Riassunti Weaver

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    13-Aug-2015
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riassunti biologia

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CAPITOLO 2 NATURA MOLECOLARE DEI GENI NATURA DEL MATERIALE GENETICO Il DNA costituito da basi azotate puriniche ( A/G) e pirimidiniche (C/T),acido fosforico e dallo zucchero deossiribosio;nellRNA si trova lo zucchero ribosio e lU al posto della timina. Un nucleoside composto da una base e uno zucchero( in RNA e DNA) e un nucleotide rappresenta lunione di pi nucleotidi tramite legami fosfodiesteri tra acido fosforico e posizioni 3 e 5 degli zuccheri,mentre la base si lega in posizione 1 dello zucchero. Una catena di DNA polare poich presenta nella parte alta un gruppo fosfato 5 e nella parte bassa un gruppo ossidrilico 3. STRUTTURA DEL DNA Chargaff decret che la quantit di adenine e timine fosse identica cosi come quello di G e C,e che il numero di pirimidine fosse quasi lo stesso delle purine. Nella determinazione della struttura fu rilevante la diffrazione ai raggi X: da una soluzione concentrata di DNA si traeva,con un ago,una fibra costituita da un insieme di molecole di DNA affiancate longitudinalmente a causa della trazione a cui erano sottoposte. Tale fibra si comporta come un cristallo diffrangendo i raggi X ad una determinata umidit. Una molecola complessa ( proteina) genera un profilo di diffrazione costituito da molte macchie;una struttura semplice invece ha un profilo costituito da puntini disposti a forma di X,evidenziabili nellanalisi del DNA solo se costituiti da una struttura semplice,ripetuta e allungata,quale pu essere lalfa-elica. Il DNA una doppia elica con gruppi zucchero-fosfato allesterno e basi allinterno,con appaiamento pur-pir;la distanza fra le coppie di basi adiacenti di 3.32 A,e la distanza per compiere un giro dellelica di 33,2 A(passo dellelica),ossia per ogni giro ci sono 10 coppie. I due filamenti sono antiparalleli,una con polarit 53 e laltro 35,e in soluzione il DNA ha una struttura simile a quello della diffrazione se non per la presenza di 10.5 coppie di basi ogni giro delica. I filamenti complementari possono essere separati ed ognuno pu servire da stampo per la sintesi di un nuovo filamento durante la replicazione semiconservativa che assicura che i 2 Duplex siano uguali alle molecole di partenza. GENI COSTITUITI DA RNA Alcuni virus contengono geni costituiti da RNA a singolo e doppio filamento invece che di DNA,come ilfago,un virus batterico privo di vita propria ed attivit metabolica finch non infetta una cellula ospite che comincer a produrre proteine virali. I geni virali producono,con le proteine del capside,nuove particelle virali. CHIMICA FISICA DEGLI ACIDI NUCLEICI Nella cellula il DNA pu presentarsi in varie forme:la forma B,destrorsa con basi orizzontali proposta da Watson e Crick,come una struttura di sale di sodio del DNA in una conformazione fibrosa ottenuta a valori elevati di umidit relativa (92%);forma A destrorsa ottenuta ad un livello di umidit del 75%,con il piano su cui giacciono le basi inclinato di 20 rispetto al piano orizzontale,con 11 coppie ogni giro e con un valore del passo dellelica di 24.6 A (tale struttura assunta da ibridi DNA-RNA e da un doppio filamento di RNA);forma Z estesa,elicoidale e sinistrorsa con un andamento a zig zag. Separazione dei filamenti di DNAIl contenuto di G+C varia in una molecola di DNA dal 22 al 73% e ci pu avere effetto sulle caratteristiche fisiche del DNA,quali la temperatura di denaturazione e la densit che aumentano allaumentare della % G+C . Se una soluzione di DNA scaldata i legami covalenti si rompono dando vita al processo di denaturazione/fusione del DNA e la temperatura alla quale i filamenti sono denaturati o dissociati per met detta temperatura di fusione Tm. Lentit della denaturazione misurata in base allassorbanza a 260 nm della soluzione di DNA( il DNA assorbe la luce a questa lunghezza donda a causa della natura elettrica delle basi). Quando i 2 filamenti sono uniti,lassorbanza ridotta dalla vicinanza delle basi e quando si separano,aumenta del 30-40% e il fenomeno detto effetto ipercromico. Siccome le basi G e C sono tenute insieme da 3 legami H,la loro energia di legame superiore rispetto al legame A-T,e allaumentare del contenuto di G/C aumenta anche la Tm. La denaturazione consentita anche da solventi organici (dimetil solfossido,formammide) da un elevato valore di pH e da una bassa [ ] ionica/salinica ottenuta rimuovendo gli ioni che schermano le cariche (-) sui filamenti. Un aumento del contenuto di G/C influenza anche la densit del DNA,poich il volume molare < rispetto ad A/T e ci dipende dal metodo di misurazione tramite centrifugazione in CsCl che si lega maggiormente alle coppie G/C la cui densit risulta aumentata. Rinaturazione/Annealing I filamenti separati possono riassociarsi se influenzati dalla:temperatura,25 al di sotto della Tm,e per tale motivo una procedura comune per mantenere il DNA nella forma denaturata di mettere la soluzione calda in ghiaccio (quenching),cossich il raffreddamento rapido impedisca lappaiamento;concentrazione,> la [ ] e > a probabilit che i filamenti complementari si incontrino e quindi la velocit di appaiamento; tempo,maggiore ,e maggiore sar lannealing.

Ibridazione Se isoliamo un filamento di DNA costituente un gene e lo poniamo in presenza di un filamento di RNA complementare,si crea un ibrido;lo stesso accade se si pongono insieme 2 filamenti di origine diversa con lievi differenze,ad esempio se uno dei 2 radioattivo. CAPITOLO 4 TECNICHE DI CLONAGGIO MOLECOLARE ( LABORATORIO) CLONAGGIO DEI GENI Un clone un gruppo di cellule o organismi identici tra loro e la procedura tipica consiste nellintroduzione di un gene estraneo in cellule batteriche e la separazione delle singole cellule da cui si ottengono colonie. Le cellule di una stessa colonia possiedono lo stesso gene introdotto e finch questo in grado di replicarsi pu essere clonato,clonato la cellula batterica ospite. Endonucleasi di restrizione Impediscono linvasione da parte di DNA esogeno (virale) tagliandolo in frammenti restringendo i possibili ospiti del virus; i tagli avvengono in siti allinterno del DNA esogeno e non alle estremit. Soltanto lenzima Hind II del ceppo Rd di Haemophilus influenzae in grado di tagliare il DNA in siti specifici e riconosce la sequenza GTPyPuAC/CAPuPyTG,operando il taglio a livello della sequenza Py-Pu. Gli enzimi a taglio sporadico (Not I) riconoscono siti di taglio di 8 coppie di basi e tagliano meno frequentemente;gli enzimi isoschizomeri ( Sma I Xma I) riconoscono la medesima sequenza ma con sito di taglio diverso. Gli enzimi di restrizione sono importanti perch capaci di tagliare i 2 filamenti negli stesi punti e perch possono effettuare tagli sfalsati lasciando porzioni di DNA a singolo filamento alle estremit,dette estremit coesive,in grado di appaiarsi temporaneamente ( possibilit di legare 2 diverse molecole di DNA). Tali tagli sono possibili perch le sequenze di riconoscimento hanno una simmetria bilaterale (identiche se capovolte di 180): 5GAATTC-3 / 3CTTAAG-5e sono dette palindromi;la lettura deve essere sempre 53. Le endonucleasi sono quasi sempre accoppiate a metilasi che metilano gli stessi siti sul DNA e collettivamente sono noti come siti di restrizionemodificazione/R-M. La metilazione consente al DNA la protezione dalle endonucleasi e il suo permanere nella cellula ospite. Quando il DNA replicato,un filamento del duplex formatosi non sar metilato a differenza dellaltro metilato,ma questaemimetilazione/a met assicurer protezione alla doppia elica,consentendo alla metilasi di trovare i siti per ottenere una doppia elica completamente metilata. Cohen e Boyer tagliarono 2 molecole di DNA diversi (plasmidi = piccole molecole di DNA circolare indipendenti dal cromosoma della cellula ospite)con lo stesso enzima EcoRI. Il 1 plasmide pSC101 conteneva il gene che conferiva resistenza allantibiotico tetraciclina mentre il 2 RSF1010 conferiva resistenza alla streptomicina e alla sulfonammide. Entrambi contenevano un sito di restrizione EcoRI e in seguito al taglio si ottennero 2 molecole di DNA lineari con le stesse estremit coesive che si appaiarono. La DNA ligasi un covalentemente le 2 molecole ottenendo unDNA ricombinante in vitro,costituito da 2 pezzi di DNA precedentemente separati; se introdotto in cellule batteriche conferisce resistenza alla tetraciclina ( si possono ottenere anche comunemente in natura). Vettori Entrambi i plasmidi sono utilizzati come trasportatori per permettere la replicazione di DNA ricombinanti;generalmente si utilizzano 1 vettore e 1 frammento di DNA esogeno che dipende dal vettore per essere replicato;siccome il DNA esogeno sprovvisto di unorigine di replicazione pu essere replicato solo se si trova in un vettore contenente tale sito. 1)Plasmidi come vettori : Uno dei pi famosi ma non pi utilizzati il pBR322 contenente i geni che conferiscono la resistenza agli antibiotici ampicillina e tetraciclina e tra questi 2 geni si trova lorigine della replicazione. Attraverso manipolazioni il plasmide ottenne un solo ed unico sito di taglio per enzimi di restrizione,utile per evitare la perdita di parte del plasmide. Nella clonazione del frammento di DNA esogeno nel sito per lenzima Pst I del pBR322 si taglia il vettore con Pst I per creare le estremit coesive e ci deve avvenire anche nel DNA. In seguito sono combinati il vettore e il DNA esogeno,ed incubati con la DNA ligasi che lega covalentemente i 2 DNA dopo che si sono unite le estremit coesive del vettore e del DNA. In seguito si deve trasformare lE.coli con la miscela di DNA,incubando le cellule in soluzione concentrata di sale di calcio per rendere le membrane permeabili;poi le cellule permeabili sono mescolate con il DNA permettendogli di entrare allinterno. Il DNA pu entrare anche attraverso elettroporazione,utilizzando campi elettrici ad alto voltaggio. Siccome il DNA che otteniamo non tutto ricombinato ma si hanno anche plasmidi ricomposti,per separarli utile la resistenza agli antibiotici caratteristica dei plasmidi. Le cellu