 0; 0,5; 2 e

5 mL L-1

e inoculados ou não com Phytophthora nicotianae. A inoculação com o patógeno foi realizada seis dias após a aspersão do produto e avaliação ocorreu aos treze dias após a inoculação. Médias seguidas da mesma letra, não diferem entre si pelo teste de Scott-Knott a 5% de probabilidade. As barras indicam o erro padrão da média (n=6)

2.4.1.4 Fenóis totais

Com relação à produção de compostos fenólicos pela parte aérea das plantas,

é possível notar que plântulas tratadas com fosfito de potássio nas concentrações de

0,5 e 2 mL L-1 exibiram diferença significativa quando comparados com as

inoculadas e não inoculadas com o patógeno (Figura 4A). Nesse sentido, a parte

aérea de plântulas inoculadas apresentou maiores valores quando comparada às

não inoculadas. Por outro lado, somente as raízes das plântulas tratadas com as

concentrações de 0,5 e 2 mL L-1 de Phytogard® apresentaram diferença estatística

entre inoculadas e não inoculadas. Nesse caso, os maiores valores de fenóis totais

A B

44

foram apresentados pelas raízes das plântulas não inoculadas com P. nicotianae

(Figura 4B).

Figura 4 - Fenóis totais de parte aérea (A) e raízes (B) de plântulas de tangerina ‘Sunki’ tratadas com

Phytogard® (fosfito de potássio: P2O5 = 28%; K2O = 26%) nas concentrações de 0; 0,5; 2 e

5 mL L-1

e inoculadas ou não com Phytophthora nicotianae. A inoculação com o patógeno foi realizada seis dias após a aspersão do produto e avaliação ocorreu aos treze dias após a inoculação. Barras de mesma cor, acompanhadas de letras minúsculas iguais, não diferem entre si. Barras pertencentes a uma mesma dose, acompanhadas de letras maiúsculas iguais, não diferem entre si pelo Teste de Tukey a 5% de probabilidade. As barras indicam o erro padrão da média (n=5)

2.4.1.5 Proteínas totais

Tratando-se da produção de proteínas totais pela parte aérea das plântulas,

podemos observar na Figura 5A que houve diferença significativa entre plantas

inoculadas e não inoculadas somente nas plantas que não foram tratadas com

Phytogard®, onde plantas inoculadas exibiram valores maiores quando comparadas

às não inoculadas. Ainda sobre a parte aérea, as diferenças entre os valores de

proteínas totais só foram significativas nas plantas não inoculadas com o patógeno,

sendo a concentração de 5 mL L-1 a única que diferiu do controle (dose 0 mL L-1).

Com relação às proteínas totais extraídas das raízes das plântulas, houve diferença

significativa entre plantas inoculadas e não inoculadas nas doses 0 e 5 mL L -1,

sendo que plantas inoculadas apresentaram valores maiores. Valores semelhantes

foram encontrados entre as plântulas inoculadas, maiores concentrações de

proteínas totais foram encontradas nas raízes de plântulas tratadas com Phytogard®

nas doses 0 e 5 mL L-1. Quando analisamos o fator inoculação isoladamente, é

possível verificar que as raízes de plântulas inoculadas com P. nicotianae

apresentaram valores de proteínas totais maiores quando comparadas as não

inoculadas (Figura 5B).

B A

45

Figura 5 - Proteínas totais de parte aérea (A) e raízes (B) de plântulas de tangerina ‘Sunki’ tratadas com Phytogard

® (fosfito de potássio: P2O5 = 28%; K2O = 26%) nas concentrações de 0;

0,5; 2 e 5 mL L-1


2.4.1.6 Atividade de β-1,3 glucanase

Com relação à atividade da enzima β-1,3 glucanase da parte aérea das

plântulas tratadas com fosfito de potássio, pode ser observado na Figura 6A que

houve diferença significativa entre plantas inoculadas e não inoculadas apenas na

dose 0,5 mL L-1. Diferenças estatísticas entre as concentrações só foram

observadas entre as plantas não inoculadas, sendo que as concentrações 0 e 0,5

mL L-1 apresentaram maiores valores quando comparadas as concentrações 2 e 5

mL L-1. A atividade dessa enzima no tecido das raízes das plântulas foi

estatisticamente diferente entre plantas inoculadas e não inoculadas nas doses 0 e 5

mL L-1 apresentando valores menores do que os demais tratamentos. Diferenças

significativas na atividade da β-1,3 glucanase em raízes de plântulas tratadas com

diferentes concentrações de Phytogard® só puderam ser observadas nas plantas

inoculadas onde plantas tratadas com o produto na concentração de 2 mL L -1

exibiram maiores valores de atividade dessa enzima (Figura 6B).

A B

46

Figura 6 - Atividade da β-1,3 glucanase de parte aérea (A) e raízes (B) de plântulas de tangerina ‘Sunki’ tratadas com Phytogard

® (fosfito de potássio: P2O5 = 28%; K2O = 26%) nas

concentrações de 0; 0,5; 2 e 5 mL L-1


2.4.1.7 Atividade de guaiacol peroxidase

Não houve diferença significativa na atividade da enzima guaiacol peroxidase

nos tecidos da parte aérea de plântulas tratadas com diferentes concentrações de

Phytogard® e inoculadas ou não com P. nicotianae (Figura 7A). Por outro lado, a

atividade dessa enzima nos tecidos das raízes das plântulas foi diferente em todas

as concentrações de fosfito de potássio utilizadas, com exceção da concentração de

2 mL L-1, quando comparamos plantas inoculadas e não inoculadas. Diferenças

significativas entre os tratamentos com diferentes concentrações de fosfito só foram

observadas nas plantas não inoculadas em que a concentração de 5 mL L -1

apresentou valores menores quando comparado às demais (Figura 7B).

A B

47

Figura 7 - Atividade de guaiacol peroxidase de parte aérea (A) e raízes (B) de plântulas de tangerina

‘Sunki’ tratadas com Phytogard® (fosfito de potássio: P2O5 = 28%; K2O = 26%) nas

concentrações de 0; 0,5; 2 e 5 mL L-1


2.4.1.8 Atividade de fenilalanina amônia-liase

Embora não haja diferença estatística, foi observada maior atividade da enzima

fenilalanina amônia-liase nos tecidos de plantas inoculadas quando comparadas às

não inoculadas com relação à parte aérea das plântulas. Da mesma forma, não

houve diferença significativa entre os valores da atividade da enzima nas plantas

que receberam diferentes concentrações de fosfito (Figura 8A). Com relação aos

tecidos das raízes, maior atividade enzimática ocorreu em plantas não inoculadas

com P. nicotianae nas concentrações de 0 e 5 mL L-1 de Phytogard® quando

comparadas às inoculadas (Figura 8B). Entre as não inoculadas, valor

estatisticamente maior foi encontrado somente em plantas que não receberam

tratamento com fosfito, enquanto que entre as inoculadas não houve diferença

estatística entre as plantas que receberam diferentes concentrações do produto.

A B

48

Figura 8 - Atividade de fenilalanina amônia liase de parte aérea (A) e raízes (B) de plântulas de

tangerina ‘Sunki’ tratadas com Phytogard® (fosfito de potássio: P2O5 = 28%; K2O = 26%)

nas concentrações de 0; 0,5; 2 e 5 mL L-1


2.4.1.9 qPCR

Como pode ser observado na Figura 9, embora não haja diferença estatística,

maior concentração de P. nicotianae foi encontrado nas raízes de plantas não

tratadas com Phytogard® quando comparado aos demais tratamentos.

Figura 9 - Concentração de Phytophthora nicotianae em raízes de mudas de tangerina ‘Sunki’

tratadas com Phytogard® (fosfito de potássio: P2O5 = 28%; K2O = 26%) nas concentrações

de 0, 0,5, 2 e 5 mL L-1

e inoculadas com o patógeno. A análise estatística foi realizada por meio de Teste de tukey à 5 % de probabilidade e distingue apenas os tratamentos em que houve inoculação do patógeno. As barras indicam o erro padrão da média (n=3)

A B

49

2.4.2 Uso de Phytogard® no controle de P. plurivora em mudas de faia


Foi realizado, assim como para citros, ensaio para avaliar o consumo de água

por mudas de faia tratadas com Phytogard® e inoculadas com P. plurivora. A análise

estatística foi realizada apenas com os dados do último dia de avaliação, mas como

é possível observar, embora não se tenha encontrado diferenças significativas entre

os tratamentos utilizados, as mudas tratadas com o fosfito de potássio e inoculadas

com o patógeno apresentaram valores maiores de consumo de água quando

comparadas as plantas inoculadas e não tratadas com o produto no último dia de

avaliação (Figura 10). Observando o incremento do consumo diário ao longo do

tempo, também podemos verificar o aumento dos valores em mudas tratadas e

inoculadas em maior escala quando comparadas às plantas que foram apenas

inoculadas e não receberam a aplicação do produto. O consumo de água de plantas

inoculadas com o patógeno e tratadas com Phytogard® foi muito semelhante aos

valores de consumo de água de plantas não inoculadas com o patógeno,

demonstrando dessa forma a capacidade de controle da doença pelo fosfito de

potássio.

Figura 10 - Consumo de água de mudas de faia tratadas com Phytogard

® (fosfito de potássio: P2O5 =

28%; K2O = 26%) nas concentrações 0 e 2 mL-1

e inoculadas ou não com Phytophthora plurivora para avaliação do efeito protetor do produto. A inoculação com o patógeno foi realizada seis dias após a aspersão do produto. Linhas seguidas da mesma letra, não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade na última avaliação. As barras indicam o erro padrão da média (n=10)

50

2.4.2.2 Incidência

Com relação a incidência em mudas de faia, com base na a Tabela 3 e Figura

11 é possível notar que o Phytogard® se mostrou eficaz no controle de P. plurivora

nas mudas. As plantas que receberam pulverização com o fosfito de potássio

tiveram a incidência reduzida em 100% quando comparadas as plantas inoculadas e

não tratadas com o produto.

Tabela 3 - Incidência da doença (Phytophthora plurivora) em mudas de faia (Fagus sylvatica) tratadas

com Phytogard® (fosfito de potássio: P2O5 = 28%; K2O = 26%) nas concentrações de 0 e 2

e mL L-1

para avaliação do efeito protetor do produto. A inoculação com o patógeno foi realizada seis dias após a aspersão do produto e avaliação ocorreu aos treze dias após a inoculação. Cada tratamento consistiu de dez repetições

Concentração de

Phytogard®

(mL L-1

)

Incidência

(%)

Inoculadas Não inoculadas

0 30 0

2 0 0

51

Figura 11 - Ilustração de um experimento para avaliação do efeito do Phytogard® (fosfito de potássio:

P2O5 = 28%; K2O = 26%) aplicado por aspersão na concentração de 0 e 2 mL L-1

em mudas de faia inoculadas ou não com P. plurivora. A inoculação com o patógeno foi realizada aos seis dias após a aspersão do produto. A foto corresponde ao 13º dia após a inoculação com o patógeno (A- 0 mL L

-1, não inoculadas; B- 0 mL L

-1, inoculadas; C- 2 mL

L-1

, não inoculadas; D- 2 mL L-1, inoculadas)

2.4.2.3 Fluorescência de clorofila

Com relação à fluorescência de clorofila podemos observar na Figura 12 que

os valores referentes às plantas tratadas com o fosfito de potássio e inoculadas com

P. plurivora foram maiores quando comparados às inoculadas e não tratadas.

Somente as mudas do controle (não tratadas e não inoculadas) apresentaram

valores maiores e estatisticamente diferentes dos demais tratamentos. Mesmo não

havendo diferença significativa, plantas tratadas com Phytogard® e inoculadas

apresentaram maiores valores de fluorescência de clorofila quando comparadas com

as plantas apenas inoculadas e não pulverizadas com o produto.

52

Figura 12 - Fluorescência da clorofila (medida pelo rendimento quântico do fotossistema II) de mudas de faia (Fagus sylvatica) tratadas com Phytogard

® (fosfito de potássio: P2O5 = 28%; K2O =

26%) nas concentrações de 0 e 2 e mL L-1

e inoculados ou não com Phytophthora plurivora para avaliação do efeito protetor do produto. A inoculação com o patógeno foi realizada seis dias após a aspersão do produto. A seta indica o dia da inoculação com o patógeno. Linhas seguidas da mesma letra, não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade na última avaliação. As barras indicam o erro padrão da média (n=10)

2.4.2.4 qPCR

Foi realizada também a quantificação do patógeno P. plurivora nos tecidos de

raízes de faia inoculados e tratados ou não com Phytogard®. Embora não haja

diferença estatística entre os tratamentos, é possível verificar que as raízes das

plantas tratadas com Phytogard® apresentaram menores quantidades do patógeno

em seus tecidos, com uma redução variando no mínimo 50% (Figura 13).

53

Figura 13 - Concentração de Phytophthora plurivora em raízes de mudas de faia (Fagus sylvatica) tratadas com Phytogard

® (fosfito de potássio: P2O5 = 28%; K2O = 26%) nas

concentrações de 0 e 2 mL L-1

e inoculadas com o patógeno. A análise estatística foi realizada por meio de Teste T à 5 % de probabilidade e distingue apenas os tratamentos em que houve a inoculação do patógeno. As barras indicam o erro padrão da média (n=10)

2.5 Discussão

O controle de doenças de plantas causadas por espécies de Phytophthora spp.

é um desafio para os fitopatologistas em todo mundo (DALIO, 2003). Devido a

diferenças bioquímicas entre esses microrganismos (oomicetos) e os fungos

verdadeiros (Reino Fungi), os fungicidas utilizados na agricultura são ineficazes para

o controle desse grupo de patógenos. Existe hoje no mercado, um pequeno grupo

de fungicidas capazes de controlar oomicetos, entretanto, por atuarem

especificamente no organismo alvo, os casos de resistência são frequentes (SUKUL;

SPITELLER, 2000; DALIO, 2013). Com intuito de reduzir o uso de produtos tóxicos

ao ambiente e ao homem, produtos alternativos, como é o caso dos fosfitos, têm

sido estudados para um programa de manejo integrado de doenças. Embora muitos

trabalhos relatem o uso dos fosfitos para o controle de oomicetos (DORN et al.,

2007; PASTOR et al., 2011; FÖRSTER et al., 1998; COOKE; LITTLE, 2002; BÉCOT

et al., 2000; DIANESE et al., 2007, 2008, 2009; DE BOER et al., 1990; DALIO et al.,

2014) informações sobre o modo de ação, produtos comerciais, doses e épocas de

aplicação se mostram importantes para a tomada de decisão quanto ao uso dos

54

mesmos. Portanto, foi observado nesse trabalho que o produto à base de fosfito de

potássio, Phytogard®, foi capaz de controlar Phytophthora spp. em plântulas de citros

e mudas de faia. A dose recomendada de Phytogard® pelo fabricante para mudas

cítricas é de 2 mL L-1, entretanto, os valores de incidência da doença foi reduzido em

84% nas plantas que foram pulverizadas com o produto na concentração de 0,5 mL

L-1 e em 100% nas concentrações de 2 e 5 mL L-1 quando comparadas as plantas

não pulverizadas com o produto (Tabela 2). Semelhante a esses resultados, a

aplicação de fosfito na concentração de 20 mg mL-1 promoveu proteção de plantas

de fumo contra a invasão pelo mesmo patógeno, P. nicotianae, o que resultou em

lesões menores quando comparadas as plantas não tratadas com fosfito (SMILLIE et

al., 1989). Plântulas de citros apresentaram menor suscetibilidade a Phytophthora

palmivora quando tratadas com diferentes fontes de fosfito comparadas às plântulas

tratadas com outras fontes de P, reforçando o potencial do fosfito no controle de

Phytophthora em citros, mesmo quando pequenas quantidades desse composto são

encontradas nos tecidos dos hospedeiros (ORBOVIC et al., 2008). Tuset e

colaboradores (2003), citado por Garcia-Mina (2006), trataram mudas de citros

(Citrus sinensis) com diferentes formulações de fosfito e quando inoculadas com

Phytophthora citrophthora em todas as formulações utilizadas houve redução no

número de plantas afetadas. Além da cultura do citros e de patógenos do gênero

Phytophthora, os fosfitos se mostraram eficazes no controle de doenças em

mamoeiro contra Asperisporium caricae e P. palmivora, reduzindo significativamente

a quantidade das doenças quando comparadas às plantas não tratadas com fosfito

(DIANESE et al., 2008 e 2009). Plântulas de couve-flor tratadas com concentrações

de Phytogard® de 7, 10 e 20 mL L-1 foram completamente protegidas contra

Peronospora parasitica, quando o produto foi pulverizado antes ou após a

inoculação com o patógeno (BÉCOT et al., 2000).

Não foi observada diferença na produção de massa fresca das plântulas de

tangerina ‘Sunki’ não inoculadas com P. nicotianae e tratadas com diferentes

concentrações de Phytogard®. Entretanto, nas plântulas inoculadas houve um

aumento gradual de massa fresca de parte aérea e raiz à medida que se aumentou

a concentração de fosfito de potássio aplicada (Figura 3). De maneira semelhante,

Orbovic et al (2008) verificaram que não houve diferença na quantidade matéria

seca de raízes de plântulas de citros dez semanas após as mesmas terem recebido

aplicação de fosfito via foliar. Albrigo (1999) e Lovatt (1999) observaram que

55

aplicações foliares de fosfito em laranjeiras pode proporcionar maior número de

flores, rendimento de frutos e aumento de sólidos solúveis. Por outro lado, pequenas

quantidades de fosfito foram inibitórias ao crescimento de Arabidopsis (TICCONI et

al., 2001), tomateiro (VARADARAJAN et al., 2002) e Brassica nigra (CARSWELL et

al., 1996). O aumento da massa fresca somente em plantas inoculadas com P.

nicotianae pode indicar o potencial de controle do fosfito que reduziu os danos

causados pelo patógeno e fez com que o hospedeiro não tivesse sua fisiologia

normal afetada pelo mesmo. Diferentes respostas fisiológicas proporcionadas pelo

fosfito podem estar relacionadas ao metabolismo de carboidratos, estímulo da rota

do ácido shiquímico e/ou alterações hormonais e químicas nas plantas (LOVATT;

MIKKELSEN, 2006).

Não existe recomendação de Phytogard® para uso em faia na Alemanha,

contudo, por se tratar de uma espécie arbórea semelhante ao citros, foi testada a

eficiência desse produto no controle de P. plurivora utilizando-se a dose

recomendada para citros. A incidência da doença foi reduzida em 100% em mudas

de faia pulverizadas com Phytogard® na concentração de 2 mL L-1 (Tabela 3). Dalio

et al., (2014), verificaram que mudas de faia tratadas com concentração final de

0,5% de fosfito de potássio (Sigma-Aldrich) e inoculadas com P. plurivora não

morreram e nem mostraram sintomas da doença durante todo o ensaio. Aplicações

foliares de fosfito nas concentrações de 2,5; 5 e 10 g L-1 foram realizadas em

espécies florestais do gênero Banksia, sendo essas plantas submetidas a

inoculações natural e artificial com Phytophthora cinnamomi onde todas as

concentrações de fosfito reduziram a mortalidade das árvores. A porcentagem de

sobrevivência das espécies arbóreas Banksia baxteri e Lamberia inermis, após a

aplicação de fosfito, aumentou em 68% e 78% quando comparadas a 31% e 54%

em plantas não tratadas com fosfito, respectivamente. Por sua vez, o fosfito aplicado

na concentração de 6 g L-1 em Xanthorrhoea australis preveniu a morte de árvores

em vegetação infestada com P. cinnamomi (SHEARER; FAIRMAN, 2007; ABERTON

et al., 1999). Em ecossistemas naturais no oeste da Austrália, o fosfito é utilizado

com frequência para reduzir o impacto e a disseminação de P. cinnamomi (HARDY

et al., 2001).

Uma planta saudável necessita que suas células recebam água, nutrientes e

minerais para que possa conduzir suas funções fisiológicas normais. Essa água é

essencial à hidratação do citoplasma e parede celular e o transporte de metabólitos

56

para todas as partes da planta. A água presente no solo deve ter um contato íntimo

com a superfície radicular da planta onde é absorvida. A água após ser absorvida,

para que atinja a endorderme e alcance o xilema, se move através das vias

simplasto (onde a água se movimenta de uma célula para outra por meio dos

plasmodesmas), transmembrana (a água atravessa diretamente a membrana

plasmática) e apoplasto (onde a água se move exclusivamente pela parede celular

sem atravessar qualquer membrana) (TAIZ; ZEIGER, 2006). O transporte de água

na planta está relacionado com a taxa de transpiração e com a taxa de absorção

que acontece por meio de uma redução contínua do potencial de água (ψ). Caso a

taxa de transpiração seja maior do que a taxa de absorção, a planta passará por

processo de estresse hídrico, o que afetará seu metabolismo (JACKSON et al.,

2000). De acordo com Medina et al. (2005), as plantas de citros são ineficientes na

absorção de água em decorrência da pequena abundância de pêlos radiculares os

quais se encontram em sua maioria perto da superfície do solo, além disso, essas

plantas a presentam pequena relação parte aérea/raízes.

Vários eventos podem comprometer o uso eficiente da água, o qual envolve o

acúmulo de biomassa de uma cultura por unidade de água transpirada, sendo que

dentre eles estão os patógenos que podem interferir no movimento ascendente da

água (STANGARLIN E LEITE, 2008). Patógenos, como Phytophthora spp., podem

causar extensa destruição do sistema radicular do hospedeiro mesmo antes dos

sintomas tornarem-se visíveis na parte aérea do hospedeiro (AGRIOS, 2005). A

injúria causada por esses patógenos afeta diretamente os pêlos radiculares,

comprometendo a quantidade de água absorvida e, por consequência, o balanço

hídrico e o uso eficiente da água (STANGARLIN E LEITE, 2008). Observando os

resultados de consumo de água de plântulas de tangerina ‘Sunki’ e faia inoculadas

com Phythophthora spp. podemos constatar a injúria causada pelos patógenos nos

hospedeiros, que apresentaram menores taxas de absorção de água quando

comparadas as não inoculadas (Figuras 1 e 10). É interessante observar que plantas

inoculadas e aspergidas com fosfito de potássio apresentaram valores de absorção

de água semelhantes às plantas não inoculadas com o patógeno. Os valores de

massa fresca de parte aérea e raízes de plântulas de citros tratadas com Phytogard®

apresentaram valores semelhantes aos de plantas não inoculadas (Figura 3). Esses

resultados são consequência da capacidade do produto, a base de fosfito de

potássio, em reduzir os danos causados pelo patógeno nos tecidos do hospedeiro

57

de modo com que o metabolismo do mesmo não fosse prejudicado, garantindo

dessa forma a manutenção do uso eficiente da água.

Existem vários trabalhos na literatura que relatam o uso de fosfitos para o

controle de oomicetos, entretanto, os mecanismos através dos quais esse controle

ocorre ainda são inconclusivos (Dalio et al., 2014). Segundo esses autores, existem

dois modos de ação dos fosfitos relacionados ao controle de doenças de plantas que

incluem ação direta na inibição do crescimento dos patógenos quando estes entram

em contato com o fosfito acumulado nos tecidos das plantas (WILKINSON et al.,

2001; DELIOPOULOS et al., 2010) e o estímulo da defesa das plantas, na ausência

ou presença dos patógenos (JACKSON et al., 2000; ESHRAGHI et al., 2011).

Considerando que nesse trabalho o fosfito de potássio foi pulverizado nas folhas das

plantas e o patógeno foi inoculado via raiz, é necessário que sejam algumas

considerações. Uma delas seria o fato de que o fosfito tenha sido translocado e

acumulado nas raízes das plantas, e que a ação do mesmo tenha sido diretamente

(fosfito tenha sido tóxico ao patógeno). Uma segunda consideração leva em conta

que o fosfito em concentrações subtóxicas ao patógeno, tenha atuado como um

indutor de resistência, ativando as defesas latentes e/ou complementando os

mecanismos já existentes no hospedeiro. Uma terceira leva em conta a

complementariedade dos dois mecanismos, onde caso a concentração de fosfito

alcance níveis tóxicos ao patógeno dentro do tecido do hospedeiro, os efetores e ou

PAMPs de Phytophthora podem ser liberados devido à ruptura das hifas, o que

facilitaria o reconhecimento do patógeno pelo hospedeiro e, por consequência, a

ativação de rotas de sinalização e defesa (KING et al., 2010).

De forma geral, as plantas são capazes de se defender do ataque de

patógenos de maneira efetiva, dada a multiplicidade e eficiência de mecanismos, de

maneira que, na natureza, a resistência é a regra e a suscetibilidade a exceção. A

resistência do hospedeiro a um microrganismo patogênico pode ser definida, sob o

aspecto fisiológico, como a capacidade da planta em atrasar ou evitar a entrada e/ou

subsequente atividade do patógeno em seus tecidos (GOODMAN et al., 1986;

NOJOSA et al., 2009., 2005; SCHWAN-ESTRADA et al., 2008; PASCHOLATI et al.,

2011). O sistema de defesa vegetal é multicomponente e reúne mecanismos

estruturais e bioquímicos, pré e pós- formados em relação a penetração do patógeno

que atuam de maneira dinâmica e coordenada no momento, local e magnitude

adequadas. Esse sistema inicia-se com o reconhecimento do patógeno pelo

58

hospedeiro, continua com a transdução de sinais e resulta em reprogramação do

metabolismo celular vegetal, envolvendo mudanças na atividade gênica (ISAAC,

1992; SOMSSICH E HAHLBROCK, 1998, PASCHOLATI E LEITE, 1995). Existem

na literatura diversos trabalhos que sugerem que o fosfito de potássio seja um

indutor de resistência, ou seja, potencializador de respostas de defesa no

hospedeiro que auxilia no controle em diversos patossistemas (DALIO et al. 2012;

THAO; YAKAMAWA, 2009; GUEST; GRANT, 1991; DELIOPOULUS;

KETTLLEWELL; HARE, 2010; REUVENI; SHEGLOV; COHEN 2003; LIM et al. 2013;

GOMES et al. 2011). Ao saber que os mecanismos de defesa das plantas contra

fitopatógenos envolvem alterações metabólicas que estão correlacionadas com

mudanças na atividade de enzimas-chave nos metabolismos primário e secundário

(SCHWAN-ESTRADA et al., 2008), procurou-se verificar se o produto a base de

fosfito de potássio, Phytogard®, atuou como um indutor de resistência no controle da

P. nicotianae em plântulas de citros. Para tanto, foram realizados ensaios

bioquímicos para melhor entender esse processo.

Compostos fenólicos e as enzimas peroxidase, β-1,3 glucanase e fenilalanina

amônia-liase estão envolvidos no mecanismo de resistência contra o ataque de

patógenos (PASCHOLATI, 2011). Os fenóis são sintetizados pelas plantas

principalmente pela rota do ácido shiquímico e apresentam ação sobre patógenos,

pela inibição da germinação de esporos, crescimento micelial e a atividade de

enzimas microbianas, podendo ser produzidos antes ou após a chegada do

patógeno (TAIZ; ZEIGER, 2006; SCHWAN-ESTRADA; STANGARLIN.

PASCHOLATI, 2008; LO; NICHOLSON, 2008). Por sua vez, a fenilalanina amônia-

liase (FAL) é uma enzima-chave na via dos fenilpropanóides (SCHWAN-ESTRADA;

STANGARLIN; PASCHOLATI, 2008), principal rota responsável pela síntese de

compostos fenólicos em plantas (TAIZ; ZEIGER, 2006). De acordo com diversos

trabalhos na literatura, existe correlação entre a atividade da FAL e o acúmulo de

compostos fenólicos solúveis e de lignina (UMESHA, 2006; JU et al. 1995). A

peroxidase catalisa a redução do peróxido de hidrogênio em conjunto com a

oxidação de compostos como fenóis, alcaloides e auxinas (ZIPOR; OREN-SHAMIR,

2013). Sua atividade é potencializada em condições de estresse, lignificação,

fortificação da parede celular, infecção por patógenos e, portanto, atuando na

proteção das plantas (SIEGEL, 1993). As peroxidases são consideradas um sistema

modelo para estudos de atividade enzimática devido à eficiência dos protocolos

59

existentes e a estabilidade de sua estrutura (ZIPOR; OREN-SHAMIR, 2013). No

caso das glucanases, as mesmas estão classificadas dentro do grupo 2 das

proteínas relacionadas à patogênese (proteínas- RP). As proteínas-RP são

induzíveis no hospedeiro em resposta à infecção por um patógeno ou por estímulos

abióticos, e geralmente não são encontradas em tecido sadio (SCHWAN-ESTRADA;

STANGARLIN. PASCHOLATI, 2008; VAN LOON, 1994). Os mecanismos de ação

das proteínas-RP envolve ação hidrolítica sobre os componentes da parede celular

de patógenos (YOSHIKAWA; TSUDA; TAKEUCHI, 1993). No caso das glucanases,

elas hidrolisam polímeros de glucana, principais componentes da parede celular de

oomicetos (VAN LOON; VAN STRIEM, 1999). Existe também um mecanismo

indireto, que corresponde a liberação de eliciadores não específicos devido à ação

lítica dessas enzimas (YOSHIKAWA; TSUDA; TAKEUCHI, 1993).

No presente trabalho, pode-se verificar que não houve diferença significativa na

produção de fenóis totais na parte aérea de plantas tratadas com fosfito quando

comparadas as não tratadas. Nos tecidos das raízes, a quantidade de fenóis totais

foi maior nas plantas não inoculadas, sendo que nessas mesmas plantas não houve

diferença nos valores desses compostos nas plantas tratadas com fosfito (Figura 4).

Esses valores correspondem aos encontrados na atividade da FAL, onde também

não houve diferença entre plantas tratadas e não com fosfito e inoculadas ou não

com o patógeno (Figura 8). Entretanto, nas raízes maior atividade dessa enzima foi

encontrada em tecidos não inoculados. Embora sejam esperadas maiores

concentrações de compostos fenólicos e atividade da FAL em tecidos de plantas

resistentes e inoculadas com o patógeno, essas concentrações podem variar ao

longo do tempo após a inoculação com o patógeno. No trabalho de BELTRAME

(2010) as raízes de tangerina Sunki, inoculadas com P. nicotianae, apresentaram

menor teor de fenóis totais do que as plantas não inoculadas, três meses após a

inoculação. Porém, no oitavo mês após a inoculação, as raízes de tangerina Sunki

inoculadas apresentaram maior concentração de compostos fenólicos do que as

plantas não inoculadas. As plantas utilizadas para a extração e quantificação dos

fenóis totais foram coletadas aos 13 dias após a inoculação, o que isso pode

significar que os compostos fenólicos totais tenham sido produzidos em maior

quantidade e, com diferença entre os tratamentos, imediatamente após a invasão do

patógeno nas raízes e que aos 13 dias essa quantidade tenha diminuído. Ao

contrário dos resultados obtidos nesse trabalho, vários pesquisadores encontraram

60

relação entre a quantidade de compostos fenólicos e a resistência do hospedeiro ao

patógeno. Cahill e McComb (1992) verificaram que a inoculação de P. cinnamomi

induzia a atividade da FAL, seguida por alterações nos níveis de fenóis e de lignina

em raízes de Eucalyptus calophylla (resistente), mas não de Eucalyptus marginata

(suscetível). Cahill et al. (1989) inocularam P. cinnamomi em diferentes espécies

vegetais, sendo que estudos histológicos mostraram que a lignificação da parede

celular, deposição de compostos fenólicos e a formação de papila e calose foram

encontradas mais freqüentemente nas espécies resistentes do que nas suscetíveis.

Não houve diferença significativa na atividade da guaiacol peroxidase na parte

aérea das plantas tratadas ou não com fosfito e inoculadas ou não com P. nicotianae

(Figura 7A). Nos tecidos da raiz, semelhante à atividade da FAL e da quantidade de

compostos fenólicos totais, maior atividade da peroxidase foi encontrada nas plantas

não inoculadas. Nas plantas inoculadas, houve um ligeiro aumento na atividade da

peroxidase em plantas tratadas com fosfito na concentração de 2 mL L-1 indicando

um possível incremento do sistema de defesa da planta pela aplicação do

Phytogard® (Figura 7B). A peroxidase está envolvida na produção de lignina assim

como a FAL. Essas enzimas participam de rotas metabólicas que estão inter-

relacionadas e por isso suas atividades tendem a se correlacionar, como foi o caso

dos resultados desse trabalho. Guest e Bompeix (1990) relataram vários trabalhos a

respeito do modo de ação de fosfatos, enfatizando o efeito dos mesmos na

biossíntese de etileno, na atividade de fenilalanina amônia-liase, que envolve a

síntese de fenilpropanóides e a biossíntese de lignina e de fitoalexinas (GUEST,

1986; GUEST et al., 1989; NEMESTOTHY; GUEST, 1990; SAINDRENAN et al.,

1988).

As peroxidases (PR-9) são glicoproteínas antioxidantes capazes de catalisar

grande número de reações como, produção ou catálise de H2O2, formação de

lignina, suberização, catabolismo de auxinas e cicatrização de ferimentos (ALVAREZ

et al., 1998). Além disso, em cultivares resistentes ou em plantas tratadas com

indutores de resistência esse aumento é mais pronunciados que nas relações

planta-patógenos compatíveis (RONCATO; PASCHOLATI, 1998). Em outro trabalho,

Egea et al. (2001) verificaram a existência de uma correlação positiva entre a

resistência de três cultivares de pimentão a Phytophthora capsici e a excreção de

peroxidases por culturas celulares dessas variedades inoculadas com esse

oomiceto.

61

O envolvimento das peroxidases em diferentes processos fisiológicos em uma

planta superior pode indicar a atuação de diferentes isoenzimas. Em linho (Linum

usitatissimum L.), por exemplo, a guaiacol peroxidase (GPX) apresenta isoformas

ácidas e básicas, sendo que a isoforma ácida está envolvida com a biossíntese da

parede celular vegetal, incluindo a formação de lignina. A isoforma básica participa

da regulação da degradação do ácido indol-acético (AIA) e da síntese de etileno

(FIELDES; GERHARDT, 1998). Portanto a atividade total de peroxidases envolve a

ação de várias isoenzimas, cada qual relacionada à uma função fisiológica, como

por exemplo detoxificação, lignificação, produção de peróxido de hidrogênio, etc. No

presente trabalho, observou-se maior atividade da guaicol peroxidase em tecidos de

raiz quando comparado aos tecidos de parte aérea, sendo que provavelmente esse

resultado tenha sido observado devido a maior produção de peróxido de hidrogênio

nesses tecidos (Figura 7).

As proteínas-RP, β-1,3-glucanases e quitinases têm sido detectadas em várias

plantas após a ativação com indutores (FAULIN, 2010) e em interações de

resistência do hospedeiro ao patógeno (BELTRAME, 2010). Guzzo (2004) observou

que plantas de cafeeiro, tratadas com acibenzolar-S-metilico (ASM), um importante

indutor de resistência em plantas, aumentaram local e sistemicamente a atividade

das enzimas β-1,3-glucanases e quitinases. Resultado semelhante também foi

observado em folhas, caules e tubérculos de batata, por Bokshi; Morris; Deverall

(2003) os quais detectaram aumento da β-1,3-glucanase após tratamento foliar das

plantas com 100 mg de i.a./L de ASM, em casa de vegetação e em campo. Plantas

de pimenta-de-macaco (Piper colubrinum) (resistente) e o cultivar Kalluvally

(tolerante) de pimenta-do-reino (Piper nigrum) apresentaram aumento na atividade

de glucanases 1 e 2 dias após a inoculação de P. capsici, respectivamente

(NAZEEM et al., 2008). Hipocótilos de plântulas de soja (cultivar Jangyup) foram

inoculados com as raças 2 e 4 de P. megasperma f. sp. glycinea, o que resultou em

interações incompatível e compatível, respectivamente. A atividade de glucanases

aumentou mais rapidamente em hipocótilos inoculados com a raça 2 do que com a

raça 4 (YI; HWANG, 1996).

Houve maior atividade da enzima β-1,3 glucanase nos tecidos das raízes do

que na parte aérea das plantas utilizadas nesse trabalho, provavelmente devido ao

fato de que P. nicotianae tenha sido inoculado nas raízes e seja um patógeno que

ataca o sistema radicular (Figura 6). Nos tecidos das raízes de plantas inoculadas

62

com o patógeno, foi observado um aumento na atividade dessa enzima à medida

que se aumentou a concentração de fosfito de potássio aplicado. Na maior dose (5

mL L-1), a atividade da β-1,3 glucanase foi reduzida, indicando que nesses tecidos

há menor quantidade de patógeno e, por consequência, menor atividade enzimática.

Essa hipótese pode ser sustentada quando observamos os resultados da

quantidade de patógeno encontrada nos tecidos das raízes das plantas inoculadas

através da análise de qPCR (Figura 9).

A quantidade de patógeno detectada via qPCR em raízes de citros e faia nas

plantas que foram tratadas com Phytogard® foram menores quando comparadas as

não tratadas (Figuras 9 e 13). Esses resultados corroboram com os dados de

incidência de doença em ambos os casos, onde a incidência da doença foi menor

em plantas tratadas com o fosfito de potássio (Tabelas 2 e 3). Beltrame (2010)

estudando a reação de duas variedades de porta enxertos, citrumelo ‘Swingle’ e

tangerina ‘Sunki’ resistente e suscetível a Phythophthora spp., respectivamente,

observou que a quantidade média de DNA de P. nicotianae em raízes da variedade

resistente foi 2,7 e 3,1 vezes menor do que em raízes da suscetível 4 e 7 dias após

a inoculação, respectivamente. Por suas vez, Dalio et al (2014) verificou que não

houve morte de mudas de faia tratadas com fosfito de potássio a 0,5% e inoculadas

com P. plurivora aos 10 dias após a inoculação. A quantidade de DNA do patógeno

ao longo do tempo permaneceu na ordem de 8 ng g-1 de tecido de raízes tratadas

com fosfito e inoculadas com o patógeno, enquanto que, em raízes de plantas

somente inoculadas, esses valores aumentaram de 10 ng g-1 1 de DNA no dia 2 até

130 ng g-1 de DNA 10 dias após a inoculação.

Como pode ser notado nesse trabalho, foram encontrados resultados de

controle em citros e faia de P. nicotianae e P. plurivora, respectivamente que são

patógenos que infectam e colonizam raízes, por meio de aplicação foliar de fosfito

nos hospedeiros, antes da inoculação com os patógenos. Esses dados nos fazem

refletir a respeito da mobilidade do fosfito, caso esse tenha atuado diretamente no

desenvolvimento dos patógenos (WILKINSON et al., 2001; DELIOPOULUS et al.,

2010; DALIO et al., 2014). Diferente da maioria dos fungicidas sistêmicos, o fosfito

possui a capacidade de ser translocado via xilema e floema (GROUSSOL et al.,

1986; LÜTTRINGER, DE CORMIS, 1985; GUEST; GRANT, 1991) e essa mobilidade

pode ser verificada com base em diferentes trabalhos na literatura. ORBOVIC et al

(2008) detectou a presença de fosfito em folhas e raízes de citros dez dias após a

63

aplicação do mesmo via foliar e solo. Esses autores relataram que o fosfito nas

condições experimentais utilizadas, translocou via xilema com maior eficiência do

que via floema. Dalio et al (2014), após pulverizar fosfito de potássio em folhas de

faia, verificou quantidades dez vezes maiores desse composto nas raízes do que as

necessárias para inibir em 50% o crescimento in vitro de P. plurivora. Essa alta

concentração de fosfito foi encontrada nas raízes aos seis dias após a aplicação na

parte aérea das plantas, assim como no final do experimento. Esses dados

concordam com as publicações que também relatam que o fosfito é livremente

translocado, juntamente com os fotoassimilados, sendo acumulado nos vacúolos das

células (JACKSON et al., 2000; OUIMETTE et al., 1990). A importância das relações

fonte-dreno e a translocação de fosfatos para contribuir com o controle de doenças,

principalmente em culturas perenes, se torna visível. Com a utilização desses

produtos, tornou-se possível a aplicação foliar como tratamento preventivo para

doenças radiculares (GUEST; GRANT, 1991).

O processo fotossintético constitui-se na conversão da energia luminosa em

energia química. Esta conversão é possível devido à sensibilidade das moléculas de

clorofila à luz. Os sistemas de coleta de luz do fotossistema II são compostos de

numerosas moléculas de clorofila aderidas a complexos protéicos que capturam a

energia luminosa e a transferem para o centro de reação do fotossistema II

(CAMPOSTRINI, 2001). O valor da razão Fv/Fm é proporcional ao rendimento

quântico da fase fotoquímica da fotossíntese (BUTLER; KITAJIMA, 1975). Nesse

trabalho, foi determinada a eficiência quântica do fotossistema II (Fv/Fm), a qual se

infere a capacidade efetiva da planta em converter energia luminosa em química. Os

maiores valores de fluorescência de clorofila foram encontrados em plantas não

tratadas com fosfito e não inoculadas com o patógeno, seguido das plantas tratadas

e não inoculadas. Em seguida vieram os valores das tratadas e inoculadas e por

último as somente tratadas com o Phytogard®. Embora não se tenha observado

diferença significativa entre as plantas inoculadas com P. nicotianae e tratadas com

Phytogard® e as plantas somente inoculadas, as que receberam pulverização com

fosfito exibiram valores maiores quando comparadas as que não receberam (Figura

12). Esses resultados indicam que, de alguma maneira, o fosfito foi capaz de reduzir

os danos fisiológicos nos hospedeiros inoculados com o patógeno, já que o declínio

da relação Fv/Fm é um bom indicador do dano fotoinibitório quando plantas estão

sujeitas a estresses bióticos e abióticos (BAKER et al., 1983; Ögren; Öquist, 1985).

64

2.6 Conclusões

O produto á base de fosfito de potássio, denominado Phytogard®, em todas as

concentrações utilizadas controla de maneira preventiva doenças causadas por

Phytophthora nicotianae e Phytophthora plurivora em citros e faia, respectivamente.

Nas condições do presente trabalho, o Phytogard® altera o metabolismo do

hospedeiro auxiliando-o contra o ataque dos patógenos.

Em plântulas de tangerina ‘Sunki’, o Phytogard® altera a atividade de algumas

enzimas relacionadas à patogênese, mas não é possível concluir que o controle seja

mediado por indução de resistência.

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75

3 MECANISMOS DE AÇÃO DO FOSFITO DE POTÁSSIO SOBRE Phytophthora

nicotianae e Phytophthora plurivora

Resumo

O fosfito de potássio possui um grande potencial para controle de doenças de plantas, principalmente para aquelas causadas por oomicetos. No Brasil, sua atual recomendação destina-se apenas à fertilização foliar em diversas culturas. Embora possamos encontrar diversos trabalhos na literatura que relatam o efeito negativo desses produtos sobre o crescimento de fitopatógenos, o Comitê de Ação a Resistência à Fungicidas (FRAC), classifica os fosfitos, como produtos com ingrediente ativo sem mecanismo de ação definido. Diante disso, o objetivo desse estudo foi (i) avaliar o efeito direto do produto comercial à base de fosfito de potássio, o Phytogard®, sobre o desenvolvimento de Phytophthora nicotianae e Phytophthora plurivora e (ii) verificar os possíveis mecanismos de ação desse produto sobre esses patógenos. O micélio dos patógenos foi exposto a concentrações crescentes de Phytogard® sendo determinado o crescimento micelial e produção de massa fresca de micélio. Foi avaliada também a interferência do fosfito de potássio sobre a produção de zoósporos por esses patógenos. Com a finalidade de estudar os possíveis mecanismos de ação do Phytogard® sobre P. nicotianae e P. plurivora, avaliou-se a perda de eletrólitos, peroxidação de lipídios e a atividade da enzima β-1,3 glucanase do micélio exposto a diferentes concentrações do produto. Foi avaliado também a morfologia das hifas tratadas ou não com o Phytogard® através da técnica de Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV). Os resultados mostraram que o micélio de ambos os patógenos foi inibido à medida que se aumentou a concentração de fosfito apresentando inibição de 50% (EC50) na concentração de Phytogard® de 1,9 mL L-1 e 0,6 mL L-1 para P. nicotianae e P. plurivora, respectivamente. A produção de zoósporos de ambos os patógenos foi reduzida á partir da menor concentração de Phytogard® utilizada. Embora os valores de perda de eletrólitos do micélio dos patógenos expostos ao fosfito tenham sido crescentes à medida que se aumentou a concentração do produto e ao longo do tempo, não houve diferença entre os tratamentos nas análises de peroxidação de lipídios e proteínas totais. Houve decréscimo na atividade da enzima β-1,3-glucanase à medida que as concentrações de Phytogard® aumentaram para ambos os patógenos. Foi verificado por meio da técnica de MEV que houve mudanças morfológicas nas hifas dos patógenos tratados com o fosfito comparado às não tratadas. Portanto, é possível concluir que o Phytogard® inibe o crescimento micelial e a produção de zoósporos de P. nicotianae e P. plurivora. Além disso, o produto modifica a morfologia das hifas, atuando na permeabilidade de membrana e na síntese de parede celular das hifas dos patógenos.

Palavras-chave: Mecanismos de ação; Membrana plasmática; Parede celular; Fosfito de potássio

Abstract

The potassium phosphite has a high potential to control plant diseases, specially for those caused by oomycetes. In Brazil, the current recommendation for

76

phosphite use is only as leaf fertilizer in different crops. Although we can find many papers reporting the negative effect of these products on the pathogen growth, the Fungicides Resistance Action Committee (FRAC), classifies phosphites as products with the active ingredient with mode of action no defined . Thus, the aim of this study was: (i) evaluate the direct effect of the commercial product based on potassium phosphite, Phytogard®, on the development of Phytophthora nicotianae and Phytophthora plurivora and (ii) study the possible mode of action of the product on these pathogens. Mycelium from the pathogens was exposed to increase concentrations of Phytogard® and mycelial growth and fresh mycelium mass production were determined. We also assessed the interference of potassium phosphite on zoospore production by these pathogens. In order to study the possible mode of action of Phytogard® on P. nicotianae and P. plurivora, the electrolyte leakage, lipid peroxidation and the β-1,3 glucanase activity on mycelium exposed to different concentrations of the product were evalueted. It was also observed the hyphae morphology from mycelium treated or not with the Phytogard® by scanning electron microscopy (SEM). The results showed that mycelium growth was inhibited in both pathogens as the phosphite concentration, increased showing 50% of inhibition (EC50) at 1.9 mL L-1 and 0.6 ml L-1 Phytogard® concentrations to P. nicotianae and P. plurivora, respectively. The zoospore production by both pathogens was reduced already by using the lowest concentration of Phytogard®. Although the electrolyte leakage from mycelium exposed to phosphite increased as the product concentration was increased, there was no differences between treatments in lipid peroxidation and total protein analysis. There was a decrease in the β-1,3-glucanase activity in mycelium treated with Phytogard® as the concentration increased for both pathogens. It was detected by SEM morphological changes in pathogen hyphae treated with the phosphite when compared to untreated hyphae. Therefore, we conclude that the Phytogard® inhibits mycelial growth and zoospore production by P. nicotianae and P. plurivora. Furthermore, this product modifies the hyphae morphology, acts on fungal membrane permeability and mycelium cell wall synthesis.

Keywords: Mechanisms of action; Plasmatic membrane; Cell wall; Potassium

phosphite

3.1 Introdução

Atualmente, por meio de técnicas filogenéticas moleculares modernas O

gênero Phytophthora está agrupado dentro da classe dos Oomicetos que também

agrupam patógenos de insetos, crustáceos, peixes, vertebrados e vários outros

microrganismos e plantas (MARGULIS; SHWARTZ, 2000). Essa classificação deixa

bem clara a íntima relação desses microrganismos com algas fotossintéticas, mas

nenhuma relação com fungos verdadeiros (SOGIN; SILBERMAN, 1998; BALDAUF

et al., 2003; ADL et al., 2005).

77

Os fosfitos são capazes de influenciar negativamente no desenvolvimento dos

fitopatógenos e sua fungitoxicidade varia entre as espécies e depende

principalmente da exposição do patógeno a estes compostos (DALIO et al., 2012).

King et al. (2010) demonstraram através de observações citológicas, a ocorrência de

lise de células de Phytophthora cinnamomi ao cultivarem o microrganismo em meio

acrescido de fosfito. Os autores sugeriram uma possível ação do produto sobre a

síntese da parede celular. Devido à capacidade dos fosfitos em afetar a síntese da

parede celular, esses produtos reduzem a esporulação e o crescimento micelial dos

fitopatógenos, exercendo atividade fungistática o que resulta na redução de doenças

(ROMA, 2013; PANICKER; GANGADHARAN, 1999; DERCKS; BUCHNAUER, 1987;

SMILIE et al., 1989; GUEST; BOMPEIX, 1990). Entretanto, o Comitê de Ação a

Resistência à Fungicidas (FRAC), classifica os produtos derivados do ácido

fosforoso, como o fosetyl-alumínio, rotineiramente utilizado no controle de

oomicetos, e os fosfitos, como ingrediente ativo sem mecanismo de ação definido

(FRAC, 2012).

De acordo com Kimati (2011), um fungicida deve atuar na seletividade à células

fúngicas apenas, sem afetar outros organismos, possuir amplo espectro de ação,

permitir armazenagem e ser acessível economicamente. Os carboidratos

constituintes da parede celular de fungos e oomicetos atuam como barreira protetora

e são necessários para o crescimento e viabilidade dos mesmos. Assim, a inibição

desses componentes indica um eficiente mecanismo de ação contra fungos

(DURAN; CARY; CALVO, 2010).

Alguns autores recentemente relataram que o tratamento com fosfito tem

levado algumas espécies de hospedeiro ao estado de priming, que é a




ESHRAGHI et al., 2011). Portanto, é possível inferir que o fosfito atue de duas

formas sobre o patógeno: inibindo diretamente o desenvolvimento do microrganismo

e/ou induzindo mecanismos de defesa do hospedeiro contra o fitopatógeno (DALIO

et al., 2012; JACKSON et al., 2000).

Diante disso, o objetivo desse estudo é avaliar o efeito direto do produto

comercial à base de fosfito de potássio, o Phytogard®, sobre o desenvolvimento de

78

P. nicotianae e P. plurivora e verificar os possíveis mecanismos de ação desse

produto sobre esses patógenos.

3.2 Revisão Bibliográfica

3.2.1 Phythophthora nicotianae e Phythophthora plurivora: classificação e

morfologia

O gênero Phytophthora está agrupado dentro da classe dos Oomicetos que

também agrupam patógenos de insetos, crustáceos, peixes, vertebrados e vários

outros microrganismos e plantas (MARGULIS; SHWARTZ, 2000). Atualmente, por

meio de técnicas filogenéticas moleculares modernas baseadas em sequências de

RNA ribossomal (rRNA), dados de aminoácidos para proteína mitocondrial e genes

cromossomais, os oomicetos foram agrupados como a única linhagem de eucariotos

no Reino Stramenophila. Essa classificação deixa bem clara a íntima relação desses

microrganismos com algas fotossintéticas, mas nenhuma relação com fungos

verdadeiros (SOGIN; SILBERMAN, 1998; BALDAUF et al., 2003; ADL et al., 2005).

Durante muitos anos os oomicetos eram classificados no mesmo grupo dos

fungos devido à alta semelhança morfológica, no habitat, reprodução e estratégias

de infecção (DALIO, 2013). Todavia, comparado aos fungos, muitas diferenças

fazem os oomicetos estarem mais relacionados filogeneticamente a plantas do que

fungos, como por exemplo, a composição da parede celular que consiste

principalmente de celulose, enquanto que a parede celular de fungos contém

principalmente quitina.

Atualmente, as espécies de Phytophthora estão classificadas no Reino

Stramenopila, sendo que esses microrganismos produzem estruturas de resistência,

como clamidósporos, oósporos e zoósporos encistados. Essas estruturas podem

germinar e produzir esporângios ou microesporângios em condições favoráveis (alta

umidade e aeração). Os microesporângios podem germinar diretamente ou produzir

zoósporos, enquanto que os esporângios são sempre formados sobre o solo ou

superfície dos órgãos atacados (LARANJEIRA et al., 2005). O micélio desses

patógenos é cenocítico e hialino, possui parede celular composta por β-glucana e

celulose, não são capazes de sintetizar esteróis e apresentam fase vegetativa

diploide. Os zoósporos biflagelados são as estruturas oriundas da reprodução

assexual, enquanto que o esporo sexual (oósporo) é originado a partir da fusão da

79

estrutura sexual feminina (oogônio) com a masculina (anterídio) (ERWIN; RIBEIRO,

1996).

P. nicotianae é heterotálica, ou seja, necessita de tipos de compatibilidade

sexual distintas (A1 e A2) em um mesmo local. A temperatura ótima de crescimento

de P. nicotianae é de 27 a 32 °C e os esporângios dessa espécie são apicais,

papilados globosos. Os clamidósporos são formados sob condições desfavoráveis

ao crescimento micelial, ou seja, baixa disponibilidade de oxigênio, nutrientes, níveis

de CO2 altos, temperaturas entre 15 e 18 °C e desenvolvimento de raízes reduzido

ou nulo (ERWIN; RIBEIRO, 1996; FEICHTENBERGER et al.; 2005). P. plurivora é

uma espécie hemibiotrófica que ataca raízes de plantas lenhosas, particularmente F.

sylvatica (WERRES, 1995; FLEISCHMANN et al., 2005; JUNG et al., 2005). Essa

espécie é homotálica e possui anterídio e esporângios em forma de limões (DALIO,

2013). As condições adequadas para P. plurivora são solos com alta umidade e

temperaturas em torno de 10º C quando os esporângios são formados liberando

zoósporos biflagelados que são quimiotaticamente atraídos para a superfície do

hospedeiro. Após a penetração nas raízes da planta, as hifas crescem inter e

intracelularmente no tecido das raízes finas e depois de danificar as plantas, o

patógeno inicia a sua fase necrotrófica (JUNG; BURGESS, 2009; TSAO, 1990).

3.2.2 Fosfito e seus efeitos sobre patógenos de plantas

Conseguimos encontrar na literatura diversos trabalhos in vitro que

demonstram as alterações causadas pelos fosfitos sobre patógenos de plantas, em

especial para os oomicetos (DALIO et al., 2012; DERCKS; BUCHENAUER, 1987;

FENN; COFFEY, 1984; SMILIE et al., 1989). Os fosfitos são capazes de influenciar

negativamente no desenvolvimento dos fitopatógenos e sua fungitoxicidade varia

entre as espécies e depende principalmente da exposição do patógeno a estes

compostos (DALIO et al., 2012). Devido à capacidade dos fosfitos em afetar a

síntese da parede celular, esses produtos reduzem a esporulação e o crescimento

micelial dos fitopatógenos, exercendo atividade fungistática resultando na redução

de doenças (ROMA, 2013; PANICKER; GANGADHARAN, 1999; DERCKS;

BUCHNAUER, 1987; SMILIE et al., 1989; GUEST; BOMPEIX, 1990). Trabalhos

envolvendo transcriptômica revelaram que as células de patógenos expostos a

fosfitos exibem alterações na expressão de genes que codificam proteínas

envolvidas na síntese da parede celular, síntese de aminoácidos, metabolismo

80

proteico, metabolismo energético, detoxificação de toxinas e estresse oxidativo,

comprometendo a morfologia e a fisiologia do microrganismo (KING et al., 2010).

Para espécies de Phytphthora, diferentes autores relatam a influência negativa

do fosfito na produção de esporângios e zoósporos (DOLAN; COFFEY, 1998;

GUEST; GRANT, 1991; GREENHALGH et al., 1994; WILKINSON et al., 2001),

sendo que esses resultados são importantes do ponto de vista epidemiológico, pois

leva a redução do potencial de inóculo e, por consequência, redução na intensidade

da doença (DALIO et al., 2012). É provável que a inibição da esporulação aconteça

devido a influência das concentrações de fosfito sobre o crescimento micelial e/ou na

percepção/transdução de sinais, o que resulta na mudança do estado vegetativo

para o reprodutivo, como uma estratégia de sobrevivência do microrganismo

(TZORTZAKIS e EKONOMAKIS, 2007).

Durante o processo evolutivo, as plantas desenvolveram mecanismos de

defesa que as fazem aptas a reconhecer invasores e, como consequência, evitar a

colonização de patógenos em seus tecidos, utilizando diferentes estratégias, como a

produção de fitoalexinas, morte celular programada, produção de PR-proteínas,

entre outros (DALIO et al., 2014; OSSWALD, 2012). O tratamento com fosfito em

folhas de Arabidopsis thaliana desencadeou o processo de morte celular local e o

acúmulo de compostos fenólicos ao redor das células infectadas. Dessa forma, o

crescimento e a produção de esporângio por Phytophthora palmivora foi inibido

(DANIEL et al., 2006). Recentemente alguns autores relataram que o tratamento de

fosfito tem levado algumas espécies de hospedeiro ao estado de priming, que é a




ESHRAGHI et al., 2011). Portanto, é possível inferirr que o fosfito atue de duas

formas sobre o patógeno: inibindo diretamente o desenvolvimento do microrganismo

e/ou induzindo mecanismos de defesa do hospedeiro contra o fitopatógeno (DALIO

et al., 2012; JACKSON et al., 2000).

3.3 Material e métodos

Os ensaios foram conduzidos no Laboratório de Fisiologia e Bioquímica

Fitopatológica e no Núcleo de Apoio à Pesquisa em Microscopia Eletrônica aplicada

81

à Agricultura na Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, Universidade de

São Paulo (USP) em Piracicaba, SP.

3.3.1 Os isolados

O isolado de Phytophthora nicotianae foi obtido junto ao Centro de Citricultura

‘Sylvio Moreira’ APTA/IAC, o qual foi previamente identificado com o auxílio de

técnicas moleculares.

O isolado de Phytophthora plurivora foi cedido pelo grupo de pesquisa

coordenado pelo Prof. Wolfgang Osswald da Universidade Técnica de Munique

(Freising, Alemanha).

3.3.2 Fosfito de potássio

A fonte de fosfito de potássio utilizada foi o Phytogard®, o qual é produzido pela

Stoller do Brasil Ltda. O produto contém 28% de P2O5, obtido à partir de ácido

fosforoso e 26% de K2O, com densidade de 1,51 g L-1 e pH = 7.

3.3.3 Efeito do fosfito de potássio no desenvolvimento in vitro de Phytophthora

sp.

3.3.3.1 Efeito sobre o crescimento micelial

Foram utilizadas placas de poliestireno de 90 mm contendo 20 mL de meio de

cultivo. Para P. nicotianae foi elaborado meio cenoura-ágar (100g de cenoura, 20 g

de ágar e 1000 mL de água, autoclavado por 30 minutos à 121 °C e 1 atm), no qual

foi adicionado o volume necessário para obtenção das seguintes concentrações de

Phytogard®: 0; 2; 4; 6; 8; 10 mL L-1. Para P. plurivora foi utilizado o meio V8-ágar. O

meio foi obtido a partir de suco caldo de vegetais V8 autoclavado por 30 minutos à

121 °C e 1 atm, no qual foi adicionado o volume necessário para a obtenção das

concentrações 0; 0,01; 0,05; 0,1; 0,5 e 2 mL L -1 de Phytogard®.

Como controle, foram utilizadas placas contendo apenas o meio de cultivo. Foi

depositado no centro de cada placa um disco de meio (5 mm de diâmetro) contendo

o patógeno. As placas foram incubadas à 25 °C no escuro, sendo que a avaliação

consistiu de duas medições perpendiculares ao diâmetro da colônia com o auxílio de

paquímetro digital. Com os resultados obtidos, foi calculada a inibição do

crescimento micelial do patógeno, expressa em porcentagem, de acordo com a

fórmula abaixo:

82

Inibição = (Dc – Dt) / Dc x 100

Dc = diâmetro da colônia no tratamento controle

Dt = diâmetro da colônia em uma determinada concentração

À partir destes dados foi estudada uma regressão linear para determinação da

CE50, a qual representa a concentração efetiva de Phytogard® capaz de inibir em

50% o crescimento micelial do patógeno (RUSSEL, 2002). Com base nesses valores

foi possível comparar a sensibilidade dos patógenos ao fosfito de potássio.

O experimento foi instalado em delineamento inteiramente casualizado com

seis tratamentos (concentrações de fosfito) e cinco repetições, onde cada placa

correspondeu a uma repetição, totalizando 30 placas para cada fitopatógeno. O

experimento foi realizado duas vezes.

3.3.3.2 Preparo das amostras para observação em Microscópio Eletrônico de

Varredura (MEV)

Os patógenos P. nicotianae e P. plurivora foram cultivados conforme o item

3.3.3.1. Foram retirados fragmentos(5x5 mm) do meio de cultivo dos bordos das

colônias para o processamento. Os fragmentos foram submersos em solução de

Karnovsky, contendo glutaraldeído 2,5%, paraformaldeído 2,0%, tampão fosfato

0,05M, pH 7,2 por 12h. Posteriormente, os fragmentos foram imersos em tampão

cacodilato 0,05M por 10 min e em imersos novamente em tampão cacodilato 0,1M

mais solução de tetróxido de ósmio 1% na mesma proporção (KARNOVISKY, 1965

modificado) por 1h. A desidratação das amostras foi realizada em soluções de

concentrações crescentes de acetona, sendo acetona 30% e 50% por 20 min cada,

seguido de acetona 70% por 120 min, 90% por 20 min e por fim, acetona 100% 3

vezes por 20 min cada. As amostras foram levadas para secagem em ponto crítico,

utilizando o gás carbônico como meio de secagem, sendo em seguida montados em

stubs, metalizados com ouro e observados em microscópio eletrônico de varredura.

3.3.3.3 Obtenção de micélio em meio líquido

Foram transferidos cinco discos (5mm) de micélio, oriundos de colônias com 7

dias de idade de P. nicotianae e P. plurivora, para Erlenmeyers contendo 100 mL de

83

meio líquido cenoura (1000mL de água destilada em 200g de cenoura batidos no

liquidificador) e V8 (900 mL de água destilada em 100mL de suco de vegetais V8 e

3g de CaCO3), respectivamente.

O material foi mantido sob agitação constante por 6 dias à 80 rpm e

temperaturas de 28º e 22º C no escuro para P. nicotianae e P. plurivora,

respectivamente.

3.3.3.4 Efeito sobre a produção de massa fresca de micélio

O ensaio foi instalado segundo o item 3.3.3.3. Antes da adição dos discos de

micélio com os patógenos, foram pipetados volumes para a obtenção das

concentrações de 0; 0,5; 2 e 5 mL L-1 de Phytogard® no meio cenoura líquido para o

ensaio com P. nicotianae e das concentrações de 0; 0,5; 1 e 2 mL L-1 no meio V8

líquido para o ensaio com P. plurivora.

Ao fim do experimento, o micélio de ambos os patógenos foi separado do meio

líquido com auxílio de bomba a vácuo e papel filtro Whatman® 40 e, as massas (g)

mensuradas com auxílio de balança analítica.

O ensaio foi instalado em delineamento inteiramente casualizado com quatro

tratamentos (concentrações de fosfito) e cinco repetições, onde cada Erlenmeyer

correspondeu a uma repetição, totalizando 20 Erlenmeyers. O experimento foi

realizado duas vezes.

3.3.3.5 Efeito sobre a produção de zoósporos

Em placas de poliestireno de 90 mm foram depositados 10 discos de micélio de

P. nicotianae, juntamente com 20 mL de meio líquido de cenoura pobre autoclavado

contendo Phytogard® nas concentrações finais de 0; 0,5; 2 e 5 mL L-1, onde

permaneceram por 72h em câmara tipo BOD a 25º C e luz contínua. Posteriormente,

o meio de cenoura foi substituído por 10 mL de água destilada esterilizada contendo

as mesmas concentrações de Phytogard®, onde permaneceram por mais 48h. Em

seguida, a água foi coletada das placas e procedeu-se a observação da formação de

esporângios e contagem do número de zoósporos com auxílio de câmara de

Neubauer e microscópio de luz. Foram considerados mortos os zoósporos que não

se moviam durante o período da avaliação.

O ensaio foi instalado em delineamento inteiramente casualizado com quatro

tratamentos (concentrações de fosfito) e cinco repetições onde cada placa

84

correspondeu a uma repetição, totalizando 20 placas. Cada placa foi submetida a

contagem de zoósporos por duas vezes. O experimento foi realizado duas vezes.

3.3.4 Estudos dos mecanismos de ação do fosfito de potássio sobre o micélio

de Phytophthora sp.

3.3.4.1 Perda de eletrólitos

O micélio de ambos os patógenos foi obtido conforme o item 3.3.3.3, com

adição das concentrações de fosfito conforme o item 3.3.3.4. Para assegurar a

remoção do produto aplicado no micélio coletado, o mesmo foi lavado com 150 mL

de água destilada durante o processo de separação do micélio e o meio líquido.

Posteriormente, o micélio foi pesado e transferido para copos plásticos (110 mL)

contendo 20 mL de solução de sacarose 0,2 M. Decorrido 60 min, as soluções foram

transferidas para tubos de ensaio e realizada a leitura da condutividade elétrica das

soluções com auxílio de condutivímetro (HI 9043, Hanna Istruments), com o objetivo

de detectar a perda de eletrólitos por parte do micélio.


cinco repetições (concentrações de fosfito), onde cada Erlenmeyer constituiu uma

repetição, totalizando 20 Erlenmeyers. Os resultados foram expressos em mS.g

micélio-1. O experimento foi realizado duas vezes.

Para avaliação da perda de eletrólitos ao longo do tempo, após a obtenção do

micélio conforme o item 3.3.3.3, o mesmo foi filtrado e transferido para copos

plásticos (100 mL), contendo 25 mL de solução de sacarose 0,2 M. Os tratamentos

utilizados foram: 1) tratamento controle: o micélio do patógeno foi transferido para

solução de sacarose 0,2 M e submetido à maceração com auxílio de bastão de

vidro, levando a ruptura física da membrana do mesmo, alterando sua

permeabilidade; 2) tratamento com fosfito de potássio 0 mL L-1: o micélio do

patógeno foi transferido para solução de sacarose 0,2 M; 3) tratamento com fosfito

de potássio: o micélio do patógeno foi transferido para solução de sacarose

acrescida de Phytogard® nas concentração de 2 e 1 mL L-1 para P. nicotianae e P.

plurivora, respectivamente. Decorridos 0, 5, 10, 20, 30 e 60 minutos, as soluções

foram transferidas para tubos de ensaio e realizada a leitura da condutividade

elétrica das soluções com auxílio de condutivímetro, com o objetivo de detectar a

perda de eletrólitos por parte do micélio no decorrer do tempo.

85


três repetições (concentração de fosfito, controle e micélio macerado), onde cada

copo plástico constituiu uma repetição, totalizando 20 copos. Os resultados foram

expressos em mS.g micélio-1. O experimento foi realizado duas vezes.

3.3.4.2 Peroxidação de lipídios

Para a avaliação de possíveis alterações nos lipídios constituintes da

membrana plasmática das células dos patógenos, a avaliação da peroxidação

lipídica foi realizada conforme o método proposto por Heath & Packer (1968) e

Cakmak & Host (1991). Para tanto, o micélio obtido de acordo com o item 3.3.3.3 foi

macerado em nitrogênio líquido, com auxílio de cadinho e pistilo e, em seguida,

adicionado10% de polivinilpolipirrolidona (PVPP) e 1,3 mL de ácido tricloroacético

(TCA) 0,1% à 0,3 g de micélio. O macerado foi centrifugado à 10000 g por 15

minutos a 4º C e, em seguida, 250 μL do sobrenadante foram transferidos para

tubos de vidro contendo 1 mL de solução recém preparada de TCA 20% acrescida

de ácido tiobarbitúrico (TBA) 0,5%. O branco da reação foi constituído de 1 mL da

solução de TCA 20% + TBA (0,5%) e 250 μL de TCA 0,1%. O material permaneceu

em banho-maria à 95 °C por 30 minutos, com posterior paralisação da reação em

banho de gelo por 15 minutos. Em seguida, o volume da reação foi transferido para

tubos plásticos para centrifugação à 10000 g por 15 minutos. Após a centrifugação,

as leituras dos sobrenadantes foram realizadas em espectrofotômetro à 535 e 600

nm e a concentração de malonaldeído (MDA) foi determinada pela seguinte fórmula:

ABS = B x C, onde

B = coeficiente de extinção molar, o qual equivale à 155 mM-1 cm-1 para o MDA

C = concentração

Assim:

C = ABS (535-600)/B = mM MDA

Portanto,

86

MDA = {{[ABS/155)x2]x(1700/500)}/MF}x1000, onde

MF = massa fresca


cinco repetições (concentrações de fosfito), onde cada Erlenmeyer constituiu uma

repetição, totalizando 20 Erlenmeyers. Os dados foram expressos em nmol MDA g

micélio fresco-1. O experimento foi realizado duas vezes.

3.3.4.3 Síntese de proteínas

A extração das proteínas solúveis foi efetuada à partir da maceração do micélio

obtido de acordo com o item 3.3.3.4 na presença de nitrogênio líquido, seguido pela

adição de tampão fosfato de potássio 100 mM (pH 7,5) contendo 1 mM de EDTA, na

proporção de 3 mL de tampão para cada 1g de micélio fresco. O material foi

centrifugado a 4 ºC durante 45 min a 15000 g, sendo o sobrenadante considerado o

extrato proteico que foi armazenado a -20º C para verificação da atividade da β-1,3

glucanase.

Utilizou-se o reagente Protein Assay (BioRAD®), diluido cinco vezes, para a

determinação de proteínas totais, de acordo com o método de Bradford (1976). Para

cada amostra foram utilizados 1000 μL da solução do reagente preparada e 20 μL

do extrato proteico diluído sete vezes. A curva padrão foi determinada utilizando-se

albumina de soro bovino (ASB).


quatro tratamentos (concentrações de fosfito) e cinco repetições, onde cada

Erlenmeyer constituiu uma repetição, totalizando 20 Erlenmeyers. Os dados foram

expressos em mg de proteína g micélio fresco-1. O experimento foi realizado duas

vezes.

3.3.4.4 Atividade da β-1,3 glucanase

Para se avaliar o efeito do fosfito sobre a síntese de parede celular dos

patógenos, a qual possui β-glucana em sua composição dentre outros polímeros, foi

determinada a atividade de β-1,3-glucanase. O substrato utilizado foi laminarina, um

polissacarídeo obtido da alga Laminaria digitata, o qual reage com a enzima e libera

moléculas de glicose.

87

Utilizou-se o ácido 3,5-dinitrosalicílico (ADNS) (MILLER, 1989) para

quantificação de açúcares redutores. A reação foi preparada com 150 μL de

laminarina (4 mg mL-1) dissolvida em tampão acetato de sódio 100 mM (pH 5,0) e

100 μL do extrato proteico. Ao branco da reação foi adicionado apenas laminarina e,

ainda, para cada amostra avaliada, também foi preparada uma reação controle

composta de laminarina, extrato da amostra e reagente ADNS (ABELES; FOENCE,

1970). As amostras foram constituídas do extrato proteico obtido no item 3.3.4.3.

Após a incubação por 2 horas à 40º C, a reação foi paralisada com a adição de

125 μL de ADNS, sendo a reação, em seguida, aquecida por 5 minutos em banho

maria a 95º C. Em seguida, a reação foi resfriada em banho de gelo e, ao volume da

reação foram adicionados 1125 μL de água destilada. Após homogeneização, a

leitura foi realizada em espectrofotômetro à 540 nm.

A atividade enzimática foi expressa em mg de glicose liberada h-1 mg proteína-

1, com base em curva padrão de glicose. O experimento foi realizado duas vezes.

3.4 Resultados

3.4.1 Efeito do fosfito de potássio no desenvolvimento in vitro de Phytophthora

sp.

3.4.1.1 Crescimento micelial, produção de massa fresca de micélio e produção

de zoósporos de Phytophthora sp.

Foi possível observar expressiva redução do crescimento micelial dos

patógenos P. nicotianae e P. plurivora em concentrações crescentes de fosfito de

potássio (Figura 1). O patógeno P. nicotianae teve seu crescimento inibido em 50%

(EC50) na concentração de Phytogard® 1,9 mL L-1, enquanto que para P. plurivora

essa inibição foi alcançada na concentração de 0,6 mL L-1. Nessas condições, P.

plurivora mostrou-se ser cerca de 3 vezes mais sensível do que P. nicotianae a

Phytogard® (Tabela 1).

88

Figura 1 - Inibição do crescimento micelial de Phytophthora nicotianae (A) e Phytophthora plurivora (B), a 25º C em diferentes concentrações de Phytogard

® (fosfito de potássio: P2O5 = 28%;

K2O = 26%). A avaliação ocorreu no dia em que as colônias submetidas a concentração 0 mL/L

-1 atingiram os bordos das placas. As barras representam o erro padrão da média (n =

5)

Ambos os patógenos tiveram os valores de massa fresca de micélio reduzida à

medida que se aumentou a concentração de Phytogard®, sendo que os valores de

todas as concentrações avaliadas diferiram estatisticamente do controle (0 mL L-1)

(Figura 2). O patógeno P. nicotianae teve sua produção de massa fresca cerca de

3,5 vezes menor do que na concentração 5 mL L-1 de Phytogard® quando

comparado a concentração 0 mL L-1. Já P. plurivora também teve valores de massa

fresca na concentração de 2 mL L-1 de Phytogard® cerca de 2,8 vezes menor

comparada a concentração 0 mL L-1. Esse resultado também é ilustrado na Figura 3,

onde o micélio dos patógenos cresceu menos e apresentou aspecto diferente

quando comparado ao controle.

Tabela 1 - Valores de EC50 para Phytophthora plurivora e Phytophthora nicotianae submetidos a concentrações crescentes de Phytogard

® (fosfito de potássio: P2O5 = 28%; K2O = 26%)

Patógeno EC50 (mL/L-1)

P. nicotianae 1,9

P. plurivora 0,6

A B

89

Figura 2 – Efeito de diferentes concentrações de Phytogard


26%) sobre a produção de micélio de Phytophthora nicotianae (A) e Phytophthora plurivora (B) cultivados em meio cenoura e V8 líquidos, respectivamente, após seis dias de incubação. Colunas seguidas da mesma letra, não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. As barras indicam o erro padrão da média (n=5)

A B

A

90

0 mL/L

-1 0,5 mL/L

-1 2 mL/L

-1 5 mL/L

-1

0 mL/L

-1 0,5 mL/L

-1 1 mL/L

-1 2 mL/L

-1

Figura 3 - Influência de diferentes concentrações de Phytogard® (fosfito de potássio: P2O5 = 28%;

K2O = 26%) sobre a produção de micélio de Phytophthora nicotianae (A) e Phytophthora plurivora (B) cultivados em meio cenoura e V8 líquidos, respectivamente, após seis dias de incubação

O Phytogard® inibiu a produção de zoósporos por P. nicotianae e P. plurivora

em todas as concentrações avaliadas quando comparadas ao controle (0 mL L-1).

Em todos esses tratamentos, com exceção do controle, os zoósporos encontrados

estavam mortos (Figuras 4A e B).

B

A

91

Figura 4 - Influência de diferentes concentrações de Phytogard® (fosfito de potássio: P2O5 = 28%;

K2O = 26%) sobre a produção de zoósporos de Phytophthora nicotianae (A) e Phytophthora plurivora (B).Colunas seguidas da mesma letra, não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. As barras indicam o erro padrão da média (n=5)

3.4.1.2 Microscopia eletrônica de varredura

Foi possível observar modificações nas hifas tanto de P. nicotianae (Figuras

5B, C e D) quanto de P. plurivora (Figuras 6B, C e D) quando cultivadas em

concentrações crescentes de Phytogard®. Houve alterações na morfologia das hifas

sendo essas mais finas e com maiores números de ramificações, as quais são

menores e atrofiadas, quando comparadas ao micélio cultivado sem o fosfito de

potássio (Figuras 5A e 6 A).

A B

92

Figura 5 - Microscopia eletrônica de varredura. Micélio de Phytophthora nicotianae cultivado em meio cenoura-ágar nas concentrações de 0 mL L

-1 (A), 0,5 mL L

-1 (B), 2 mL L

-1 (C), 5 mL L

-1 (D) de

Phytogard® (fosfito de potássio: P2O5 = 28%; K2O = 26%) após cinco dias. Setas indicam

diferenças na morfologia das hifasdo micélio tratado ou não com fosfito. Barras = 21,37 μm (A); 18,75 μm (B); 16,65 μm (C) e 37,5 μm (D)

A B

C D

93

Figura 6 - Microscopia eletrônica de varredura. Micélio de Phytophthora plurivora cultivado em meio cenoura-ágar nas concentrações de 0 mL L

-1 (A), 0,5 mL L

-1 (B), 1 mL L

-1 (C), 2 mL

L-1

(D) de Phytogard

® (fosfito de potássio: P2O5 = 28%; K2O = 26%) após cinco dias.

Setas indicam diferenças na morfologia das hifas do micélio tratado ou não com fosfito. Barras = 15 μm (A); 18,75 μm (B, C) e 25 μm (D)

3.4.2 Estudo dos mecanismos de ação do fosfito de potássio sobre o micélio

de Phytophthora sp.

3.4.2.1 Efeito sobre a permeabilidade de membrana

3.4.2.1.1 Perda de eletrólitos

Foi observada diferença significativa entre os tratamentos frente à perda de

eletrólitos por parte do micélio de P. nicotianae e P. plurivora quando cultivados em

meio acrescido de fosfito de potássio emrelação ao controle (0 mL L-1) (Figura 5).

Observou-se, neste ensaio, que para P. nicotianae a condutividade elétrica média foi

de 12, 28, 33, e 79 μS cm-1 g micélio fresco-1, a qual foi obtida junto ao micélio do

A B

C D

94

patógeno cultivado nas concentrações de 0; 0,5; 2 e 5 mL L-1 de Phytogard®. Para P.

plurivora os valores foram de 99, 137, 145, e 214 μS cm-1 g micélio fresco-1, obtidos

junto ao micélio do patógeno cultivado nas concentrações de 0; 0,5; 1 e 2 mL L-1 do

produto. Mais uma vez, o micélio de P. plurivora se mostrou mais sensível quando

comparado a P. nicotianae, pois apresentou valores superiores de condutividade

elétrica.

Figura 7 - Efeito de diferentes concentrações de Phytogard® (fosfito de potássio: P2O5 = 28%; K2O =

26%) sobre a perda de eletrólitos por parte do micélio de Phytophthora nicotianae (A) e Phytophthora plurivora (B) cultivados em meio cenoura e V8 líquidos, respectivamente, após 6 dias de incubação. Os dados são expressos em micro-Siemens cm

-1 g micélio

fresco-1

(mS cm-1

g micélio fresco-1

) em função das diferenças na condutividade na solução de sacarose, onde o micélio foi imerso por 60 minutos. Colunas seguidas da mesma letra, não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. As barras indicam o erro padrão da média (n=5)

Foi avaliada também a perda de eletrólitos ao longo do tempo por parte do

micélio de P. nicotianae e P. plurivora na presença de solução de sacarose contendo

Phytogard® na concentração de 2 mL L-1 (Figura 8). Houve diferença estatística entre

os tratamentos para os valores de condutividade do micélio de P. nicotianae aos 60

minutos. Para ambos os patógenos, os valores de condutividade foram aumentando

ao longo do tempo, sendo que, o micélio exposto ao fosfito de potássio apresentou

valores superiores ao do controle que, por sua vez, consistiu de micélio rompido

mecanicamente. Não houve variação na condutividade a partir dos 20 e 30 minutos

para P. nicotianae e P. plurivora, respectivamente (Figura 8).

A B

95

Figura 8 - Efeito da concentração de 2 mL L

-1de Phytogard


26%) sobre a perda de eletrólitos por parte do micélio de Phytophthora nicotianae (A) e Phytophthora plurivora (B) cultivados em meio cenoura e V8 líquidos, respectivamente, após seis dias de incubação. Os dados são expressos em micro-Siemens cm

-1 g micélio

fresco-1

(mS cm-1

g micélio fresco-1

) em função das diferenças na condutividade na solução de sacarose, onde o micélio foi imerso, ao longo do tempo. O micélio de todos os tratamentos foi cultivado na ausência de fosfito, sendo que as concentrações de fosfito de 0 e 2 mL L

-1 foram obtidas na solução de sacarose, e o controle representa micélio

transferido para solução de sacarose e macerado com bastão de vidro. Linhas seguidas da mesma letra, não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade de avaliação. As barras indicam o erro padrão da média (n=5)

3.4.2.1.2 Peroxidação de lipídios

A peroxidação de lipídios foi determinada com o objetivo de se avaliar o efeito

do fosfito sobre os lipídios constituintes da membrana plasmática de P. nicotianae e

P. plurivora. O principal produto da reação entre o ácido tiobarbitúrico e os ácidos

graxos poli-insaturados oxidados é o malonaldeído, o que permite inferir

indiretamente sobre a integridade da membrana plasmática. Não foram observadas

diferenças significativas nas concentrações de malonaldeído no micélio dos

patógenos nas concentrações de Phytogard® utilizadas (Figura 9).

A B

96

Figura 9 - Efeito de diferentes concentrações de Phytogard


26%) sobre a peroxidação de lipídios em micélio de Phytophthora nicotianae (A) e Phytophthora plurivora (B) cultivados em meio cenoura e V8 líquidos, respectivamente, após seis dias de incubação. Colunas seguidas da mesma letra, não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. As barras indicam o erro padrão da média (n=5)

3.4.2.2 Efeito sobre a síntese de proteínas

Nesse ensaio, não foram verificadas diferenças significativas nas

concentrações de proteínas no micélio dos patógenos em resposta as diferentes

concentrações de fosfito de potássio (Figura 10). Entretanto, para P. nicotianae, a

síntese de proteínas do micélio cultivado em concentração 5 mL L-1 de Phytogard®

foi maior quando comparado ao controle. Para P. plurivora, a concentração de

Phytogard® que proporcionou maior síntese proteica foi a de 1 mL L-1.

Figura 10 - Efeito de diferentes concentrações de Phytogard®

(fosfito de potássio: P2O5 = 28%; K2O = 26%) sobre a síntese de proteínas no micélio de Phytophthora nicotianae (A) e Phytophthora plurivora (B) cultivados em meio cenoura e V8 líquidos respectivamente, após seis dias de incubação. Colunas seguidas da mesma letra, não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. As barras indicam o erro padrão da média (n=5)

A B

B A

97

3.4.2.3 Efeito do fosfito sobre a síntese da parede celular

3.4.2.3.1 Efeito sobre a atividade de β-1,3-glucanase

Observa-se na Figura 11, decréscimo na atividade de β-1,3-glucanase à

medida que as concentrações de Phytogard® aumentaram para ambos os

patógenos, com exceção para a concentração de 0,5 mL L-1. Para P. nicotiane, a

concentração de 5 mL L-1 de fosfito de potássio interferiu negativamente na atividade

da β-1,3-glucanase que apresentou valores estatisticamente menores quando

comparados a concentração de 0 mL L-1. Por sua vez, com relação à P. plurivora, a

concentração de 2 mL L-1 de Phytogard® reduziu a atividade dessa enzima, a qual

apresentou valor significativamente menor quando comparado a concentração 0 mL

L-1.

Figura 11 - Atividade de β-1,3-glucanase em micélio de Phytophthora nicotianae (A) e Phytophthora

plurivora (B), cultivado em meio contendo diferentes concentrações de Phytogard® (fosfito de potássio: P2O5 = 28%; K2O = 26%), após seis dias de incubação. Colunas seguidas da mesma letra, não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. As barras indicam o erro padrão da média (n=5)

3.5 Discussão

O estudo dos mecanismos de ação dos fosfitos pode oferecer aos

fitopatologistas uma ferramenta para se estudar as interações planta-patógeno e

com isso lançar mão de métodos de controle (GUEST E GRANT, 1991). Ensaios in

vitro têm demonstrado que os fosfitos causam alterações no crescimento e

reprodução de fitopatógenos e a fungitoxicidade pode variar de acordo com a

espécie do patógeno e também da exposição do microrganismo a estes compostos

(DALIO et al., 2012). Os resultados desse trabalho revelam que há ação direta do

A B

98

Phytogard® no crescimento micelial e produção de zoósporos por P. nicotianae e P.

plurivora.

Houve redução no crescimento micelial de P. nicotianae à medida que se

aumentou a concentração de Phytogard®, tanto em meio sólido quanto em meio

líquido. Segundo King e colaboradores (2010), o tratamento in vitro de P. cinnamomi

com fosfito resultou na inibição de 68,6% do crescimento micelial do patógeno.

Semelhante aos resultados do presente trabalho, o patógeno P. plurivora teve

seu crescimento micelial inibido à medida que se aumentou a dose de fosfito,

alcançando valores de até 65% de inibição na dose de 100 mg/mL (DALIO et al.,

2014). Quando P. plurivora cresceu em meio de cultivo contendo 2 mL/L-1 de

Phytogard®, o patógeno teve seu crescimento inibido em 100%. Esses resultados

também foram observados quando o patógeno foi cultivado em meio líquido

contendo o fosfito de potássio onde a produção de massa fresca de micélio diminuiu

à medida que se aumentou a concentração do produto (Figura 2B). Além disso,

pode ser observado na Figura 3B, que o micélio de P. nicotianae exibiu aspecto

totalmente diferente quando exposto principalmente à concentração de 2 mL/L -1 de

Phytogard® quando comparado a dose 0 mL/L-1. A tendência do micélio de

Phytophthora e de outros patógenos em meio de cultura líquido é crescer em

formato esférico. Entretanto, com a adição de fosfito de potássio, esse crescimento

não foi esférico, sendo irregular e fazendo com que o meio de cultivo ficasse com

aspecto turvo.

De acordo com Pilbeam (2003), para espécies de Phytophthora, os valores de

EC50 referentes à inibição de crescimento micelial podem variar de 1,3 a 244 µg mL-1

de fosfito. No presente trabalho, P. nicotianae teve seu valor de EC50 em torno de 1,9

mL L-1 de Phytogard®, enquanto que para P. plurivora essa inibição foi alcançada na

concentração de 0,6 mL L-1. Nessas condições, P. plurivora mostrou-se ser cerca de

3 vezes mais sensível que P. nicotianae ao Phytogard® (Tabela 1). O valor de EC50

para P. plurivora encontrado nesse trabalho é correspondente ao valor de 32,4 mg

mL-1, valor próximo ao relatado por Dalio et al. (2014), que foi de 34 mg L-1.

O fosfito também inibe a reprodução de Phytophtora (PILBEAM, 2003; DALIO,

2014; COFFEY; JOSEPH, 1985). Essa afirmação pôde ser comprovada nesse

trabalho, pois a partir da concentração de 0,5 mL L-1 de Phytogard®, ambos os

patógenos tiveram a produção de zoósporos inibida, além do que, os zoósporos

encontrados estavam mortos (Figura 4). Segundo Guest e Grant (1991), a inibição

99

do crescimento e da esporulação dos patógenos aos fosfitos se deve a ação

fungistática devido à ação direta desse composto. Estudando o efeito de diferentes

sais sobre o crescimento micelial, esporulação e germinação de esporos de

diferentes patógenos, Mills e colaboradores (2004) verificaram que o ácido fosfônico

reduziu drasticamente o crescimento micelial de Phytophthora erythroseptica e

Phytophthora infestans, e a esporulação e a germinação de P. infestans. Esses

autores concluíram que existem vários outros sais que possuem efeito fungistático

para diferentes patógenos, os quais podem ser utilizados para implementação de um

manejo integrado e sustentável de doenças de plantas.

Foi observado no presente trabalho o efeito direto do fosfito de potássio sobre

P. nicotianae e P. plurivora quando avaliou-sea perda de eletrólitos do micélio de

ambos os patógenos quando expostos a esse produto. Houve elevada perda de

eletrólitos pelo micélio de ambos os patógenos quando, cultivados por seis dias em

concentrações crescentes de Phytogard®. Observou-se perda de eletrólitos cerca de

quatro vezes maior do micélio de P. nicotianae quando cultivado em meio contendo

Phytogard® na concentração de 5 mL L-1 quando comparado à dose 0 mL L-1.

Semelhante a esses resultados, o micélio de P. plurivora também apresentou perda

de eletrólitos de 99 μS cm-1 g micélio fresco-1 quando cultivado em concentração de

0 mL L-1 do produto, enquanto que para o micélio cultivado em concentração de 2

mL L-1 esse valor foi de 214 μS cm-1 g micélio fresco-1. Mais uma vez, é possível

constatar a maior sensibilidade de P. plurivora ao Phytogard® quando comparada à

P. nicotianae.

Quanto à perda de eletrólitos ao longo do tempo, é possível observar que para

ambos os patógenos, os valores de condutividade foram aumentando ao longo do

tempo sendo que, o micélio exposto ao fosfito de potássio apresentou valores

superiores ao do controle que, por sua vez, consistiu de micélio rompido

mecanicamente. Não houve variação na condutividade a partir dos 20 e 30 minutos

para P. nicotianae e P. plurivora, respectivamente (Figura 6), indicando o maior

efeito direto do produto nos primeiros momentos de exposição ao mesmo. Dercks e

Buchenauer (1987) observaram que o micélio de diferentes espécies de

Phytophthora quando exposto ao fungicida à base de fosfito, Fosetyl-Al, aumentou o

efluxo de íons à medida que se aumentou a dose e o tempo de exposição ao

fungicida. Walters e Bingham (2007) relataram que os fosfatos podem sequestrar o

Ca apoplástico e com isso alterar a integridade da membrana celular afetando a

100

atividade de enzimas, como as poligaracturonases, sendo que nesse caso,

eliciadores poderiam ser liberados a partir da parede celular do patógeno.

Além da inibição do crescimento micelial, King e colaboradores (2010)

observaram o efeito adverso na morfologia da hifa do oomiceto relatando distorções

e lise das paredes e a produção de ramificações atrofiadas dessas hifas quando

comparadas ao micélio crescido em meio sem fosfito. Foram observadas mudanças

morfológicas severas no micélio de Phytophthora cactorum e Phytophthora capsici

em função do tratamento com o fungicida Fosetyl-Al. O micélio dos patógenos

crescidos em meio de cultivo contendo o fungicida apresentou-se atrofiado e

desorganizado, as hifas se mostraram mais grossas e com ramificações anormais

quando comparadas ao micélio dos patógenos não tratados com o fungicida

(DERCKS; BUCHENAUER, 1987). Resultados semelhantes foram encontrados

nesse trabalho, onde observando-se as Figuras 5 e 6, é possível verificar

modificações morfológicas das hifas de P. nicotianae e P. plurivora, principalmente

ramificações atrofiadas e a parede das hifas enrugadas quando cultivados em

crescentes concentrações de Phytogard®. Dessa forma, esses resultados

corroboram com os demais encontrados no presente estudo, onde a inibição do

crescimento micelial e a modificação da morfologia das hifas mostram-se como

consequências da ação direta do Phytogard® sobre os patógenos, como o aumento

da perda de eletrólitos do micélio dos patógenos.

Em função dos resultados do presente trabalho, o qual indicou a alteração da

permeabilidade da membrana do patógeno cultivado na presença de fosfito de

potássio, foi determinado o efeito do fosfito sobre a peroxidação de lipídios da

membrana. Esta análise permite inferir sobre a ação de radicais livres decorrentes

do estresse causado pelo fosfito ao microrganismo, o que pode conduzir à alteração

na permeabilidade da membrana (FARMER; MUELLER, 2013). A avaliação indireta

da peroxidação de lipídios por meio da determinação do malonaldeido não

evidenciou diferença entre os tratamentos, demonstrando que a elevada perda de

eletrólitos não deve ser incitada pela alteração nos lipídios da membrana (Figura 9).

Niere e colaboradores (1990) mostraram que fosfonatos reduziram o comprimento

de polifosfatos e a quantidade de triagliceróis presentes em P. palmivora, mas não

observou efeito na quantidade de fosfolipídios presentes. Existem relatos a respeito

da ausência do efeito de fosfonados sobre o metabolismo de fosfolipídios em

oomicetos em vários trabalhos na literatura (CREAMER; BOSTOCK, 1986;

101

HENDRIX; ROUSER, 1976; WASSEF; HENDRIX, 1977). Diferentes desses

resultados, quando Phytophthora capsici e P. palmivora foram tratados com

concentrações sub-inibitórias de fosfonatos, mudanças significativas nos lipídios do

micélio foram observadas (SOULIÉ et al., 1989; DUNSTAN et al., 1990; GUEST;

GRANT, 1991). Portanto, é possível supor que os diferentes resultados sejam

consequência da utilização de diferentes técnicas de detecção de lipídios, e que haja

necessidade de uma investigação minuciosa da membrana para concluir se há

redução dos lipídios da mesma ou se a alteração da permeabilidade seja

consequência de outros eventos.

Segundo Guest e Grant (1991), existe uma variedade de moléculas de

polissacarídeos e glicoproteínas que são produzidos na superfície de espécies de

Phytophothora crescidas em ágar, sendo que essas moléculas são reduzidas na

presença de fosfonatos. Essas trocas no metabolismo, observadas quando não há

inibição do crescimento micelial, sugerem que os fosfonatos podem exercer efeito

nos mecanismos de reconhecimento do hospedeiro inibindo a atividade de

supressores e aumentando a produção ou atividade de eliciadores pelo patógeno

(KING et al., 2010).

Nesse trabalho, não foram verificadas diferenças significativas nas

concentrações de proteínas totais do micélio dos patógenos em resposta as

diferentes concentrações de fosfito de potássio (Figura 10). Entretanto, para P.

nicotianae, a síntese de proteínas do micélio cultivado em concentração 5 mL L-1 de

Phytogard® foi maior quando comparado ao controle. Para P. plurivora, a

concentração de Phytogard® que proporcionou maior síntese proteica foi a de 1 mL

L-1. Embora não haja diferença significativa, as maiores concentrações de fosfito de

potássio foram capazes de inibir o crescimento dos patógenos contribuindo para as

mudanças morfológicas das hifas. Portanto, é possível que o método de detecção do

teor de proteínas totais utilizado nesse trabalho não tenha sido eficiente para

quantificar a produção de proteínas específicas relacionadas ao crescimento desses

oomicetos. King e colaboradores (2010) verificaram que a toxicidade do fosfito às

células de Phytophthora resultou em diferenças no crescimento e morfologia das

hifas. Essas mudanças podem ser atribuídas à alterações na transcrição de vários

genes putativos, como os que codificam proteínas envolvidas na biossíntese dos

componentes da parede celular, síntese de aminoácidos, metabolismo de proteínas,

102

formação e tráfico de vesículas, metabolismo energético, desintoxicação e estresse

oxidativo.

Uma das principais características dos oomicetos é a presença de parede

celular constituída por glucanas (β-1,3, e β-1,6 glucanas) e celulose e não por

quitina, polímero de N-acetil glucosamina encontrada na parede celular de fungos

verdadeiros (ALEXOPOULOS; MIMS; BLACKWELL, 1996). Em função dessa

característica, umas das etapas para se estudar possíveis mecanismos de ação do

Phytogard® procurou descobrir se há interferência desse produto na degradação das

β-1,3, glucanas. Houve redução da atividade da enzima β-1,3, glucanase a medida

que se aumentou as concentrações de fosfito de potássio no meio de cultivo para o

crescimento de P. nicotianae e P. plurivora. Em função desses resultados, podemos

inferir que quanto maior a concentração de fosfito, provavelmente menor é a

produção de β-1,3, glucanas produzidas pelo micélio dos patógenos, indicando que

o Phytogard® pode estar associado à inibição da produção desse componente de

parede. Resultados semelhantes foram relatados por Roma (2013) que estudou

possíveis mecanismos de ação do Phytogard® sobre Rhizopus stolonifer. Quanto

maior a dose do produto, menor era a atividade da β-1,3, glucanase. Embora esse

seja um fungo verdadeiro, esse patógeno também possui β-1,3, glucanas como

componente da parede celular de suas hifas. Da mesma forma, em decorrência das

alterações geradas por agentes perturbadores da parede celular, há a indução da

produção de enzimas relacionadas à síntese de parede, de forma a compensar o

dano ocorrido na busca da manutenção da integridade da mesma (ADAMS, 2004;

LENARDON; MUNRO; GOW, 2010). Isto ocorre em microrganismos que tratados

com um ingrediente ativo da classe das equinocandinas, o qual é utilizado com

antifúngico para tratamento em humanos (LEONARDON; MUNRO; GOW, 2010).

A redução do crescimento micelial, as alterações morfológicas observadas nas

hifas, a maior perda de eletrólitos e o efeito negativo na síntese de parede

proporcionado pelo fosfito sobre os patógenos cultivado na presença do produto,

podem ser correlacionados a atuação do fosfito em alvos como a membrana e a

parede celular. Entretanto, outros ensaios devem ser conduzidos para maior

compreensão da atuação deste ingrediente ativo (ROMA, 2013). Estudos com

Phytophthora citrophthora demonstraram que uma concentração capaz de inibir

apenas 20% do crescimento micelial gerou alterações na síntese de DNA

(BARCHIETTO et al. 1992). Considerando que os produtos à base de fosfitos são

103

considerados pelo FRAC como produtos com modo de ação indefinido, os

resultados desse trabalho poderão contribuir para a classificação dos fosfitos em um

determinado grupo de fungicidas e, assim, colaborar no seu uso com segurança no

manejo de doenças de plantas (ROMA, 2013).

3.6 Conclusões

De acordo com os resultados obtidos neste trabalho, o produto Phytogard®, à

base de fosfito de potássio, inibe o crescimento micelial e produção de zoósporos

por Phytophthora nicotianae e Phytophthora plurivora. Além disso, o produto

modifica a morfologia das hifas, atua na permeabilidade de membrana e na síntese

de parede celular do micélio dos patógenos.

Não houve alteração na síntese de proteínas e na peroxidação de lipídios da

membrana dos patógenos tratados com o fosfito de potássio, indicando que existem

outros possíveis mecanismos de ação atuantes nesse processo.

104

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RICARDO DE NARDI FONOFF - USP · Aos amigos do GOU Água Viva (Grupo de Oração Universitário)...

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